Name: Fare Vomeronazal Organ Akut Doku Dilimleri Tanımlı hücre popülasyonlarının derinlemesine Fizyolojik Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Keşfedin fare vomeronazal organında akut doku dilimleri kullanarak duyu nöronlarının bütün hücre yama kelepçesi kayıtlarıyla derinlemesine fizyolojik analizini. Bu yöntem kimyasal algılama mekanizmalarını in vivo ortamda araştırmaya olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

FPR-rs3-i-venus fare serisini oluşturdukları, yapıcı eleştirileri ve verimli tartışmaları için Ivan Rodriguez ve Benoit von der Weid'e teşekkür ederiz. Bu çalışma, Volkswagen Vakfı (I/83533), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SP724/6-1) ve Alman federal ve eyalet hükümetlerinin Mükemmellik Girişimi tarafından finanse edilmiştir. MS, Volkswagen Vakfı'nın Lichtenberg Profesörüdür.

Tüm hayvan prosedürleri deneysel amaçlar için kullanılan hayvanların korunması (Direktif 86/609 / EEC) ve önerileri Avrupa Laboratuar Hayvan Bilimi Dernekleri Federasyonu (FELASA) tarafından ileri sürülen yerel ve Avrupa Birliği mevzuatı ile uyum içinde idi. C57BL / 6 fareleri ve Fpr-RS3-i Venus farenin Hem yiyecek ve su ad libitum ile 12 saat ışık / karanlık döngüsünde, oda sıcaklığında, her iki cinsiyet grupları barındırıldı. deneyler için cinsiyet ya genç yetişkinler (6-20 hafta) kullanıldı. Hiçbir belirgin cinsiyet bağımlı farklılıklar gözlenmiştir. 1. Solüsyon Hazırlama <ol><li> Hücre-dışı solüsyon S 1 hazırlanması: 4- (2-Hidroksi-etil) -piperazin-1-etansülfonik asit 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES, (mM olarak) ihtiva eden hücre-dışı çözelti tamponlu (HEPES); pH = 7.3 (NaOH ile ayarlanır); (Glukoz ile düzeltilmiş) ozmolarite = 300 mOsm. </li><li> ekstraselüler hazırlayınlar Çözelti 2: karbojen oksijenli (% 95 O2,% 5 CO2) CaCl2, 1 MgSO 4 125 NaCl, 25 (mM olarak) NaHCO 3, 5 KCl, 1 ihtiva eden hücre-dışı çözelti 5 BES; pH = 7.3; (Glukoz ile düzeltilmiş) ozmolarite = 300 mOsm. </li><li> Doku yerleştirilmesi için% 4 düşük jelleşme sıcaklığına sahip bir agaroz çözeltisi (S3) hazırlayın:% 4 düşük jelleşme sıcaklığı agaroz. 2 g bir manyetik karıştırıcı ile birlikte 100 ml&#39;lik bir cam şişe içinde laboratuar S 1 50 ml agaroz düşük jelleştirme eritin. agaroz eriyik için, yaklaşık 20 dakika boyunca ya da çözelti karıştırılırken saydam hale gelinceye kadar 70 ° C&#39;de (kapağın sıkı bir şekilde kapatılmamış olan) bir su banyosu içinde bir şişe yerleştirin. soğutun ve sonraki kullanıma kadar 42 ° C &#39;de, ikinci bir su banyosu içinde eritilmiş agaroz tutun. </li><li> Hücre-içi solüsyon s, 4 hazırlayın: Pipet çözelti 2 (serbest Ca2 + = 110 nM) 1 EGTA 143 KCI, 2 KOH, 0.3 CaCl, 10 HEPES, 2 MgATP (mM olarak), 1 NaGTP;pH = 7.1 (KOH ile ayarlanmıştır); osmolarite = 290 mOsm. </li><li> / Değiştir S 1 kompozisyonunun ayarlanması, bireysel deneysel tasarım (örneğin, farmakolojik blokerler gerilim aktive akımları belirli türleri izole etmek) göre S 2 ve S 4. </li></ol> 2. Çalışma Alanı Hazırlığı <ol><li> Sıcaklık ve pH ayarlaması ve sürekli oxygenate çözüm için buz üzerinde S 2, en az 30 dakika önce diseksiyon, yer dilim depolama odasını oksijenlendirdikten doldurun. </li><li> S 2 ile kayıt ayarları da dilim süperfüzyomu için doldurun ve sürekli oksijen. </li><li> Diseksiyon önce S 2 ile vibratome bölmeyi doldurun ve odanın etrafında ezilmiş buz düzenlemek. Alternatif olarak, vibratome odasına odasını oksijene yedek buz oksijenli çözümü transferi ve sürekli oksijenlendirdikten tutun. </li><li> cerrahi aletleri ve sarf düzenleyin. </li><li> diseksiyon altında buz jel paketi yerleştirinmikroskop, çanak alt donmaya karşı VNO doku önlemek için bir kağıt havlu ile kaplayın. </li><li> Kısaca,% 70 etanol ve distile su ile durulama ve vibratome monte temizleyin traş makinesi bıçak. Her dilimleme oturumu için değiştirin. </li></ol> 3. VNO Diseksiyon ve katıştırma <ol><li> CO 2 ve keskin cerrahi makas kullanarak başını kesmek için kısa maruz bırakılarak hayvan kurban. Not: kritik buz üzerinde VNO kapsülü koyarak hayvan ödün zaman olduğu gibi, en az 2 dk süreyi en aza indirmek. doku canlılığını muhafaza etmek için, en az 30 dakika içinde agaroz de tamamen Dissected VNOs yerleştirin. </li><li> Büyük cerrahi makas ile alt çene çıkarın. Ağız boşluğu ile girmek ve ayrı ayrı her tarafında mandibula kemik ve kas kesti. </li><li> başaşağı büyük Petri kabındaki başın kalan kısmını yerleştirin. </li><li> üst çene ve daha rahat erişmek için orta forseps ile burun ucu çevresindeki deri çekmeyekesici dişler. </li><li> Rostral yönde (Şekil 1A) bir ~ 45 ° &#39;lik açıyla kesici dişlerin en büyük kısmını kesip kemik makas kullanın. Bu burun boşluğundan VNO kapsülün çıkarılması kolaylaştıracaktır. Not: VNO kapsülün ucu zarar görmesini önlemek için dişin köküne kesmeyin. </li><li> Orta forseps ile rostral kısmında sert üst damak tut ve dikkatli bir düz açı (Şekil 1B) geri tek parça halinde soyun. Not: Tekrar tekrar buz gibi soğuk S 2 ile durulayın. </li><li> vomer kemik ve çene ucu arasındaki kemik füzyon kesmek için mikro yaylı makas kullanın. VNO kapsüle sol ve sağ taraf yanal hem de küçük adımlar halinde kemiğin kesilmesi dışarıya doğru VNO gelen ve dikkatli bir şekilde işaret ucunun eğri kısmı ile makas ipuçları yerleştirin. </li><li> VNO kapsülü çıkarmak için, kaudal kısmında vomer kemiği kesmek için mikro yaylı makas kullanın ve dikkatli n dışarı vomer kemiğini kaldırınorta forseps kullanarak asal boşluğu. Hemen diseksiyon kalan adımlar gerçekleştirilir bir buz jel paketini bir stereo mikroskop altında küçük bir petri tabağına VNO aktarın. </li><li> Kurumasını önlemek için doku buz soğukluğunda S 2. Alanın küçük bir miktarda VNO durulayın. </li><li> orta forseps ile vomer kemiğin arka kapma VNO yumuşak dokuları ihtiva kıkırdak kapsül ayırın. Her iki VNOs arasındaki bölünmüş (Şekil 1D i) görünür hale gelmesi için dorsal görünümü için kapsül yerleştirin. </li><li> Arka kısmında aşağı tuş vomer kemik tutarken merkez kemikten hem kıkırdak VNO kapsülleri ayırmak için ince forseps ucu kullanın. Not: Sadece kıkırdak kapsülün RIM forseps kullanın ve narin duyusal epitel kolayca zarar olarak kıkırdak delip için çok dikkatli olun. </li><li> İki VNOs ayrılır sonra, köknar encapsulating kıkırdağı kaldırarak başlamakt VNO. </li><li> bir ince forseps ile kapsülün üst çemberinin tut ve daha önce vomer kemik (medial tarafı) bağlı olduğu kıkırdak duvar uzak ayrıldı. </li><li> kıkırdak çanak alt kavisli yan tarafı ile VNO çevirmek ve güvenli forseps kullanarak bir tarafta kıkırdak aşağı pin kalan kaldırmak için. Dikkatle doku ve kıkırdak arasındaki bağlantıyı gevşetmek için kıkırdak ve VNO arasında bir çok düz açıyla arka tarafında ikinci ince forseps taşıyın. </li><li> Yavaş yavaş duyusal epitel zarar vermemek için, kendi kaudal ucunda tutarak uzak kıkırdaktan VNO soyma. </li><li> VNO kapsülden levered sonra, dilimleme işlemi sırasında agaroz çevredeki doku ayırmak olacaktır kıkırdak kalan parçaları olarak kalan tüm küçük kıkırdak parçalarını kaldırmak için emin olun. </li><li> Doku hasarını önlemek için ilk Dissected VNO buz-soğuk 2 küçük bir damla koyun. lateral yan Wil ilgili büyük bir kan damarıl organı hala bozulmamış ve fena halde diseksiyon (Şekil 2A ii) sırasında zarar olmadığını belirten görünür hale gelir. kan damarı hasar var bu durumda, hala sürece genel morfolojisi açıkça düşüklüğüne uğramamış gibi VNO dilimleme ile devam etmek faydalı olacaktır. </li><li> Hemen ikinci VNO teşrih. </li><li> VNOs yerleştirmek için, erimiş S 3 ağız hem de kültür kaplarına dolgu (42 ° C&#39;de su banyosu içinde depolanmış, 1.3). </li><li> duyusal epitel zarar vermemek için ince forseps ile geniş kaudal ucunda VNO tutun. </li><li> agaroz VNO daldırın ve ekstrasellüler çözüm filmi yanı sıra yüzeyinden herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için ileri geri yatay birkaç kez hareket ettirin. </li><li> çanak alt bakan kaudal ucu ile dikey VNO yerleştirin. Bunun yerine, doğrudan forseps ile VNO kısma ait, yakın Proximi forseps ucu hareket ettirerek yönünü ayarlamakVNO için ty. Not: Deney sırasında duyusal nöronlar dilim uçağı ve erişilebilirlik belirler olarak gömme sırasında Oryantasyon önemlidir. </li><li> jel buz paketi üzerinde yemekleri yerleştirin ve Agaroz katılaşmış kadar bekleyin. Not: Agaroz bu çevredeki agaroz doku ayırmak gibi katılaşan başladıktan sonra VNO yönünü değiştirmeyin. </li></ol> 4. Koronal VNO Doku Dilimleme <ol><li> Büyük bir Petri kabı kapağının içine küçük çanak agaroz blok kaldırmak için küçük bir spatula kullanın, baş aşağı yukarı bakacak VNO kaudal ipucu bırakarak agaroz çevirin. </li><li> cerrahi neşter (ucunda 3-4 mm, altta 8-10 mm) kullanılarak bir piramit şekline blok kesin. Gömülü doku zarar vermemeye özen gösterin. </li><li> vibratome numune plakasının merkezine piramit şeklindeki blok düzeltmek ve yapıştırıcı tamamen kurumasını için ~ 1 dakika beklemek zorunda süper yapıştırıcı kullanın. </li><li> dilimleme c numune plaka aktarınhamber ve buna bağlı olarak ikinci bir VNO hazırlar. kullanılana kadar 4 ° C, ikinci örnekle plaka tutun. </li><li> kalınlığı: Aşağıdaki ayarlara sahip bir titreşimli bıçak mikrotom kullanın 150-200 mikron; Hız: 3.5 au = 0,15 mm / sn; Frekans: = 75 Hz 7,5 au. kısaca Diseksiyon mikroskobu altında dilim morfolojisi inceledikten sonra kullanıma kadar oxygenating odasına dilim aktarın. Dilimler birkaç saat boyunca muhafaza edilebilir. </li></ol> 5. Tek hücreli Elektrofizyolojik Kayıtlar <ol><li> kayıtlar için, suya daldırma amaçları, Dodt ya da kızıl ötesi ayırıcı müdahale kontrast (IR DIC) ve epi-floresan gibi soğutulmuş bir CCD kamera ile donatılmış bir dikine duran aşamalı mikroskop kullanımı. veri toplama için bir yama-kelepçe amplifikatör, kafa sahne, AD / DA arayüz kartı ve (kayıt yazılımı dahil) bir PC kullanın. </li><li> 10-20 yama pipetler (4-7 MQ) bir stok hazırlayın. borosilikat cam kılcal damarlardan çekme pipetler (1.50 mm OD / 0.86 mm ID) istimalBir Microforge ile ga mikropipet çektirmesi ve yangın lehçe. Not: oldukça küçük VSNs yama yaparken Yangın pipet uçları parlatma önemlidir. Bu durum, yüksek dirençli bir sızdırmazlık elde etmek için negatif basınç uygulanırken, hücre zarını önlemek için yararlı olacaktır. Pipet açılışı parlatma sonra yaklaşık 1 mikron olmalıdır. </li><li> kullanana kadar hasar ve toz birikmesini önlemek için bir pipet depolama kavanoz pipetler tutun. </li><li> çözüm rezervuarları doldurma ve deneysel tasarım göre tüp ile perfüzyon sistemi hazırlayın. Not: güçlü elektrofizyolojik kayıtlar engel olacak şekilde tamamen tüp içindeki hava kabarcıklarını çıkarın. </li><li> ~ 3 ml / dakika akış elde etmek için basınç ayarlayın. Not: Yüksek basınç elektrofizyolojik kayıtlar doku dilim hareketini yanı sıra fesih neden olacaktır. </li><li> görüntüleme odasına VNO dilim aktarın ve 0.1 mm kalınlığında synt ile kablolu paslanmaz çelik çapa kullanarak dilim pozisyonunu düzeltmekinfographie lifler (Şekil 2B - C). Not: sentetik elyaf ipliklerin biri değil dilim çevreleyen agaroz ile doku dilim örtmeyin. </li><li> Banyo uygulaması aracılığıyla oda sıcaklığında oksijenli S 2 ile kurulum ve sürekli Superfuse dilim kayıt Transfer görüntüleme odası. </li><li> Banyo çözeltisinin sürekli bir değişim için yavaş bir emme oluşturmak için çözeltinin yüzeyine emme kılcal ayarlayın. 8-in-1 çoklu varil &quot;perfüzyon kalem&quot; yukarıda ve kan damarı (Şekil 2C, 3A) 50 içeren VNO dilim olmayan duyusal kısmına yakın ayarlayın. Zıt yönlerde gelen dilim dönük olması perfüzyon kalem ve kayıt pipet düzenlemek için yararlı olacaktır. </li><li> Referans elektrodu ve (150 mM KCI ile dolu), L-şeklinde bir agar köprü kullanılarak banyo çözeltisi bağlayın. </li><li> Pipet çözüm S 4 ile yama pipet doldurun. </li><li> kaplama kapalı kazıma olmadan kafa aşamasına bağlı gümüş klorür kaplı yama elektrot üzerinde pipet montaj ve sıkıca takın. </li><li> hafif pozitif basınç uygulayın (yaklaşık 10 ml plastik şırınga 1 ml) banyo girmeden önce yama pipet. </li><li> (Şekil 2B) onu vurmadan hedefi batığın edebilmek için yeterince mikro manipülatörler kullanarak banyoya pipet indirin. </li><li> Baş aşamasına bağlı elektrofizyoloji yazılımı kullanarak (4-7 MQ arasında R pip) pipet direnci izleyin. Not: R pip ise &lt;4 MQ cam ucu kırıldı. R pip&gt; 10 M? Ise, uç büyük ihtimalle tıkalı ve pipet değiştirilmesi gerekir. </li><li> Kızılötesi optimize edilmiş diferansiyel girişim kontrast (DIC) kullanarak bir CCD kamera ile VNO dilim görselleştirmek ve floresan aydınlatma kullanılarak FPR-RS3-i Venüs (benzer etiketli nöronların veya) hücreleri ifade eden tanımlamakve uygun bir filtre küpü. </li><li> Odak ve hedef floresan veya floresan olmayan hücrelerin deneysel tasarım bağlı. </li><li> hücre gövdesi yaklaşmak için, maksimum duyarlılık el tekerlekleri kullanın. Pipet yakın olduğunu bir kez pozitif basınç nedeniyle, hücre soma zarında küçük bir göçük görünür hale gelir. </li><li> pozitif basınç bırakın ve yüksek direnç mühür (1-20 GΩ) elde etmek için, hücre zarındaki emmek için hafif negatif basınç uygulayın. hücre zarı bozar ve tam hücreli yapılandırmasını kurmak için kısa ve nazik vakum uygulayın. </li><li> deney sırasında sürekli erişim direnci izleyin. Not: Sadece küçük ve istikrarlı bir erişim direnci sergileyen nöronlar (R girişinin ≤3%; değişimi &lt;deney boyunca% 20) analiz içine. </li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

VNO Semiokimyasallar tespit eden bir kimyasal-duyusal bir yapıdır. Bugüne kadar, vomeronasal reseptörlerinin çoğunluğu sadece birkaç reseptör-ligand çifti tespit edilmiş olarak deorphanized gerekmektedir. Bunlar arasında, V1rb2 erkek idrar feromon 2-heptanon 30 spesifik olarak aktive edilmesi tanımlanmıştır, V2rp5 erkek belirli feromon ESP1 57 da SYFPEITHI V2r1b ve V2rf2 MHC peptid ile aktive edilecek şekilde aktif hale 48 ve SEIDLILGY 58, sırasıyla. reseptör-ligand ilişkileri...

Çoğu hayvan çevreleriyle etkileşim kimyasal duyu temeline dayanmaktadır. koku duyusu uygun çiftleşme ortakları bulma ve gıda değerlendirilmesi, yırtıcı kaçınarak ve bulmak için önemli bir rol oynar. Ana koku epiteli 1,2, Grueneberg ganglion 3,4, Masera 5,6 septal organ ve vomeronasal organı: En memelilerde, koku alma sistemi en az dört anatomik ve fonksiyonel olarak farklı çevresel alt sistemden oluşur. VNO kimlik, cinsiyet, sosyal rütbe ve cinsel devlet 7-10 hakkında bilgi veren kimyasal ipuçlarını tespit önemli bir rol oynar aksesuar koku alma sistemi (AOS), periferal duyusal yapıyı içermektedir. VNO sağ damak üzerinde burun septum dibinde yer almaktadır. Farelerde, bir kıkırdak kapsül 11-13 içine bir ikili kör bitmeyen bir borudur. Organ, bir hilal şeklinde medial duyusal epithe hem oluşurVSNs limanlar ve yan tarafında olmayan bir duyu kısmının Lium. Her iki epitel arasındaki dar vomeronasal kanalı 14 yoluyla burun boşluğuna bağlı olan bir mukus doldurulmuş lümen yer almaktadır. Olmayan duyu dokuda büyük bir yan damar negatif basınç 15,16 aracılığıyla bu VNO lümenine peptitler veya küçük proteinler gibi göreli olarak büyük, daha çok uçucu olmayan moleküllerin girişini kolaylaştırmak için, bir vasküler pompalama mekanizması sağlar. VNO yapısal bileşenler doğumda mevcut ve organ kısa bir süre ergenlik 17 önce yetişkin boyutuna ulaşır. Ancak, kemirgen AOS zaten gençler fonksiyonel olup olmadığını 18-20 tartışmaya hala tabidir. VSNs kendi epitel konumu ve ifade reseptör tipine hem ile ayırt edilir. VSNs bir miyelinsiz akson ve lümen doğru çıkıntı ve bir microvillous dendritik topuzu ile biten bir tek apikal dendrit ile iki kutuplu bir morfoloji göstermektedir. VSN baltaons salkımlı, dorso-kaudal ucunda kıkırdaklı kapsül bırakır septum boyunca yükselir, aksesuar koku ampul (AOB) 21,22 ile kribriform plaka ve projeler geçer vomeronasal siniri oluşturur. vomeronasal duyusal epitel iki katmandan oluşur: apikal tabaka lümen yan ve limanlardan V1R- ve nöronlar FPR-R eksprese eden bir tür ise her iki yakın yer almaktadır. Bu nöronlar AOB 23-25 ​​ön kısmına G-proteini α alt birimi G αi2 projeyi birlikte ifade. G αo yanında daha bazal tabaka ekspres V2Rs veya FPR-Rs1 bulunan Duyu nöronları ve AOB 26-28 arka bölgeye kendi aksonları gönderin. Vomeronasal nöronlar olasılıkla idrar, tükürük gibi çeşitli vücut sıvılarının salgılanan ve sıvı gözyaşı vardır oldukça küçük yarı-kimyasallara 29-33 (V1Rs) veya proteinli bileşiklerin 34-38 (V2Rs) tarafından aktive edilir 37,39-41 </sup&gt;. Yerinde deneylerde VSNs da formilatlı peptidler ve çeşitli antimikrobik / enflamasyon bağlantılı bileşikler 25,42 ile aktive olduğunu göstermiştir. Ayrıca, heterolog FPR-rs proteinler (bkz 43 referans) conspecifics veya bozulmuş gıda kaynaklarından 25 hastalık için detektörleri gibi bir potansiyel rolü gösteren, bağışıklık sisteminde ifade FPRs ile agonist spektrumları paylaşmak dile getirdi. Belirli VSN toplumlarda reseptör-ligand ilişkileri ve aşağı doğru sinyal kaskadlar anlamak için temel bir yerli bir ortamda temel biyofizik özellikleri ayrıntılı bir değerlendirmedir. Geçmişte, hücresel sinyal analizi, büyük ölçüde floresan işaretleyici protein 30,44-49 coexpressing tarafından nöronların tanımlanmış bir nüfusa işaret genetiği değiştirilmiş hayvanlardan faydalandı. Bu protokol, bir fluoresan işaretleyici ile birlikte FPR-RS3 eksprese eden bir transgenik fare hattı (FPR-RS3-i Venüs) kullanılır.Bu yaklaşım, akut koronal VNO doku dilimler halinde tek nöron patch-kelepçe kayıtları kullanarak optik tanımlanabilir hücre popülasyonunun elektrofizyolojik analizi gerçekleştirmek için böyle bir genetiği değiştirilmiş fare zorlanma istihdam nasıl örnekliyor. Bir hava basınç tahrikli çoklu varil perfüzyon sistemi duyusal uyaranlar ve farmakolojik ajanların kayıtları sırasında, hızlı tersinir ve fokal nöronal stimülasyon ya da önlenmesini sağlar. slice preparatlarda Tüm hücre kayıtları hücrenin doğal ortamında bir içsel özellikler, gerilim-etkin iletkenlikleri ayrıntılı analizi, hem de hareket potansiyeli boşaltım kalıpları için izin verir.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Kimyasallar< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Agaroz (düşük jelleşme sıcaklığı)</td> <td>PeqLab</td><td>35-2030</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Mg-ATP)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Bis (2-hidroksietil) -2-aminoetansülfonik asit (BES)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>B9879</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Etilen glikol tetraasetik asit (EGTA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>GTP (Na-GTP)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>51120</td><td></td></tr> <tr><td>(2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum hidroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03564</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidrojen karbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Cerrahi aletler ve sarf malzemeleri</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Büyük Petri kabı, 90 mm</td><td>VWR</td><td></td><td>dekapitasyonu, VNO kapsülünün diseksiyonu</td></tr><tr><td>Küçük Petri kabı,</td> VNO diseksiyonu için 35 mm <td>VWR</td><td></td><td>kapağı, agaroz içine gömmek için çanak</td></tr><tr><td>Keskin büyük cerrahi makas</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td></td> kafa <td>kesme, alt çenenin çıkarılması</td></tr><tr><td>Güçlü kemik makası</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td></td><td>kesici dişler</td></tr><tr><td>Orta forseps, Dumont cımbız #2</td> Cildi <td>ve damağı çıkaran</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td></td></tr><tr><td>Mikro yaylı makas, 8,5 cm, kavisli, 7 mm bıçaklar&nbsp;</td><td>VNO'yu kesen</td> <td>Güzel Bilim Araçları</td><td></td>&nbsp;</tr><tr><td>İki çift ince forseps, Dumont cımbız #5</td><td>VNO'yu kıkırdaklı kapsülden çıkaran</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td></td></tr><tr><td>Küçük paslanmaz çelik spatula</td><td>Agaroz bloğu ve doku dilimlerini işleyen</td>Güzel <td>Bilim Araçları</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi neşter</td><td></td><td></td><td>agaroz bloğunu piramidal şekle kesme</td></tr> <tr><td>< güçlü > < / güçlü > <</td> <td>güçlü > < / güçlü ></td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>HEKA Elektronik</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat cam kılcal damarlar (1.50 mm OD / 0.86 mm ID)</td><td>Bilim Ürünleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD kamera</td><td>Leica Microsystems</td><td>DFC360FX</td><td></td></tr><tr><td>Filtre küpü, uyarma: BP 450-490, bastırma: LP 515</td><td>Leica Microsystems</td><td>I3</td><td></td></tr><tr><td>Floresan lamba</td><td>Leica Microsystems</td><td>EL6000</td><td></td></tr><tr><td>Sıcak plaka manyetik karıştırıcı</td><td>Snijders</td><td>34532</td><td></td></tr><tr><td>Microforge&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipülatör Cihazı&nbsp;</td><td>Luigs & Neumann</td><td>SM-5</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet çektirme, dikey iki kademeli</td><td>Narishige</td><td>PC-10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>CSM DM 6000 SP5</td><td></td></tr><tr><td>Gürültü giderici 50/60 Hz (HumBug)</td><td>Quest Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objective&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>HCX APO L20x/1.00 W</td><td></td></tr><tr><td>Osiloskop</td><td>Tektronik</td><td>TDS 1001B</td><td></td></tr><tr><td>Ozmometre&nbsp;</td><td>Gonotec</td><td>Osmomat 030</td><td></td></tr><tr><td>Perfüzyon sistemi 8'i 1 arada</td><td>AutoMate Scientific pH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metre beş kolay</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipet saklama kavanozu</td><td>World Precision Instruments</td><td>e212</td><td></td></tr><tr><td>Kayıt odası&nbsp;</td><td>Luigs & Neumann</td><td>Dilim mini haznesi</td><td></td></tr><tr><td>Tıraş bıçakları</td><td>Wilkinson Kılıç GmbH</td><td>Wilkinson Kılıç Klasik</td><td></td></tr><tr><td>Oksijenli dilim saklama odası; Alternatif ticari odalar şunlardır: örneğin , BSK1 Beyin Dilimi Tutucu (Digitimer) veya Ön Bölme (BSC-PC; Warner Instruments)</td> <td>ısmarlama</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>S4E</td><td></td></tr><tr><td>Tetik arayüzü&nbsp;</td><td>HEKA Elektronik</td><td>TİB-14 S</td><td></td></tr><tr><td>Vibratom&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT 1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Su banyosu&nbsp;</td><td>Memmert</td><td>WNB 45</td><td></td></tr></tbody></table>

fare vomeronazal organ akut doku dilimleri tanımlı hücre popülasyonlarının derinlemesine fizyolojik analizi

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Çoğu memelide, vomeronazal organ (VNO) hem hetero hem de spesifik sosyal ipuçlarını tespit eden kemosensoriyel bir yapıdır. Vomeronazal duyusal nöronlar (VSN'ler), kemosensör ipuçlarının hassas ve spesifik tespitine izin veren en az üç farklı kemoreseptör gen ailesinden spesifik bir G proteinine bağlı reseptör (GPCR) tipini eksprese eder. Bu aileler, V1r ve V2r gen ailelerinin yanı sıra varsayılan kemoreseptör genlerinin formil peptit reseptörü (FPR) ile ilişkili dizi (Fpr-rs) ailesini içerir. Vomeronazal reseptör-ligand etkileşimlerinin ve aşağı akış sinyalizasyonunun fizyolojisini anlamak için, her bir spesifik VSN sınıfına özgü biyofiziksel özellikleri tanımlamak önemlidir.
Burada açıklanan fizyolojik yaklaşım, transgenik bir fare hattı (Fpr-rs3-i-Venüs) kullanarak tanımlanmış bir duyusal nöron popülasyonunun tanımlanmasına ve derinlemesine analizine izin verir. Bununla birlikte, bu protokolün kullanımı, bu spesifik hatla sınırlı değildir ve bu nedenle, diğer genetik olarak değiştirilmiş hatlara veya vahşi tip hayvanlara kolayca genişletilebilir.

Tanımlanmış hücre popülasyonlarının biyofiziksel ve fizyolojik özelliklerine anlamak için, biz fare VNO (- 2 Şekil 1) akut koronal doku dilimleri gerçekleştirin. Diseksiyon sonra, dilimler bir kaç saat süre ile buz soğukluğunda oksijenli hücre dışı çözelti (S2) &#39;de muhafaza edilebilir. Kayıt kurulumda, taze oksijenli çözümü ile bir sabit döviz (Şekil 2B) deney boyunca doku canlılığını sağlar. Biz burada bir transgenik fare...

Burada, tüm hücre yama-klemp kayıtlarını kullanarak fare vomeronazal organının akut koronal doku dilimlerinde tanımlanmış bir duyusal nöron popülasyonunun tanımlanmasına ve derinlemesine analizine izin veren fizyolojik bir yaklaşımı açıklıyoruz.

Fare Vomeronazal Organ Akut Doku Dilimleri Tanımlı hücre popülasyonlarının derinlemesine Fizyolojik Analizi

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Bu prosedürün genel amacı, fare vomeronazal organından alınan akut doku kesitlerindeki tanımlanmış bir duyusal nöron popülasyonunun tek hücreli elektrofizyolojik analizini gerçekleştirmektir. Bu yöntem, koku alma mekanizmaları gibi kemosensasyon alanındaki temel soruların aydınlatılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, akut doku kesitlerindeki duyusal nöronlardan kayıt alınarak, bu hücrelerin doğal ortamlarında incelenebilmesidir.Bu prosedüre başlamak için, hayvanı sakrifiye ettikten sonra, ağız boşluğundan büyük cerrahi makaslar geçirerek alt çeneyi çıkarın; her iki taraftaki mandibula kemiklerini ve kaslarını ayrı ayrı kesin. Ardından, kesici dişlere daha iyi erişim sağlamak için üst çenenin derisini ve burnun ucunun çevresini orta boy forsepslerle temizleyin. Daha sonra, VNO kapsülünün burun boşluğundan çıkarılmasını kolaylaştırmak için kemik makasını kullanarak kesici dişlerin büyük bir kısmını rostral yöne doğru 45 derecelik bir açıyla kesin.VNO kapsülünün ucunun zarar görmesini önlemek için diş kökünü kesmeyin. Ardından, sert üst damağı rostral kısmından orta boyutlu forseyle tutun ve düz bir açıyla dikkatlice tek parça halinde soyun. Nazal boşluğu buz gibi soğuk S2 solüsyonu ile defalarca yıkayın. Sonrasında, vomer kemiğinin ucu ile çene arasındaki kemik sızıntısını kesmek için mikro yaylı makas kullanın.Makas uçlarını, kavisli kısım VNO'dan uzağa bakacak şekilde yerleştirin. Ve VNO kapsülünün lateralinde, hem sol hem de sağ tarafta kemiği küçük adımlarla dikkatlice kesin. VNO kapsülünü çıkarmak için vomer kemiğini kaudal kısımdan kesin ve orta boy pensler kullanarak vomer kemiğini burun boşluğundan dikkatlice kaldırın.VNO'yu hemen, buz jeli paketinin üzerindeki bir stereo mikroskop altında küçük bir petri kabına aktarın; disseksiyonun geri kalan adımları burada gerçekleştirilmelidir. Daha sonra, dokunun kurumasını önlemek için VNO'yu az miktarda buz gibi soğuk S2 ile yıkayın. Ardından, orta uçlu pensle vomer kemiğinin arka kısmını tutarak VNO yumuşak dokularını içeren kıkırdak kapsülleri ayırın.Bunun için, her iki VNO arasındaki ayrım görünür hale gelecek şekilde kapsülü dorsal görünüm için konumlandırın. Vomer kemiğini arka kısımda sabitlenmiş halde tutarken, ince uçlu bir pensetin ucuyla her iki kıkırdak VNO kapsülünü merkezi kemikten ayırın. Daha önce vomer kemiğine yapışık olan medial kıkırdak duvarın kaldırıldığından emin olun.VNO çevresindeki kıkırdağı temizlerken pensleri yalnızca kıkırdak kapsülünün kenarında kullanın. Hassas duyusal epitelyuma zarar vermemeye çok dikkat edin. Kalan kıkırdağı temizlemek için VNO'yu, kavisli lateral tarafı kabın altına gelecek şekilde döndürün ve kıkırdağı bir taraftan pens kullanarak güvenli bir şekilde sabitleyin.Ardından, doku ile kıkırdak arasındaki bağlantıyı gevşetmek için ikinci ince penseti, kıkırdak ile VNO arasından çok düz bir açıyla arka taraftan dikkatlice hareket ettirin. Sensoriyel epitelyuma zarar vermemek için VNO'yu kaudal ucundan tutarak kıkırdaktan yavaşça soyun. VNO kapsülden kaldırıldıktan sonra, kalan tüm küçük kıkırdak parçalarını temizleyin; çünkü kalan kıkırdak parçaları, dilimleme işlemi sırasında dokunun çevredeki agarozdan ayrılmasına neden olacaktır.Ardından, doku hasarını önlemek için diseke edilen ilk VNO üzerine küçük bir damla buz soğukluğunda S2 yerleştirin. VNO'ları gömmek için, her iki küçük petri kabını kenarına kadar eritilmiş S3 ile doldurun. Bundan sonra, her bir VNO'yu agaroz içine daldırın ve yüzeyindeki hücre dışı çözelti tabakasını ve varsa hava kabarcıklarını gidermek için yatay olarak birkaç kez ileri geri hareket ettirin. VNO'yu, rostral ucu kabın tabanına bakacak şekilde dikey olarak konumlandırın.Ardından, her iki kabı da jel buz paketinin üzerine yerleştirin ve agaroz katılaşana kadar bekleyin. Agaroz katılaşmaya başladıktan sonra VNO yönünü değiştirmeyin, çünkü bu durum dokunun çevredeki agarozdan ayrılmasına neden olur. Bu işlemde, agaroz bloğunu küçük kaptan alıp geniş bir petri kabının kapağına yerleştirmek için küçük bir spatula kullanın ve VNO'nun rostral ucunu yukarı bakacak şekilde agarozu ters çevirin.Ardından, gömülü dokuya zarar vermemeye dikkat ederek, bloğu cerrahi bir bistüri ile piramit şeklinde kesin. Daha sonra, piramit şeklindeki bloğu vibratom numune plakasının merkezine sabitlemek için hızlı yapıştırıcı kullanın. Yapıştırıcının tamamen kuruması için yaklaşık bir dakika bekleyin.Numuneyi 150 ila 200 mikrometre kalınlığında kesitlere ayırın. Kesit morfolojisini diseksiyon mikroskobu altında kısaca inceleyin. Ardından, tüm kesitleri kullanıma kadar oksijenasyon odasına aktarın.Bu adımda, bir VNO dilimini görüntüleme haznesine aktarın ve dilimin konumunu 0,1 mm kalınlığındaki sentetik liflerle bağlanmış paslanmaz çelik ankrajlar kullanarak sabitleyin. Doku dilimini sentetik fiber ipliklerden herhangi biriyle örtmeyin. Ardından, görüntüleme haznesini kayıt düzeneğine aktarın ve dilimi oda sıcaklığında oksijenle zenginleştirilmiş S2 ile sürekli olarak süperfüze edin.Banyo çözeltisinin sabit bir değişimini sağlamak için emme kapilerini çözeltinin yüzeyine göre ayarlayın. Ardından, kan damarını içeren VNO diliminin duyusal olmayan kısmının üzerine ve yakınına sekizli çok kanallı perfüzyon kalemini yerleştirip ayarlayın. Sonrasında, 150 millimolar potasyum klorür ile doldurulmuş L şeklinde agar köprüsü kullanarak referans elektrodu ve banyo çözeltisini birbirine bağlayın.Ardından, patch pipeti S4 pipet çözeltisi ile doldurun. Pipeti, kaplamayı kazımadan, kafa aşamasına bağlı gümüş klorür kaplı elektrot üzerine yerleştirin ve sıkıca sabitleyin. Daha sonra, banyoya girmeden önce patch pipete hafif pozitif basınç uygulayın. Pipeti izleyin ve direncin 4 megaohm ile 10 megaohm arasında olduğundan emin olun.Kızılötesi optimize DIC kullanarak VNO kesitini bir CCD kamera ile görüntüleyin ve floresans aydınlatma ile uygun bir filtre küpü yardımıyla FPR-rs3 i-Venus ekspres eden hücreleri veya benzer şekilde işaretlenmiş nöronları tanımlayın. Maksimum hassasiyet için hücre gövdesine el tekerleklerini kullanarak yaklaşın. Pozitif basınç nedeniyle, pipet ucu yakın mesafeye geldiğinde hücre soma membranında küçük bir çöküntü görünür hale gelir.Ardından pozitif basıncı serbest bırakın ve 1 ila 20 gigaohm değerinde yüksek dirençli bir sızdırmazlık sağlamak amacıyla hücre membranını içeri çekmek için hafif negatif basınç uygulayın. Sonrasında, hücre membranını bozmak ve tüm hücre konfigürasyonunu kurmak için kısa ve nazik bir vakum uygulayın. Bu şekilde, koronal VNO doku kesitinin konfokal görüntüsü, vomeronasal duyusal epiteldeki floresan FPR-rs3 Tau Venus pozitif nöronların dağılımını göstermektedir.FPR-rs3 Tau Venus pozitif nöronlar, lüminal sınırda yumru benzeri bir yapıyla sonlanan tek bir apikal dendrit sergiler. Burada, VSN somasından gerçekleştirilen tüm hücre patch clamp kayıtları gösterilmektedir. Burada, FPR-rs3 pozitif VSN'lerin TTX duyarlı hızlı aktive olan sodyum akımıyla ilgili tüm hücre patch clamp kayıtlarından alınan temsili izler yer almaktadır.Kontrol koşulları altındaki voltaj basamak kayıtları, voltaja bağımlı hızlı ve geçici bir içe doğru akımı ortaya çıkarmaktadır. Bir mikromolar TTX uygulaması akımı güçlü bir şekilde azaltır. Burada gösterilen dijital olarak çıkarılmış iz ise TTX duyarlı voltaj kapılı sodyum akımını ortaya çıkarmaktadır.Temsili akım kenetleme izleri, basamaklı pozitif ve negatif akım enjeksiyonu üzerine üretilen depolarizasyonu, hiper-polarizasyonu ve aksiyon potansiyeli serilerini göstermektedir. Uzmanlaşıldığında, tüm diseksiyon ve doku dilimleme işlemi her iki VNO için yaklaşık bir saatte tamamlanabilir. Bu prosedürün ardından, daha geniş nöron popülasyonları analiz edilirken verimliliği artırmak amacıyla hücre dışı gevşek yama kayıtları veya kalsiyum görüntüleme gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, ağız vomeronazal organından akut doku kesitlerinin nasıl hazırlanacağı ve vomeronazal duyusal nöronlardan tek hücreli elektrofizyolojik kayıtların nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

in-depth-physiological-analysis-defined-cell-populations-acute-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Multielectrode array (MEA) kayıtları nöronların büyük nüfus elektriksel aktivite eğitimi için bir yöntem sağlar. Burada, aynı anda doku uyarıcı fare vomeronasal epitel kayıt MEA hazırlanması ayrıntılar mevcut.

Vomeronasal Epitel Multielectrode Dizi Kayıtlar

Farelerde, feromonları algılamak için yeteneği esas vomeronasal organ (VNO) tarafından aracılık eder. Burada, kalsiyum görüntüleme yapmak için VNO akut doku dilim hazırlık açıklanmıştır. Bu fizyolojik bir yaklaşımdır alt popülasyonlar ve / veya bireysel nöronlar gözlemleri yaşayan bir doku sağlar ve reseptör-ligand tanımlanması için uygundur.

Görüntüleme Feromon Fare Vomeronasal Akut Doku Dilim Hazırlama içinde Algılama

Vomeronazal organ (VNO), sosyal ve üreme bilgilerini ileten tür içi kimyasal sinyalleri tespit eder. VNO dokusunda G-CaMP2 eksprese eden transgenik fareler kullanarak Ca2+ görüntüleme deneyleri gerçekleştirdik. Bu yaklaşım, vomeronazal nöronların çok sayıda feromon uyarısına verdiği karmaşık yanıt modellerini analiz etmemize olanak tanır.

Görüntüleme Nöronal cevaplar Vomeronasal Organ Dilim hazırlıklar Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensör ifade

Bu video, bir fare vomeronazal organının (VNO) izolasyonunu ve vibratom kesiti için doku hazırlığını özetlemektedir. Bölümler, belirli bir duyusal nöron grubunun biyofiziksel ve fizyolojik özelliklerini karakterize etmek için kullanılır.

Vibratom kesiti için fare vomeronazal organının hazırlanması

Bu video, farelerde koku alma duyusal nöronlarının (OSN'ler) delikli bir yama kelepçesi tekniği kullanılarak elektrofizyolojik kaydını göstermektedir. Florofor etiketli koku reseptörlerine sahip OSN'leri içeren koku alma epiteli, bir fareden izole edilir ve bir kayıt odasında sabitlenir. Bir kayıt pipeti, bir OSN'nin dendritik topuzuna kenetlenir ve pipet içindeki nistatin, hücre ile elektriksel bağlantı oluşturmak için zarı deler. Son olarak, bir koku uyarıcısı vermek için başka bir pipet...

Farelerde Koku Alma Duyu Nöronlarının Delikli Yama-Kelepçe Kaydı

Protokol videosu, farelerde vomeronazal organın (VNO) duyusal nöronlarından elektrofizyolojik kayıt için bir tam hücre yama kelepçesi oluşturmayı açıklar. Floresan olarak işaretlenmiş duyusal nöronlara sahip bir koronal VNO dilimi, bir kayıt kurulumuna yerleştirilir. Etiketli bir nöron, kimyasal uyaranlara yanıt olarak elektrofizyolojik kayıt için tüm hücre konfigürasyonunda bir kayıt pipeti ile yamalanır.

Vomeronazal Duyusal Nöronlardan Elektrofizyolojik Kayıt için Tam Hücre Yama Kelepçesi Oluşturulması

Korunan Anatomik Örgütü ile bozulmamış Fare Burun Doku hazırlamak için etkili bir Manuel kemik sıyırma Yöntemi

Fare aksesuar koku ampul (AOB) duyusal kodlama bağlamında çalışma zor olmuştur. Burada, biz AOB nöronlar fare feromonlar ve Kayromonlar bir bilgi işleme araştırmalarını kolaylaştırmak, onların çevresel girişlerine işlevsel bağlı kaldığı bir ex vivo hazırlık üreten bir diseksiyon göstermektedir.

Bozulmamış Vomeronasal Organ ve Aksesuar Koku Ampul Ex Vivo Hazırlıklar

Koku alma duyusal nöronlarının fizyolojik özelliklerini analiz etmek hala teknik sınırlamalarla karşı karşıyadır. Burada, gen hedefli farelerde koku alma epitelinin sağlam bir preparasyonu içinde delikli yama klempi yoluyla kaydediyoruz. Bu teknik, membran özelliklerinin karakterizasyonuna ve tanımlanmış koku alma reseptörlerini eksprese eden nöronların spesifik ligandlarına verilen yanıtlara izin verir.

Bozulmamış neuroepithelium Fare Koku Duyu Nöronlar Delikli Patch-kelepçe Kayıt: Bir Belirlenen Odorant Reseptör ifade Nöronlar Fonksiyonel Analiz

Bu makale, tek çekirdekli RNA dizilimi amacıyla murin koku alma epitelinin diseksiyonu ve dissosiyasyonu için kolaylaştırılmış bir protokol sağlar.

Tek çekirdekli süspansiyonlar için fare koku alma epitelinin hızlı diseksiyonu ve ayrışması

Keşfedin fare vomeronazal organında akut doku dilimleri kullanarak duyu nöronlarının bütün hücre yama kelepçesi kayıtlarıyla derinlemesine fizyolojik analizini. Bu yöntem kimyasal algılama mekanizmalarını in vivo ortamda araştırmaya olanak tanır.

Fare Vomeronazal Organ Akut Doku Dilimleri Tanımlı hücre popülasyonlarının derinlemesine Fizyolojik Analizi

Daha fazla video keşfet