Dünya Tarım Pest Böcek Embriyo Mikroenjeksiyon yoluyla Nükleik Asitler teslim edilmesi, Ceratitis capitata

Bu prosedürün genel amacı, önemli bir tarım zararlısı olan Ceratitis Capitata'nın embriyolarına nükleik asitler vermek ve nihayetinde kontrolü için araç kutusunu genişletmektir. Bu yöntem, hareketsiz bir organizmadaki genleri işlevsel olarak düzeltmeye ve ayrıca transgenik suşlar oluşturmaya yardımcı olur. Bu tekniğin temel avantajı, istenen etkileri elde etmek için çok düşük miktarda nükleik asit enjekte edilmesidir.

Medfly kolonisinin tüm yaşam evrelerini %65 nem ile 25 santigrat derecede ve sabah 8'de başlayan bir foto faz ile 12 12 saatlik aydınlık/karanlık fotoğraf periyodunda koruyun. Sineklere kılcal hareket yoluyla su sağlamak için kafesin tabanındaki küçük bir açıklıktan bir sünger şerit yerleştirin. Altı litrelik bir kafes kuruyorsunuz, birine 1.500 ila 2.000 pupa yüklüyorsunuz.

Yiyecek için, kafesi yaklaşık 45 gram bir ila 10 maya ve şeker karışımı ile doldurun. Yumurtaları toplamak için kafesin altına suyla dolu bir tabak yerleştirin. Dişiler, daha sonra suda toplanacak olan yumurtaları ağın içinden bırakacaktır.

Bakire dişiler yumurta gibi poz verebildiğinden, yumurtaları toplamadan önce sineklerin en az bir haftalık olmasını bekleyerek yumurtaların hepsinin döllendiğinden emin olun. Yumurtaları toplamak için suyu ince bir süzgeçle süzün. Daha sonra pasteural bir pipet kullanarak, yumurtaları yaklaşık 0,5 litre standart larva yemi ile dolu plastik bir kutuya aktarın.

Yeterince yumurta bırakılmadıysa, yetişkinin yiyeceğinin maya içeriğini %25'e kadar artırın, her kutuyu pupa lehine bir kepek tabakası içeren şeffaf bir kaba koyun. Hava sirkülasyonuna izin vermek için kabı net bir kapakla örtün. Yaklaşık 10 gün sonra, pupa için kepek tabakasına atlayan üçüncü instar larvalarını kontrol edin.

Bulduktan sonra, sonraki günlerde pupa olup olmadığını kontrol etmeye hazırlanın. Pupayı toplamak için, onları kaptan süpürmek için yumuşak bir fırça kullanın. İlk olarak, pupaları küçük bir kapta toplayın.

Toplamalar tamamlandıktan sonra pupaları yeni bir yetişkin kafesine aktarın. Yetişkinler yaklaşık 10 gün içinde ortaya çıkmalıdır. Mikro enjeksiyon için önceden hazırlanmış slaytlar bulundurun.

Bir slayta iki santimetrelik bir çift taraflı bant şeridi takın ve embriyoları nemli tutan bir yağ tabakası için bir duvar yapmak için kenarları bir çin kalemi ile işaretleyin. Yeni bırakılmış embriyoları toplamak için, genç döllenmiş dişilerin yeni bir tepside 30 dakika yumurtada kalmasına izin verin ve ardından embriyoları toplayın. Koryonu embriyolardan çıkarmak için, süzgeci ve yumurtaları beş saniye boyunca ticari% 50 ağartma çözeltisine batırın.

Embriyoları aşırı ağartmamak çok önemlidir. Süzgeci dikkatlice temiz ultra saf suya batırarak ağartılmış embriyoları hemen yıkayın. Bunu en az dört kez yapın.

Ardından, süzgeci berrak ultra saf suda tutun ve embriyoları iki saat içinde enjekte edin. Daha sonra, ince bir boya fırçası kullanarak, yaklaşık 50 embriyo toplayın ve bunları suyla ıslatılmış siyah filtre kağıdı diskine yerleştirin. Diseksiyon stereo mikroskobu altında, embriyoları hazırlanmış bir mikroskop lamının çift taraflı bandına yerleştirin.

Tüm embriyoları aynı yönde yönlendirin. Embriyoları dikkatli bir şekilde manipüle etmek önemlidir çünkü embriyo zarının boya fırçası ile delinmesi embriyonun hayatta kalmasını azaltan hasarlara neden olabilir. Şimdi embriyoları bir kloro-trifloro etholene yağı tabakası ile örtün.

Yağ, çin işaretleyici sınırları tarafından içerilmelidir. Sınırları aşmayın. Bir mikropipet kullanarak, enjeksiyon iğnesini mikrolitre başına bir ila iki mikrogram olmak üzere birkaç mikrolitre nükleik asit çözeltisi ile yükleyin.

Ardından, iğneyi mikro enjeksiyon aparatına bağlayın ve 150 hekto-paskal'lık bir geri basınçla 800 hekto-paskal'da yarım saniyelik bir enjeksiyon sağlayacak şekilde ayarlayın. Enjekte etmek için bir ayak pedalı tetiği kullanın ve slaytı hareket ettirmek için sahne kontrollerini kullanırken iğneyi kontrol etmek için mikro manipülatörü kullanın. Enjeksiyon bolusunun düzgün bir şekilde çıkarıldığını onaylayın ve ardından iğneyi sıradaki ilk embriyonun arka kutbu ile hizalayın.

Sahneyi hareket ettirerek, iğneyi embriyoya yerleştirin ve nükleik asitlerin bolusunu enjekte edin. Enjekte edilen sıvı, embriyonun hafif bir hareketine neden olan iç basınçta bir artışa neden olacaktır. Pedalı bırakın ve hemen ama nazikçe iğneyi embriyodan çıkarın.

Enjeksiyon bölgesinde küçük bir sitoplazma sızıntı yapacaktır. Bu normal. Embriyolar enjeksiyonla patlıyorsa, embriyoları yağla kaplamadan önce birkaç dakika kurumasına izin verin.

Enjeksiyonun ardından slaytı bir petri kabına aktarın. Kabın kapağına bir filtre kağıdı diski yerleştirin. Filtreyi suyla ıslatın ve petri kabını parafin filmi ile kapatın.

Odayı 25 santigrat derecede inkübe edin. Enjeksiyondan iki gün sonra, yumurtadan çıkmış larvalar için slaytları gün boyunca birkaç kez kontrol edin. Yağda larva arayın ve ince bir boya fırçası kullanarak bunları havuç bazlı larva yemi içeren bir petri kabına aktarın.

Her tabağa en fazla 200 larva yükleyin. Larva yağda uzun süre hayatta kalamaz, bu yüzden sık sık arayın. Larvaları kapak çoğunlukla kapalı olacak şekilde kuluçkaya yatırın, böylece larvalara hala hava akışı olur.

Bulaşıkları günlük olarak kontrol edin ve bir hafta sonra bulaşıkları kepek içeren bir kaba koyarak larva toplamaya hazırlanın. Pupaları toplayın ve kısa bir süre sonra ortaya çıkmalarını bekleyin. Daha sonra yumurtadan çıkmış yetişkinleri karbondioksit kullanarak uyuşturun ve transformasyon açısından inceleyin.

Tarama yaparken, bu mobilizasyon yöntemi kritik olabilir. Medfly yetişkinleri buz veya CO2 kullanılarak uyuşturulabilir, ancak uzun süreli maruz kalma diğerlerinin hayatta kalmasını azaltabilir. DS kırmızı geniş filtre kullanarak kırmızı floresan olup olmadığını kontrol edin.

Veya bir EYFP filtresi kullanarak yeşil floresan olup olmadığını kontrol edin. Heterozigot bir suş oluşturmak için dönüştürülmüş bireyleri, karşı cinsten vahşi tip yetişkinlerle birlikte küçük bir kafese aktarın. Bir deneyde, inx5 gen ekspresyonunu susturmak için çift gerilmiş RNA kullanıldı.

Enjekte edilmemiş kontrollerin yetişkin germ hattı beklendiği gibi normal görünürken, tedavi edilen bireyler az gelişmiş testisler ve yumurtalıklar gösterdi. Her iki cinsiyetten bireylerin karınlarındaki inx5 transkript bolluğunun ölçülmesi, kontrollere kıyasla genin önemli ölçüde daha düşük ekspresyonunu doğruladı. İkinci bir deneyde, farklı floresan belirteçleri sürmek için beta-2 tubulin promotörü kullanılarak etiketli spermli iki suş üretildi.

Transgenik erkekler vücutta ve testislerde belirgin bir floresan paterni gösterdi. Bu video ile, nükleik asitlerin medfly embriyolarına yetiştirilmesi ve mikro enjeksiyonu için optimize edilmiş protokollerimizi sunuyoruz. Bir kez ustalaştıktan sonra, sekiz saatlik bir iş günü boyunca 1.000'e kadar embriyo enjekte edilebilir.

Bu prosedürü takiben, yeni nesil medfly suşları geliştirmek için thy-lino-crisp-er, cas-min-eta-geno-meta-tine gibi diğer metaller gerçekleştirilebilir.