Name: Canlı hücre fotoafinite Etiketleme tarafından Yerli Hücresel Ortamında Küçük Molekül bağlayıcı proteinlerin belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Öğrenin, canlı hücrelerde fotoafinite etiketleme kullanarak küçük molekül bağlayıcı proteinleri nasıl belirleyeceğinizi. Bu yöntem, ilaçların moleküler etki mekanizmalarını açıklamak için güvenilir bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Fotoafinite etiketleme protokolünün tasarımı konusunda tavsiyeleri için Dr. Ben Nacev'e, itrakonazol fotoafinite probunu sentezlediği için Dr. Wei Shi'ye, afinite aşağı çekme deneyleri hakkında tavsiyeleri için Dr. Yongjun Dang'a ve yardımcı yorumlar ve destek için JOL laboratuvarının diğer üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Farmakoloji / Toksikoloji alanında bir PhRMA Vakfı Bursu (SAH'ye); Ulusal Kanser Enstitüsü Hibe R01CA184103; Uçuş Görevlisi Tıbbi Araştırma Enstitüsü; Prostat Kanseri Vakfı (JOL); ve kısmen Ulusal Translasyonel Bilimleri Geliştirme Merkezi'nden (NCATS) Grant UL1 TR 001079 tarafından finanse edilen Johns Hopkins Klinik ve Translasyonel Araştırma Enstitüsü.

NOT: Bu protokol, canlı hücrelerde kullanım için Mackinnon&#39;dan ve Taunton 10 uyarlanmıştır. Kültür Hücrelerinin hazırlanması 1. <ol><li> (Aşağıya bakınız) istenen numune sayısı steril 6 cm hücre kültür kaplarına hazırlayın. Not: hücrelerin bir çanak işleme durumuna göre kullanılır, ancak daha fazla protein, 2 veya 3 yemekler durum başına hazırlanmış ve UV ışınımı sonrasında birleştirilebilir gerekli ise. <ol><li> hücrelerin en az 3 yemekleri hazırlamak; DMSO yalnızca (D) Prob tedavisi (P) ve prob + rakip (C) Negatif kontrol. </li><li> İsteğe bağlı olarak, bir UV kontrol olarak 4. çanak, sonda ile tedavi, ancak UV ışığına maruz kalmaması için hazırlar. Not: birden çok rakip molekülleri, ilgi küçük molekülün farklı analogları, test edilecek ise, gerektiğinde ilave bir rakip plakaları hazırlamak. </li></ol></li><li> 4 mL kültür ortamı içinde kültür tabaklarına HEK293T hücreleri ekleyin. 3,5 milyon c kullanınplaka başına arşın. Not: hücre deneyin başlangıcında hemen hemen% 100 konfluent böylece hücrelerin sayısı en protein verimi elde etmek için, her hücre türü için belirlenmelidir. HUVEC için plaka başına 0,3 milyon hücre kullanın. İyi bir yaklaşım konfluent 15 cm çanak hücrelerin 1/10 olduğunu. HEK293T hücreleri kültüre gereken Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin ile takviye edilmiştir. </li><li> Kültür inkübatör hücreleri Dönüş (37 ° C,% 5 CO2) gece boyunca karıştırılmıştır. </li></ol> Hücreler ve foto-çapraz 2. Tedavi <ol><li> Bir sonraki gün, ön kısım, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine aşağıdaki ilaçlar: <ol><li> İlk tedavi olarak, 2 tüpleri ve 1 borunun 10 mM yarışmacının (örneğin, tadil edilmemiş ana bileşik) 4 ul DMSO 4 ul ekle. </li><li> İkinci tedavi için, 1 tüp DMSO 16 ul ve 50 arasında 16 ul# 181; 2 tüplere M fotoafinite probu. NOT: En iyi konsantrasyon farklı prob (tartışma) için farklı olabilir, ancak 200-500 arasında nM iyi bir başlangıç ​​noktası (burada 200 nM kullanın) &#39;dir. yarışmacının konsantrasyonu probu en az 20 kat (burada 10 mcM kullanıyorum) bu aşması gerekir. DMSO&#39;nun nihai konsantrasyonu, her levha olarak eşit olması gerekmektedir ve% 0.5 (20 ul hacim) fazla olmamalıdır. </li></ol></li><li> hücre kültürü kaputu içine hücre plakaları getirin ve aşağıdaki gibi adım 2.1.1 öncesi aliquoted ilaçlar ekleyin: kültür ortamı aspire 1 ml, medyada ön aliquoted ilaç resuspending ve yavaşça plaka damla geri ekleyerek bilge. DMSO (D) plaka ve sonda (P) plakaya DMSO ekleyin ve rekabet (C) plakaya rakip ekleyin. 30 dakika boyunca kültür inkübatör plakaları dönün. </li><li> silik kültürü kaputu ışıkları ile, prob adım 2.1.2 öncesi aliquoted probu ekleyin (P) ve yarışma (C) plakaları ve eklemeYukarıdaki DMSO (D) plakaya DMSO. 1 saat boyunca kültür inkübatör plakaları dönün. </li><li> İnkübasyon sırasında, aşağıdaki öğeleri hazırlamak; plakaların tüm sığabilecek bir buz tepsisi; buz soğukluğunda lisis tampon maddesi (PBS [pH 8.5] + 1 x proteaz inhibitör kokteyli [komple EDTA-içermeyen su içinde yapılan 50x stok çözeltisinden seyreltilmiş]; 200 ul / plaka); mikrosantrifüj tüpleri, buz üzerinde, farklı tedavi koşulların her biri için D, P, veya C etiketli. </li><li> 1 saat inkübasyon sonunda 15 dk önce, soğuk bir odada UV lambası (365 nm) kurmak ve ampul ısınmak için yeniden açın. </li><li> prob ile 1 saat süreyle inkübe edildikten sonra buz üzerinde yemekler yerleştirin. aşırı prob çıkarmak için yavaşça 5 ml buz gibi soğuk PBS (pH 7.4) ile hücrelerin yıkayın. 4 ml buz gibi soğuk PBS ile hücrelerin yeniden kapsamaktadır. </li><li> Lambanın Isıtma aza indirmek için bir buz paketi üzerinde UV lamba altında 3 cm merkezli hücrelerin çanak yerleştirin. 3 dakika boyunca ışın tedavisi. buz tepsiye çanak çıkarın ve tüm numuneler için tekrarlayın. </li><li> birfter ışınlama, hücreler PBS aspire ve her plakaya proteaz inhibitörleri ile buz soğukluğunda PBS (pH 8.5) 200 ul ilave edin. buz üzerinde önceden etiketlenmiş mikrosantrifüj tüplerine kauçuk kazıyıcı ve transfer kullanarak hücreleri plakadan ayırın. </li><li> (Örnek 250 ul bir% 10 SDS ve 10 ul)% 0.4 bir son konsantrasyona SDS ekleyin. DİKKAT: SDS toz tehlikelidir. burnunun ve ağzının üzerinde bir maske takarak SDS tozu solumaktan kaçının. </li><li> Lyse 10 darbe (çıkışı 1, görev döngüsü% 30) süspansiyonu sonicating 10 pals ikinci tur önce 1 dakika boyunca buz üzerinde inkübe, hücrelerin. </li><li> Gerekirse, süspansiyon 2 ul kaldırmak ve tam hücre parçalama sağlamak için ışık mikroskobu altında kontrol edin. </li><li> Hücre lizizi tamamlamak ve tüm proteinleri denatüre etmek için 5 dakika boyunca 95 ° C olarak ayarlanmış sıcak bir plaka üzerinde örnekleri kaynatılır. </li><li> Bu inci gibi, bir spektrofotometrik deterjan uyumlu protein deneyi kullanılarak her bir numune içindeki protein konsantrasyonu ölçümü750 nm&#39;de absorbans ölçümü için ayarlanmış bir spektrofotometre ile, üretici talimatlarına göre e DC Protein Deney 19,. </li><li> Gerektiğinde PBS pH 8.5 +% 0.4 SDS ilave edilerek 2.5 mg / ml protein konsantrasyonu normalize (ya da konsantrasyonlar ise daha düşük 2.5 mg / ml, en düşük protein konsantrasyonu ile örnek normalize) (örneğin, numuneler, 5 ise 250 ul mg / ml) 2.5 mg / ml&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek üzere, PBS, pH 8.5 +% 0.4 SDS, 250 ul ekle. </li></ol> Etiketli Proteinlerin Görselleştirme için tıklayın Kimya tarafından Floresan Tag 3. Eklenti <ol><li> Yeni bir mikrosantrifüj tüpüne hücre lizatının transfer 40 ul çıkarın. biyotin-azid (aşama 4) ile reaksiyona sokulması için kalan lizatları tutun. </li><li> sırasıyla aşağıdaki reaktifler ekleyin: 0.2 ul flor-azid (DMSO içinde 1 mM stok çözelti), 0.58 ul TCEP (100 mM&#39;lik bir stok su içinde NaOH 4 eşdeğer, taze olarak hazırlanmıştır) ve 3.38 ul TBTA (1.4 7 mM stok: DMSO t-butanol 1 oran). Vortex karıştırın. </li><li> Reaksiyonu başlatmak üzere 1.14 ul -5H 2 O (su içinde 50 mM) CuSO 4 ekleyin. Vortex kısa ve karanlıkta 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> reaksiyonun sönmesi için 2x SDS örnek tampon maddesi 50 ul ekle. Bu noktada, gerektiğinde gece boyunca -20 ° C &#39;de en iyi sonuçları veya deposu için bir SDS-PAGE jeli 20 doğrudan örneklerini yürüt. </li><li> örnekleri dondurma ise, jel üzerine yüklenmeden önce 95 ° C&#39;de 5 dakika boyunca ısıtın. Not: hedef proteinin moleküler ağırlığı, tipik olarak, bu aşamada bilinmediği için, farklı akrilamid konsantrasyonları ile 2 jeller çalıştırmak için tavsiye edilir (yani,% 8 ve% 15) ya da geniş bir moleküler ağırlık aralığı, gradyan jeli (örneğin, 4-15%), tam molekül ağırlığı kapsama sağlamak. </li><li> Boyanın önü jelin sonuna ulaştığı zaman, fazla unreacte tüm sağlamak için ilave bir 5 dakika daha jel çalışmaya devamd flor-azid tamamen jel çıkıldı. </li><li> GKD 2 O olan bir kaba jel çıkartın ve tüm fazla flor-azit yıkamak için, yumuşak çalkalama ile 10 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> bir cam plaka üzerine jel yerleştirin ve üreticinin talimatlarına göre bir Typhoon flüoresan jel tarayıcı kullanılarak jel tarama. </li></ol> Etiketli proteinlerinin eğilim saflaştırılmasına Click kimyası ile de biotin etiketini 4. Ek <ol><li> Aşama 3.1 kalan lizatları, sonra normalizasyon 2.5 mg / ml elde örnek hacmi 500, 550 ve 600 ul ise tüm örnekler (örneğin, aynı hacimde olan örneğin, protein normale döndükten sonra en fazla miktarda kullanmak, 500 kullanımı her ul). </li><li> PBS (pH 7.4) 50 ul yüksek kapasiteli streptavidin agaroz boncuklar, önceden yıkanmış 2x ekleyerek lizatları ön temizleyin. rotasyon ile 4 ° C &#39;de 1 saat inkübe edin. </li><li> 3 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüj ile boncuk Pelet. t kaldırO buz üzerinde yeni bir mikrosantrifüj tüpüne süpernatan ve boncuk atın. </li><li> &quot;Girdi&quot; etiketli yeni bir tüp DMSO örnek% 1-2 çıkarın. -20 ° C&#39;de 2 x SDS örnek tamponu ve mağaza eşdeğer hacim. </li><li> lizat 500 ul, aşağıdaki reaktifler ekleyin: 1.38 ul biyotin-azid (DMSO içinde 10 mM stok), 5.5 ul TCEP, 32,5 ul TBTA. Vortex karıştırın. </li><li> 11 ul kısaca lizat ve vorteks 500 ul başına -5H 2 O CuSO 4 ekleyin. 30 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> -20 ° C&#39;ye soğutulmuş asetonla 4 Örnek hacimleri ekleyin. örnekler ve -80 ° C&#39;de bir gece inkübe Vortex tamamen proteinleri çöktürmek ve reaksiyona girmemiş biyotin-azit kaldırmak için. </li><li> Santrifüj, 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 17,000 x g&#39;de örnekler çökelmiş proteinleri pelet. </li><li> Tamamen süpernatanı havalandırın, ve 150 ul PBS (pH 7.4) +% 1 SDS içinde sonikasyon ile proteinler resolubilize. </li><li&gt;% 0.2 SDS seyreltilmesi için, PBS (pH 7.4), 600 ul ekle. </li><li> 30 ul önceden yıkanmış yüksek kapasiteli streptavidin agaroz tanelerine örnekleri ekleyin ve rotasyon ile 4 ° C &#39;de 1 saat inkübe edilir. </li><li> 3 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüj ile boncuk Pelet. ilişkisiz proteinler ve imha edilmesini içeren süpernatant aspire. </li><li> tanelerine yıkama tamponu (400 mM NaCI, 50 mM Tris,% 0.2 SDS, pH 7.4) 1 ml ilave edilir ve rotasyon ile oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir. </li><li> Tekrarlayın 4.12 ve 4.13 3 kez yineleyin. </li><li> boncuklar tamamen yıkama tamponu aspire, ve 2 x SDS numune tamponu 30 ul ekle. </li><li> boncuklardan proteinleri serbest bırakmak için 95 ° C sıcaklıkta bir blok üzerinde 5 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Oda sıcaklığında 13.000 xg&#39;de 1 dakika için boncuk santrifüjleyin. NOT: Bu noktada, numuneler, SDS-PAGE çalıştırmak için hazır olana kadar -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. örnekleri dondurma durumunda, kullanımdan önce 95 ° C &#39;de 5 dakika ısıtın. </li><li> dikkatliceboncuk kapalı proteinleri içeren örnek tamponu pipet ve SDS-PAGE 20 üzerine yük (aşağıdaki önemli açıklamalara bakın). boncuklar gerekirse daha sonra reboiling için kaydedilebilir. Not: gümüş boya ile protein tespiti için, iyi sonuçlar 1 mm kalınlığında jel kullanılarak elde edilir. bir grup kütle spektrometrisi (MS) analizi için, gümüş boyalı jel üzerinden kesilecek olursa, steril çözeltiler taze tüm reaktifleri hazırlayıp jeli üzerinde örnekler arasında iyi bir boş bırakın. Bu arka plan proteinleri çıkartılır böylece prob kulvar kesilmiş, her grup için, bir paralel kesit DMSO şerit alınmalıdır. Western blot ile protein kimliğinin doğrulanması için, SDS-PAGE jeli çalışan, aynı zamanda adım 4.4 giriş örnek yüklemek için çok önemlidir. </li><li> Hedef protein (ler) tespit etmek için gümüş boyama 21 veya Western blot 22 biri için standart bir protokol takip edin. </li></ol>

<ol><li>Schenone, M., Dančìk, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+identification+and+mechanism+of+action+in+chemical+biology+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery.</a> Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).</li>
<li>Cook, D., Brown, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+learned+from+the+fate+of+AstraZeneca%27s+drug+pipeline%3A+a+five-dimensional+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: a five-dimensional framework.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (6), 419-431 (2014).</li>
<li>Titov, D. V., Liu, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+validation+of+protein+targets+of+bioactive+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification and validation of protein targets of bioactive small molecules.</a> Bioorg Med Chem. 20 (6), 1902-1909 (2012).</li>
<li>Jung, H. J., Kwon, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+deconvolution+of+bioactive+small+molecules%3A+the+heart+of+chemical+biology+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Target deconvolution of bioactive small molecules: the heart of chemical biology and drug discovery.</a> Arch Pharm Res. 38 (9), 1627-1641 (2015).</li>
<li>Sumranjit, J., Chung, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Advances+in+Target+Characterization+and+Identification+by+Photoaffinity+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Recent Advances in Target Characterization and Identification by Photoaffinity Probes.</a> Molecules. 18 (9), 10425-10451 (2013).</li>
<li>Robles, O., Romo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemo-+and+site-selective+derivatizations+of+natural+products+enabling+biological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Prod+Rep%22%5BJournal%5D)">Chemo- and site-selective derivatizations of natural products enabling biological studies.</a> Nat Prod Rep. 31 (3), 318-334 (2014).</li>
<li>Zhou, Q., Gui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioconjugation+by+Native+Chemical+Tagging+of+C-H+Bonds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Bioconjugation by Native Chemical Tagging of C-H Bonds.</a> J Am Chem Soc. 135 (35), (2013).</li>
<li>Li, Z., Hao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Synthesis+of+Minimalist+Terminal+Alkyne-Containing+Diazirine+Photo-Crosslinkers+and+Their+Incorporation+into+Kinase+Inhibitors+for+Cell-+and+Tissue-Based+Proteome+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Design and Synthesis of Minimalist Terminal Alkyne-Containing Diazirine Photo-Crosslinkers and Their Incorporation into Kinase Inhibitors for Cell- and Tissue-Based Proteome Profiling.</a> Angew Chem Int Edit. 52 (33), 8551-8556 (2013).</li>
<li>Chamni, S., He, Q. L., Dang, Y., Bhat, S., Liu, J. O., Romo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diazo+reagents+with+small+steric+footprints+for+simultaneous+arming%2FSAR+studies+of+alcohol-containing+natural+products+via+O-H+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chem+biol%22%5BJournal%5D)">Diazo reagents with small steric footprints for simultaneous arming/SAR studies of alcohol-containing natural products via O-H insertion.</a> ACS chem biol. 6 (11), 1175-1181 (2011).</li>
<li>Mackinnon, A. L., Taunton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+Identification+by+Diazirine+Photo-Cross-linking+and+Click+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Target Identification by Diazirine Photo-Cross-linking and Click Chemistry.</a> Curr Protoc Chem Biol. 1, 55-73 (2009).</li>
<li>Smith, E., Collins, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoaffinity+labeling+in+target-+and+binding-site+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Future+med+chem%22%5BJournal%5D)">Photoaffinity labeling in target- and binding-site identification.</a> Future med chem. 7 (2), 159-183 (2015).</li>
<li>Huisgen, R., Szeimies, G., Möbius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1.3-Dipolare+Cycloadditionen%2C+XXXII.+Kinetik+der+Additionen+organischer+Azide+an+CC-Mehrfachbindungen%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Ber%22%5BJournal%5D)">1.3-Dipolare Cycloadditionen, XXXII. Kinetik der Additionen organischer Azide an CC-Mehrfachbindungen.</a> Chem Ber. 100 (8), 2494-2507 (1967).</li>
<li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Chemistry%3A+Diverse+Chemical+Function+from+a+Few+Good+Reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 40 (11), 2004-2021 (2001).</li>
<li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stepwise+huisgen+cycloaddition+process%3A+copper%28I%29-catalyzed+regioselective+%26%2334%3Bligation%26%2334%3B+of+azides+and+terminal+alkynes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective &#34;ligation&#34; of azides and terminal alkynes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 41 (14), 2596-2599 (2002).</li>
<li>Tornøe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidotriazoles+on+Solid+Phase%3A+%5B1%2C2%2C3%5D-Triazoles+by+Regiospecific+Copper%28I%29-Catalyzed+1%2C3-Dipolar+Cycloadditions+of+Terminal+Alkynes+to+Azides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">Peptidotriazoles on Solid Phase: [1,2,3]-Triazoles by Regiospecific Copper(I)-Catalyzed 1,3-Dipolar Cycloadditions of Terminal Alkynes to Azides.</a> J Org Chem. 67 (9), 3057-3064 (2002).</li>
<li>Head, S. A., Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+drug+itraconazole+targets+VDAC1+to+modulate+the+AMPK%2FmTOR+signaling+axis+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Antifungal drug itraconazole targets VDAC1 to modulate the AMPK/mTOR signaling axis in endothelial cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 112 (52), E7276-E7285 (2015).</li>
<li>Shi, W., Nacev, B. A., Aftab, B. T., Head, S., Rudin, C. M., Liu, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Itraconazole+Side+Chain+Analogues%3A+Structure-Activity+Relationship+Studies+for+Inhibition+of+Endothelial+Cell+Proliferation%2C+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor+2+%28VEGFR2%29+Glycosylation%2C+and+Hedgehog+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Itraconazole Side Chain Analogues: Structure-Activity Relationship Studies for Inhibition of Endothelial Cell Proliferation, Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 (VEGFR2) Glycosylation, and Hedgehog Signaling.</a> J Med Chem. 54 (20), 7363-7374 (2011).</li>
<li>Shi, W., Nacev, B. A., Bhat, S., Liu, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Absolute+Stereochemistry+on+the+Antiangiogenic+and+Antifungal+Activities+of+Itraconazole%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Impact of Absolute Stereochemistry on the Antiangiogenic and Antifungal Activities of Itraconazole.</a> ACS Med Chem Lett. 1 (4), 155-159 (2010).</li>
<li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).</li>
<li>Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+estimation+of+polypeptide+chains+by+electrophoresis+in+SDS-polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Bioph+Res+Co%22%5BJournal%5D)">Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.</a> Biochem Bioph Res Co. 28 (5), 815-820 (1967).</li>
<li>Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+silver+stain+for+detecting+proteins+and+peptides+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels.</a> Anal Biochem. 98 (1), 231-237 (1979).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> P Natl Acad Sci USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

İlacın hücresel fenotip onların bilinen fonksiyonları dayalı potansiyel hedefleri daraltmak için kullanılan yukarıdan aşağıya, ya da aşağıdan yukarıya, hedef: küçük moleküllerin hedefleri belirlenmesi için farklı yaklaşımlar genel olarak iki kategoride toplanabilir kimyasal veya genetik yollarla 3 doğrudan tanımlanır. Yukarıdan-aşağıya veya fenotipik çalışmalar ilacın etkilenen bazı hücresel süreçleri tanımlamak (örneğin, transkripsiyon / çeviri / DNA sentezi, hücre döngüsü bloğu, yolun aktivasyonu /...

Biyoaktif küçük moleküller temelde hücre içinde, ile etkileşim ve bir ya da daha fazla &quot;hedef&quot; moleküller, en çok protein fonksiyonunu değiştirerek çalışır. ilaç keşfi, ne, bir aktif bileşik fenotipik tarama yoluyla tespit edilir, bu bileşiğin moleküler hedef (ler) in tespiti, sadece hareket ve bileşik potansiyel yan etkilerinin mekanizmasının anlaşılması, değil, aynı zamanda potansiyel olarak keşfetmek olmayan, son derece önemlidir yeni biyoloji hastalık modelin altında yatan ve terapötik 1 yeni mekanistik sınıfların gelişmesi için önünü açtı. hedef tanımlama terapötik kullanılacak bir ilaç için gerekli olmasa da, son yıllarda yeni ilaç adayları geçerli bir hedef bilinen ise, daha iyi yatırım getiri nedenle klinik çalışmalarda başarılı ve daha muhtemel olduğunu artan bir tanıma olmuştur 2. Böylece, küçük belirlemek için yöntemler artan bir ilgi olmuşturmolekül hedef proteinler. Klasik bir hedef belirleme deneyi tipik haliyle ilgi küçük molekül, bir reçine üzerine immobilize ve bağlanmamış protein yıkanarak ve geri kalan proteinler elüt edilmekte ve 3 tespit edilir, sonra bütün hücre lizatları ile kuluçkalanır afinite saflaştırma dayanır. Bu teknik, çok sayıda küçük moleküller 4 hedeflerini tanımlamak için kullanılmış olsa da, bazı nedenlerle, evrensel bir hedef kimliği yöntem için uygun değildir. İlk olarak, hedef proteinin küçük moleküllü bağlanma yeteneğini muhafaza etmek için, hücre lizizi sonrasında doğal yapısını muhafaza etmelidir. Bu genellikle, doğal ortamından ayrılmış sonra yapı değişimlerine uğrama, ya da sadece agrega ve solüsyonun dışında çökelmesi membran proteinleri için, özellikle sorun yaratabilir. korurken İkinci olarak, küçük molekül kimyasal olarak reçine üzerine immobilize edilebilir bir şekilde değiştirilmesi gerekirHedef protein bağlanma yeteneğidir. Bu reçineye giderildikten sonra derin bağlanma cepleri nedenle küçük moleküle erişilemez olabilir. Üçüncü olarak, bağlanma afinitesi etkileşimi zor düşük afinite etkileşimler kimlik verme, yıkama adımları sırasında korunur şekilde yeterince yüksek olması gerekmektedir. pH, iyon konsantrasyonu veya diğer endojen moleküllerin varlığı gibi Dördüncü, çevre koşulları hücre içinde mekansal değişir ve bazen ilaç hedef etkileşimleri için de önkoşul olabilir. Böylece, izin ve deneme yanılma önemli miktarda gerektirebilir hücrenin dışında bağlayıcı korumak için doğru koşulların bulunması. Fotoafinite işaretleme küçük bir molekülün bir hücrenin doğal kapsamında hedefinin kovalent izin vererek bu sorunları circumvents. Aksine büyük bir hantal reçine küçük molekül immobilize daha molekül yerine kimyasal iki küçük fonksiyonel g yüklemek için modifiye edilirroups: belirli bir ışık dalga boyuna sahip ışınlanmış olduğunda hedef proteine ​​kovalent çapraz bağlanmasını sağlayan bir foto-aktifleştirilebilen kısım, ve hedef proteinin algılanabilir ve daha sonra izole sağlayan bir raportör grubu yer alır. Canlı hücreler, prob bağlanmakta ve kovalent hedef proteine ​​çapraz bağlayan ve prob-protein kompleksi daha sonra izole bozulmamış, fotoafinite probu ile tedavi edilir. hedefe bağlanabilen prob özgünlüğü ana bileşiğin fazla bir hedef proteine ​​probun bağlanması uzaklıkta rekabet için kullanılan paralel bir rekabet deneyi gerçekleştirmek gösterilmiştir. fotoafinite prob tasarımı ve sentezi küçük bir molekülün diğerine büyük ölçüde değişir ve bu protokolde kapsamında değildir; Ancak, konuyla ilgili çeşitli mükemmel tartışmalar 5-9 yayınlandı. ana dikkate presumab nedenle prob ana bileşiğin biyolojik etkinliğini muhafaza etmesidirly Aynı hedef (ler) e bağlandığı görülmüştür. Yapı-aktivite ilişkisi (SAR) çalışmaları molekülün parçaları biyo kaybı olmadan değiştirilebilir belirlemek için gerçekleştirilmelidir. Farklı kimyasal grupların çeşitli avantajları ve dezavantajları 10 sahip diazirine, benzofenon ve aril azit içeren ışıkla çapraz bağlayıcı, olarak kullanıldı. Benzer şekilde, prob bağlayıcı proteinler izole etmek için kullanılmıştır birçok muhabir etiketleri bulunmaktadır. Raportör grupları gibi yaygın olarak kullanılan biyotin veya flüoresan etiketler olarak, kendi işlevsel olabilir, ya da daha küçük ve biyolojik aktivite 11 tehlikeye böylece daha az muhtemel olması avantajına sahiptir foto-çapraz adım sonraki daha işlevselleştirilmesini gerektiren ön olabilir. Bu protokol, bir foto-çapraz diazirine grubu içeren bir fotoafinite sonda ve bir Cu (I) ile bir raportör grubunun eklenmesi için bir terminal alkin -catalyz kullandıked Azid-Alkin Kansız-Hüsgen Siklokatılma (veya tıklayın) reaksiyon 12-15. SAR çalışmaları, tasarım ve sentez soruşturma ve bu çalışmaların sonuçları yerde 16-18 yayınlandı.

<table><tbody><tr><td>Tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>20490</td><td>Taze kullanım günü yapın. 4 eq NaOH ile suda 100 mM stok hazırlayın.</td></tr><tr><td>Tris [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] amin (TBTA)</td> <td>AnaSpec</td><td>63360-50&nbsp;</td><td>T-bütanolün DMSO'ya 4: 1 oranında 1.7 mM stok hazırlayın, -20&nbsp'de saklayın; &deg;C.</td></tr><tr><td>Bakır Sülfat (CuSO4&#8226; 5H2O)</td><td>LabChem, Inc.</td><td>LC13440-1</td><td>50 mM su stoğu hazırlayın, oda sıcaklığında saklayın.</td></tr><tr><td>Biotin-azide</td><td>Click Kimya Araçları</td><td>AZ104-100</td><td>DMSO'da 10 mM stok hazırlayın, -20&nbsp'de saklayın; &deg;C.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-azid&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A10277</td><td>DMSO'da 1 mM stok hazırlayın, -20&nbsp'de saklayın; &deg;C.</td></tr><tr><td>Çalışırken 365 nm UV lambalı</td><td>Spectroline</td><td>FC100</td><td>UV engelleyici gözlükler takılmalıdır.</td></tr><tr><td>Proteaz inhibitör tabletleri, EDTA içermeyen</td><td>Roche Life Science</td><td>11873580001</td><td>Suda 50x çözelti hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın; &deg;C.</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>Sonifier 250</td><td>Çıkış 1'e ayarlayın, görev %30.&nbsp;</td></tr><tr><td>Floresan jel tarayıcı</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>FLA 9500</td><td>Alexa-fluor 647'yi algılamak için kırmızı lazer kullanın.</td></tr><tr><td>Deterjan uyumlu Dc protein test kiti</td><td>Bio-Rad</td><td>5000112</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Kapasiteli Streptavidin Agaroz boncukları&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>20359</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagles Orta, düşük glikozlu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11885092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu, nitelikli</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140079</td> Penisilin/Streptomisin çözeltisi ThermoFisher Scientific 15140122 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS Numune Tamponu (2x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC2676</td><td></td></tr></tbody></table> Serisi

canlı hücre fotoafinite etiketleme tarafından yerli hücresel ortamında küçük molekül bağlayıcı proteinlerin belirlenmesi

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Küçük moleküllerin moleküler hedef(ler)ini belirlemek, etki mekanizmalarını anlamak için zorlu ama gerekli bir adımdır. Çeşitli küçük moleküllerin bağlayıcı proteinlerini başarılı bir şekilde aydınlatmak için çeşitli hedef tanımlama yöntemleri geliştirilmiş ve kullanılmış olsa da, bu tekniklerin, belirli türdeki küçük molekül-hedef etkileşimlerini tespit etmek için onları uygun olmayan hale getiren dezavantajları vardır. Özellikle, hücre lizizi üzerine yapıları bozulabilen zar proteinlerininki gibi doğal hücresel koşullara bağlı olan kovalent olmayan etkileşimler, genellikle afiniteye dayalı hedef tanımlama yöntemlerine uygun değildir. Burada, canlı hücrenin ortamındaki küçük molekül bağlayıcı proteine kovalent olarak çapraz bağlanmak için bir fotolablab grup içeren bir probun kullanıldığı, hücre lizizinden sonra etkileşimin sürdürülmesine gerek kalmadan hedef proteinin tespit edilmesine ve izolasyonuna izin veren bir yöntemi gösteriyoruz. Bu teknik, hem temel biyoloji hem de ilaç keşfi bağlamında, bilinmeyen mekanizmalara sahip biyolojik olarak ilginç küçük molekülleri incelemek için değerli bir araçtır.

Burada gösterilen sonuçlar, daha önce 16 yayımlanmıştır kullanımı olan antifungal ilaç itrakonazol, fotoğraf afinite probu ile elde edilmiştir. Bu özellik sayesinde 35 kDa zar proteini Voltaj bağımlı Anyon Kanal 1 (VDAC1) gibi önemli bir itrakonazol bağlayıcı proteini tespit etmek canlı hücre fotoafinite işaretleme tekniği kullanımını göstermektedir. Yukarıdaki protokol rakip molekül olarak photolabeling ve modifiye...

Burada, fotoafinite etiketlemesi kullanarak küçük molekül bağlayıcı proteinlerin tanımlanması için bir yöntem açıklıyoruz. Bu tekniğin avantajı, hedef proteinlerin bağlanma ve kovalent etiketlemesinin canlı hücresel ortamda gerçekleşmesi ve hücre lizizi üzerine doğal protein yapısını ve bağlanma koşullarını bozma riskini ortadan kaldırmasıdır.

Canlı hücre fotoafinite Etiketleme tarafından Yerli Hücresel Ortamında Küçük Molekül bağlayıcı proteinlerin belirlenmesi

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Bu prosedürün genel amacı, canlı hücrelerde hedefle bağlanabilen bir fotoafinite probu kullanarak küçük moleküllerin bağlayıcı proteinlerini belirlemek ve böylece hedefin ardından izole edilmesini ve tanımlanmasını sağlamaktır. Bu yöntem, ilaçların veya diğer küçük moleküllerin moleküler etki mekanizmasını aydınlatmak için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hedef proteinlerin bağlanmasının ve kovalent olarak etiketlenmesinin doğal hücresel ortamda gerçekleşmesiyle, hücre lizisinde doğal protein yapısının ve bağlanma koşullarının bozulması riskinin ortadan kaldırılmasıdır.İstenen örnek sayısı kadar steril altı santimetrelik hücre kültürü plağı hazırlayarak bu prosedüre başlayın. Genellikle, her tedavi koşulu için bir plak hücre kullanılır; bu gösterim için, yalnızca DMSO içeren negatif kontrolün D, yalnızca prob tedavisinin P ve prob artı kompetitörün C olarak etiketlendiği üç plak hücre hazırlanacaktır. Her bir kültür plağına, dört mililitre kültür ortamında 3,5 milyon HEK 293 T hücresi ekleyin.Hücreleri gece boyunca inkübe edin. Hücrelere uygulama yapmadan önce, gerekli ilaçları 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine önceden paylaştırın. Kompetitör ön işlemi için, iki tüpün her birine dört mikrolitre DMSO ve bir tüpe dört mikrolitre 10 milimolar kompetitör ekleyin.Prob işlemi için, bir tüpe 16 µL DMSO ve ikişer tüpe 15 µM fotoafinite probundan 16 µL ekleyin. Önceden porsiyonlanmış ilaçların eklenmesi için hücre kültür kaplarını hücre kültürü davlumbazına alın. Kompetisyon işlemi kabından 1 mL kültür ortamını aspire edin, bunu önceden porsiyonlanmış kompetitör içeren mikro santrifüj tüpüne aktarın ve ilacı ortamda yeniden süspande edin.Besiyeri ve ilaç karışımını damla damla nazikçe tekrar kaba ekleyin. Aynı şekilde, hem negatif kontrol kabına hem de prob kabına DMSO ekleyin. Kapları 30 dakika boyunca inkübatöre geri yerleştirin.30 dakika sonra, kapları kültür önleğine geri getirin ve ışıkları kısın. Negatif kontrol kabına önceden hazırlanmış DMSO'yu, prob ve kompetisyon kaplarına ise probu ekleyin. Kapları bir saat boyunca inkübatöre geri yerleştirin.Bir saat sonra, kapları buzun üzerine yerleştirin. Fazla probu uzaklaştırmak için her kaptaki hücreleri beş mililitre buz gibi soğuk PBS ile nazikçe yıkayın. Hücrelerin üzerini dört mililitre buz gibi soğuk PBS ile tekrar kapatın.Lambadan kaynaklanan ısınmayı minimize etmek için, hücrelerin bulunduğu kabı bir buz paketinin üzerine, UV lambasının üç santimetre altına ortalanacak şekilde yerleştirin ve üç dakika boyunca ışınlayın. Kabı çıkarıp buz üzerine yerleştirin. Tüm örnekleri bu şekilde ışınlayın.Tüm örneklerin ışınlanmasının ardından, hücrelerdeki PBS'yi aspire edin ve her bir kaba 200 microliter buz gibi soğuk, proteaz inhibitörlü PBS ekleyin. Hücreleri kauçuk bir kazıyıcı kullanarak kaptan ayırın ve buz üzerindeki önceden etiketlenmiş mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Her bir örneğe final konsantrasyonu 0.4% olacak şekilde SDS ekleyin. Süspansiyonu 10 puls sonikasyona tabi tutarak, bir dakika boyunca buzda inkübe ederek ve ardından tekrar 10 puls sonikasyon uygulayarak hücreleri lize edin.Hücre lizini tamamlamak ve tüm proteinleri denatüre etmek için numuneleri 95 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma bloğunda beş dakika boyunca kaynatın. Metin protokolünde açıklandığı şekilde her numunedeki protein konsantrasyonunu ölçtükten sonra, gerektiği kadar PBS pH 8.5 artı %0,4 SDS ekleyerek protein konsantrasyonunu 2,5 mg/mL değerine normalize edin. Bu prosedüre başlamak için, önceki bölümde hazırlanan her hücre lizatından 40 µL'yi yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Sırasıyla şu reaktifleri ekleyin: 0,2 µL flour-azide, 0,58 µL TCEP ve 3,38 µL TBTA. Karıştırmak için vortekslenmesini sağlayın. Reaksiyonu başlatmak için 1,14 µL bakır sülfat pentahidrat ekleyin.Kısaca vorteksleyin ve karanlıkta, oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Reaksiyonu durdurmak için 50 µL 2X SDS örnek tamponu ekleyin. Örnekleri bir SDS-PAGE jelinde yürütün ve boya önü jelin sonuna ulaştığında, reaksiyona girmemiş tüm fazla flor-azidin jelden tamamen çıktığından emin olmak için jeli beş dakika daha yürütmeye devam edin.Kalan tüm flor-azid yıkandıktan sonra, jeli bir cam plak üzerine yerleştirin ve üretici talimatlarına uygun olarak floresan jel tarayıcı kullanarak tarayın. Biyotin etiketi bağlanması için, tüm örnekler aynı hacimde olacak şekilde, protein normalizasyonundan sonra maksimum hücre lizatı miktarı kullanın. Her örneği, 50 µL ön yıkanmış yüksek kapasiteli streptavidin agaroz boncuk içeren yeni bir tüpe ekleyerek lizatları ön temizlemeden geçirin.Dönüşümlü olarak dört derece Celsius'ta bir saat boyunca inkübe edin. Boncukları santrifüjle çöktürün. Süpernatanı buz üzerinde yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve boncukları atın.500 µL lizat başına şu reaktifleri ekleyin: 1,38 µL biotin-azid, 5,5 µL TCEP ve 32,5 µL TBTA. Karıştırmak için vorteksleyin. 500 µL lizat başına 11 µL bakır sülfat pentahidrat ekleyin ve kısa süreliğine vorteksleyin.Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Proteinleri tamamen çöktürmek ve reaksiyona girmemiş biotin-azidi uzaklaştırmak için, 20 °C'ye soğutulmuş dört örnek hacmi kadar aseton ekleyin, örnekleri vorteksleyin ve 80 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, çöktürülmüş proteinleri pelitlemek için örnekleri 4 °C'de 15 dakika boyunca 17.000 x g'de santrifüjleyin.Süpernatantı tamamen aspire edin, her örneğe 150 µL PBS pH 7.4 ve %1 SDS ekleyin ve proteinleri sonikasyonla yeniden çözünür hale getirin. SDS konsantrasyonunu %0,2'ye seyreltmek için her örneğe 600 µL PBS ekleyin, ardından örneği, 30 µL önceden yıkanmış yüksek kapasiteli streptavidin agaroz boncuk içeren yeni bir tüpe ekleyin. Dört derece Celsius'ta bir saat boyunca rotasyonla inkübe edin.Bir saat sonra, boncukları 1000 x g'de üç dakika santrifüj ederek çöktürün. Bağlanmamış proteinleri içeren süpernatantı aspire ederek atın. Boncuklara bir mililitre yıkama tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında, rotasyonla beş dakika inkübe edin.Santrifüj edin, süpernatantı uzaklaştırın ve yıkama tamponu ile tekrar yıkayın. Son yıkamadan sonra, yıkama tamponunu boncuklardan tamamen aspire edin ve 30 µL 2X SDS örnek tamponu ekleyin. Proteinlerin boncuklardan salınması için 95 °C'lik bir ısıtıcı blokta beş dakika inkübe edin.Boncukları oda sıcaklığında bir dakika boyunca 13000 x g hızda santrifüjleyin. SDS-PAGE için proteinleri içeren örnek tamponunu boncukların üzerinden dikkatlice pipetleyin. Floresan etiketle işaretleme sonrası proteinlerin görselleştirilmesi, bu floresan taramalı jel ile gösterilmiştir.Yaklaşık 35 kilodalton ağırlığındaki ana spesifik bağlayıcı protein bandı, yalnızca prob şeridinde görülmektedir ve fazla miktardaki ana bileşik ile yarışmalı olarak ortadan kaldırılmıştır. Aynı 35 kilodaltonluk bant, biotin pulldown sonrası gümüş boyama ile görselleştirilmiş ve ardından kütle spektrometrisi ile membran proteini VDAC1 olarak tanımlanmıştır. Proteinin kimliği, VDAC1'e özgü bir antikor kullanılarak ayrıca doğrulanmıştır.Sinyal, prob şeridinde mevcuttur ve kompetisyon şeridinde azalmıştır. Girdi fraksiyonunun dahil edilmesi, antikorun çalıştığını ve ilgilenilen proteinin lizatta tespit edilebildiğini doğrular. Pulldown örneklerinin moleküler ağırlığındaki hafif artış, kovalent olarak bağlı olan probdan kaynaklanmaktadır.Protokoldeki belirli adımların doğru şekilde gerçekleştirilmemesinin sonuçları gösterilmiştir. Fazla flor-azidin eksik olarak uzaklaştırılması, floresan taramalı jelin altında büyük siyah lekelerin oluşmasına neden olurken; lizatların yetersiz ön temizlenmesi ve/veya boncukların yetersiz yıkanması, gümüş boyamalı jelde çok yüksek arka plan boyanmasıyla sonuçlanır. Pulldown deneyi, başlangıçtan bitişe kadar toplam iki ila üç gün sürer.Hedef protein kütle spektrometrisi veya western blotting ile izole edilip tanımlandıktan sonra, hedefin ilaçla indüklenen fenotip ile olan ilgisini değerlendirmek için ileri düzey hedefe özgü doğrulama deneyleri gerçekleştirilmelidir.

identification-small-molecule-binding-proteins-native-cellular

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

SNAP-etiket ve CLIP-tag protein etiketleme sistemleri, canlı hücreler ilgi bir protein, floresan boyalar da dahil olmak üzere moleküller, kendine özgü, kovalent eklenti sağlar. Klonlanmış ve ifade sonra tekrar clone kalmadan, etiketli protein çok sayıda downstream uygulamalar için çeşitli substratlar kullanılmalıdır.

Canlı Hücre Görüntüleme için SNAP-tag Fusion Proteinler ifade COS-7 Floresan Etiketleme

Tek molekül izleme ile kombine Fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) verir canlı Escherichia coli hücrelerinde protein-DNA etkileşimleri doğrudan gözlem ve ölçümü.

Fotoaktive Tek molekül Takip Kullanma Canlı Bakteriyel Hücrelerde Protein-DNA Etkileşimleri görselleştirme

Bu protokol, canlı hücrelerin yüzeyindeki tek reseptörleri görselleştirmek ve izlemek ve böylece reseptör yanal hareketliliğini, reseptör komplekslerinin boyutunu analiz etmek ve ayrıca geçici reseptör-reseptör etkileşimlerini görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan mikroskobunun nasıl kullanılacağını açıklar. Bu protokol diğer zar proteinlerine genişletilebilir.

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Protein-protein etkileşimleri, bimoleküler floresan tamamlama (BiFC) ile fotoaktif lokalizasyon mikroskobu (PALM) birleştirilerek nanometre uzamsal çözünürlüğe sahip hücrelerde görselleştirilir. Burada açıklanan, bireysel Ras-Raf komplekslerinin nano ölçekli kümelenmesini ve difüzyonunu görselleştirmek için U2OS hücrelerinde Ras-Raf etkileşimlerini görüntülemek için BiFC-PALM'in kullanılmasıdır.

Bimoleküler Floresan tamamlama ile fotoaktive Yerelleştirme Mikroskobu (BiFC-PALM)

Bu el yazması, işlevselleştirilmiş düzlemsel destekli lipid çift tabakası ile temas halinde olan bir T hücresinin immünolojik sinapsı içinde meydana gelirken, T hücresi antijen reseptörü (TCR) ile antijenik peptit yüklü MHC molekülleri arasındaki bağlanma dinamiklerini ölçmek için (tek moleküllü) Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) tabanlı testlerin nasıl yapılacağını açıklar.

TCR-pMHC Bağlama Ölçüm<em&gt; In Situ</em&gt; Bir FRET tabanlı Mikroskopi Assay kullanılarak

Zebra balığı embriyolarında bulunan düşük bolluktaki endojen reseptörlerin tespiti için yeni bir teknik tanımlanmıştır. Buna AFLIP adını verdik çünkü reseptörün immünopresipitasyona bağlı ligandı tarafından afinite etiketlemesinden oluşuyor.

Zebra balığı Embriyolar Endojen Reseptör Affinity Etiketleme Tespiti

Facile Floresans tahlil kanonik olmayan amino-asit (ncAAs) memeli hücrelerinde proteinlerin içine birleşmeyle amino-asil-tRNA-sentetaz/tRNA çiftleri verimliliğini değerlendirmek için sunulmuştur. G-protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) çalışmaya ncAAs uygulanması siteleri ve bioorthogonal GPCR canlı hücreleri üzerinde etiketleme bağlama fotoğraf-çapraz eşleme dahil olmak üzere açıklanır.

Kimyasal ve genetik eklenmesi en iyi duruma getirme GPCRs fotoğraf-çapraz eşleme ve canlı memeli hücreleri Bioorthogonal kimyada probları

Böl-BioID, BioID yakınlık etiketleme tekniğine dayalı bir protein parçaları-uluslara tahlil için adım adım bir protokol sağlar. İki verilen protein etkileşimi harekete geçirmek, o kendi yerel hücresel ortamlarında içerik bağımlı protein kompleksleri proteomik analiz sağlar. Yöntemi basit, uygun maliyetli ve yalnızca standart Laboratuar donanımları gerektirir.

Split-BioID — Proteomik analiz onların yerel hücresel ortamında içeriğe özel Protein kompleksleri

Burada, içinde canlı hücre organelleri tek zar proteinleri çok renkli yerelleştirme için bir iletişim kuralı mevcut. Fluorophores eklemek için kendi kendine etiketleme protein kullanılır. Aynı organel farklı membranlar bölmeleri içinde bulunan proteinler, ~ 18 hassasiyetle lokalize nm.

Çok renkli yerelleştirme mikroskobu canlı memeli hücre organelleri tek membran proteinlerin

Doğası gereği düzensiz birçok proteinin, çok sayıda hücresel süreç için önemli bir davranış olan oldukça dinamik biyomoleküler kondensatların oluşumuna katıldığı gösterilmiştir. Burada, canlı hücrelerdeki biyomoleküler kondensatlarda proteinlerin birbirleriyle etkileşime girdiği dinamikleri ölçmek için tek moleküllü görüntüleme tabanlı bir yöntem sunuyoruz.

Biyomoleküler Kondensatlarda Protein Etkileşim Dinamiğinin Tek Moleküllü Ölçümü

Bu protokol, plazma zarı proteinlerinin nano ölçekli mekânsal organizasyonunu çözmek için tek antikor etiketlemesini (SAL) tanımlar. Tek molekül düzeyinde kümülatif antikor-epitop etkileşimlerini kullanarak, membran SAL (mSAL), yerel epitop dağılımlarını haritalandırırken aynı zamanda doğal hücresel ortamda antikor bağlanma davranışını yakalar.

Tek Antikor Etiketleme Kullanarak Zar Proteinlerinin Tek Moleküllü Lokalizasyon Mikroskopisi

Öğrenin, canlı hücrelerde fotoafinite etiketleme kullanarak küçük molekül bağlayıcı proteinleri nasıl belirleyeceğinizi. Bu yöntem, ilaçların moleküler etki mekanizmalarını açıklamak için güvenilir bir yaklaşım sunar.

Canlı hücre fotoafinite Etiketleme tarafından Yerli Hücresel Ortamında Küçük Molekül bağlayıcı proteinlerin belirlenmesi

Daha fazla video keşfet