Dünya Tarım Pest Böcek Embriyo Mikroenjeksiyon yoluyla Nükleik Asitler teslim edilmesi,

Bu prosedürün genel amacı, önemli bir tarımsal zararlı olan Ceratitis Capitata embriyolarına nükleik asitler aktararak, sonuçta bu zararlının kontrolü için kullanılan araç setini genişletmektir. Bu yöntem, immobil bir organizmada genlerin fonksiyonel olarak karakterize edilmesine ve transgenik suşların oluşturulmasına yardımcı olur. Bu tekniğin temel avantajı, istenen etkileri elde etmek için çok düşük miktarda nükleik asit enjekte edilmesidir.

Akdeniz meyve sineği kolonisinin tüm yaşam evrelerini 25 °C sıcaklıkta, %65 nemde ve ışık evresi sabah saat 08:00'de başlayan 12 saatlik ışık/12 saatlik karanlık fotoperiyodunda tutun. Sineklerin kılcal hareket yoluyla suya erişimini sağlamak için kafesin tabanındaki küçük bir açıklıktan bir sünger şerit yerleştirin. Altı litrelik bir kafes hazırlayın ve içine 1.500 ile 2.000 arasında pupa yerleştirin.

Yem olarak kafese, yaklaşık 45 gram oranında 1:10 oranında maya ve şeker karışımı koyun. Yumurtaları toplamak için kafesin altına suyla dolu bir tabak yerleştirin. Dişiler yumurtaları ağ üzerinden bırakacak ve yumurtalar suyun içinde toplanacaktır.

Bakire dişiler yumurta bırakabildiği için, yumurtaları toplamadan önce sineklerin en az bir haftalık olmasını bekleyerek tüm yumurtaların döllendiğinden emin olun. Yumurtaları toplamak için suyu ince bir süzgeçle süzün. Ardından, bir pastör pipeti kullanarak yumurtaları yaklaşık 0.5 litre standart larva besini içeren plastik bir kutuya aktarın.

Yeterli miktarda yumurta bırakılmamışsa, erginlerin besinindeki maya içeriğini %25'e kadar artırın. Her kutuyu, pupa dönemini kolaylaştırmak için bir kat kepek içeren şeffaf bir kaba yerleştirin. Hava sirkülasyonunu sağlamak için kabı fileli bir kapakla örtün. Yaklaşık 10 gün sonra, pupa evresine geçmek için kepek tabakasına atlamış olan üçüncü instar larvaları kontrol edin.

Bulunduktan sonra, sonraki günlerde pupaları kontrol etmeye hazır olun. Pupaları toplamak için, onları kaptan süpürerek almak üzere yumuşak bir fırça kullanın. Pupaları başlangıçta küçük bir kapta toplayın.

Toplamalar tamamlandıktan sonra, pupaları yeni bir ergin kafesine aktarın. Erginler yaklaşık 10 gün içinde çıkacaktır. Mikroenjeksiyon için lamları önceden hazırlayın.

Bir lam üzerine iki santimetrelik çift taraflı bant şeridi yapıştırın ve embriyoların nemli kalmasını sağlayan bir yağ tabakası için duvar oluşturmak amacıyla kenarları bir markör kalem ile işaretleyin. Taze yumurtlanmış embriyoları toplamak için, genç döllenmiş dişilerin yeni bir tepsi üzerinde 30 dakika boyunca yumurta bırakmasına izin verin ve ardından embriyoları toplayın. Embriyolardan korion tabakasını uzaklaştırmak için, süzgeci ve yumurtaları ticari %50'lik çamaşır suyu çözeltisine beş saniye boyunca daldırın.

Embriyoların aşırı ağartılmaması kritik önem taşır. Ağartılan embriyoları, süzgeci temiz ultra saf suya dikkatlice daldırarak hemen yıkayın. Bu işlemi en az dört kez tekrarlayın.

Ardından, süzgeci saf ultra saf suda bekletin ve embriyoları iki saat içinde enjekte edin. Sonrasında, ince bir resim fırçası kullanarak yaklaşık 50 embriyo toplayın ve bunları suya batırılmış siyah filtre kağıdından bir diskin üzerine yerleştirin. Bir diseksiyon stereo mikroskobu altında, embriyoları hazırlanmış bir mikroskop lamının çift kaplamalı bandı üzerine sıralayın.

Tüm embriyoları aynı yöne doğru yönlendirin. Embriyo membranının resim fırçasıyla delinmesi, embriyonun sağkalımını azaltan hasarlara yol açabileceği için embriyoların dikkatle manipüle edilmesi önemlidir. Şimdi embriyoların üzerini bir kat kloro-trifloro etilen yağı ile kaplayın.

Yağ, çin markeri ile çizilen sınırların içerisinde kalmalıdır. Sınırların dışına taşmamaya dikkat edin. Bir mikropipet kullanarak, enjeksiyon iğnesine mikrolitre başına bir ila iki mikrogram konsantrasyonda birkaç mikrolitre nükleik asit çözeltisi yükleyin.

Ardından, iğneyi mikroenjeksiyon aparatına bağlayın ve 150 hecto-pascals geri basınç ile 800 hecto-pascals basınçta yarım saniyelik bir enjeksiyon sağlayacak şekilde ayarlayın. Enjeksiyon yapmak için ayak pedalı tetikleyicisini kullanın ve lamı hareket ettirmek için sahne kontrollerini kullanırken iğneyi kontrol etmek için mikro-manipülatörü kullanın. Enjeksiyon bolusunun düzgün bir şekilde boşaltıldığını onaylayın ve ardından iğneyi sıradaki ilk embriyonun posterior polü ile hizalayın.

Sahneyi hareket ettirerek iğneyi embriyoya yerleştirin ve nükleik asit bolusunu enjekte edin. Enjekte edilen sıvı, iç basınçta bir artışa neden olarak embriyonun hafifçe hareket etmesini sağlayacaktır. Pedalı bırakın ve hemen ancak nazikçe iğneyi embriyodan çıkarın.

Enjeksiyon bölgesinden bir miktar sitoplazma sızacaktır. Bu normaldir. Eğer embriyolar enjeksiyonla birlikte patlıyorsa, embriyoları yağ ile kaplamadan önce birkaç dakika kurumaya bırakın.

Enjeksiyonun ardından lamı bir petri kabına aktarın. Kabın kapağına bir filtre kağıdı disk yerleştirin. Filtreyi suyla ıslatın ve petri kabını parafin film ile kapatın.

Hazneyi 25 °C'de inkübe edin. Enjeksiyondan iki gün sonra, gün boyunca birkaç kez lamları kontrol ederek yumurtadan çıkmış larvaları arayın. Yağın içindeki larvaları bulun ve ince bir resim fırçası kullanarak bunları havuç bazlı larva besiyeri içeren bir petri kabına aktarın.

Her bir kaba 200'e kadar larva yerleştirin. Larvalar yağ içerisinde uzun süre hayatta kalamaz, bu nedenle sık sık kontrol edin. Larvalara hava akışı sağlanması için kapakları çoğunlukla kapalı tutarak larvaları inkübe edin.

Kapları günlük olarak kontrol edin ve bir hafta sonra kapları kepek içeren bir kaba yerleştirerek larvaları toplamaya hazırlanın. Pupaları toplayın ve kısa bir süre sonra çıkmalarını bekleyin. Daha sonra, yumurtadan çıkan yetişkinleri karbondioksit kullanarak anestezi altına alın ve transformasyon açısından inceleyin.

Tarama yapılırken, bu mobilizasyon yöntemi kritik olabilir. Medfly yetişkinleri buz veya CO2 kullanılarak anestezi edilebilir ancak uzun süreli maruziyet diğerlerinin sağkalım oranını düşürebilir. DS red geniş filtre kullanarak kırmızı floresan varlığını kontrol edin.

Veya bir EYFP filtresi kullanarak yeşil floresan kontrolü yapın. Heterozigot bir suş oluşturmak için transforme edilen bireyleri, karşı cinsle beraber yabani tip yetişkinlerin bulunduğu küçük bir kafese aktarın. Bir deneyde, inx5 gen ifadesini susturmak için çift zincirli RNA kullanılmıştır.

Enjeksiyon yapılmamış kontrollerin yetişkin germ hattı beklendiği gibi normal görünürken, işlem görmüş bireylerde gelişmemiş testisler ve yumurtalıklar gözlemlenmiştir. Her iki cinsiyetten bireylerin abdomenlerindeki inx5 transkript bolluğunun kantifikasyonu, genin kontrollerle karşılaştırıldığında anlamlı derecede daha düşük ekspresyonunu doğrulamıştır. İkinci bir deneyde, farklı floresan belirteçleri yönlendirmek için beta-2 tubulin promotörü kullanılarak işaretli spermlere sahip iki suş oluşturulmuştur.

Transgenik erkekler, vücutlarında ve testislerinde belirgin bir floresan örüntüsü göstermiştir. Bu video ile, meyve sineği embriyolarının yetiştirilmesi ve nükleik asitlerin mikroenjeksiyonu için optimize edilmiş protokollerimizi sunuyoruz. Yöntem uzmanlık düzeyinde uygulandığında, sekiz saatlik bir çalışma gününde 1.000 embriyoya kadar enjeksiyon yapılabilir.

Bu prosedürün ardından, yeni nesil medfly suşları geliştirmek için thy-lino-crisp-er ve cas-min-eta-geno-meta-tine gibi diğer metaller uygulanabilir.