Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Bu Afinite Yakalama Protokolünün genel amacı, memeli hücrelerinden endojen protein komplekslerini izole etmektir. Bu yöntem, hücre ve moleküler biyolojide, hangi proteinlerin fiziksel olarak bağlı fonksiyonel modüller halinde bir araya geldiği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, ilgilenilen hedef protein ile ilişkili çok sayıda fiziksel etkileşimin aynı anda gözlemlenebilmesidir.

Metin protokolünde açıklandığı gibi bir ila sekiz gram hücre büyütün. Büyüme ortamını büyük bir behere dökün. Ardından, kültür kabını büyük bir dikdörtgen buz kabında buzun üzerine yerleştirin.

Kültür kabına 20 mililitre buz gibi soğuk 1x fosfat tamponlu salin veya PBS ekleyin ve büyük bir hücre sıyırıcı kullanarak hücreleri tabaktan serbest bırakın. Hücreleri buz üzerinde önceden soğutulmuş 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Aynı yemeğe 10 mililitre daha buz gibi soğuk 1x PBS ekleyin.

Kalan hücreleri toplayın ve 50 mililitrelik tüpe aktarın. Her yemek için bu işlemi tekrarlayın. Farklı tabaklardan elde edilen hücre süspansiyonları, numune sayısını ve plastik atıkları azaltmak için birleştirilebilir.

Daha sonra, numuneleri dört santigrat derecede 1.000 x g'de beş dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, süpernatanı dikkatlice dökün. Her peleti on mililitre buz gibi soğuk 1x PBS'de yeniden süspanse edin.

Yeniden askıya alınan peletleri 50 mililitrelik tüp başına beşe kadar konsolide edin. Boş tüpleri 10 mililitre PBS ile yıkayın. Çözeltiyi konsolide numunelere ekleyin ve daha önce olduğu gibi santrifüjleyin.

Süpernatanı çıkardıktan sonra, peleti 10 mililitre buz gibi soğuk 1x PBS'de yeniden süspanse edin. Pistonu 20 mililitrelik bir şırıngadan çıkarın ve bir kenara koyun. Şırınganın ağzını kapatın, şırıngayı 50 mililitrelik bir tüpün içine yerleştirin ve hücre süspansiyonunu oraya aktarın.

1000 x g, dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Hücrelerin üst tabakası emilmeye başlayana kadar süpernatanı bir vakum tuzağı sistemine bağlı ince uçlu bir pipetle aspire edin. Bu, ıslak hücreli bir pelet ile sonuçlanır.

Şırınganın kapağını açın, pistonu yerleştirin ve hücreleri doğrudan bir strafor kutuda sıvı nitrojen banyosunda tutulan sıvı nitrojenle dolu büyük bir plastik behere damlatın. Kalan hücreleri şırıngadan zorla daldırın. Daha sonra, donmuş hücreleri 50 mililitrelik tüplere dökün.

Fazla sıvı nitrojenin buharlaşmasına izin vermek için tüpleri gevşek bir şekilde kapatın. Onları gece boyunca 80 santigrat derecede tutun. Ertesi gün kapakları tamamen sıkın.

Donmuş hücreler, kriyofrezelemeye kadar bu şekilde 80 santigrat derecede saklanabilir. Hücre boncuklarını 80 santigrat derece dondurucudan çıkarın ve sıvı nitrojen banyosunda 50 mililitrelik bir tüp tutucuya yerleştirin. 50 mililitrelik bir kavanozu, iki adet 20 milimetrelik bilyeyi ve kavanoz kapağını sıvı nitrojen içeren temiz bir dikdörtgen buz kovasında önceden soğutun.

Ayrıca, bir PTFE yalıtkanını önceden soğutun. Bir dizi disk veya bir manşon ve disk kullanın. Değirmende uygun dengeyi ayarlayın.

Forseps kullanarak, önceden soğutulmuş iki 20 milimetre öğütme bilyesini ve donmuş hücreleri önceden soğutulmuş öğütme kavanozunun içine yerleştirin. Kavanoza yarıya kadar sıvı nitrojen ekleyin, kapağı kavanozun üzerine yerleştirin ve düzeneği değirmene aktarın. Düzeneği yerine kenetleyin ve 400 rpm'lik bir program kullanarak, üç dakika, her dakika ters dönüş ve aralık kesintisi olmadan üç döngü frezeleme gerçekleştirin.

Frezeleme sırasında bilyelerin tıkırdadığını duymak çok önemlidir, bu, bilyelerin çarpıştığını ve malzemeyi toz haline getirdiğini gösterir. Bu sesin duyulmaması, frezelemenin gerçekleşmediği anlamına gelir. Üç öğütme döngüsünün tamamlanmasının ardından kavanozu tekrar sıvı nitrojene getirin ve soğuması için bir an dinlenmeye bırakın.

Kapağı dikkatlice çıkarın. Forseps kullanarak topları çıkarın ve tozu önceden soğutulmuş bir spatula kullanarak önceden soğutulmuş 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Kavanoza sıvı nitrojen eklemenin, topların üzerine yapışan tozun çıkmasına yardımcı olabileceğini unutmayın.

Hücre ekstraktının hazırlanması için, 100 miligram hücre tozunu önceden soğutulmuş 1.5 veya iki mililitrelik bir mikrofüj tüpüne tartın. Boş mikrofüj tüpü ile analitik terazinin darasını alın. Sıvı nitrojen soğutmalı bir kaşık veya spatula kullanarak hücre tozunu tüpe dağıtın.

Tüpü sıvı nitrojene geri döndürmeden önce tüp içinde dağıtılan tozun kütlesini analitik terazide kontrol edin. Tüpü hücre tozu ile açın ve tüp içindeki basıncı serbest bırakmak ve toza eklendiğinde ekstraksiyon tamponunun hemen donmasını önlemek için bir dakika oda sıcaklığında bekletin. Tüpe proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş 400 mikrolitre özütleyici ekleyin.

Tüpü kısa bir süre girdaplayın ve ardından buzu tutun. Numuneye kısa bir düşük enerjili nabız vermek ve herhangi bir agregayı dağıtmak için bir mikro uçlu ultrasonicator kullanın. Ekstraktı santrifüjleme ile netleştirin.

Son olarak, süpernatanı çıkarın ve afinite yakalamaya devam edin. Afinite ortamını önceden yıkamak için, antikor bağlı paramanyetik boncuklar içeren tüpleri mıknatısın üzerine yerleştirin. Boncuklar saniyeler içinde tüpün yan tarafında birikecek ve depolama çözeltisinin çıkarılmasına izin verecektir.

Ardından, boncuklara 500 mikrolitre ekstraksiyon tamponu ekleyin. Karıştırmak için kısa bir süre orta hızda girdap. Pluse, tüm içeriği tüpün dibine toplamak için tüpleri mini bir santrifüjde döndürün.

Ardından tüpleri mıknatısın üzerine yerleştirin ve çözeltiyi aspire edin. Arıtılmış hücre ekstraktını önceden yıkanmış afinite ortamı içeren tüplere aktararak afinite yakalamayı başlatın ve kısaca girdap yapın. Tüpleri dört santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin ve bir döndürücü tekerlek üzerinde sürekli yumuşak bir şekilde karıştırın.

Boncuklar inkübasyon boyunca asılı kalmalıdır. Süpernatanı aspire edin ve boncukları bir mililitre soğuk ekstraksiyon tamponu ile üç kez yıkayın. Proteinleri elüte etmek için, boncuklardan antikor zincirlerinin salınımını azaltmak için indirgeyici ajan olmadan SDS sayfası numune tamponu ekleyin.

Çalkalama ile oda sıcaklığında beş ila on dakika inkübe edin. Süpernatanı toplayın ve kaydedin, ardından numuneleri SDS sayfasına tabi tutun, ardından standart teknikler kullanarak protein boyama yapın. Bireysel protein bantları tanımlama için eksize edilebilir veya numunenin tamamı, numunenin sadece kısa bir süre elektroforla elektroforez edilmesiyle tek bir analizde karakterize edilebilir.

Afinite yakalama için kullanılan çözünmeyen ortamı içeren malzeme, geri kazanılan proteomu etkileyebilir. Burada manyetik boncuklar, demir emdirilmiş agaroz ve geleneksel agaroz gösterilmiştir. Her besiyeri, anti-FLAG M2 antikorlarına bağlandı ve kriyofrezelenmiş HEK 293 hücrelerinden üretilen ekstraktlara çivilenmiş FLAG etiketli bakteriyel alkalin fosfatazı yakalamak için kullanıldı.

Mikron ölçekli manyetik boncuklar, nispeten düşük bir spesifik olmayan protein adsorpsiyon seviyesini gösteren en temiz profili gösterdi. Hücre lizisi yöntemi, geri kazanılan proteomu da etkileyebilir. Burada, endojen bir protein kompleksi, kriyofrezelenmiş veya sonikasyonlu hücre ekstraktlarından afinite yakalamaya tabi tutuldu.

Hücre ekstraktı, kriyofrezelenmiş hücre tozundan üretildiğinde daha az yüksek kütleli kirletici gözlendi. Manyetik medya diğer ortamlardan daha düşük arka plan sergileyebilse de, antikorun kendisi, özellikle hedef antijeninin yokluğunda, yanlış pozitif kontaminasyonun adsorpsiyonunu kolaylaştırabilir. Antikor paratopları dolu olduğunda veya işgal edilmediğinde anti-FLAG manyetik ortamının katkıda bulunduğu arka plan bağlanmasını belirlemek için, 3x FLAG peptit spike-in'inin varlığında veya yokluğunda HEK 293T hücre ekstraktları kullanılarak sahte afinite yakalama deneyleri yapıldı.

Aynı kökenli epitopunun yokluğunda, alfa FLAG ortamı, 3x FLAG peptidi ile rekabetçi bir şekilde kaçınılabilen ve SDS sayfa numune tamponu tarafından daha büyük ölçüde kaçınılabilen saptanabilir bir arka plan proteini seviyesi yakalar. 37 ila 50 kilodalton arasında baskın bir kirletici tür gözlendi. Rakip bir epitopun varlığında, hem 3x FLAG hem de SDS bazlı elütsyonlar, arka plan protein bağlanmasından nispeten ücretsizdir.

Bu prosedürü denerken, dikkatli, hızlı ve hassas bir şekilde çalışmak önemlidir. Sonuçlarınız için hangi adımların en kritik olduğunu öğrenmek için prosedürlerinizi ve gözlemlenen varyasyonları takip edin. Bu prosedürü takiben, karışımın bileşimini, homojenlik seviyesini ve kurucu makromoleküler komplekslerin boyutunu ve şeklini analiz etmek için kütle spektrometresi, hız-bölgesel santrifüjleme ve elektron mikroskobu gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Geliştirilmesinden sonra, afinite yakalama, proteomik alanındaki araştırmacıların, fizyolojik protein komplekslerinin bileşimlerini benzersiz ayrıntılarla keşfetmelerinin yolunu açtı ve bu, devam eden bir küresel araştırma çabası olmaya devam ediyor. Bu videoyu izledikten sonra, memeli hücrelerinin kriyofrezeleme için nasıl hazırlanacağını ve ilgilenilen bir proteinin afinite yakalamasının nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.