Ventral Kök Stimulation için eğik Omurilik Dilimleri hazırlanması

Biz genç farelerde omurilik eğik dilim nasıl hazırlanacağını göstermektedir. Bu preparat, ventral köklerin uyarılması için izin verir.

Bu prosedürün genel amacı, ventral köklerin uyarılmasına izin veren omuriliğin eğik dilimlerini hazırlamaktır. Bu tekniğin temel avantajı, ventral-kök stimülasyonu için motoronöral tanımlamalara izin vermesi ve motorinöral akson kollateralleri tarafından zayıflatılan ventral hücrelerin incelenmesine izin vermesidir. İlk olarak ventral hücreleri uyarmak için güvenilir bir yola ihtiyaç duyduğumuzda bu yöntem için fikir sahibi olduk.

Bu yönteme yeni olan kişiler, diseksiyonun farklı adımlarını düzgün bir şekilde yürütmenin zorluğu nedeniyle mücadele edeceklerdir. Düşük sodyumlu ACSF ile P2 ila P11 fareyi perfüze ederek başlayın. Farenin kafasını kestikten ve sırttaki cildi çıkardıktan sonra, omuzlardan ve göğüs kafesinden aşağı doğru iki kesik yapın.

Ardından, omur kolonu ve kaburgaları hayvanın alt kısmından izole etmek için omuriliği kaudal bölümde mümkün olduğunca düşük kesin. Vertebral sütunu çevirin ve hala kaburgalara bağlı olan iç organları çıkarın. Vertebra kolonu daha küçük, silikon dolgulu başka bir Petri kabına aktarın.

Soğuk ACSF ekleyin ve karbojen ile kabarcık ekleyin ve dokuyu sırt tarafı yukarı tutmak için dört böcek pimi kullanın. Daha sonra, önce ince makasın ucunu kemik ile omurilik arasına sokarak ve kemiği rostral uçtan keserek, beyaz maddeden uzak durduğunuzdan emin olarak sırt tarafına laminektomi yapın. Zaten kesilmiş olan kemik bandını tutmak için cımbız kullanırken her iki taraftaki kesikleri değiştirin.

Ardından, durayı kaldırmak için küçük cımbız ve her iki taraftaki rostral kaudal erişim boyunca kesmek için küçük makas kullanın. Duranın çıkarılması kritik bir adımdır. Bunu iyice yapmak için fazladan birkaç dakika harcamaya değer.

Dura çıkarıldıktan sonra, kordonu yarı kesilmiş omurga tarafından oluşturulan oluğun sol tarafına doğru nazikçe itmek için kör bir cam uç kullanın. Daha sonra ventral ve dorsal kökleri parlak tarafta, kordona girdikleri yerden mümkün olduğunca kesin. İşlemi sol tarafta tekrarlayın, her zaman rostraldan kaudal'a gidin.

Diseksiyondan sonra omuriliği vertebral kolondan dışarı kaydırın. Ardından, sırt yüzeyi yukarı gelecek şekilde kabloyu sabitlemek için küçük bir böcek pimi kullanın. Bağlı zar parçalarını hassas bir şekilde çıkarın.

Temizlendikten sonra, kablonun her iki ucunu kesin ve yönünü işaretlemek için kablonun ön kısmına bükülmüş bir böcek pimi yerleştirin. Daha sonra omuriliği buz gibi soğuk hücre içi çözeltiye aktarın. Daha sonra, önceden hazırlanmış erimiş agarı bir buz ve su karışımı üzerinde soğutun.

Sıcaklığı ölçerken agarı karıştırın. Agarın sıcaklığı 38 santigrat dereceye ulaştığında, omuriliği böcek iğnesinden tutun ve rostral tarafı aşağı bakacak şekilde agarın içine daldırın. Omuriliğin mümkün olduğunca düz olduğundan, duvarlardan uzakta olduğundan ve kuyruk kısmı hafifçe yukarı bakacak şekilde olduğundan emin olun.

Agarın kordonun etrafında mümkün olduğunca çabuk katılaşmasını sağlamak için beheri buz ve su karışımında bırakın. Katılaşmadan sonra, omuriliği içeren agar bloğunu, bloğun tabanı kordun bel kısmı ile 35 derecelik bir açıda olacak şekilde kesin. Sırt yüzeyi tabandan uzağa bakmalıdır.

Siyanoakrilat yapıştırıcı kullanarak bloğu vibratom haznesine yapıştırın. Motor havuzlarının çıktıkları ventral köklerle sürekliliğini sağlamak için bloğun doğru şekilde monte edilmesi çok önemlidir. Bloğu potasyum glukonat çözeltisine daldırın.

Vibratom parametrelerini ayarlayın. Daha sonra, bel bölgesinin eğriliği ve daha büyük çapı ile tanımlanabilen 350 400 mikron kalınlığında dilimler kesin. Uygun dilimleri 34 santigrat derecede ACSF'ye aktarın.

Tipik olarak, iki milimetre veya daha fazla uzanan ventral kökleri olan dört ila beş uygun dilim vardır. 34 santigrat derecede yaklaşık 30 dakika bekledikten sonra dilimleri oda sıcaklığına soğutun ve ardından kayıt seansına başlayın. Önceden 40 ila 170 mikron arasında değişen uç çaplarına sahip çeşitli pipetlerden oluşan bir kutu hazırlayın.

Kesit pipetlerini hazırlamak için uzun tapure'lu pipetleri seçin. Daha sonra, bir elmas bıçak kullanarak, farklı pozisyonlarda kesimler yapın ve diseksiyon mikroskobu altında, her bir pipeti cımbızla ucuna vurarak kırın. Ardından, odayı kayıt mikroskobundan çıkarın ve bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin.

Bir emme stimülasyon elektroduna monte edilmek üzere yeterli uzunlukta bir ventral kök içeren bir dilim seçin. Dilimi ventral kökler yukarı bakacak şekilde yönlendirerek monte edin, ardından agarın geri kalanını dilimin etrafında bırakırken agarı ventral köklerin etrafında hassas bir şekilde kesin ve numuneyi aşağıda tutmak için ızgarayı yerleştirin. Hazneyi tekrar mikroskobun üzerine monte edin ve kayıt haznesini oda sıcaklığında dakikada bir ila iki mililitre hızında ACSF ile sürekli olarak perfüze edin.

ACSF ile doldurulmuş ve bir şırıngaya bağlı bir cam pipet kullanarak, ventral köklerden birini emdirin. Ventral kökün iyi bir şekilde uyarılmasını sağlamak için, pipet ucunun ventral kök etrafında sıkı olması gerekir. İstenen hücre tipinin yama kelepçesi kaydını elde edin ve daha önce tarif edildiği gibi ventral kök stimülasyonunun etkisini kaydedin.

Bu görüntü, voltaj-kelepçe kaydından elde edilen sonuçları göstermektedir. Üst panellerin kayıtları, alt panellerdekilerden farklı motonöronlardan alınır. Üst panel, bir motonöronun kırmızı renkte bir voltluk stimülasyona ve siyah renkte beş voltluk bir stimülasyona karşı antidromik tepkisini gösterir.

Alttaki iz, kırmızı renkte 20 voltluk bir stimülasyona ve siyah renkte 30 voltluk bir stimülasyona ortodromik aksiyon potansiyeli yanıtını gösterir. Siyah noktalar uyaran zamanlamasını gösterir. Çift ok başları, orto ve antidromik sivri uçlar arasındaki gecikme farkını vurgular.

Burada, mevcut kelepçe kayıtları gösterilir. Üst panel, sırasıyla kırmızı ve siyah renkte 10 volt ve 15 volt stimülasyonlara antidromik yanıtı gösterir. Alt panel, sırasıyla kırmızı ve siyah olarak 25 ve 40 voltluk stimülasyonlara ortodromik yanıtı gösterir.

Yine, uyaran zamanlaması ve gecikmelerdeki farklılıklar belirtilir. Renshaw hücre havuzunun bu görüntüsü, eğik bir kondansatör ve 20x'lik bir objektif kullanılarak elde edildi. Okla gösterildiği gibi ventral köke birleşen motonöron aksonlarına dikkat edin.

Aynı bölgenin bu görüntüsü 40x objektif kullanılarak çekilmiştir. Varsayılan Renshaw hücreleri ok başları ile gösterilir. Burada gösterilen, siyah nokta ile gösterilen ventral kökün uyarılmasını takiben bir Renshaw hücresinin voltaj kelepçesi kaydıdır.

Hücre içi çözeltideki QX-314, hücrenin ateşlenmesini engelledi ve glisin ve gaba yanıtları sırasıyla 3 mikromolar gabazin ve bir mikromolar striknin tarafından bloke edildi. Kırmızı iz, gri olanların ortalamasıdır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik 20 veya 30 dakika içinde gerçekleştirilebilir.

Bu prosedürü denerken, hazırlığı her zaman soğuk ortamda tutmayı unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, ventral kök stimülasyonuna uygun eğik omurilik dilimlerinin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız. Ventral kök stimülasyonu, motorinöral kimliği kolayca doğrulamak ve daha da önemlisi ventral hücreleri güvenilir bir şekilde uyarmak için kullanılabilir.