Bitki patojeni olarak genetik manipülasyonu Ustilago maydis Mantar Biyoloji ve Bitki Mikrop Etkileşimleri Eğitim için

Bu protokolün genel amacı, is mantarı olan ustilago maydis'i genetik olarak değiştirmektir. Bu suş oluşturma yöntemi, genlerin çeşitli şekillerde fonksiyonel karakterizasyonuna izin verir. Örneğin, genleri silebiliriz, promotusu değiştirebiliriz veya füzyon yapıları oluşturabiliriz.

Bu yöntemin temel avantajı, modifikasyonu kesin olarak doğrulayabilmemizdir, böylece herhangi bir fenotip, ilgilenilen gendeki değişiklikle doğrudan bağlantılı olabilir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi önemlidir, çünkü protoplasting reaksiyonun ne zaman durdurulacağını bilmek başarılı dönüşüm için kritik öneme sahiptir. Hazırlık olarak, iki mililitrelik yuvarlak tabanlı tüpleri eksi 20 santigrat derecede soğutun.

Daha sonra, yeni bir plaka kullanarak üç mililitrelik bir ön kültürü YEPS-Light'ta aşılayın. 28 santigrat derecede dönen bir tekerlek üzerinde 24 saat inkübe edin. Ertesi gün, şaşkın bir şişede 50 mililitre YEPS-Light'a 25 mikrolitre ön kültür ekleyin.

Ardından, üstel faza ulaşana kadar kültürü bir orbital çalkalayıcı üzerinde büyütün. 1.0'lık bir optik yoğunluk, ustilago maydis'teki bir ila iki çarpı 10 ila yedinci hücrelere karşılık gelir. 600 nanometrede optik yoğunluğu kontrol edin.

0,6 ile 1,0 arasında bir değer kabul edilebilir. Ardından, hücrelerde 40x büyütme altında kontaminasyon olup olmadığını kontrol edin. Bakteriyel kontaminasyonlar, küçük ve sıklıkla hareket eden hücreler olarak tanımlanabilir.

Mantar kontaminasyonları, şekillerine veya boyutlarına göre tanımlanabilir. Her zaman kontamine kültürleri atın ve sadece temiz olanlardan çalışın. Hücreleri 1.500 G'de beş dakika boyunca peletledikten sonra, süpernantantı atın.

Ardından, peleti 25 mililitre SCS'de tekrar askıya alın. Santrifüjlemeyi tekrarlayın. Ve bu arada, hücre peleti başına üç mililitre protoplasting çözelti hazırlayın.

Bu çözeltiyi 22 mikronluk bir filtreden geçirin. Şimdi süpernatanı atın ve peleti iki mililitre protoplasting çözelti içinde yeniden askıya alın. Daha sonra hücrelerin %30 ila 40'ı yuvarlak veya toplu iğne başı şeklinde olana kadar oda sıcaklığında dinlendirin.

Reaksiyon beş ila 20 dakika sürebilir. Beş dakika sonra mikroskop altında gözlemlemeye başlayın. Maksimum dönüşüm verimliliğini elde etmek için protoplastik reaksiyonun doğru zamanda durdurulması gerekir.

Ve sonra, protoplastlar sabun köpüğü gibi çok dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Protoplastları her zaman buz üzerinde tutarak protokole devam edin. Bir sonraki adım, onları 10 mililitre soğuk SCS ile yıkamak ve daha sonra 1.000 G'de beş dakikalık bir dönüşle toplamaktır.

Yıkamalardan sonra, peleti 10 mililitre soğuk STC'de tekrar süspanse edin. Daha sonra hücreleri 1.000 G'de beş dakikalık bir dönüşle tekrar toplayın, ardından 1 mililitre soğuk STC'de tekrar süspanse edin. Şimdi soğuk tüplerde 100 mikrolitrelik alikotlar yapın ve bu alikotları eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Ustilago maydis protoplastlarını dönüştürmek için, dönüşüm başına iki seçim hazırlayın. İlk önce RegLight agar'ı eritin ve 60 santigrat dereceye kadar soğutun. Daha sonra, erimiş agarın bir kısmına, seçici antibiyotiği çalışma konsantrasyonunun iki katı olarak ekleyin ve alt tabakayı oluşturmak için her plakaya 12 mililitre ekleyin.

Numune dikkatlice karıştırılmalıdır. Baloncuk yapmaktan kaçının. Kalan RegLight'ı antibiyotiksiz olarak 60 santigrat derecede tutun.

Daha sonra, her dönüşüm için buz üzerinde bir tüp protoplast çözün. Çözüldükten sonra, bir mikrolitre heparin çözeltisi ve bir mikrogram doğrusallaştırılmış yapı DNA'sı ekleyin. Sonra onları 10 dakika buz üzerinde tutun.

Beklerken 12 mililitre antibiyotiksiz RegLight'ı antibiyotikli RegLight'ın üzerine yayın. Daha sonra, her bir dönüşüm tüpüne 500 mikrolitre STC / PEG ekleyin ve bunları inversiyonlarla dikkatlice karıştırın. Daha sonra buz üzerinde inkübasyona 15 dakika daha devam edin.

Şimdi her dönüşüm reaksiyonunu iki ayrı seçici RegLight plakasına dağıtın. Devam etmeden önce tüm sıvının plakalara batırıldığından emin olun. Ardından, 100 ila 200 koloni elde etmek için plakaları beş ila yedi gün boyunca 28 santigrat derecede dik olarak inkübe edin.

Sadece birkaç koloni büyürse, protoplastlar çok fazla hücre duvarı içerebilir ve bu, onları hücre üreten bir plazma ile dönüştürerek test edilebilir veya yenilenemeyebilir ve bu, onları antibiyotiksiz plakalara ekerek test edilebilir. Daha sonra test için 24 dönüştürücü seçin. Tek koloniler elde etmek için onları seçici YEPS-Light üzerinde yeniden saflaştırın.

Her plakada, antibiyotiklerin dönüştürücü olmayanlara karşı seçim yaptığından emin olmak için orijinal suşun bir kısmını da çizin. Mutasyonları, iki PCR ve bir Southern Blot analizi içeren üç aşamalı bir süreç kullanarak doğrulamak çok önemlidir. Bunlar metin protokolünde detaylandırılmıştır.

Bu bölüm, bu analizler için gerekli olan genomik DNA'nın nasıl hazırlanacağını açıklamaktadır. İlk olarak, beş mililitre YEPS-Light'ı aday dönüştürücü ile aşılayın ve 28 santigrat derecede 24 saat boyunca dönen bir tekerlek üzerinde inkübe edin. Ertesi gün, kültürün iki mikrolitresini bir CM plakasına bırakın.

Kültürü steril tutun. Daha sonra yaklaşık 200 mikrolitre hidroklorik asitle yıkanmış cam boncuk ve iki mililitre 24 saatlik kültür içeren iki mililitrelik bir tüp hazırlayın. Tüpü beş dakika boyunca 12.000 G'de döndürdükten sonra, süpernatanı aspire edin ve atın.

Depolama için dondurulabilen pelete 500 mikrolitre usti-lizis tamponu iki ekleyin. Ardından tüpü bir Vibrax üzerinde 1.000 RPM'de beş ila 15 dakika çalkalayın. Hücrelerin tamamen yeniden süspanse edildiğinden emin olun, ardından tüpü 65 santigrat derecede 15 ila 20 dakika inkübe edin.

Ardından, tüpü beş dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Soğuduktan sonra, 100 mikrolitre 8 molar potasyum asetat ekleyin ve kısa bir girdap veya on inversiyon uygulayın. Daha sonra, tüpü oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 12.000 G'de döndürün.

Daha sonra, süpernatantın 500 mikrolitresini 1.5 mililitrelik bir tüpe alikotlayın ve alikota 400 mikrolitre izopropanol ekleyin. Karıştırdıktan sonra, tüpü 12.000 G'de beş dakika boyunca döndürün. Süpernatanı atın ve peletlenmiş DNA'yı 500 mikrolitre% 70 etanol ile yıkayın. Şimdi beş dakikalık bir dönüş uygulayın ve süpernatanı tamamen çıkarın.

Kısa bir dönüşten sonra, DNA peletinin birkaç dakika kurumasını bekleyin ve ardından 50 mikrolitre RNase NTE ekleyin. RNaz'ı ekledikten sonra, çalkalayarak inkübe edin ve ardından analizler için DNA'yı kullanmaya devam edin. Cintinazların tek ve çift mutantları cts3 delta ve diğer üç kitinaz genine sahip çoklu mutantlar, iki farklı genetik arka planda aynı yapılarla sırayla üretildi.

Transformantlar PCR ve daha sonra Southern Blot analizi ile doğrulandı. cts3 geni için, SG200 suşunda homolog rekombinasyon oranı %70 idi, bu da cts3'ün esansiyel olmayan bir işlevi olduğunu düşündürmektedir. Bazı mutasyonlar belirgin büyüme kusurlarına yol açar.

Örneğin, cts1/2 çift mutantında belirgin bir hücre ayırma kusuru vardı. Septanın boyanması, sitokinezin tamamlanacağını, ancak hücrelerin bağlı kalacağını gösterdi. Kitinazların virülansa katkısını test etmek için, SG200 suş mutantları kullanılarak fide enfeksiyonu testleri gerçekleştirildi.

Kontrollü bir gen olan khd4'ün mutasyonu virülansı azaltırken, tüm kitinazların silinmesi mısır fidelerinin enfeksiyonunu etkilemedi. Bu videoyu izledikten sonra, ustilago maydis gibi is mantarlarının genetik olarak nasıl değiştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, suşlar yaklaşık dört hafta içinde kolayca oluşturulabilir.

Bu prosedürü kullanırken, gelecekteki klonlama programlarını kullanarak gerinim doğrulama detayını planlamak gerçekten önemlidir. Mantar kültürleriyle çalışmaya başlamadan önce bunu yapın. Bu prosedürde yapılan küçük değişikliklerle, sporsorium reilianum veya ustilago esculenta gibi diğer is mantarları ve hatta piriformospora indica gibi filamentli mantarlar genetik olarak değiştirilebilir.

Genetiği değiştirilmiş organizmalarla çalışmanın ülkenizdeki düzenlemelere göre yapılması gerektiğini unutmayın.