Name: Edu Boyama tarafından Drosophila Yetişkin Yumurtalıkların Mitokondriyal DNA replikasyonu Yerinde Etiketlenmesi içinde (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Öğrenin Drosophila yetişkin yumurtalıklarında mitokondriyal DNA replikasyonunu EdU boyama ile yerinde etiketleme yöntemini. Bu teknik mitokondriyal biyogenez ve kalıtım mekanizmalarını incelemek için yapısal bütünlüğü korur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

El yazması hakkındaki yorumları için K. Delaney'e teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal, Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (NHLBI) İntramural Programı tarafından desteklenmiştir.

1. Doku Toplama ve Diseksiyon <ol><li> kuru maya içeren her flakon, kültür 10 yetişkin dişi 2-3 gün 10 erkek ile uçar. Not: besili erkek sineklerin bakımı genel kalitesini ve yumurtalık verimini artırmak ve diseksiyon kolaylaştıracaktır. </li><li> Kadın bir karbondioksit (CO 2) pad sinek uçar uyutmak. </li><li> Stereoskop altında RT ortamı bir kesme yastığı (% 10 fetal bovin serumu (FBS) ile desteklenmiş Schneider Drosophila ortamı) birkaç damla yerleştirin. canlı ve sağlıklı dokuları korumak için orta tüm diseksiyon işlemleri yürütmek. </li><li> Bir besili kadın alt toraks keskin ince burunlu forseps ile uçmak tut. Karında dokular maruz kadar sinek aşırı posterior hafifçe römorkör forseps başka bir set kullanın. Diğer dokularda (örneğin bağırsaklar) iki yumurtalıklar ayırın. Not: Her yumurtalık görüntüler oluşturma olan bir opak bir yapı16-20 ekli ovaryolden, d. </li><li> Reaktiflerin penetrasyonunu artırmak birbirinden çekerek ve birkaç kez ovaryol her arasında forseps ipuçları ileterek yumurtalıkların açın. Aşağıdaki işlemleri sırasında dokuların kaybını en aza indirmek için bir yumurtalık içinde bağlı ovaryolden tutun. </li><li> % 10 FBS ile Schneider Drosophila ortamında 500 ul ihtiva eden bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü hemen yumurtalıkların aktarın. </li><li> diseksiyon tekrarlayın ve her mikrosantrifüj tüp 10-15 yumurtalıklar toplamak. </li></ol> 2. Edu Etiketleme <ol><li> Her bir tüp içinde orta aspire ve 7 uM afidikolin ihtiva eden,% 10 FBS ile Schneider Drosophila ortamında 500 ul ile değiştirin. Not: afidikolin mtDNA çoğaltma 7, 12 etkilemeden DNA polimerazı a&#39;yı inhibe nükleer DNA sentezini engellemek için kullanılır. Afidikolin konsantrasyonunu kadar arttırmak mümkündür70 uM daha inhibisyonunu elde etmek için. DMSO içinde 3-30 mM aphidicolin stok çözeltisi en fazla 6 hafta -20 ° C&#39;de karanlıkta saklanabilir. </li><li> orta değiştirirken onlar çözümleri altındaki batırma emin olun, sağlıklı yumurtalıkların tutmak için. Adım 2.6 ile% 10 FBS ile Schneider Drosophila ortamı kullanın. </li><li> yavaşça döndürülerek bir tezgah üstü rocker oda sıcaklığında 3 saat boyunca yumurtalıkları inkübe edin. <ol><li> Ilaç tedavisi, örneğin, mitokondriyal uncoupler karbonil siyanit 4-triflorometoksi fenilhidrazon (FCCP) için, afidikolin tedaviden 2 saat sonra ortam içine ilacın uygun bir konsantrasyona (örneğin, 10 uM FCCP) ekleyin. 1 saat daha inkübe devam edin. </li></ol></li><li> veya ilaçsız orta içeren aphidicolin çıkarın. Kısaca iki kez orta yumurtalıkların (afidikolin gerekli değildir) durulayın. </li><li> 1 ml orta içeren 10 mM edu ve 7 mcM aphidicolin ekleyin ve incubatin devam2 st için oda sıcaklığında örn. -20 ° C&#39;de (DMSO içinde), 10 mM stok çözeltisi edu saklayın. </li><li> Edu ve aphidicolin içeren orta kaldırmak. 3 dakika her biri için iki kez (aphidicolin olmadan) orta ile yıkayın. </li></ol> 3. Doku Fiksasyon ve Permeabilization <ol><li> fosfat tamponlu tuzlu su (PBS, pH 7.4) içinde% 4 paraformaldehit çözeltisi hazırlayın. Not: önceden attı ampullerde saklanır ticari olarak temin edilebilen paraformaldehid kullanılmıştır. Yeni bir ampul açın ve kullanımdan önce% 4 sulandırmak. DİKKAT: Formaldehit zehirlidir; cilt ve göz koruması ile bir davlumbaz ele alınmalıdır. </li><li> yavaşça döndürülerek oda sıcaklığında 20 dakika süreyle% 4 paraformaldehid ile yumurtalıkları düzeltildi. </li><li> Fiksatif çıkarın ve 5 dakika, her seferinde, PBS içinde% 3 BSA, 1 ml iki kez yumurtalık yıkayın. </li><li> dokuların geçirgenliği, yıkama solüsyonu çıkarın ve PBS içinde% 0.5 Triton X-100 1 ml. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> permeabilizasyon çözeltisini çıkarın ve 1 ml iki kez yıkayınPBS içinde% 3 BSA. </li></ol> 4. Edu Algılama Not: edu algılama &quot;klik&quot; kimyası dayanan, bir Cu (I) &#39;in edu terminal alkin grubu flüoresan azidler ekler [3 + 2] siklo-13, paladyum, ve flüoresan molekülü daha sonra tespit edilebilmesi tabi tutulur. Kolayca katalitik olmayan Cu (II) türüne oksitlenir Cu (I), bu yana, reaksiyonu katalize etmek için gerekli olan, Cu (I) &#39;in elde edilmesi için in situ Cu (II) sülfat azaltılması önerilir. Bu Cu (II) sülfat, örneğin askorbik asit (bundan sonra &quot;katkı maddesi&quot; tampon) bakır oluşturmak için (I) &#39;in bir indirgeyici varlığında kullanılır vardır. <ol><li> Deneyden önce, (Alexa Fluor 488 azid, Alexa Fluor &quot;dye azid&quot; ahiret olarak adlandırılan tercih fluorofor bağlı olarak 555 azid veya başkaları,), Edu reaksiyon tamponu ve edu tampon katkı Alexa Fluor azidin çalışma çözeltisi hazırlamak üreticinin uyguntalimatlar. <ol><li> 70 ul DMSO içinde boya azid sulandırın. 1 yıla kadar -20 ° C de çalışan bir çözüm saklayın. </li><li> deiyonize su ile 10x edu reaksiyon tamponu sulandırarak taze edu reaksiyon tamponu hazırlayın. NOT: sonra, 4 ° C &#39;de kalan 1x çözelti saklayın. 1x çözeltisi en fazla 6 ay süreyle stabildir. </li><li> Tamamen su deiyonize 2 ml tozu eriterek edu tampon katkı 10x stok solüsyonu olun. Not: Bu stok çözeltisi, 1 yıla kadar -20 ° C&#39;de stabildir. Çözelti kahverengi bir renk oluşursa, o bozulmuş ve atılmalıdır. </li></ol></li><li> Taze her zaman edu reaksiyon kokteyl hazırlayın ve hazırlık 15 dakika içinde kullanın. tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için, reaksiyon bileşenleri aynı oranda muhafaza emin olun. <ol><li> Taze 1x edu deiyonize su içinde (adım 4.1.3 hazırlandı) 10x stok çözeltisi 1:10 oranında seyreltilmesiyle ilave çözelti tampon sağlayın. Bu s kullanınAynı gün ların çözüme. </li><li> Amacıyla aşağıdaki bileşenlerin bir araya EGT Reaksiyon kokteyli 1 ml hazırlayın: 860 ul 1x edu reaksiyon tamponu, 40 ul CuSO 4, 2.5 ul boya azid, 100 ul 1 x edu tamponu katkı maddesi. Not: maddeler en iyi performansı sağlamak için ilave edilir önemlidir. </li></ol></li><li> % 3 BSA ile PBS çıkarın ve her bir tüpe edu Reaksiyon kokteyl 0.5 ilave edin. yavaşça döndürülerek oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. ışıktan koruyarak örnekleri tutun. </li><li> Edu Reaksiyon kokteyl çıkarın ve PBS içinde% 3 BSA, 1 ml ile bir kez yıkanır. </li><li> 1 ml PBS ile bir kez numune yıkanır. </li></ol> 5. Antikor etiketleme Not: Edu boyamadan sonra antikor etiketleme yapın. hiçbir ek boyama isteniyorsa, biri doğrudan montaj ve görüntüleme geçebilirsiniz. Örnekler tüm işlemler ve ışıktan korunması önemlidir. <ol><li> yıkama solüsyonu çıkarın. 30 dakika boyunca PBS içinde% 0.2 BSA ve% 0.1 Triton X-100 ihtiva eden bloke çözeltisi 1 ml yumurtalık bloke eder. </li><li> Engelleme çözüm çıkarın ve çözümü engelleme seyreltilmiş primer antikor (antikor α örneğin, fare ATP sentaz alt birimi, 1: 1000 seyreltme) ile değiştirin. 4 ° CO / N karanlıkta inkübe edin. </li><li> Çözelti 3 kere 10 dakika her bloke 1 ml numune yıkanır. arka plan en aza indirmek için, 30 dakika her biri için iki kez daha yıkanır. Engelleme çözüm çıkarın. </li><li> Oda sıcaklığında 2 saat boyunca (200 seyreltme, örneğin, keçi anti-fare Alexa Fluor 568 ikincil antikor, 1) çözeltisi engelleme seyreltilmiş sekonder antikor ile inkübe edin. Not: Edu bağlanmış olandan farklı bir renk kullanın. </li><li> Adım 5.3 gerçekleştirilen yıkama adımları tekrarlayın. </li><li> 1 ml PBS ile durulayın kez deterjanı çıkarmak için. </li></ol> 6. Montaj ve Görüntüleme <ol><li> Dikkatlice PBS ve imm kaldırmakediately 50 ul (veya DAPI olmadan) orta montaj yumurtalıkların kapsamaktadır. Not: ovaryolden birbirinden ayrılır ise sertleşme olmayan bir montaj ortamı kullanın. Yumurtalıklar bir hafta kadar 4 ° C &#39;de, montaj ortamında saklanabilir. </li><li> Bir pipet ucunu kesin ve bir mikroskop lamı üzerine dikkatlice yumurtalıkların aktarmak için kullanabilirsiniz. </li><li> stereomicroscope altında keskin ince burunlu forseps ile tamamen ayrı her ovaryol. arka ucunda ve sahne 14 veya olgun yumurta odalarındaki bağlantı dokuları çıkarın. Genç yumurta odaları ön ucunda ve şeffaf altındadır. </li><li> birbirleri ile örtüşmeyen böylece forseps ile yumurta odaları aynı hizaya getirin. </li><li> Yavaşça numune üstünde # 1.5 cam lamel indirin. montaj orta oda sıcaklığında birkaç saat boyunca polimerize olmaya bırakın. şeffaf tırnak cilası ile mühür. </li><li> Görüntü görüntüleme öncesinde 4 ° C&#39;de ertesi gün, ya da mağaza slaytlar. </li><li> Konfokal mi altında görselleştirmekBir 63X yağ daldırma amacı ile croscope. üç boyutlu z yığınlarının görüntüler çekin. Not: Edu epitel kılıf daha sonra aşamalı yumurta odaları ve arka plan floresan in sinyal güçlü vardır. Belirli bir germarium Edu etiketleme incelerken, bir tarafından üst üste ya da diğer dokularda veya daha sonra aşamalı yumurta odalarına yakın olan germariums kaçınmalısınız. </li></ol>

<ol><li>Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+mutations+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA mutations in human disease.</a> Nat Rev Genet. 6 (5), 389-402 (2005).</li>
<li>Wallace, D. C., Chalkia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+genetics+and+the+heteroplasmy+conundrum+in+evolution+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA genetics and the heteroplasmy conundrum in evolution and disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (11), a021220(2013).</li>
<li>Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpradling%2C+AC+%22The+development+of+Drosophila+melanogaster%22">The development of Drosophila melanogaster</a>. , Cold Spring Harbor Lab. Press. (1993).</li>
<li>Riechmann, V., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axis+formation+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Axis formation during Drosophila oogenesis.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 374-383 (2001).</li>
<li>Lin, H., Yue, L., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+fusome%2C+a+germline-specific+organelle%2C+contains+membrane+skeletal+proteins+and+functions+in+cyst+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Drosophila fusome, a germline-specific organelle, contains membrane skeletal proteins and functions in cyst formation.</a> Development. 120 (4), 947-956 (1994).</li>
<li>Cox, R. T., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Balbiani+body+and+the+fusome+mediate+mitochondrial+inheritance+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A Balbiani body and the fusome mediate mitochondrial inheritance during Drosophila oogenesis.</a> Development. 130 (8), 1579-1590 (2003).</li>
<li>Davis, A. F., Clayton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+localization+of+mitochondrial+DNA+replication+in+intact+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ localization of mitochondrial DNA replication in intact mammalian cells.</a> J Cell Biol. 135 (4), 883-893 (1996).</li>
<li>Iborra, F. J., Kimura, H., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+organization+of+mitochondrial+genomes+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">The functional organization of mitochondrial genomes in human cells.</a> BMC Biol. 2, (2004).</li>
<li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+adult+primate+neocortex%3A+an+evaluation+of+the+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in adult primate neocortex: an evaluation of the evidence.</a> Nat Rev Neurosci. 3 (1), 65-71 (2002).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li>
<li>Hill, J. H., Chen, Z., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+propagation+of+functional+mitochondrial+DNA+during+oogenesis+restricts+the+transmission+of+a+deleterious+mitochondrial+variant%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Selective propagation of functional mitochondrial DNA during oogenesis restricts the transmission of a deleterious mitochondrial variant.</a> Nat Genet. 46 (4), 389-392 (2014).</li>
<li>Lentz, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+%28mtDNA%29+Biogenesis%3A+Visualization+and+Duel+Incorporation+of+BrdU+and+EdU+Into+Newly+Synthesized+mtDNA+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).</li>
<li>Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidotriazoles+on+solid+phase%3A+%5B1%2C2%2C3%5D-triazoles+by+regiospecific+copper%28i%29-catalyzed+1%2C3-dipolar+cycloadditions+of+terminal+alkynes+to+azides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides.</a> J Org Chem. 67 (9), 3057-3064 (2002).</li>
<li>Horwitz, H. B., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+inhibition+by+ethidium+bromide+of+mitochondrial+DNA+synthesis+in+physarum+polycephalum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific inhibition by ethidium bromide of mitochondrial DNA synthesis in physarum polycephalum.</a> J. Cell Biol. 49, 546-553 (1971).</li>
<li>Huberman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+views+of+the+biochemistry+of+eucaryotic+DNA+replication+revealed+by+aphidicolin%2C+an+unusual+inhibitor+of+DNA+polymerase+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">New views of the biochemistry of eucaryotic DNA replication revealed by aphidicolin, an unusual inhibitor of DNA polymerase alpha.</a> Cell. 23 (3), 647-648 (1981).</li>
<li>McClung, C., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+behavioral+responses+to+free-base+cocaine+and+the+development+of+behavioral+sensitization+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Stereotypic behavioral responses to free-base cocaine and the development of behavioral sensitization in Drosophila.</a> Curr Biol. 8 (2), 109-112 (1998).</li>
<li>Moore, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+intoxication+in+Drosophila%3A+Genetic+and+pharmacological+evidence+for+regulation+by+the+cAMP+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway.</a> Cell. 93 (6), 997-1007 (1998).</li>
<li>Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-aminobutyric+acid+B+receptor+1+mediates+behavior-impairing+actions+of+alcohol+in+Drosophila%3A+adult+RNA+interference+and+pharmacological+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Gamma-aminobutyric acid B receptor 1 mediates behavior-impairing actions of alcohol in Drosophila: adult RNA interference and pharmacological evidence.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5485-5490 (2003).</li>
<li>Koch, E. A., Spitzer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+effects+of+colchicine+on+oogenesis+in+Drosophila%3A+induced+sterility+and+switch+of+potential+oocyte+to+nurse-cell+developmental+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Multiple effects of colchicine on oogenesis in Drosophila: induced sterility and switch of potential oocyte to nurse-cell developmental pathway.</a> Cell Tissue Res. 228 (1), 21-32 (1983).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Edu markalama yeni sentezlenmiş DNA içine dahil edilmek ve nükleosid analoglarının boyama dayanır çoğalan hücrelere DNA sentezini algılamak için yeni ve etkili bir yöntemdir. Bu yöntem daha hızlı ve çok hassas olduğu BrdU etiketleme yöntemine göre daha üstündür. Daha da önemlisi, 10. Tarihsel olarak, BrdU etiketleme üstün bir alternatif olarak, Edu etiketleme S-fazında nükleer DNA replikasyonu çalışmak için kullanılan, dokular 9-montaj tüm iyi yapısal korunması ve verimli Edu-boya penetrasyonu sağlar Hücre döngüsü. Afidikolin S-fazı 12 ila 15 nükleer DNA replikasyonu için başlıca polimerazdır DNA polimeraz a bir inhibitörüdür. mtDNA çoğaltma tedavi afidikolin hassas olmayan bir DNA polimeraz y, ile gerçekleştirilir. Bu nedenle, öncesinde ve edu inkübasyon sırasında aphidicolin tedavisi önemli ölçüde nükleer DNA&#39;ya edu birleşmesini engellemiştir. Olması gerekiyoruygun depolanmış, ve nükleer DNA replikasyonunu inhibe aphidicolin etkinliği bizim elimizde değişken ise afidikolin birkaç hafta stabil olabilir unutulmamalıdır. Daha fazla veri analizleri gelen güçlü nükleer DNA etiketleme ile ovaryolden veya yumurta odaları ekarte edilmelidir. mtDNA çoğaltma hali hazırda, aynı zamanda sitoplazma toplam hacmine normalize edu puncta sayısını sayarak mtDNA çoğaltma seviyesini ölçmek için basit bir şekilde elde edilir sitoplazmasmda puncta olarak görselleştirilebilir. Görüntüleme yazılımı otomatik olarak büyük veri kümelerinin hesaplama analizler için özellikle yararlıdır mikroskobik görüntüleri, Edu puncta tanımlamak için uygulanabilir. Nükleer DNA replikasyonu eksik inhibisyonu kromozomu üzerindeki farklı loci Edu dahil yol ve çekirdeğin içinde puncta olarak görüntüleyebilir Ancak, önlemler, önlemler alınmalıdır. Ayrıca diğer durumlarda, Edu yoğunluğu repli katılmadanArka plan ve gürültü yüksek olabilir iken cating mtDNA, zayıf olabilir. Bu nedenle, otomatik görüntü analizleri için, bireysel parametrelerin dikkatle tanımlanmalıdır. Ayrıca görüntülerin doğru edu puncta tanımlanır emin olmak için eğitimli gözlerle ele alınması gerektiğini tavsiye edilir. Drosophila oogenez sırasında yeni sentezlenmiş mtDNA Görselleştirme mtDNA çoğaltma farmakolojik veya genetik düzensizliklerin çeşitli maruz sinekler deneyi yaparak, fizyolojik veya patolojik koşullar altında düzenlenir nasıl araştırmak için bir fırsat sağlar. Col T300I 11: Daha önceki bir çalışmada, Edu birleşme deneyi bir mtDNA mutant Drosophila mt gerçekleştirildi. Ayrıca, mitokondriyal membran potansiyelini bozmaya, yumurtalık mitokondriyal uncoupler FCCP ya da 2,4-dinitrofenol (DNP) Önceki EDU&#39;ya dahil çeşitli konsantrasyonları ile muamele edildi. deneysel amaçlarla bağlıve ilaç özellikleri, farklı yöntemler etkin verilme için kabul edilebilir. Yetişkin sinekler, ilaç bir buhar (örn, etanol ve kokain) halinde sunulabilir 16,17 ya da ilaçlar hızlı bir şekilde gövde 18 boyunca yayılır karın içine enjekte edilebilir. En yaygın uygulama ilaçlar sinek yiyecek ya da sakaroz / ilaç doymuş filtre kağıdı eklenir olmasıdır. Örneğin, mikrotübül montaj, kolşisin önleyicisi, yumurtalık diseksiyon 19 önce 2-3 gün sinekler beslenmiştir. Bu nedenle, ilaç dağıtım yöntemini değerlendirmek ve uygun konsantrasyonları seçmek önemlidir. Drosophila yumurtalıklarda mtDNA çoğaltma başarılı görüntüleme sağlamak için, birkaç kritik adımlar dikkatle yürütülmelidir. En önemlisi, diseksiyon ve edu kuruluş sırasında yumurtalıkların canlılığını ve sağlığını korumak esastır (Adım 1 ve 2). FBS ile Schneider Drosophila ortamı oda sıcaklığına ısıtıldı gerekenkullanmadan önce. Bir yumurta odaları ve kesme aletleri veya pipet uçları arasında doğrudan teması en aza indirmek gerekir. Yumurtalıklar dehidratasyonu önlemek için çözümleri altındaki tüm kere dalmış olmalıdır. dokular kolaylıkla yol açabilir ilgilenmedikleri soluk veya floresan sinyalleri. Doku montaj aşaması sırasında, ovaryolden birbirinden ayrılmalıdır ve bir mikroskop lamı üzerine yayılır. Yumurta odasının her biri üst üste yığılırlar ve emin olun. Biz sahnede 14 ötesine yumurta odaları küçük edu dahil edilmesini gösterdiğini fark ettim. Buna ek olarak, çünkü büyük boyutlu, geç dönem yumurta odaları sık sık komşu genç yumurta odaları odak dışına çıkmasına neden. Böylece geç dönem yumurta odaları atılmalıdır tavsiye edilir. Burada Drosophila yetişkin yumurtalıklarda mtDNA kopyalayan etiketleme için ayrıntılı bir protokol sağlar. Bu yöntem çeşitli genetik ve farmakolojik perturbations altında mtDNA çoğaltma basit ölçümü için izin verir,ve gelişimsel mitokondriyal biyogenezi ve mtDNA miras yatan mekanizmaları diseksiyon için yararlı olacaktır.

Nükleer genomu yanı sıra, her ökaryotik hücre de mitokondrial matriks küçük dairesel DNA kopya binlerce içerir. Mitokondriyal DNA (mtDNA) elektron taşıma zincirinin temel alt birimleri kodlar da, çoğaltma ve mtDNA&#39;nın transkripsiyonu için tüm faktörler de dahil olmak üzere mitokondriyal proteom çoğunluğu, nükleer genom tarafından kodlanır. kalıtım Mendel yasaları takip nükleer genom aksine, hayvan mitokondriyal genom anne soyu ile münhasıran kalıtsaldır. Bu nedenle, mtDNA çoğaldı ve kadın oosit yoluyla bir nesilden nasıl iletildiğini anlamak temelde önemlidir. Ancak, mtDNA çoğaltma kadın germline düzenlenmiştir nasıl üzerinde devam eden tartışmalar vardır. Ayrıca, mtDNA iletimi için yaygın olarak kabul mtDNA darboğaz teorisi primordial germ hücrelerinden mtDNA&#39;nın nüfus nispeten az sayıda durin için alt örneklendirilmiştir olduğunu göstermektedirg geliştirme 1 2. Ayrıca mtDNA çoğaltma geçici ve oogenez boyunca uzaysal olarak düzenlenmiş olduğunu ima eder. Bu nedenle, tohum çizgisi gelişimi sırasında mtDNA replikasyon yerinde tespit mtDNA miras mekanizmasının anlaşılması kolaylaştıracaktır. Drosophila oogenesis mtDNA çoğaltma ve iletim incelemek için bir genetik uysal bir sistem sağlar. İki Drosophila yumurtalıkların her birinde, yumurta üretiminin işlevsel birimler olan ovaryolden 3 olarak adlandırılan yumurta odaları 16-20 bağımsız dizeleri, (Şekil 1A bakınız) vardır. Her bir ovaryol ön uç germarium denilen bir yapı oluşur oogenez, ilerici bir doğrusal organizasyonunu içerir. germarium daha farklı gelişim aşamalarında germ hücreleri içeren dört bölgeye ayrılmıştır. Bölgede 1, germ kök hücreler c olarak bilinen kızı hücreleri üretmek için asimetrik bölünme yoluyla gitmekystoblasts. Bölge 2a nihai bölünme tamamlayan cystoblasts içerir. Cystoblasts bölümü üreten 16-hücre gruplarının dört mermi uğrarlar. 16 hücreleri halka kanalları denilen sitoplazmik köprülerle birbirine bağlı kalır. Diğer 15 polyploid hemşire hücreler olarak geliştirmek ise sadece hücre biri, oosit olarak farklılaşma taahhüt eder. Fusome olarak bilinen önemli bir sitoplazmik yapısı, halka kanalların oluşumu ile kolaylaştırmak kist polarite ve hemşire hücre oosit etkileşimleri 4,5 belirlemek için önerilmektedir. kistler bölge 2b doğru ilerlerken, kist yapıları germarium tüm genişliği boyunca ve daha folikül hücreleri ile ilişkili hale gelir. germarium yapıları ilk tomurcuklanan yumurta odasını içeren bölge 3 ile sona erer. Daha sonra, yumurta odaları 14 morfolojik farklı aşamalarında ovaryol yoluyla ilerleme germarium, arka ucunda monte edilir. oosit büyüme, WH hemşire hücreleri bağlıdırich taşıyıcı proteinler, mRNA ve oosit içine halka kanallarla hücreiçi yapılar (örneğin, Golgi). Drosophila oogenez sırasında, her 16 hücre kist içinde mitokondri bir kısmı fusome ile ilişkili olduğu tespit edilmiştir, halka kanallarından taşındı ve Balbiani gövdesi 6 olarak adlandırılan büyük bir kitle tek oosit içine teslim edildi. Bu olgu kadın yumurtalıkların yoluyla mitokondriyal kalıtım kalite kontrolüne katkıda önerilmiştir. mtDNA sentezi algılama hücresel DNA&#39;ya işaretli DNA öncülerinin dahil dayanır. Geleneksel olarak, timidin, 5-bromo-2&#39;-deoksiüridin bir nükleosit analoğunun (BrdU), doku kültürü hücreleri 7,8 mtDNA çoğaltma etiketlemek için kullanıldı. Ancak, antikor bazlı BrdU etiketleme özellikle tüm montaj doku boyama, çeşitli sınırlamalar sergiler. BrdU etiketleme bir büyük dezavantajı ortaya çıkarmak için, DNA denatürasyon gerektirmesidirBrdU epitopu, anti-BrdU antikoru ile tespit edilebilir, böylece. Numune, numune yapısını bozar ve boyamanın ardından, Yöntem 9 karmaşıklaştırır gibi kimyasal maddeler (örneğin, hidroklorik asit ya da metanol ve asetik asit karışımı) DNaz ile, ısı ya da sindirim gibi sert denatüre edici şartlar altında muamele edilecek olan 10. Burada, alternatif bir timidin analog 5-etinil-2&#39;-deoksiüridin (edu), Drosophila ergin yumurtalıklarda replike mitokondriyal DNA etiketlemek için kullanılır. Bu yöntem daha hızlı ve son derece hassastır. Edu hali hazırda DNA replikasyonu sırasında hücresel DNA&#39;ya dahil edilir. Aşağıdaki algılama bir &quot;klik&quot; reaksiyona dayanır, bir Cu (I) &#39;e, terminal alkin grubu ve bir flüoresan azid 10 ile kovalent reaksiyona, paladyum. Reaksiyon numunenin denatürasyon gerektirmez, çünkü iyi yapısal koruma sağlar. Boya a Ayrıca, boyutzide yalnızca 1/500 tüm montaj dokuların hızlı ve etkili nüfuz eder ve bir antikor molekülünün 10, bu göstermektedir. Biz Drosophila oogenez sırasında mtDNA çoğaltma tespit etmek için bu yöntem kullanılır ve bir çoğaltma bağımlı mtDNA&#39;sının seçici kalıtım mekanizması önermektir bize yol Drosophila yumurtalık 11 germarium bölgede çarpıcı bir mekansal desen, bulduk. Biz burada Drosophila yumurtalıklarda mtDNA çoğaltma edu etiketlenmesi konusunda ayrıntılı bir protokol mevcut. (: Col T300I mt) 11, yanı sıra potansiyel mitokondriyal membran dağıtmak ve potansiyel mtDNA çoğaltma bozmak mitokondriyal eşleşmeyenler, farklı tedavi protokolünün uygulanmasını göstermek için, biz de mtDNA bir mtDNA mutant Drosophila çoğaltma test edilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Schneider' s Drosophila orta</td><td>Invitrogen</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10100-147</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5 Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Aphidicolin</td><td>Sigma</td><td>A0781</td><td>Aliquot DMSO'da çözündükten sonra. Tekrarlayan çözdürme ve dondurmadan kaçının. Işıktan koruyun. Çözündükten sonra 6 hafta içinde kullanılabilir.</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit, %16 EM dereceli</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15710</td><td>Formaldehit toksiktir; cilt ve göz koruması olan bir çeker ocakta kullanılmalıdır.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3190</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Görüntüleme Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>C10337</td><td>EdU, CuSO4, Alexa Fluor 488 azid, EdU reaksiyon tamponu ve Edu tampon katkı maddesi dahildir</td></tr><tr><td>Fare ATP sentaz alt birimi ve alfa; antikor, (15H4C4)</td><td>MitoSciences</td><td>Ab14748</td><td>1:1.000 seyreltme</td></tr><tr><td>Fare Hts antikoru (klon RC)</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası (DSHB)</td><td>hts RC</td><td>1:1.000 seyreltme</td></tr><tr><td>Keçi anti-fare Alexa Fluor 568 ikincil antikor</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td>1:200 seyreltme</td></tr><tr>DAPI <td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td>ile<td>Vectashield montaj ortamı</td></tr><tr><td>Cam lameller, #1.5 22 mm x 22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-B</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop lamı</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-103</td><td></td></tr><tr><td>Oje</td><td>Elf</td><td></td><td>Ojelerde kullanılan pigmentlerin çoğu floresandır ve numunelere sızar. Sadece şeffaf oje kullanılmalıdır.</td></tr></tbody></table>

edu boyama tarafından drosophila yetişkin yumurtalıkların mitokondriyal dna replikasyonu yerinde etiketlenmesi içinde

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Mitokondriyal genom, yalnızca anne hattı yoluyla kalıtılır. Mitokondrinin ve genomunun nasıl çoğaldığını ve dişi oosit yoluyla bir nesilden diğerine nasıl aktarıldığını anlamak temel öneme sahiptir. Genetik izlenebilirlik ve oosit gelişiminin ilerlediği zarif, düzenli basitlik nedeniyle, Drosophila oogenezi mitokondriyal çalışma için paha biçilmez bir sistem haline gelmiştir. Drosophila yumurtalıklarında mitokondriyal DNA (mtDNA) replikasyonunu tespit etmek için bir EdU (5-etinil-2'-deoksiuridin) etiketleme yöntemi kullanıldı. Bu yöntem, BrdU (5-bromo-2'-deoksiuridin) etiketleme yönteminden daha üstündür, çünkü iyi yapısal korumaya ve tüm montajlı dokuların verimli floresan boya penetrasyonuna izin verir.
Burada, Drosophila yetişkin yumurtalıklarında replike mitokondriyal DNA'yı EdU ile etiketlemek için ayrıntılı bir protokolü açıklıyoruz. Yumurtalıkların canlılığını artırmak, hazırlık sırasında sağlıklarını korumak ve yüksek kaliteli görüntüleme sağlamak için bazı teknik çözümler sunulmaktadır. Yumurtalıklarda yeni sentezlenen mtDNA'nın görselleştirilmesi, yalnızca oogenez yoluyla mtDNA replikasyonunun çarpıcı zamansal ve mekansal modelini ortaya çıkarmakla kalmaz, aynı zamanda çeşitli genetik ve farmakolojik bozulmalar altında mtDNA replikasyonunun basit bir şekilde ölçülmesine de izin verir.

Yukarıdaki protokol Drosophila oogenez sırasında mitokondrial DNA replikasyonu göstermektedir mitokondri (Şekil 1B-C) ile ilişkili noktalı yapıların, görselleştirme sağlar. ATP sentaz alfa alt birimi (Şekil 2) için boyama ile işaretlenmiş mitokondri ile lokalize edu puncta. Gözlenen işaretler doğrulama, etidyum bromid 11 mtDNA çoğaltma 14 inhibitörü ile muamele edilmiş yumurtalıklarda mevcut olduğu bu puncta mtDNA.Aphidicolin mtDNA çoğaltma (Şekil 2) etkilemeden nükleer DNA boyama inhibe etmek için kullanılmıştır kopyalayan Gerçekten etiketi. Afidikolin tedavi olmadan, yoğun edu sinyalleri çekirdekleri etiket ve mtDNA puncta zorlukla (Şekil 3) tespit edildi. Bununla birlikte, aphidicolin mevcudiyetinde, nükleer dahil önemli ölçüde azalmıştır ve mitokondri ile ilgili birçok puncta gözlenmiştir. (Şekil 1B) mtDNA çoğaltma yüksek düzeyde bulunmaktadır. Bununla birlikte, özellikle, mtDNA çoğaltma germarium bir uzamsal desen görüntülenir. Edu puncta sayısı ile belirtildiği gibi orada germarium bölgesinde 1 mtDNA replikasyon orta düzeyde olan, ancak neredeyse bölgesi 2A&#39;da Resim edu dahil (Şekil 1C). Kist germarium bölge 2B aşağı hareket ettikçe, mtDNA çoğaltma devam ve bölge 2B arka kist edu puncta sayısı bölgesi 2A (Şekil 1C) içinde çok daha yüksek oldu. hu li tai Shao (HTS) proteini ile boyanmış Spesifik olarak, yoğun edu şirketleşme, halka kanalları ve fusome yapıların çevresinde yoğunlaştırıldı. mtDNA germarium bölgesinde 3&#39;te yüksek bir seviyede replike tutulur (Şekil 1C) Belir arasındaki ilişkiyi göstermek içinIC genler veya mitokondriyal DNA çoğalması ile muamele Drosophila yumurtalıkları gen manipülasyonu ya da ilaç tedavisi için tabi tutulabilir. Biz FCCP mitokondriyal membran potansiyelini dağıtır klasik mitokondriyal protonophore, farklı konsantrasyonları ile yumurtalıkları işlemden geçirildi. Bir kontrol olarak, DMSO mtDNA çoğaltma (Şekil 4A) üzerinde herhangi bir etki. FCCP yüksek dozda (10 uM) hemen hemen tamamen germarium (Şekil 4D) boyunca mtDNA çoğaltma tükenmiş. Bununla birlikte, FCCP (2 veya 5 mcM) alt konsantrasyon bölgeleri 2B ve 3 mitokondriyal bozulma karşı daha duyarlıdır düşündüren, bölgeler 2B ve 3 (Şekil 4B-C) bir bölgede 1 mtDNA çoğaltma küçük bir etkisi ama inhibe çoğaltma vardı, ya da onlar göreceli yavaş çoğaltma kinetiği korumak. Yukarıdaki sonuçlar, mitokondriyal DNA replikasyon mitokondriyal aktivite ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Özellikle germarium farklı bölgelerinde mitokondriyal imp farklı cevapairment. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54516/54516fig1.jpg" /> Şekil 1. mtDNA Drosophila oogenez sırasında çoğaltma. Bir Drosophila ovaryol (A) Diyagram ve germarium büyütülmüş görünümü. Yumurta odaları, ardışık gelişim aşamalarını posterior doğru, anterior soldan ovaryol göstermektedir. germarium olarak, fusome (kırmızı), germ kök hücreler (mavi), mitokondri (yeşil), (konumlandırma, fusome yapısı ve mitokondriyal kümeleri tarafından tanınan kırık çizgi) gelecek oosit, kistler (şeftali) ve dört gelişim bölgeleri gelişmekte gösterilir . (B) HTS-RC, kanaldan ve fusome için bir marker karşı vahşi tip edu etiketli ovaryol antikorun Örnek z yığın projeksiyon. aphidicolin varlığında, Edu mtDNA (ok başları) ve çekirdekler (oklar) dahil edildi. Ölçek çubuğu, 10 mikron.(C) B kutulu bölgede özetlenen germaria arasında Büyütülmüş görünüm. Dört gelişim bölgeleri gösterilir. Ölçek çubuğu, 5 mikron 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54516/54516fig2.jpg" /> Afidikolin tedavi ile edu dahil tarafından görüntülendi Drosophila germarium Şekil 2. mtDNA çoğaltma (A) -. (D) edu dahil edilmesini gösteren bir vahşi tip germarium Temsilcisi konfokal bölümü (yeşil, b) mitokondri, ATP Sentaz alfa alt birimi boyama ile işaretlenmiş DNA polimeraz-α inhibitörü aphidicolin ile ön inkübasyon DAPI lekelemesi (mavi, D) ile etiketlenmiş (kırmızı, C) ve çekirdekler. (A39. ;-D &#39;)&#39; de kutulu alanın büyütülmüş bir fotoğraf (A) edu birleşmesini (B gösteren &#39;), mitokondri (C&#39;) ve çekirdekler (D &#39;). aphidicolin varlığında, nükleer birleşme (oklar) azalır ve birçok puncta mitokondri (ok başları) içinde lokalize edildi. Ölçek çubukları, 10 um. Şekil 11&#39;den modifiye edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54516/54516fig3.jpg" /> Şekil 3. mtDNA çoğaltma ancak afidikolin muamelesi olmadan Drosophila germarium tespit edilir (A) -. (D) edu birleşme (yeşil) gösteren bir vahşi tip germarium temsili konfokal bölümü, mitokondri, işaretlenmişDNA polimeraz-α inhibitörü aphidicolin yokluğunda DAPI boyama (mavi) ile etiketlenmiş ATP Sentaz alfa alt birimi boyama (kırmızı) ve çekirdekler. (A&#39;-D &#39;) büyütülmüş (A) kutulu alanın görüntü edu birleşme (B gösteren&#39;), mitokondri (C &#39;) ve çekirdekler (D&#39;). aphidicolin olmadan, yoğun edu sinyalleri etiket çekirdekleri (oklar) ve mtDNA puncta zorlukla tespit edildi. Ölçek çubukları, 10 um. Şekil 11&#39;den modifiye edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54516/54516fig4.jpg" /> Şekil 4. Mitokondriyal uncoupler mtDNA çoğaltma bozar. Yabani tip germarium gösteren Temsilcisi z yığın projeleri DMSO ile tedavi(A) ya da 2 uM (B), 5 uM (C), edu birleştirme esnasında 10 uM (D) konsantrasyonlarda mitokondriyal uncoupler FCCP. 2 uM FCCP (B) ile muamele edilmiş bölüm 2b bozulmuş edu etiketleme Not ve bölgesi 2B ve 5 uM FCCP ile işlemden geçirildi, 3, hem de (kutular belirtilen). Dört gelişim bölgeleri gösterilmektedir. Oklar, nükleer DNA; ok uçları, mtDNA. Ölçek çubuğu, 10 mikron. Şekil 11&#39;den modifiye edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Drosophila oogenezi, mitokondriyal proliferasyon ve kalıtım çalışmalarında son derece yararlı olmaya devam ediyor. Bu el yazması, Drosophila yetişkin yumurtalıklarındaki replikasyon yapan mitokondriyal DNA'yı (mtDNA) 5-etinil-2'-deoksiüridin (EdU) ile etiketlemek için kullanılan ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır, bu da daha önce tartışmalı olan mitokondriyal kalıtımla ilişkili mekanizmaların ortaya çıkarılmasını kolaylaştırmaktadır.

Edu Boyama tarafından Drosophila Yetişkin Yumurtalıkların Mitokondriyal DNA replikasyonu Yerinde Etiketlenmesi içinde

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Bu deneyin genel amacı, EdU Boyama yoluyla drosophila yetişkin yumurtalıklarındaki mitokondriyal DNA replikasyonunu işaretlemektir. Bu yöntem, mitokondriyal biyogenez süreci ve gelişim sırasında mitokondriyal DNA kalıtımı gibi mitokondriyal alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bütün haldeki bağlı dokularda iyi yapı korunumu ve etkili floresan boya penetrasyonu sağlamasıdır.Deneye başlamak için, kuru maya içeren drosophila besiyerine sahip bir tüp alın ve 10 yetişkin dişi sinek ile 10 yetişkin erkek sineği 25 °C'de iki ila üç gün boyunca kültüre edin. İnkübasyon boyunca sineklerin iyi beslendiğinden emin olun. Sinekleri bir karbondioksit sinek pedi üzerinde anestezi altına alın ve bir resim fırçası ile dişi sinekleri seçin.%10 FBS ile desteklenmiş, oda sıcaklığındaki drosophila besiyerinden birkaç damlayı bir diseksiyon pedine ekleyin ve pedi bir stereo mikroskobun altına yerleştirin. Sivri uçlu ince cımbızlar kullanarak, şişman bir dişi sineği alt toraks kısmından tutun. Tüm dokular besiyerinin içinde kalacak şekilde, ikinci bir cımbız yardımıyla, abdomen dokuları açığa çıkana kadar sineğin en arka kısmından nazikçe çekin.Ardından, iki overi çevreleyen bağırsaktan ve yabancı dokulardan ayırın. Overleri nazikçe çekerek açın ve ovariolleri açığa çıkarın. Reaktiflerin nüfuz etmesini kolaylaştırmak için pensetin uçlarını her bir ovariolün arasından birkaç kez geçirin.Son olarak, yumurtalıkları %10 FBS içeren 500 µL temiz drosophila medyumu bulunan 1,5 ml'lik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. İstenilen miktarda yumurtalık toplamak için diseksiyon işlemini tekrarlayın ve her bir mikro santrifüj tüpüne 10 ila 15 adet yerleştirin. Etiketlemeye başlamak için, dokunun işlem boyunca çözelti altında kalmasını sağlayarak, yumurtalıkların bulunduğu tüplerdeki medyumu aspire edin ve yerine nükleer DNA sentezini engelleyen bir ajan olan 7 µM aphidicolin içeren 500 µL medyum ekleyin.Overleri, oda sıcaklığında bir bench top rocker üzerinde nazik rotasyonla üç saat boyunca inkübe edin. İlaç uygulaması isteniyorsa, iki saatlik inkübasyonun ardından seçilen ilacın uygun konsantrasyonunu ortama ekleyin ve inkübasyonun seçilen ilaç için belirlenen süre boyunca devam etmesini sağlayın. Ortamı overlerden uzaklaştırın ve taze drosophila ortamı ile iki kez kısa süreli durulama yapın.On mikromolar EdU ve yedi mikromolar aphidicolin içeren bir mililitre ortam ekleyin ve yumurtalıkları oda sıcaklığında, hafif rotasyonla iki saat boyunca inkübe edin. Son olarak, EdU ve aphidicolin içeren sıvıyı uzaklaştırın ve yumurtalıkları temiz drosophila ortamı ile iki kez, her seferinde üç dakika boyunca yıkayın. Dokuyu sabitlemek için, yumurtalıkları önce oda sıcaklığında, hafif rotasyonla yirmi dakika boyunca %4 paraformaldehitte inkübe edin.Ardından tespit ediciyi uzaklaştırın ve dokuyu, her seferinde beş dakika boyunca, rotasyonla bir mililitre PBS içinde %3 BSA ile iki kez yıkayın. Permeabilizasyon için yıkama solüsyonunu uzaklaştırın, bir mililitre PBS içinde %0.5 Triton X-100 ekleyin ve ardından yumurtalıkları oda sıcaklığında yirmi dakika boyunca rotasyonla inkübe edin. Son olarak, solüsyonu uzaklaştırın ve dokuyu bir mililitre PBS içinde %3 BSA ile iki kez yıkayın.Deneyden önce, EdU tampon katkısını üretici talimatlarına göre hazırlayın ve saklayın. 10x stok çözelti oluşturmak için EdU tampon katkısı tozunu iki mililitre deiyonize su içerisinde tamamen çözün. Saptamaya başlamak için, 10x EdU reaksiyon tamponunu iyonize su ile seyrelterek, iki tüp yumurtalığı etiketleyebilecek miktarda bir mililitre 1x çalışma çözeltisi şeklinde taze EdU reaksiyon tamponu hazırlayın.10x stok çözeltiyi deiyonize su ile 1:10 oranında seyrelterek 100 µL taze 1x EdU katkı tamponu çözeltisi hazırlayın. Reaktifleri şu sırayla birleştirerek bir mL EdU reaksiyon kokteyli hazırlayın: 860 µL 1x EdU tamponu, 40 µL bakır sülfat, 2,5 µL boya azidi ve 100 µL EdU tamponu katkısı. Reaktiflerin bu belirli sırayla eklenmesi ve hazırlamanın ardından 15 dakika içinde kullanılması önemlidir.BSA çözeltisini örneklerden uzaklaştırın ve her tüpe 0,5 mililitre EdU reaksiyon kokteyli ekleyin. Örnekleri oda sıcaklığında, hafif rotasyonla 30 dakika boyunca inkübe edin. Örnekleri ışıktan koruyun.Son olarak, örnekleri bir mililitre PBS içinde %3BSA ile bir kez yıkayın ve ardından bir mililitre PBS ile bir kez daha yıkayın. Antikor etiketlemesine başlamak için, önce yumurtalıklardaki yıkama solüsyonunu uzaklaştırın ve PBS içinde %0,2BSA ve %0,1Triton X-100 içeren bir mililitre bloklama solüsyonu ekleyin. Örnekleri, her etiketleme adımında ışıktan korumaya dikkat ederek, oda sıcaklığında hafif ajitasyonla 30 dakika inkübe edin.Bloklama solüsyonunu uzaklaştırın. Bunun yerine bloklama solüsyonunda seyreltilmiş birincil antikor ekleyin ve dört derece santigrat sıcaklıkta, karanlıkta gece boyunca inkübe edin. Örnekleri bir mililitre bloklama solüsyonu ile üç kez, her biri on dakika olacak şekilde yıkayın ve ardından arka plan boyanmasını minimize etmek için otuzer dakikalık iki yıkama daha gerçekleştirin.Son olarak, bloklama çözeltisini uzaklaştırın. Ardından, dokuyu bloklama çözeltisinde seyreltilmiş 500 microliter sekonder antikor içerisinde, oda sıcaklığında ve ajitasyonla iki saat boyunca inkübe edin. Bir mililitre bloklama çözeltisi kullanarak yıkama adımlarını üç kez 10 dakika ve iki kez 30 dakika boyunca tekrarlayın.Son olarak, deterjanı uzaklaştırmak için dokuyu bir mililitre PBS ile durulayın. Tüm PBS'yi dikkatlice çekin ve dokunun üzerini derhal 50 mikrolitre bağlama medyumu ile kapatın. Ucu kesilmiş bir pipet kullanarak yumurtalıkları dikkatlice bir mikroskop lamı üzerine aktarın.Stereo mikroskop altında ve ince uçlu pens kullanarak, her bir ovariolü tamamen ayırın. Posterior kısımlardaki bağlantı dokularını ve 14. evre veya olgun yumurta odacıklarını çıkararak, iç kısımdaki genç, şeffaf yumurta odacıklarını bırakın. Pens kullanarak, yumurta odacıkları üst üste gelmeyecek şekilde dikkatlice hizalayın.Numunelerin üzerine 1,5 numaralı bir cam lameli yavaşça kapatın ve bağlama ortamının oda sıcaklığında birkaç saat boyunca polimerize olmasını bekleyin. Kenarları şeffaf oje ile mühürleyin ve numunelerin görüntülemesini yapın veya ihtiyaç duyulana kadar dört derece Celsius sıcaklıkta, karanlık koşullarda saklayın. Lamlar yaklaşık iki hafta boyunca saklanabilir.Slaytları, 63x yağ daldırma objektif lens kullanarak konfokal mikroskop altında görüntüleyin ve yumurtalık dokusunun üç boyutlu Z-yığını görüntülerini yakalayın. Burada gösterilen drosophila ovarioülleri, yumurta odacıklarının anteriordan posteriora doğru tipik ardışık gelişim aşamalarını sergilemektedir. Konfokal görüntüler, mitokondriyalarla ilişkili noktasal yapıların EdU boyanmasını göstermektedir ve EdU'nun drosophila oogenezi sırasında MT DNA'sına ve çekirdeklere entegre olduğu doğrulanmıştır.Burada, drosophila germaryumunda MT DNA replikasyonu, nükleer DNA polimeraz inhibitörü aphidicolin varlığında EdU inklüzyonu ile görselleştirilmiştir. Bu koşullar altında, EdU'nun nükleer inklüzyonunun azaldığı görülmekte ve birçok nokta mitokondriler içinde lokalize olmaktadır. Aphidicolin uygulamasının yokluğunda, drosophila germaryumunda MT DNA replikasyonu çok düşük düzeyde tespit edilir.Yabani tip bir germaryumun konfokal kesiti, çekirdeklerde yoğun EdU inkluzyonu gösterirken, MT DNA noktaları zar zor tespit edilebilmektedir. Yabani tip germaryumlar, farklı konsantrasyonlarda bir mitokondriyal açıcı olan FCCP ile işleme tabi tutulduğunda, MT DNA replikasyonu bozulur. Bu durum, iki mikromolar, beş mikromolar ve 10 mikromolar uygulamalarda görüldüğü üzere, EdU boyamasındaki azalma ile doğrulanmaktadır.Bu prosedür takip edilerek, çeşitli genetik ve farmakolojik hazırlıklar altında mitokondriyal DNA replikasyonunun basit kantifikasyonu gerçekleştirilebilir.

in-situ-labeling-mitochondrial-dna-replication-drosophila-adult

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Bu protokol, mikroenjeksiyon ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme kullanımı...

Mitoz incelenmesi için Mikroenjeksiyon Teknikleri Drosophila melanogaster Sinsityal Embriyo

Biz mtDNA biyogenezi araştırmak için tek tek hücrelerin içinde yeni sentezlenmiş mitokondriyal DNA (mtDNA) etiket hassas bir teknik geliştirdi. Bu teknik, nöronların hücre içi bölmeleri içinde mtDNA çoğaltma görselleştirmek için bir tyramide sinyal amplifikasyon (TSA) protokolü ile birlikte, Edu ile birleşmesiyle birleştirir.

Edu Sinyal Amplifikasyon Bireysel Hücrelerde Mitokondriyal DNA replikasyonu Görselleştirme

SAC kardeş kromatidler arasında mitotik segregasyon izlenmesi, sinyali başlatır nerede kinetochore olduğunu. A metodunda kromozom hareketi ile kinetochore proteinler ve koordinasyon birinin seçilmesi ve devir görselleştirme tarif...

Living Görselleştirilmesi Dinamik Kinetochore Protein Davranış ve Kromozom Hareket tarafından Mitotik Checkpoint incelenmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Sinsityal Embriyolar

Burada, sabit, bozulmamış nematodlarda genomik DNA'yı görselleştirmek için kullanılan bir tekniği açıklıyoruz. Video, döllenmemiş C. elegans oositlerindeki kromatini saymak için örnek bir protokol içerir.

Etanol Fiksasyonu ve DAPI Boyama: C. elegans'ta DNA'yı Görselleştirmek İçin Bir Yöntem

İmmün boyama, dokulardaki belirli hücre tiplerini ve proteinleri görselleştirmek için etkili bir tekniktir. Sonikasyonu kullanarak, burada açıklanan protokol, immünostainingden önce Drosophila melanogaster dokularını geç evre embriyolardan ve larvalardan ayırma ihtiyacını hafifletir. Formaldehitle sabitlenmiş bütün mount larvalarının immün boyaması için etkili bir metodoloji sunuyoruz.

Geç evre embriyonik ve larva soniklenmesi-kolaylaştırdı Immunoflorasan Boyama<em&gt; Drosophila</em&gt; Dokular<em&gt; Yerinde</em

Olgun Drosophila oositlerinin toplanması, hazırlanması ve görüntülenmesi için protokoller sunuyoruz. Bu yöntemler, mayoz bölünme sırasında kromozom davranışının ve iğ montajının ve işlevinin görselleştirilmesine izin verir.

Sabit Görüntüleme prometafaz ve Metafaz Mayoz ve I Teknikleri<em&gt; Drosophila</em&gt; Oositler

Mitokondriyal yapı-fonksiyon ilişkisinin analizi, mitokondriyal işlevselliğin düzenleyici mekanizmalarının tam olarak anlaşılması için gereklidir. Canlı ve sabit Drosophila yumurtalıklarında mitokondriyal yapı ve fonksiyonu incelemek için özel yöntemler bu yazıda açıklanmış ve gösterilmiştir.

Mitokondriyal Yapısı ve İşlevi incelenmesi Drosophila Yumurtalıklar

Açıklanan RNA in situ hibridizasyon Protokolü RNA algılama bütün Drosophila embriyo veya disseke doku sağlar. 96-de microtiter plakaları ve tyramide sinyal Güçlendirme kullanma, yüksek kararlılık, duyarlılık ve işlem hacmi ve nispeten düşük bir maliyetle transkript tespit edilebilir.

Yüksek çözünürlüklü Floresan Situ hibridizasyon Drosophila embriyo ve Tyramide sinyal güçlendirme kullanarak doku

Burada, moleküler işaretleri kullanarak canlı Drosophila melanogaster yumurta odasında endojen mRNA kaçakçılığı görselleştirme, algılama, analiz ve izleme için bir protokol sunuyoruz, iplik disk konfokka mikroskopi, ve açık kaynak Analizi Yazılım.

Canlı Drosophila melanogaster yumurta Chambers Içinde endojen mrnas görselleştirme ve izleme

Bu protokolün amacı, Drosophila meyozetik spermatositler kullanarak canlı ve sabit hücre mikroskobu ile bozulmamış dokudaki hücre bölünmesini analiz etmektir. Protokol, Drosophila larvaları ve erken pupalardan bütün, bozulmamış testislerin nasıl izole edilip, mikroskopi için nasıl işleyip monte edilebildiğini gösteriyor.

Drosophila Larval ve Pupal Testislerinin Canlı, Sağlam Dokuda Hücre Bölünmesi Analizi İçin Hazırlanması

5-etil-2'-deoksiyridin (EdU) ve fosfo-histon H3 (pH3) etiketlemeli hücre döngüsü analizi, kapsamlı optimizasyon gerektirebilecek çok adımlı bir prosedürdür. Burada, farklı hücre döngüsü aşamalarındaki hücreleri ayırt etmek için görüntü analizi ve niceleme dahil olmak üzere bu prosedür için tüm adımları açıklayan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

5-Etil-2'-Deoksiroridin/Fosfo-Histon H3 Drosophila Nöral Kök Hücrelerde Hücre Döngüsü İlerleme Analizi için Çift Etiketleme Protokolü

Öğrenin Drosophila yetişkin yumurtalıklarında mitokondriyal DNA replikasyonunu EdU boyama ile yerinde etiketleme yöntemini. Bu teknik mitokondriyal biyogenez ve kalıtım mekanizmalarını incelemek için yapısal bütünlüğü korur.

Edu Boyama tarafından Drosophila Yetişkin Yumurtalıkların Mitokondriyal DNA replikasyonu Yerinde Etiketlenmesi içinde

Daha fazla video keşfet