Canlı hücre fotoafinite Etiketleme tarafından Yerli Hücresel Ortamında Küçük Molekül bağlayıcı proteinlerin belirlenmesi

Bu prosedürün genel amacı, canlı hücrelerde hedefine bağlanabilen ve daha sonra hedefin izolasyonuna ve tanımlanmasına izin veren bir fotoafinite probu kullanarak küçük moleküllerin bağlayıcı proteinlerini tanımlamaktır. Bu yöntem, ilaçların veya diğer küçük moleküllerin moleküler etki mekanizmasını aydınlatmak için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hedef proteinlerin bağlanma ve kovalent etiketlemesinin doğal hücresel ortamda meydana gelmesi ve hücre lizizi üzerine doğal protein yapısını ve bağlanma koşullarını bozma riskini ortadan kaldırmasıdır.

İstenen numune sayısı için steril altı santimetre hücre kültürü kapları hazırlayarak bu işleme başlayın. Tipik olarak, tedavi koşulu başına bir tabak hücre kullanılır. Bu gösteri için üç hücre tabağı hazırlanacak ve sadece DMSO ile negatif kontrol, D etiketli, sadece prob muamelesi, sadece P etiketli ve prob artı rakip, her bir kültür kabı C.To etiketlenmiş, dört mililitre kültür ortamına 3.5 milyon HEK 293 T hücresi eklenecektir.

Hücreleri gece boyunca inkübe edin. Hücreleri tedavi etmeden önce, gerekli ilaçları 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine önceden ayırın. Rakip ön işlem için, iki tüpün her birine dört mikrolitre DMSO ve bir tüpe dört mikrolitre 10 milimolar rakip ekleyin.

Prob tedavisi için, bir tüpe 16 mikrolitre DMSO ve iki tüpün her birine 16 mikrolitre 15 mikromolar fotoafinite probu ekleyin. Önceden alıntılanmış ilaçların eklenmesi için hücre kültürü kaplarını hücre kültürü başlığına getirin. Yarışma tedavi kabından bir mililitre kültür ortamını aspire edin, önceden alıntılanmış rakibi içeren mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve ilacı ortamda yeniden süspanse edin.

Orta ve ilaç karışımını yavaşça tabağa damla damla geri ekleyin. Aynı şekilde, hem negatif kontrol kabına hem de prob kabına DMSO ekleyin. Bulaşıkları 30 dakika boyunca inkübatöre geri koyun.

30 dakika sonra bulaşıkları kültür davlumbazına geri getirin ve ışıkları kısın. Önceden alıntılanmış DMSO'yu negatif kontrol kabına ekleyin ve sondayı prob ve yarışma tabaklarına ekleyin. Bulaşıkları bir saat boyunca inkübatöre geri koyun.

Bir saat sonra bulaşıkları buzun üzerine koyun. Fazla probu çıkarmak için her tabaktaki hücreleri beş mililitre buz gibi soğuk PBS ile nazikçe yıkayın. Hücreleri dört mililitre buz gibi soğuk PBS ile tekrar örtün.

Lambadan gelen ısınmayı en aza indirmek için UV lambasının altında üç santimetre ortalanmış bir hücre tabağı yerleştirin ve üç dakika boyunca ışınlayın. Çanağı çıkarın ve buzun üzerine yerleştirin. Bu şekilde, tüm numuneleri ışınlayın.

Tüm örneklerin ışınlanmasından sonra, PBS'yi hücrelerden aspire edin ve her tabağa proteaz inhibitörleri içeren 200 mikrolitre buz gibi PBS ekleyin. Kauçuk bir kazıyıcı kullanarak hücreleri tabaktan ayırın ve buz üzerinde önceden etiketlenmiş mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Her numuneye% 0.4'lük bir nihai konsantrasyona SDS ekleyin, süspansiyonu 10 darbe için sonikleştirerek, bir dakika boyunca buz üzerinde inkübe ederek ve daha sonra başka bir 10 darbe için sonikasyon yaparak hücreleri parçalayın.

Hücre lizizini tamamlamak ve tüm proteinleri denatüre etmek için numuneleri 95 santigrat dereceye ayarlanmış bir ısı bloğunda beş dakika kaynatın. Metin protokolünde açıklandığı gibi her bir numunedeki protein konsantrasyonunu ölçtükten sonra, gerektiğinde PBS PH 8.5 artı% 0.4 SDS ekleyerek protein konsantrasyonunu mililitre başına 2.5 miligram olarak normalleştirin. Bu işleme başlamak için, önceki segmentte hazırlanan her hücre lizatının 40 mikrolitresini yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Aşağıdaki reaktifleri bu sırayla ekleyin, 0.2 mikrolitre un-azid, 0.58 mikrolitre TCEP ve 3.38 mikrolitre TBTA. Karıştırmak için girdap. Reaksiyonu başlatmak için 1.14 mikrolitre bakır sülfat pentahidrat ekleyin.

Kısa bir süre vorteks yapın ve karanlıkta 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Reaksiyonu söndürmek için 50 mikrolitre 2X SDS numune tamponu ekleyin. Numuneleri bir SDS-PAGE jeli üzerinde çalıştırın ve boya önü jelin sonuna ulaştığında, fazla reaksiyona girmemiş un-azidin tamamının jelden tamamen çıktığından emin olmak için jeli beş dakika daha çalıştırmaya devam edin.

Tüm fazla un-azidi yıkadıktan sonra, jeli bir cam tabağa koyun ve üreticinin talimatlarına göre jeli bir floresan jel tarayıcı kullanarak tarayın. Bir biyotin etiketinin eklenmesi için, protein normalizasyonundan sonra, tüm numuneler aynı hacimde olacak şekilde maksimum miktarda hücre lizatı kullanın. Her bir numuneyi 50 mikrolitre önceden yıkanmış yüksek kapasiteli streptavidin agaroz boncukları içeren yeni bir tüpe ekleyerek lizatları önceden temizleyin.

Rotasyon ile dört santigrat derecede bir saat inkübe edin. Boncukları santrifüjleme ile peletleyin. Süpernatanı buz üzerinde yeni bir mikrosantrifüj tüpüne çıkarın ve boncukları atın.

500 mikrolitre lizat başına aşağıdaki reaktifleri, 1.38 mikrolitre biotin-azid, 5.5 mikrolitre TCEP ve 32.5 mikrolitre TBTA ekleyin. Karıştırmak için girdap. 500 mikrolitre lizat başına 11 mikrolitre bakır sülfat pentahidrat ekleyin ve kısaca girdap yapın.

Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. 20 santigrat dereceye kadar soğutulmuş dört numune hacmi aseton ekleyin, numuneleri vorteksleyin ve proteinleri tamamen çökeltmek ve reaksiyona girmemiş biyotin-azidi çıkarmak için gece boyunca 80 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, çökelmiş proteinleri peletlemek için numuneleri 17.000 x g'da dört santigrat derecede 15 dakika

Süpernatanı tamamen aspire edin, her numuneye 150 mikrolitre PBS PH 7.4 ve% 1 SDS ekleyin ve proteinleri sonikasyon ile çözündürün. SDS konsantrasyonunu %0,2'ye seyreltmek için her numuneye 600 mikrolitre PBS ekleyin, ardından numuneyi 30 mikrolitre önceden yıkanmış yüksek kapasiteli streptavidin agaroz boncukları içeren yeni bir tüpe ekleyin. Rotasyon ile dört santigrat derecede bir saat inkübe edin.

Bir saat sonra, boncukları üç dakika boyunca 1000 x g'da santrifüjleme ile peletleyin. Bağlanmamış proteinler içeren süpernatanı aspire edin ve atın. Boncuklara bir mililitre yıkama tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında dönerek beş dakika inkübe edin.

Santrifüjleyin, süpernatanı atın ve tekrar yıkama tamponu ile yıkayın. Son yıkamadan sonra, yıkama tamponunu boncuklardan tamamen aspire edin ve 30 mikrolitre 2X SDS numune tamponu ekleyin. Boncuklardan proteinleri serbest bırakmak için 95 santigrat derecelik bir ısı bloğunda beş dakika inkübe edin.

Boncukları oda sıcaklığında 13000 x g'da bir dakika santrifüjleyin. SDS-PAGE için boncuklardan protein içeren numune tamponunu dikkatlice pipetleyin. Floresan etiketi ile etiketlendikten sonra proteinlerin görselleştirilmesi, bu floresan taranmış jel ile gösterilmiştir.

Yaklaşık 35 kilodaltonluk ana spesifik bağlayıcı protein bandı, yalnızca prob şeridinde bulunur ve fazla ana bileşik tarafından rekabet edilir. Aynı 35 kilodalton bandı, biyotin çekilmesinden sonra gümüş boyama ile görüntülendi ve daha sonra kütle spektrometresi ile zar proteini VDAC1 olarak tanımlandı. Proteinin kimliği, VDAC1 için spesifik bir antikor kullanılarak daha da doğrulandı.

Sinyal, prob şeridinde bulunur ve yarışma şeridinde azaltılır. Giriş fraksiyonu dahil olmak üzere, antikorun çalışmasını ve ilgilenilen proteinin lizatta tespit edilebilmesini sağlar. Aşağı çekilen numunelerin moleküler ağırlığındaki hafif artış, kıvrımlı bir şekilde tutturulmuş probdan kaynaklanmaktadır.

Protokoldeki belirli adımların doğru bir şekilde gerçekleştirilmemesinin sonuçları gösterilmiştir. Fazla un-azidin eksik çıkarılması, floresan taranmış jelin dibinde büyük siyah lekelere neden olurken, lizatların yetersiz ön temizlenmesi ve/veya boncukların yıkanması, çok yüksek arka plan lekelenmesine sahip gümüş lekeli bir jel ile sonuçlanır. Baştan sona, açılır denemenin tamamlanması iki ila üç gün sürer.

Hedef protein izole edildikten ve kütle spektrometresi veya western blotlama ile tanımlandıktan sonra, hedefin ilaca bağlı fenotiple ilgisini değerlendirmek için daha fazla hedefe özgü doğrulama deneyleri yapılmalıdır.