Fare Vomeronazal Organ Akut Doku Dilimleri Tanımlı hücre popülasyonlarının derinlemesine Fizyolojik Analizi

Bu prosedürün genel amacı, fare vomeronazal organından alınan akut doku kesitlerindeki tanımlanmış bir duyusal nöron popülasyonunun tek hücreli elektrofizyolojik analizini gerçekleştirmektir. Bu yöntem, koku alma mekanizmaları gibi kemosensasyon alanındaki temel soruların aydınlatılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, akut doku kesitlerindeki duyusal nöronlardan kayıt alınarak, bu hücrelerin doğal ortamlarında incelenebilmesidir.

Bu prosedüre başlamak için, hayvanı sakrifiye ettikten sonra, ağız boşluğundan büyük cerrahi makaslar geçirerek alt çeneyi çıkarın; her iki taraftaki mandibula kemiklerini ve kaslarını ayrı ayrı kesin. Ardından, kesici dişlere daha iyi erişim sağlamak için üst çenenin derisini ve burnun ucunun çevresini orta boy forsepslerle temizleyin. Daha sonra, VNO kapsülünün burun boşluğundan çıkarılmasını kolaylaştırmak için kemik makasını kullanarak kesici dişlerin büyük bir kısmını rostral yöne doğru 45 derecelik bir açıyla kesin.

VNO kapsülünün ucunun zarar görmesini önlemek için diş kökünü kesmeyin. Ardından, sert üst damağı rostral kısmından orta boyutlu forseyle tutun ve düz bir açıyla dikkatlice tek parça halinde soyun. Nazal boşluğu buz gibi soğuk S2 solüsyonu ile defalarca yıkayın. Sonrasında, vomer kemiğinin ucu ile çene arasındaki kemik sızıntısını kesmek için mikro yaylı makas kullanın.

Makas uçlarını, kavisli kısım VNO'dan uzağa bakacak şekilde yerleştirin. Ve VNO kapsülünün lateralinde, hem sol hem de sağ tarafta kemiği küçük adımlarla dikkatlice kesin. VNO kapsülünü çıkarmak için vomer kemiğini kaudal kısımdan kesin ve orta boy pensler kullanarak vomer kemiğini burun boşluğundan dikkatlice kaldırın.

VNO'yu hemen, buz jeli paketinin üzerindeki bir stereo mikroskop altında küçük bir petri kabına aktarın; disseksiyonun geri kalan adımları burada gerçekleştirilmelidir. Daha sonra, dokunun kurumasını önlemek için VNO'yu az miktarda buz gibi soğuk S2 ile yıkayın. Ardından, orta uçlu pensle vomer kemiğinin arka kısmını tutarak VNO yumuşak dokularını içeren kıkırdak kapsülleri ayırın.

Bunun için, her iki VNO arasındaki ayrım görünür hale gelecek şekilde kapsülü dorsal görünüm için konumlandırın. Vomer kemiğini arka kısımda sabitlenmiş halde tutarken, ince uçlu bir pensetin ucuyla her iki kıkırdak VNO kapsülünü merkezi kemikten ayırın. Daha önce vomer kemiğine yapışık olan medial kıkırdak duvarın kaldırıldığından emin olun.

VNO çevresindeki kıkırdağı temizlerken pensleri yalnızca kıkırdak kapsülünün kenarında kullanın. Hassas duyusal epitelyuma zarar vermemeye çok dikkat edin. Kalan kıkırdağı temizlemek için VNO'yu, kavisli lateral tarafı kabın altına gelecek şekilde döndürün ve kıkırdağı bir taraftan pens kullanarak güvenli bir şekilde sabitleyin.

Ardından, doku ile kıkırdak arasındaki bağlantıyı gevşetmek için ikinci ince penseti, kıkırdak ile VNO arasından çok düz bir açıyla arka taraftan dikkatlice hareket ettirin. Sensoriyel epitelyuma zarar vermemek için VNO'yu kaudal ucundan tutarak kıkırdaktan yavaşça soyun. VNO kapsülden kaldırıldıktan sonra, kalan tüm küçük kıkırdak parçalarını temizleyin; çünkü kalan kıkırdak parçaları, dilimleme işlemi sırasında dokunun çevredeki agarozdan ayrılmasına neden olacaktır.

Ardından, doku hasarını önlemek için diseke edilen ilk VNO üzerine küçük bir damla buz soğukluğunda S2 yerleştirin. VNO'ları gömmek için, her iki küçük petri kabını kenarına kadar eritilmiş S3 ile doldurun. Bundan sonra, her bir VNO'yu agaroz içine daldırın ve yüzeyindeki hücre dışı çözelti tabakasını ve varsa hava kabarcıklarını gidermek için yatay olarak birkaç kez ileri geri hareket ettirin. VNO'yu, rostral ucu kabın tabanına bakacak şekilde dikey olarak konumlandırın.

Ardından, her iki kabı da jel buz paketinin üzerine yerleştirin ve agaroz katılaşana kadar bekleyin. Agaroz katılaşmaya başladıktan sonra VNO yönünü değiştirmeyin, çünkü bu durum dokunun çevredeki agarozdan ayrılmasına neden olur. Bu işlemde, agaroz bloğunu küçük kaptan alıp geniş bir petri kabının kapağına yerleştirmek için küçük bir spatula kullanın ve VNO'nun rostral ucunu yukarı bakacak şekilde agarozu ters çevirin.

Ardından, gömülü dokuya zarar vermemeye dikkat ederek, bloğu cerrahi bir bistüri ile piramit şeklinde kesin. Daha sonra, piramit şeklindeki bloğu vibratom numune plakasının merkezine sabitlemek için hızlı yapıştırıcı kullanın. Yapıştırıcının tamamen kuruması için yaklaşık bir dakika bekleyin.

Numuneyi 150 ila 200 mikrometre kalınlığında kesitlere ayırın. Kesit morfolojisini diseksiyon mikroskobu altında kısaca inceleyin. Ardından, tüm kesitleri kullanıma kadar oksijenasyon odasına aktarın.

Bu adımda, bir VNO dilimini görüntüleme haznesine aktarın ve dilimin konumunu 0,1 mm kalınlığındaki sentetik liflerle bağlanmış paslanmaz çelik ankrajlar kullanarak sabitleyin. Doku dilimini sentetik fiber ipliklerden herhangi biriyle örtmeyin. Ardından, görüntüleme haznesini kayıt düzeneğine aktarın ve dilimi oda sıcaklığında oksijenle zenginleştirilmiş S2 ile sürekli olarak süperfüze edin.

Banyo çözeltisinin sabit bir değişimini sağlamak için emme kapilerini çözeltinin yüzeyine göre ayarlayın. Ardından, kan damarını içeren VNO diliminin duyusal olmayan kısmının üzerine ve yakınına sekizli çok kanallı perfüzyon kalemini yerleştirip ayarlayın. Sonrasında, 150 millimolar potasyum klorür ile doldurulmuş L şeklinde agar köprüsü kullanarak referans elektrodu ve banyo çözeltisini birbirine bağlayın.

Ardından, patch pipeti S4 pipet çözeltisi ile doldurun. Pipeti, kaplamayı kazımadan, kafa aşamasına bağlı gümüş klorür kaplı elektrot üzerine yerleştirin ve sıkıca sabitleyin. Daha sonra, banyoya girmeden önce patch pipete hafif pozitif basınç uygulayın. Pipeti izleyin ve direncin 4 megaohm ile 10 megaohm arasında olduğundan emin olun.

Kızılötesi optimize DIC kullanarak VNO kesitini bir CCD kamera ile görüntüleyin ve floresans aydınlatma ile uygun bir filtre küpü yardımıyla FPR-rs3 i-Venus ekspres eden hücreleri veya benzer şekilde işaretlenmiş nöronları tanımlayın. Maksimum hassasiyet için hücre gövdesine el tekerleklerini kullanarak yaklaşın. Pozitif basınç nedeniyle, pipet ucu yakın mesafeye geldiğinde hücre soma membranında küçük bir çöküntü görünür hale gelir.

Ardından pozitif basıncı serbest bırakın ve 1 ila 20 gigaohm değerinde yüksek dirençli bir sızdırmazlık sağlamak amacıyla hücre membranını içeri çekmek için hafif negatif basınç uygulayın. Sonrasında, hücre membranını bozmak ve tüm hücre konfigürasyonunu kurmak için kısa ve nazik bir vakum uygulayın. Bu şekilde, koronal VNO doku kesitinin konfokal görüntüsü, vomeronasal duyusal epiteldeki floresan FPR-rs3 Tau Venus pozitif nöronların dağılımını göstermektedir.

FPR-rs3 Tau Venus pozitif nöronlar, lüminal sınırda yumru benzeri bir yapıyla sonlanan tek bir apikal dendrit sergiler. Burada, VSN somasından gerçekleştirilen tüm hücre patch clamp kayıtları gösterilmektedir. Burada, FPR-rs3 pozitif VSN'lerin TTX duyarlı hızlı aktive olan sodyum akımıyla ilgili tüm hücre patch clamp kayıtlarından alınan temsili izler yer almaktadır.

Kontrol koşulları altındaki voltaj basamak kayıtları, voltaja bağımlı hızlı ve geçici bir içe doğru akımı ortaya çıkarmaktadır. Bir mikromolar TTX uygulaması akımı güçlü bir şekilde azaltır. Burada gösterilen dijital olarak çıkarılmış iz ise TTX duyarlı voltaj kapılı sodyum akımını ortaya çıkarmaktadır.

Temsili akım kenetleme izleri, basamaklı pozitif ve negatif akım enjeksiyonu üzerine üretilen depolarizasyonu, hiper-polarizasyonu ve aksiyon potansiyeli serilerini göstermektedir. Uzmanlaşıldığında, tüm diseksiyon ve doku dilimleme işlemi her iki VNO için yaklaşık bir saatte tamamlanabilir. Bu prosedürün ardından, daha geniş nöron popülasyonları analiz edilirken verimliliği artırmak amacıyla hücre dışı gevşek yama kayıtları veya kalsiyum görüntüleme gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, ağız vomeronazal organından akut doku kesitlerinin nasıl hazırlanacağı ve vomeronazal duyusal nöronlardan tek hücreli elektrofizyolojik kayıtların nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.