Name: Cardiotoxin Enjeksiyonu ile Akut İskelet Kası Regeneration indüksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Öğrenin, kardiyotoksin enjeksiyonu ile farelerde akut iskelet kası hasarı oluşturma ve rejenerasyon sürecini inceleme yöntemini. Bu protokol yüksek tekrarlanabilirlik sağlar ve kas iyileşmesi mekanizmalarını araştırmak için güvenilir bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Hayvan Barınağı'na ve IGB-CNR'nin Entegre Mikroskopi Tesislerine teşekkür ederiz. Bu çalışma, Avrupa Topluluğu'nun Yedinci Çerçeve Programı'ndan ENDOSTEM (Kas dokusunun onarımı ve bakımı için vaskülatürle ilişkili kök hücrelerin ve kas kök hücrelerinin aktivasyonu, hibe sözleşmesi numarası 241440), İtalyan Eğitim-Üniversite-Araştırma Bakanlığı (MIUR-PRIN2 010-2011) projesinde G.M. ve S.B. ve PON Kümesi IRMI'den GM'ye yönelik araştırma fonundan yararlanmıştır. ve CARIPLO vakfı G.M. ve S.B.'ye.

Bütün deneyler, hayvan araştırmaları için kurumsal talimatlarına göre yapılan ve Deney Hayvanları yasalara uygun Halk Sağlığı, Hayvan Sağlığı, Beslenme ve İtalyan Sağlık Bakanlığı Gıda Güvenliği Dairesi tarafından onaylanmıştır. Servikal dislokasyon prosedürleri IACUC veya eşdeğer gereksinimlerine göre kurumdan kuruma değişebilir. Tibialis anterior kas 1. Cardiotoxin Enjeksiyon <ol><li> işleme başlamadan önce, steril fosfat tamponlu tuz (PBS) içinde ya da su içinde cardiotoxin stok çözelti seyreltilerek cardiotoxin (CTX) çalışma çözeltisinin 10 uM hazırlayın. Not: CTX 1 mg / ml su içinde çözünür. 70 mcM stok solüsyonu hazırlayın. -20 ° C&#39;de kısım ve mağaza. Bu protokol için kullanılan CTX yaklaşık 7000 Da&#39;lık bir moleküler ağırlığa sahip cardiotoxins bir karışımıdır. Giymek tavsiye edilir: DİKKATçift ​​eldiven, bir hijyen maskesi ve koruyucu gözlük seyreltilmiş bile, ve çözümü ile herhangi bir teması önlemek için çok dikkatli olmak (alternatif olarak güvenlik gözlükleri için, bir başlık altında çalışmak için tavsiye edilir). </li><li> Ketamin ve ksilazin (80 mg / kg ve / kg vücut kütlesinin 10 mg) ya da diğer kabul uygun anestezik intraperitoneal enjeksiyonu ile farelere anestezi. </li><li> Fare yüzü yukarı gelecek şekilde,% 70 etanol ile arka bacaklarda sprey. Bir neşter yardımıyla Tibialis Anterior (TA) kas tam yerini, görselleştirmek için, diz altında, alt bacağın ön kısmında uzakta saçlarını kesti. Not: TA kas kemik yanal aşağı gidiş ve ayak bileğinde biten, tibianın proksimal gövde doğar. Onun uzun tendon (Şekil 1A bakınız) bileği boyunca ayak içine uzanır. </li><li> geri pistonu yavaşça çekerek enjektöre çözümün ~ 100 uL çizin. </li><li> (Hava kabarcıklarını çıkarmak dik şırınga tutaniğne ile yukarı doğru). Yavaşça aşağı pistonu çekerek tüpün iç kısmına bağlı herhangi bir hava kabarcıkları yukarı doğru gelip yardımcı olmak için şırınga tarafını hafifçe vurun. Yavaş yavaş büyük hava kabarcıkları serbest bırakmak için pistonu basın. sıvı birkaç damla iğne çıkacaktır. Bu noktada, cardiotoxin toksisitesi göz önüne alındığında, onu dağıtmak tüp içine tekrar sıvıyı almak ve emin olun. </li><li> Arzu edilen doz, ulaşılana kadar şırıngaya solüsyonu çekin. Her TA kas için CTX solüsyonu 20 mcL enjekte edilir. </li><li> diz doğru tendonu, rehberlik gibi Tibia kemiğinin pozisyonu takip ederek ta merkezinde iğne takın. TA ince doku olduğundan, (2/3 mm derinliğinde iğne, yaklaşık 10 ° ila 20 ° açı ekleyin) çok derin gitmeden enjeksiyon gerçekleştirmek ve kas kendisi (Şekil 1A) ötesine geçerek kaçının. </li><li> enjeksiyondan hemen sonra iğneyi çekin ama 2 beklemeyin - sızıntısı önlemek için 3 snCTX yaş kas düşer. </li><li> Fareler anestezi beri, uyanık ve kullanılan etanol vücut ısısını düşürmek kadar işlem sonrası, (37 ° C&#39;de) ısıtılmış bir plaka üzerinde kafes yerleştirin. </li></ol> 2. Tibialis Anterior İzolasyon Not: Kas deney ihtiyaçlarına göre cardiotoxin enjeksiyondan sonra farklı zaman noktalarında izole edilebilir. <ol><li> servikal dislokasyon ile fare Kurban. </li><li> % 70 etanol ile arka ayaklarının püskürtün. İşlem sırasında, hayvan aşağı tutmak için bir desteğe sabitlenebilir. </li><li> (Ayak üstü) proksimal tendon düzeyinde cilt kesmek, deri altında makas bıçaklarının birini takın ve diz yönünde yukarı doğru deriyi kesti. forseps yardımıyla, cilt yukarı çekin ve tamamen kas maruz kalmaktadır. Dikkatle deri ve ilgi alanından tüm saç kaldırın. </li><li> Th yavaş kısma veya keserek fasya (eleyincımbız ucu-veya tibia (Şekil 1B) ters tarafında) kasının aşırı çevresini makas diseksiyon ince mikro. Bir kez kırık, yavaşça ince uçlu cımbız yardımı ile fasya kaldırmak; Altta yatan kas zarar vermemek. Not: diğer kasların ve organların olduğu gibi, TA fasya (bacağın derin fasya), derin cilt altına yatıyor ve kolayca altta yatan kas izole etmek kaldırılması gerekiyor bağ dokusu ince bir tabaka ile kaplıdır. </li><li> Distal TA tendonu ve yan yana olan ayak yukarıda Ekstansör Digitorum tendonu, gözünüzde canlandırın. Extensor digitorum longus (EDL) kas tendonu biraz TA tendonun altında yer almaktadır. Yetişkin farelerin Tendonlar çıplak gözle görebilir. </li><li> İki aşağıdaki tekniklerden biri aşağıdaki TA kas kaldırın: <ol><li> holdin, ince mikro makas diseksiyon hem tendonları kesin ve yakın tarafına doğru çeking forseps ile tendonların. İki tendonları ayrı kasları ayırmak için farklı yönlerde nazikçe çekerek. </li><li> Ince uçlu cımbız yardımıyla, tendon kendisi (Şekil 1C, üst resim) altında ucu geçerek Ekstansör Digitorum tendonunun distal TA tendon ayırın. Yavaşça altta yatan kasları (Şekil 1C, alt resim) ayırmak için ta aşağıda cımbız kaydırın. </li><li> , Hafifçe yükseltilmiş tutmak ta tendonuna kesmek için kas altında cımbız tutun ve yavaşça diz (Şekil 1D, sol resim) bağlı altında sadece bölgede kadar yukarı doğru çekin. Makas (Şekil 1D, sağ resim) ile kas kenarında izleyen, diz altında TA kesti. Not: kas hafifçe yanlara bağlı kalırsa, bunu ayırmak yardımcı olmak için diseksiyon makas ince mikro kullanın. Not: forseps kolayca ta aşağıda sığmayan,fasya tamamen kaldırıldı edilmediğini mümkündür, ve hala kas üstünde görünür olabilir. Bu durumda, devam etmeden önce iyice kaplamasını çıkarın. </li></ol></li></ol> 3. Taze Donmuş kas Tekniği <ol><li> Tragasant zamkı ya da mantar, bir dilim benzer bir yapışkan dondurma bileşik (örneğin, optimal kesme ısısı (OCT) bileşiği) küçük bir miktar. Dondurmadan önce arka tarafındaki Cork&#39;ın dilim etiket, gerekli (Şekil 2A) eğer. </li><li> Kas enine bölümleri elde etmek için, mantar göre bir dik bir pozisyonda kas var emin distal tendon ekleme ve dışında yaklaşık 3/4 kas bırakarak kitre zamkı içine TA lavabo (Şekil Şekil 2A). </li><li> bir alüminyum kutu doldurun (alternatif bir metal bardak veya bir cam kap) izopentan ile. Bir Dewar içeren Liqui izopentanın can Askıyad azot, sıvı azot teneke kutu içine girmek için izin vermiyor. Not: İzopentan doku uygun dondurma (-150 arasında -160 ° C) uygun bir sıcaklığa ulaşması gerekir. bazı beyaz bir katı parçacıklar kutunun altındaki oluşturmaktadır ve izopentan hafif viskoz olduğunda doğru sıcaklığa ulaşılır. Not: dondurma eserler yol açabilir olarak, katı parçacıkların oluşturulmasından önce örneği donma etmeyin. izopentan tamamen katı hale gelirse o çözülene kadar Öte yandan, bazı beyaz parçacıklar hala mevcut emin, oda sıcaklığında bekletin. </li><li> Mixter forseps kullanarak hızla kas yerleştirilmiş aşağı doğru tutarak, izopentan içine kas ile mantar daldırın ve tamamen sıvıya batırılmış zaman mantar serbest bırakmak için emin olun. örnek yüzen ise bu şekilde, mantar sadece ters tarafı sıvı içinde görünür olmalıdır. </li><li> sa bırakın1 dakika için izopentan içinde yapıldığı Örnek. </li><li> Mixter forseps (ya da benzer bir forseps) kullanılarak, kas almak ve en az 2 dakika süreyle sıvı nitrojen içine daldırın. </li><li> Bir saklayabilirsiniz -80 ° C derin dondurucuda doğrudan etiketli alüminyum folyo ile ayrı ayrı numuneler sarın ve hemen kuru buz (-70 ° C) koyun, ya da. Not: süreci boyunca, adım 3.4 3.7, doğru sıcaklık korumak için ve (. ° C derin dondurucuda -80 transferi sırasında, örneğin) çözülme gelen örnekleri önlemek için son derece önemlidir. kontrolsüz çözülme ve doku içinde mevcut olan ve sonunda eşya oluşumunu veya kas liflerinin bozulmasına sebep olur, su mikrokristallerinin soğutulmasından yükselen sıcaklığı sonuçları (lifin merkezinde büyük beyaz delikler doku bölümleri üzerinde görülebilmektedir). </li></ol> Dondurulmuş Kaslar 4. Kriyostat Kesit <ol><li> Kriyostat odası sıcaklığı t SetO -20 -22 ° C arasındadır. </li><li> en az 30 dakika boyunca dengeye kavuşmaları için izin numune saplama, bıçak ve kriyostat bölmesinde örnek koyun. </li><li> Örnek saplama donma bileşik (örn Ekim bileşik) küçük bir miktar koyun ve dondurma bileşik katılaşır önce numune ile mantar batırmayın. Bu arada, bıçak tutucu bıçağı yerleştirin. </li><li> Bıçak tutucu (Şekil 2B) ile numune tutucu yönlendirmek için verilen vidaları kullanarak numune ve bıçak hizalayın. </li><li> 10 um bölüm kalınlığı ayarlayın. doku kesmek için devam edin. Tahrik tekerleğinin her fırsatta için, numune tutucu bıçak doğru kontrollü bir mesafe ilerler. </li><li> Kutuplaşmış slayt (slayt başına 8 ila 10 bölüm) (Şekil 2C) ile ilgili bölümleri yerleştirin. </li><li> Kesit sonra, -80 ° C slaytlar saklayın. Not: Örnek -80 ° C dondurucu içinde depolanır ve ilave edilen yeniden kullanılabilirgerei ve depolandığı takdirde r, kesit. </li></ol> 5. Rutin histolojik Boyama (Hematoksilen &amp; Eosin Lekeleri) Not: Çeşitli histolojik lekeleri analizine uygun olarak kas kesitleri üzerinde gerçekleştirilebilir. morfolojik ve morfometrik analizi için bir rutin histolojik leke Hematoksilen &amp; Eosin (H &amp; E) bichromic leke. Hematoksilen çekirdekler derin mor lekeler. Nükleer boyanma eozin ile zıt böyle sitoplazmada myofibers olarak eozinofilik yapıları, lekeleri (pembe / kırmızı). <ol><li> Tamamen hava-kuru 10 bölümleri ile dondurulmuş slaytlar - oda sıcaklığında 15 dakika, bir boyama tepsi slaytlar Köşkü ve boyama teknesine tepsiyi koydu. </li><li> hematoksilen ile 1 dakika boyunca Leke. </li><li> 10 dk hematoksilin yıkamak için oldukça zayıf bir musluk su jeti altında boyama çukur yatıyordu. </li><li> eozin bir alkolik bir çözüm kullanılacaksa t atlayın (5 dk 95% etanol için slaytlar daldırınsulu eosin solüsyonu halinde onun aşaması). </li><li> eozin çözeltisi ile 1 dakika boyunca karşıt. </li><li> Aşırı eozin çözümü ortadan kaldırmak için su ile durulayın. Not: hematoksilin ve eosin ile ya boyama optimal süresi, her yeni bir partisi için tanımlanmalıdır. </li><li> sınıflandırılmış etanol serileri örnekleri kurutmak:% 50 ve% 70 (bir kaç saniye) ekstrakte edildi. Hızla% 100 etanol içinde 2 değişiklik, her biri 5 dakika, ardından% 95 etanol içinde bırakın. </li><li> ksilen 2 değişiklikler, her 5 dakika veya daha uzun temizleyin. Bu adım, bir kimyasal başlık altında gerçekleştirilmelidir. </li><li> slayt montaj orta ve bir lamel ile kaplama birkaç damla uygulayarak, bir ksilen bazlı montaj orta slaytlar monte edin. montaj orta da lamel ve slayt koymak lamel uygulanabilir. <ol><li> slayt ve lamel arasındaki hava kabarcıkları oluşturarak kaçının. , Hava kabarcıklarını ortadan kaldırmak (montaj sonra) dikey slayt tutmak ve fazla mo dışarı sıkmakyavaşça künt forseps (ya da benzer bir künt bir araç) ile lamel basarak unting orta ve hava kabarcıkları. </li></ol></li><li> ksilen analizine geçmeden önce tamamen buharlaşması izin gecede birkaç saat için kaputun altında slaytlar tutun ya da. </li><li> fare başına en az bir tam kas bölümünün örtüşmeyen seri görüntüleri kullanarak H &amp; E boyalı yenileyici kas bölümlerinin morfolojik ve morfometrik analizi yapın. 20X büyütme ile, parlak alan mikroskobu ile görüntü yakalama. Not: 5 fareler en az sayıda ölçümleri istatistiksel önemi alınması tavsiye edilir. Not: Görüntü analiz yazılımı gibi (http://imagej.nih.gov/ij/) ücretsiz indir yazılım ImageJ olarak, bu amaç için kullanılabilir. </li></ol>

<ol><li>Morgan, J. E., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle satellite cells.</a> Int J Biochem Cell Biol. 35 (8), 1151-1156 (2003).</li>
<li>Roca, I., Requena, J., Edel, M. J., Alvarez-Palomo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+Precursors+from+iPS+Cells+for+Skeletal+Muscle+Cell+Replacement+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Myogenic Precursors from iPS Cells for Skeletal Muscle Cell Replacement Therapy.</a> J Clin Med. 4 (2), 243-259 (2015).</li>
<li>Cheung, T. H., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+stem+cell+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of stem cell quiescence.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).</li>
<li>Dumont, N. A., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+and+extrinsic+mechanisms+regulating+satellite+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Intrinsic and extrinsic mechanisms regulating satellite cell function.</a> Development. 142 (9), 1572-1581 (2015).</li>
<li>Hawke, T. J., Garry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+satellite+cells%3A+physiology+to+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology.</a> J Appl Physiol. 91 (1985), 534-551 (1985).</li>
<li>Saclier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentially+activated+macrophages+orchestrate+myogenic+precursor+cell+fate+during+human+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentially activated macrophages orchestrate myogenic precursor cell fate during human skeletal muscle regeneration.</a> Stem Cells. 31 (2), 384-396 (2013).</li>
<li>Pillon, N. J., Bilan, P. J., Fink, L. N., Klip, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-talk+between+skeletal+muscle+and+immune+cells%3A+muscle-derived+mediators+and+metabolic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Cross-talk between skeletal muscle and immune cells: muscle-derived mediators and metabolic implications.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 304 (5), E453-E465 (2013).</li>
<li>Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+dynamics+in+the+muscle+satellite+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche.</a> EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).</li>
<li>Costamagna, D., Costelli, P., Sampaolesi, M., Penna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Inflammation+in+Muscle+Homeostasis+and+Myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Role of Inflammation in Muscle Homeostasis and Myogenesis.</a> Mediators Inflamm. 2015, (2015).</li>
<li>Charge, S. B., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+regulation+of+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular regulation of muscle regeneration.</a> Physiol Rev. 84 (1), 209-238 (2004).</li>
<li>Arnold, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+monocytes+recruited+after+skeletal+muscle+injury+switch+into+antiinflammatory+macrophages+to+support+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis.</a> J Exp Med. 204 (5), 1057-1069 (2007).</li>
<li>Chang, C. C., Chuang, S. T., Lee, C. Y., Wei, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cardiotoxin+and+phospholipase+A+in+the+blockade+of+nerve+conduction+and+depolarization+of+skeletal+muscle+induced+by+cobra+venom%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Role of cardiotoxin and phospholipase A in the blockade of nerve conduction and depolarization of skeletal muscle induced by cobra venom.</a> Br J Pharmacol. 44 (4), 752-764 (1972).</li>
<li>Meng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+triage+and+freezing+for+models+of+skeletal+muscle+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li>
<li>Mann, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+repair+and+fibrosis+development+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Skelet+Muscle%22%5BJournal%5D)">Aberrant repair and fibrosis development in skeletal muscle.</a> Skelet Muscle. 1 (1), (2011).</li>
<li>Pessina, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+and+optimized+strategies+for+inducing+fibrosis+in+vivo%3A+focus+on+Duchenne+Muscular+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Skelet+Muscle%22%5BJournal%5D)">Novel and optimized strategies for inducing fibrosis in vivo: focus on Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Skelet Muscle. 4 (1), 7(2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada, iskelet kasında (yani, CTX kas içi enjeksiyon) akut hasara yol için bir protokol açıklar. Bu yaygın in vivo iskelet kası yenilenme dinamiklerini incelemek için güçlü bir araç olarak kullanılmaktadır. CTX enjeksiyon sarcolemma bir depolarizasyon ve elyaf 12 kasılması neden olur kas lifleri, yozlaşmasına neden olur ve kas yenilenme yol açan olaylar zincirini tetikler. İskelet kas deney ihtiyaçlarına göre, enjeksiyon ve yaralanma sonrası istenen zaman noktalarında kesilir, ve daha sonra...

Memeli yetişkin iskelet kas kasılması için özel olan çok çekirdekli kas hücreleri (myofibers) arasında fasiküller grupları ile oluşturulmaktadır. Her myofiber düzenli ve sürekli olarak düzenlenen kontraktil proteinlerin (aktin ve myosin filamanların) oluşur sarcolemma (plazma membran) içeren ve myofibrils çevrili bir ince uzun sinsityum vardır. Erişkin yaşamda ve dinlenme koşullarında, iskelet kasları kendi myonuclei 1 çok düşük bir ciro var; Gerçekten, sarcolemma altında, myofiber çevresinde yer almaktadır myonuclei, hücre döngüsünün G0 fazında tutuklandı ve 1,2 çoğalırlar edemiyoruz vardır. İskelet kasları, zarar aşağıdaki sıkıca birbirleriyle ilişkili olan doku yeniden birkaç olaylardan sonra homeostazisini ulaşan yeniden özgü yeteneği var. akut yaralanma veya travma sonrasında dejenerasyon, indüklenir yenilenmesi işlemleri ve ardındankas hücrelerinin bir yerleşik nüfusun dahil olmak üzere farklı hücre popülasyonu, içerdiğini, uydu hücreleri (SC&#39;ler). Gerçekten de, bir çevresel uyarıcılar olmadan uydu hücreleri, hareketsiz bir durumda olan sarkolemma ve bazal lamina 3,4 arasında bir niş yer almaktadır. Bir yaralanma ya da hastalık, aktif, yeni şekillendirme myofibers 5 sebebiyet veren, hasar görmüş alanlara göç ve sonunda ayırt çoğaltacak haline AVM ardından. Aktif SC&#39;ler travma 6-8 sitesinde işe farklı hücre popülasyonlarının, temel olarak iltihap hücreleri ile çapraz-kurulması. Bu cross-talk hücreleri sonunda 9 homeostazı lider, moleküler sinyaller yapısal değişiklikler hangi sürücü tarafından düzenlenmiş bir paradigma izlemenizi sağlar. AVM, inflamatuar ve interstisyel hücreler, anjiyojenik süreçler ve yeniden innervasyon etkinliklerin yanı sıra, aynı zamanda bu son derece organize ve s onarmak için koordineli bir şekilde hareket ederek, söz konusupecialized yapısı. kas fizyolojisini anlamak için değil, aynı zamanda tüm sürecin derin bilgi gerektiren tedavi stratejileri geliştirmek için değil sadece, iskelet kası yenilenme farklı yönlerini inceleyerek büyük ilgi var. Çeşitli deneysel yaklaşımlar günümüzde farklı hücre popülasyonlarının, sinyal yolları ve ilgili moleküler mekanizmaların kimliğini ve işlevini incelemek için kullanılabilir. Akut yaralanma Fare modelleri bu sürecin pek çok yönünü araştırmak için güçlü bir araç temsil etmektedir. Farklı yaygın akut kas hasarı araştırmacılar sürecinin sonuna kadar çok erken aşamalarında, in vivo rejenerasyon sürecini takip etmesine izin ikna etmek için teknikler kullanılır. Bu protokol myolysis uyarır ve doku örneklerinin analizine kadar yenilenme sürecini tetikleyen yılan zehiri türevi cardiotoxin intramüsküler enjeksiyon (CTX), gelen adımları açıklar. CTX enjeksiyonundan sonra, mice deney koşullarına bağlı olarak, farklı zaman noktalarında feda edilebilir ve iskelet kasları parçalara ayrıldı ve daha fazla analiz için işlenebilir. Son olarak, biz morfolojik gözlemler ve temel kantitatif analizleri yapmak için doku bölümleri boyama protokol açıklar. Bu protokol, yüksek ölçüde tekrarlanabilir biçimde 10 in vivo akut iskelet kas rejenerasyon çalışma sağlar.

<table><tbody><tr><td>Kardiyotoksin&nbsp; Naja mossambica mossambica</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>C9759</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin İçin Şırınga BD Micro-Fine+ İğne 30 G x 8 mm - Da 0.3 mL</td><td>BD</td><td>324826</td><td></td></tr><tr><td>Tragacanth Gum</td><td>MP BIOMEDICALS,LLC</td><td></td><td></td></tr> 104792 <tr><td>2-Metilbütan (İzopentan)</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>78-78-4.</td><td></td></tr><tr><td>OCT Killik Inklüm Solüsyonu Dahil Etme Kriyostat</td><td>Biyo-optika</td><td>&nbsp; 05-9801</td><td></td></tr><tr><td>Tüy Mikrotom Bıçağı S35</td><td>Bio-optica</td><td>&nbsp; 01-S35</td><td></td></tr><tr><td>Cam Kaydırak Superfrost Plus</td><td>Menzel-Gl&auml; ser</td><td>09-OPLUS</td><td></td></tr><tr><td>Dumon #5 Ayna Kaplama Forseps&nbsp;</td><td>2BİYOLOJİK ALETLER</td><td>11251-23</td><td></td></tr><tr><td>Makas Düz Keskin/Keskin</td><td>2BİYOLOJİK ALETLER</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Makas Noyes Düz</td><td>2BİYOLOJİK ALETLER</td><td>15012-12</td><td></td></tr><tr><td>İnce İris Makas Düz Keskin/Keskin 10,5 cm</td><td>2BİYOLOJİK ALETLER</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt</td><td>Bio-optica</td><td>09-00100</td><td></td></tr><tr><td>Slayt Lamel</td><td>BIOSIGMA</td><td>VBS651</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Etanol% 100</td> <td>sigma-Aldrich</td><td>02860-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksilen</td><td>JT BAKER</td><td>3873</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>HT110116</td><td></td></tr><tr><td>Kriyostat</td><td>LEICA</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr></tbody></table>

cardiotoxin enjeksiyonu ile akut İskelet kası regeneration indüksiyon

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

İskelet kası yenilenmesi yaralanma ya da hastalık yanıt olarak, yetişkin iskelet kaslarının oluşan bir fizyolojik bir süreçtir. Akut yaralanma kaynaklı iskelet kası rejenerasyon kas rejenerasyonu yanı sıra mekanizmaları ve farklı oyuncular yer alan olayları incelemek için yaygın olarak kullanılan bir, güçlü modeli sistemidir. Gerçekten de, bu sürecin ayrıntılı bilgi, iskelet kas dejenerasyonu neden patolojik durumların daha iyi anlaşılması için gerekli olan ve yeni hedef tedavi stratejileri belirleme yardımcı olur. Bu çalışma cardiotoxin tek bir intramüsküler enjeksiyon (CTX) aracılığıyla farelerde akut iskelet kas rejenerasyonu ikna etmek için ayrıntılı ve tekrarlanabilir bir protokol açıklar. CTX yılan zehiri toksinler ailesine aittir ve sonunda rejenerasyon olaylarını tetikleyen myofibers bir myolysis neden olur. iskelet kası rejenerasyon dinamikleri, kas bölümleri histolojik analizi ile değerlendirilir. ayrıca protokol, Diseksiyon donma ve tibialis anterior kas yanı sıra yaygın sonraki morfolojik ve morfometrik analizi için kullanılan rutin Hematoksilen &amp; Eosin boyama kesmek için deneysel prosedürler göstermektedir.

H &amp; E boyama iskelet kası rejenerasyon sırasında belirli zaman noktalarında yenileme işleminin morfolojisinin değerlendirilmesi yapılır. Şekil 3, yabani tip farelerin yaralı ta kasları üzerinde gerçekleştirilen zaman süreci analizi gösterir. Şekil 3A'da şematik olarak kaslar, CTX enjeksiyonundan sonra 3, 7, 15, ve 30 gün sonra izole edilmiştir. H &amp; E boyalı enine kesitler temsili görüntü (Şekil 3B-D), zaman içinde, iskelet kası t...

Bu yazıda, yetişkin farelerde ve diseksiyon olarak kasların sonraki manipülasyonlar, dondurma, kesme, rutin boyama ve myofiber kesit alanı analizi akut iskelet kas yenilenmesini meydana ayrıntılı bir protokol açıklamaktadır.

Cardiotoxin Enjeksiyonu ile Akut İskelet Kası Regeneration indüksiyon

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Bu prosedürün genel amacı, rejenerasyon sürecini in vivo olarak, sürecin çok erken aşamalarından sonuna kadar incelemek için iskelet kası akut yaralanmasının bir fare modelini elde etmektir. Kas akut yaralanmasının fare modelleri, rejenerasyon sürecinin birçok yönünü araştırmak için güçlü bir araçtır. Bu tekniğin ana avantajı, ilgili tüm adımların yüksek tekrarlanabilirliğidir.Bu işleme başlamak için, anestezi uygulanmış bir farenin arka bacaklarına birkaç damla %70 etanol uygulayın. Tibialis ön kasının tam yerini görselleştirmek için, alt bacağın ön kısmındaki kılları bir neşter ile çıkarın. Kardiyotoksin çözeltisini enjekte etmek için, 100 mikrolitresini şırıngaya çekin.Şırıngayı dik tutun ve hava kabarcıklarını çıkarın. Ardından, tibia kemiğinin konumunu kılavuz olarak takip ederek iğneyi TA'nın ortasına tendondan dize doğru yerleştirin. Enjeksiyonu çok derine inmeden yapın ve kasın kendisinin ötesine geçmekten kaçının.Kardiyotoksinin kastan sızmasını önlemek için iğneyi çıkarmadan önce iki ila üç saniye bekleyin. Ötenazi yapılan hayvanın arka bacaklarına birkaç damla% 70 etanol uygulayın. Cildi proksimal tendon seviyesinde kesin, ardından makasın bıçaklarından birini cildin altına sokun ve cildi diz yönünde kesin.Kası tamamen ortaya çıkarmak için cildi yukarı çekin. İlgilenilen alandaki tüm cildi ve saçları dikkatlice çıkarın. Bundan sonra, kasın aşırı çevresini yavaşça sıkıştırarak veya keserek fasyayı ortadan kaldırın.Kırıldıktan sonra, alttaki kasa zarar vermekten kaçınmak için ince uçlu cımbız yardımıyla fasyayı nazikçe çıkarın. Distal tibialis anterior tendonunu ayağın üzerinde görselleştirin, ardından cımbız ucunu tendonun altından geçirerek distal tibialis anterior tendonunu ekstansör digitorum tendonundan ayırın. Cımbızı, alttaki kastan ayırmak için tibialis anteriorunun altına hafifçe kaydırın.Hafifçe yukarıda tutmak için cımbızı kasın altında tutun. Tibialis ön tendonunu kesin ve sadece diz altındaki alan yapışana kadar yavaşça yukarı doğru çekin. Daha sonra, makasla kasın kenarını takip ederek TA'yı diz altından kesin.Bir dilim mantarın üzerine az miktarda tragacanth sakızı koyun. TA'nın distal tendonunu tragacanth diş etine yerleştirin ve kasın yaklaşık 3 / 4'ünü dışarıda bırakın, kasın mantara göre dik bir pozisyonda olduğundan emin olun. Bundan sonra, bir alüminyum kutuyu izopentan ile doldurun.İzopentan kutusunu sıvı nitrojen içeren bir dewar içinde askıya alın. İzopentan uygun sıcaklığa ulaştığında, kutunun dibinde beyaz katı parçacıklar oluşur. Mantarı kaslı olarak hızla izopentan içine daldırın ve kas pozisyonunu aşağı doğru tutun.Numune yüzerken, sıvının içinde mantarın sadece arka tarafı görünmelidir. Numuneyi bir dakika izopentan içinde bırakın. Bundan sonra, kasları en az iki dakika boyunca sıvı nitrojene batırın.Ardından, numuneleri tek tek etiketli alüminyum folyoya sarın ve hemen kuru buza koyun. İşlem sırasında doğru sıcaklığın korunması ve numunenin çözülmesinin önlenmesi son derece önemlidir. Bu prosedürde, numune saplamasını, bıçağı ve numuneyi kriyostat odasına yerleştirin ve en az 30 dakika dengelenmelerini sağlayın.Daha sonra, numune saplaması üzerine az miktarda dondurma bileşiği yerleştirin ve donma bileşiği katılaşmadan önce numuneyle birlikte mantarı OCT bileşiğine daldırın. Bıçağı bıçak tutucusuna yerleştirin. Numuneyi uygun tutucusuna yerleştirin.Bölümleri 10 mikrometre kalınlığında kesin. Ardından, bölümleri polarize bir slayt üzerine yerleştirin. Bölümlere ayırdıktan sonra slaytları 80 santigrat derecede saklayın.Kimyasal bir davlumbazda, donmuş slaytları oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika boyunca bölümlerle tamamen kurutun. Ardından, slaytları bir boyama tepsisine yerleştirin. Bölümleri hematoksilen ile bir dakika boyunca boyayın.Bundan sonra, hematoksileni yıkamak için boyama oluğunu 10 dakika boyunca oldukça zayıf bir musluk suyu jeti altına koyun. Bunu takiben, bölümleri bir dakika boyunca eozin çözeltisi ile lekeleyin, ardından aşırı eozin çözeltisini ortadan kaldırmak için suyla durulayın. Daha sonra, numuneleri kademeli bir etanol serisinde %50 oranında dehidre edin, ardından %70 Daha sonra, numuneleri hızlı bir şekilde %95 etanole daldırın, ardından %100 etanolde iki değişiklik yapın.Numuneleri, her biri en az beş dakika boyunca iki ksilen değişikliğinde temizleyin. Kızakları monte etmek için, her kızağa birkaç damla ksilen bazlı montaj ortamı uygulayın ve bir kapak kızağı ile örtün. Slaytları çeker ocakta birkaç saat veya gece boyunca tutun.Burada akut iskelet kası yaralanmasının deneysel şeması gösterilmiştir. İşte yaralanmadan sonra belirtilen günlerde kardiyotoksin ile tedavi edilen kasların hematoksilen ve eozin lekeli bölümlerinin temsili resimleri. Siyah sürekli çizgi ile çevrelenmiş birkaç nekrotik lif, muhtemelen enflamatuar hücreler tarafından istila edilmiştir.Kesikli çizgi, sızan tek çekirdekli hücrelerin bir alanını işaretler. Merkezi olarak yerleştirilmiş çekirdeğe sahip tek bir olgunlaşmamış miyofiber siyah daire ile gösterilir. İşte siyah dairelerle işaretlenmiş merkezi olarak yerleştirilmiş çekirdeklere sahip büyük rejenere eozinofilik miyofiberler.Bu grafik, TA kas bölümlerindeki merkezi çekirdekli miyofiber boyut değerlerinin ortalamasını göstermektedir. Ve bu grafik, kardiyotoksin enjeksiyonundan 6, 15 ve 30 gün sonra miyofiber kesit alanı dağılımını göstermektedir. Bu prosedürü takiben, kas dokusunun spesifik özelliklerini tanımlamak için farklı histolojik ve immünofloresan protokolleri gerçekleştirmek için iskelet kası bölümleri kullanılabilir.Bu videoyu izledikten sonra, akut yaralanmayı takip eden iskelet kası rejenerasyon sürecinin farklı yönlerini nasıl araştıracağınızı iyi anlamış olmalısınız.

induction-acute-skeletal-muscle-regeneration-cardiotoxin

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Ön kompartman kasları nöromüsküler elektriksel stimülasyon bir fare modeli (NMES), güvenli ve ucuz bir klinik yöntem, anlatılmıştır. Bu modelde, farelerde ve spesifik hedef kas kontraksiyonlarının ortaya çıkarmak amacıyla, kolayca bulunabilen bir klinik cihazı değiştirerek bir avantaja sahiptir.

Nöromüsküler Elektriksel Stimülasyon tarafından Kas Eğitimi A Mürin Modeli

İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi miyojenik progenitörler, kas distrofilerini tedavi etmek için hücre tedavisi stratejileri için adaylar vaat ediyor. Bu protokol, akut ve kronik kas yenilenmesinin fare modellerinde iPSC türevi mezoangioblastların (bir tür kas progenitörleri) engraftasyonunu ve farklılaşmasını değerlendirmek için gereken transplantasyon ve fonksiyonel ölçümleri açıklar.

Kas Yenilenmesinin Fare Modellerinde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre türevi Mezoangioblast benzeri Miyojenik Progenitörlerin Nakli

Hareketsiz uydu hücrelerin saf nüfusun izolasyonu ve kültürü, kas kök hücre topluluğu, kas kök hücre biyolojisi ve rejenerasyon, hem de kas distrofisi ve diğer dejeneratif hastalıklarda tedavileri için kök hücre nakli anlaşılması için gereklidir.

Kas Uydu Hücreleri İzolasyon, Kültür ve Transplantasyon

Ekokardiyografi perkü- intramiyokardiyal enjeksiyon sıçangil kalp gen transfer ajanları veya hücre verilmesi için etkili, güvenilir ve hedeflenebilir yaklaşımı olmaktadır. Bu protokolde belirtilen adımları izleyerek, operatör hızla bu çok yönlü, minimal invaziv teknikle yetkin olabilir.

Farelerde ultrason eşliğinde transtorasik intramiyokardiyal Enjeksiyon

Peroneal sinirin uyarılmasını ve sıçan arka ayağının anterior krural kompartmanının kasılmasını takiben ayağın dorsifleksiyonunu ölçmek için bir in vivo protokol tarif ediyoruz. Bu tür ölçümler, iskelet kası patolojisini ve kas onarımı ve rejenerasyonuna yönelik doku mühendisliği yaklaşımlarını değerlendirmek için vazgeçilmez bir translasyonel araçtır.

Uygulamaları<em&gt; İn Vivo</em&gt; Doku değerlendirilmesi için Rat Tibialis Anterior Fonksiyonel Test İskelet Kası Onarım Engineered

Minimal invaziv kas katıştırma (iskelet kas dokusu içine implante zaman donör-Hücre-aracılı myogenesis kolaylaştıran myogenic hücrelerin içerir kanıtlara dayalı MIME), dediğimiz yeni bir deneysel teknik tarif bir ana bilgisayar kas.

Minimal invaziv kas (MIME) katıştırma - donör-Hücre-aracılı Myogenesis kolaylaştırmak için yeni bir deneysel teknik

Aktif otofaji, Kas Kök Hücresi (MuSC) aktivasyonu için gerekli olan üretken kas rejenerasyonu ile ilişkilidir. Burada, LC3'ün in situ tespiti için bir protokol sunuyoruz, kontrol ve yaralı farelerdeki kas dokusu bölümlerinin MyoD pozitif MuSC'lerinde bir otofaji markörü.

Otofajinin Kas Hücrelerinde Yerinde İmmunofloresan Boyanması

Bu iletişim kuralı sıçan hindlimb iskelet kas uyarımı kaynaklı uyarlamalar gözlemlemek için egzersiz kronik contractile etkinlik modeli açıklar.

Contractile fare faaliyet kaynaklı kas iskelet fenotipik uyarlamalar çalışmaya kronik stimulasyon uygulanması

İskelet kasının kardiyotoksin aracılı yaralanması ve kendi kendine teslim edilen siRNA enjeksiyonunun bir kombinasyonunu kullanarak uydu hücrelerinde belirli bir genin fonksiyonel kaybını araştırmak için in vivo yöntemini tanımlıyoruz.

İskelet Kas Rejenerasyonu Sırasında Kardiyotoksin Yaralanması ve Kendi Kendine Teslim SiRNA In Vivo Enjeksiyonu Sırasında Uydu Hücre Fonksiyonuanalizi

Bu protokol, Ding'in yuvarlanma yöntemini taklit eden, iskelet kası hasarının bir sıçan modelini oluşturan ve hasarlı dokunun patolojisini gözlemlemek için hematoksilen-eozin boyamasını ve serum hasar belirteçlerindeki değişiklikleri tespit etmek için enzime bağlı immünosorbent testini kullanan basit bir cihazı tanımlar.

Sıçanlarda Notexin Kaynaklı Kas Yaralanmasında Ding'in Rulo Yöntemini Taklit Etmek

Burada sunulan protokol, kas sapı ve progenitör hücrelerin tek hücreli kütle sitometrisi ile tanımlanmasını ve yüksek boyutlu analizini ve işlevlerinin derinlemesine incelenmesi için FACS ile saflaştırılmasını sağlar. Bu yaklaşım, hastalık modellerinde rejenerasyon dinamiklerini incelemek ve farmakolojik müdahalelerin etkinliğini test etmek için uygulanabilir.

Yüksek Boyutlu Tek Hücreli Kütle Sitometrisi ile Akut İskelet Kası Yaralanması Sırasında İn Vivo Miyojenik Progenitörlerin Tanımlanması ve Analizi

Öğrenin, kardiyotoksin enjeksiyonu ile farelerde akut iskelet kası hasarı oluşturma ve rejenerasyon sürecini inceleme yöntemini. Bu protokol yüksek tekrarlanabilirlik sağlar ve kas iyileşmesi mekanizmalarını araştırmak için güvenilir bir model sunar.

Cardiotoxin Enjeksiyonu ile Akut İskelet Kası Regeneration indüksiyon

Daha fazla video keşfet