Görüntüleme G Nötrofil gibi HL60 Hücreleri Kemotaksis ve Sinyal Olaylar Reseptör aracılı Protein-çiftli

Görsel kemotaksis deneyleri kemoatraktan aracılı yönlü hücre göçü nasıl kontrol ökaryotik hücreler daha iyi anlaşılması için gereklidir. 1) Gerçek zamanlı, çoklu kemotaksis deneyleri yüksek çözünürlüklü izleme ve 2) aynı anda kemoatraktan degrade görselleştirmek ve nötrofil gibi HL60 hücrelerinde sinyal olaylarının zamanmekansal dinamiği: Burada ayrıntılı yöntemler açıklanmaktadır.

Bu modelin genel amacı, çoklu kemotaksis testlerinin eşzamanlı olarak izlenmesine veya tek bir kemotaksiye sahip hücrenin çoklu sinyal olaylarının görselleştirilmesine izin vermektir. Overdeck'in hücre biyologları, hücrelerin kemotaksis davranışını ölçmek için birkaç farklı yaklaşım geliştirdiler. Yakın zamana kadar, kemotaksis alanında, birden fazla kemotaksis testinin aynı anda nasıl izleneceği gibi temel soruları yanıtlayabiliyorduk.

Bu teknolojinin ana avantajı, gerçek zamanlı olarak yüksek çözünürlüklü çoklu eşzamanlı kemotaksis testleri için yüksek oranda tekrarlanabilir ve güvenilir bileşenler üretmek için mikroakışkanlar ilkesini uygulamaktır. Prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan bir doktora sonrası olan Dr.Xi Wen olacaktır. Tutucuyu monte etmek için, önce tabanı dikey konumda konumlandırmak için kolları kullanın, böylece kollar kullanıcıya doğru eğilebilir.

Ardından, 41 milimetrelik camın yüzeyini kısa bir süreliğine %70 etanol ile kaplayın ve etanolü dikkatlice çıkarmak için bir mendil kullanın. Camı tutucu tabanına yerleştirin ve camın üzerine BSA kaplı 2 milimetre kare bir kapak kılıfı yerleştirin. Ardından, küçük O-ringi gofret muhafazasının altına yerleştirin ve gofret muhafazasını, aletin arkasındaki eliptik delik ile tutucu tabanına monte edin.

Gofret muhafazasını yerine kilitlemek için tutucu tabanının iç seviyesini yatay konuma doğru çekin. Gofret muhafazasının içindeki kalıntıları üflemek için bir hava silgi kullanın. Ardından, muhafazaya% 0.1 BSA ile desteklenmiş 4 milileter RPMI 1640 ortamı ekleyin.

Şimdi, BSA kaplı hücre hareketliliği analiz cihazı çipini, yapısal yüzü camla temas edecek ve konumlandırma işareti arkada olacak şekilde gofret muhafazasının merkezine monte edin. Contayı gofret kelepçesinin altına sabitlemek için lastik conta üzerindeki iki çıkıntıyı deliklere yerleştirin ve büyük O-ringi gofret muhafazasının üstüne monte edin. Ardından gofret kelepçesini arkadaki sensör deliği ile monte edin ve gofret kelepçesini yerine kilitlemek için muhafaza tabanının dış kolunu yatay konuma doğru çekin.

Tutucu monte edildiğinde, kuyucuklarda hava kabarcığı olmadığını doğrulamak için tutucunun altını bir ışık kutusunun üzerine yerleştirin. Ardından kapağı çıkarın, düzeneği hücre hareketliliği analiz cihazı ünitesinin üstündeki plakaya aktarın ve sensör bloğunu tutucuya takın. Hücre hareketliliği testini gerçekleştirmek için, önce BSA takviyeli RPMI 1640 ortamında farklılaşmış HL60 hücrelerini ve mililitre konsantrasyonu başına iki kez on ila altıncı hücreleri askıya alıyoruz.

Ardından, görüntü alımı için hücre hareketliliği analiz cihazı ünitesini bilgisayara bağlayın ve her iki cihazı da açın. Ardından, hücre hareketliliği analiz cihazı yazılımını açın. Kamera görüntüsü kontrol panelinde, tutucu konumunu gerçek zamanlı olarak ayarlamak için yatay ve dikey çizgileri kullanın ve cihazı kamera görüntü panelinde ortalayın.

Ardından, kamerayı seçili kanala taşımak için Birinci Kanal'ı seçin ve kameranın X koordinatını görünüm alanını yatay olarak ortalayacak şekilde ayarlamak için Sola Taşı'yı kullanın Sağa Taşı'nın Sola Taşı'nı kullanın. Görüntüyü ekranın ortasına dikey olarak ayarlamak için, hücre hareketliliği analiz cihazının ön panelindeki konum düğmesini çevirin. Isıtıcı kontrol panelinde, tutucu sıcaklığını 37 santigrat dereceye ve plaka sıcaklığını 39 santigrat dereceye ayarlayın.

Tutucuya bağlı termal sensörü kullanarak sıcaklığı kontrol etmek için, ısıtmayı başlatmak için Isı'ya ve ardından Tutucu'ya tıklayın. Çekim panelinde, kemotaksis testinin aralıklarını ve süresini ayarlamak için sırasıyla Aralık için 15 saniye ve Süre için 30 dakika girin. Güvenlik amacıyla, çekim kutusunun sonundaki Isıtıcıyı kapatın.

Ardından dosyayı kaydedin, deneyin özelliklerini not paneline girin ve cihazın tüm kanallarda ortalandığını onaylayın. Şimdi tüm tamponu tutucudan çıkarın ve üçüncü kuyudan ilk kanalın üstünden sekiz mikrolitre tamponu çıkarın. Bir şırınga kullanarak, enjeksiyon sırasında hücre sayısını ve akışını kontrol etmek için ekranı gerçek zamanlı olarak izlerken, aynı kanaldaki ikinci kuyucuğa iki mikrolitre hücre enjekte edin.

Hücreler hizalandığında, sekiz mikrolitre tamponu hemen kuyuya geri ekleyin ve hücre enjeksiyonunu az önce gösterildiği gibi iki ila altı arasındaki kanallarda tekrarlayın. Tüm hücreler eklendikten sonra, tutucuya iki mililitre tampon ekleyin ve uygun kanallarda üstten üçüncü kuyucuğa bir mikrolitre kemoatraktan ekleyin. Son olarak, görüntü alımını başlatın.

Bu temsili deneyde, HL60 hücreleri, kemoatraktan enjeksiyonundan hemen sonra düz bir yolda kemovergilemeye başlar ve gradyan stabilite simülasyon sonuçlarıyla tutarlı olarak testin 60 dakikası boyunca devam eder. Hücrelerin hareket yolunun ve morfolojisinin izlenmesi, hücrelerin toplam yol uzunluğunu, yönlülüğünü, hızını ve yuvarlaklığını içeren bir kemotaksis indeksi kullanarak kemotaksis davranışlarının nicel ölçümüne ve ardından karşılaştırılmasına olanak tanır. Bir floresan boyanın kemoatraktan ile birlikte uygulanması, kemoatraktan konsantrasyonu ile izlenen floresan boya yoğunluğu arasında doğrusal bir ilişkinin kurulmasına izin verir.

Ayrıca, üniform olarak uygulanan kemoatraktan stimülasyonuna yanıt olarak, HL60 hücreleri, bir kemoatraktan gradyan D1.In GFP dokunma proteini kinazın sağlam bir membran translokasyonuna aracılık eder, HL60 hücreleri aktif olarak kinazı ön kenarın arkasına alır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu işlem düzgün bir şekilde yapılırsa 30 dakika içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, üreticinin tutucu tertibatı üzerindeki talimatlarına kesinlikle uymak ve hücre enjeksiyonunu izlemek önemlidir.

Geliştirildikten sonra, bu teknik, kemotaksis alanındaki araştırmacıların, monogenizm dictyostilium veya diğer memeli hücre sistemleri gibi çoklu kemotaksis tahlillerinin olasılığını keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, ünitenin nasıl monte edileceğini, eşzamanlı kemotaksis testlerinin nasıl gerçekleştirileceğini veya kemovergi hücrelerinde birden fazla sinyal olayını aynı anda nasıl görselleştireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.