Canlı hücre fotoafinite Etiketleme tarafından Yerli Hücresel Ortamında Küçük Molekül bağlayıcı proteinlerin belirlenmesi

Bu prosedürün genel amacı, canlı hücrelerde hedefle bağlanabilen bir fotoafinite probu kullanarak küçük moleküllerin bağlayıcı proteinlerini belirlemek ve böylece hedefin ardından izole edilmesini ve tanımlanmasını sağlamaktır. Bu yöntem, ilaçların veya diğer küçük moleküllerin moleküler etki mekanizmasını aydınlatmak için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hedef proteinlerin bağlanmasının ve kovalent olarak etiketlenmesinin doğal hücresel ortamda gerçekleşmesiyle, hücre lizisinde doğal protein yapısının ve bağlanma koşullarının bozulması riskinin ortadan kaldırılmasıdır.

İstenen örnek sayısı kadar steril altı santimetrelik hücre kültürü plağı hazırlayarak bu prosedüre başlayın. Genellikle, her tedavi koşulu için bir plak hücre kullanılır; bu gösterim için, yalnızca DMSO içeren negatif kontrolün D, yalnızca prob tedavisinin P ve prob artı kompetitörün C olarak etiketlendiği üç plak hücre hazırlanacaktır. Her bir kültür plağına, dört mililitre kültür ortamında 3,5 milyon HEK 293 T hücresi ekleyin.

Hücreleri gece boyunca inkübe edin. Hücrelere uygulama yapmadan önce, gerekli ilaçları 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine önceden paylaştırın. Kompetitör ön işlemi için, iki tüpün her birine dört mikrolitre DMSO ve bir tüpe dört mikrolitre 10 milimolar kompetitör ekleyin.

Prob işlemi için, bir tüpe 16 µL DMSO ve ikişer tüpe 15 µM fotoafinite probundan 16 µL ekleyin. Önceden porsiyonlanmış ilaçların eklenmesi için hücre kültür kaplarını hücre kültürü davlumbazına alın. Kompetisyon işlemi kabından 1 mL kültür ortamını aspire edin, bunu önceden porsiyonlanmış kompetitör içeren mikro santrifüj tüpüne aktarın ve ilacı ortamda yeniden süspande edin.

Besiyeri ve ilaç karışımını damla damla nazikçe tekrar kaba ekleyin. Aynı şekilde, hem negatif kontrol kabına hem de prob kabına DMSO ekleyin. Kapları 30 dakika boyunca inkübatöre geri yerleştirin.

30 dakika sonra, kapları kültür önleğine geri getirin ve ışıkları kısın. Negatif kontrol kabına önceden hazırlanmış DMSO'yu, prob ve kompetisyon kaplarına ise probu ekleyin. Kapları bir saat boyunca inkübatöre geri yerleştirin.

Bir saat sonra, kapları buzun üzerine yerleştirin. Fazla probu uzaklaştırmak için her kaptaki hücreleri beş mililitre buz gibi soğuk PBS ile nazikçe yıkayın. Hücrelerin üzerini dört mililitre buz gibi soğuk PBS ile tekrar kapatın.

Lambadan kaynaklanan ısınmayı minimize etmek için, hücrelerin bulunduğu kabı bir buz paketinin üzerine, UV lambasının üç santimetre altına ortalanacak şekilde yerleştirin ve üç dakika boyunca ışınlayın. Kabı çıkarıp buz üzerine yerleştirin. Tüm örnekleri bu şekilde ışınlayın.

Tüm örneklerin ışınlanmasının ardından, hücrelerdeki PBS'yi aspire edin ve her bir kaba 200 microliter buz gibi soğuk, proteaz inhibitörlü PBS ekleyin. Hücreleri kauçuk bir kazıyıcı kullanarak kaptan ayırın ve buz üzerindeki önceden etiketlenmiş mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Her bir örneğe final konsantrasyonu 0.4% olacak şekilde SDS ekleyin. Süspansiyonu 10 puls sonikasyona tabi tutarak, bir dakika boyunca buzda inkübe ederek ve ardından tekrar 10 puls sonikasyon uygulayarak hücreleri lize edin.

Hücre lizini tamamlamak ve tüm proteinleri denatüre etmek için numuneleri 95 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma bloğunda beş dakika boyunca kaynatın. Metin protokolünde açıklandığı şekilde her numunedeki protein konsantrasyonunu ölçtükten sonra, gerektiği kadar PBS pH 8.5 artı %0,4 SDS ekleyerek protein konsantrasyonunu 2,5 mg/mL değerine normalize edin. Bu prosedüre başlamak için, önceki bölümde hazırlanan her hücre lizatından 40 µL'yi yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Sırasıyla şu reaktifleri ekleyin: 0,2 µL flour-azide, 0,58 µL TCEP ve 3,38 µL TBTA. Karıştırmak için vortekslenmesini sağlayın. Reaksiyonu başlatmak için 1,14 µL bakır sülfat pentahidrat ekleyin.

Kısaca vorteksleyin ve karanlıkta, oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Reaksiyonu durdurmak için 50 µL 2X SDS örnek tamponu ekleyin. Örnekleri bir SDS-PAGE jelinde yürütün ve boya önü jelin sonuna ulaştığında, reaksiyona girmemiş tüm fazla flor-azidin jelden tamamen çıktığından emin olmak için jeli beş dakika daha yürütmeye devam edin.

Kalan tüm flor-azid yıkandıktan sonra, jeli bir cam plak üzerine yerleştirin ve üretici talimatlarına uygun olarak floresan jel tarayıcı kullanarak tarayın. Biyotin etiketi bağlanması için, tüm örnekler aynı hacimde olacak şekilde, protein normalizasyonundan sonra maksimum hücre lizatı miktarı kullanın. Her örneği, 50 µL ön yıkanmış yüksek kapasiteli streptavidin agaroz boncuk içeren yeni bir tüpe ekleyerek lizatları ön temizlemeden geçirin.

Dönüşümlü olarak dört derece Celsius'ta bir saat boyunca inkübe edin. Boncukları santrifüjle çöktürün. Süpernatanı buz üzerinde yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve boncukları atın.

500 µL lizat başına şu reaktifleri ekleyin: 1,38 µL biotin-azid, 5,5 µL TCEP ve 32,5 µL TBTA. Karıştırmak için vorteksleyin. 500 µL lizat başına 11 µL bakır sülfat pentahidrat ekleyin ve kısa süreliğine vorteksleyin.

Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Proteinleri tamamen çöktürmek ve reaksiyona girmemiş biotin-azidi uzaklaştırmak için, 20 °C'ye soğutulmuş dört örnek hacmi kadar aseton ekleyin, örnekleri vorteksleyin ve 80 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, çöktürülmüş proteinleri pelitlemek için örnekleri 4 °C'de 15 dakika boyunca 17.000 x g'de santrifüjleyin.

Süpernatantı tamamen aspire edin, her örneğe 150 µL PBS pH 7.4 ve %1 SDS ekleyin ve proteinleri sonikasyonla yeniden çözünür hale getirin. SDS konsantrasyonunu %0,2'ye seyreltmek için her örneğe 600 µL PBS ekleyin, ardından örneği, 30 µL önceden yıkanmış yüksek kapasiteli streptavidin agaroz boncuk içeren yeni bir tüpe ekleyin. Dört derece Celsius'ta bir saat boyunca rotasyonla inkübe edin.

Bir saat sonra, boncukları 1000 x g'de üç dakika santrifüj ederek çöktürün. Bağlanmamış proteinleri içeren süpernatantı aspire ederek atın. Boncuklara bir mililitre yıkama tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında, rotasyonla beş dakika inkübe edin.

Santrifüj edin, süpernatantı uzaklaştırın ve yıkama tamponu ile tekrar yıkayın. Son yıkamadan sonra, yıkama tamponunu boncuklardan tamamen aspire edin ve 30 µL 2X SDS örnek tamponu ekleyin. Proteinlerin boncuklardan salınması için 95 °C'lik bir ısıtıcı blokta beş dakika inkübe edin.

Boncukları oda sıcaklığında bir dakika boyunca 13000 x g hızda santrifüjleyin. SDS-PAGE için proteinleri içeren örnek tamponunu boncukların üzerinden dikkatlice pipetleyin. Floresan etiketle işaretleme sonrası proteinlerin görselleştirilmesi, bu floresan taramalı jel ile gösterilmiştir.

Yaklaşık 35 kilodalton ağırlığındaki ana spesifik bağlayıcı protein bandı, yalnızca prob şeridinde görülmektedir ve fazla miktardaki ana bileşik ile yarışmalı olarak ortadan kaldırılmıştır. Aynı 35 kilodaltonluk bant, biotin pulldown sonrası gümüş boyama ile görselleştirilmiş ve ardından kütle spektrometrisi ile membran proteini VDAC1 olarak tanımlanmıştır. Proteinin kimliği, VDAC1'e özgü bir antikor kullanılarak ayrıca doğrulanmıştır.

Sinyal, prob şeridinde mevcuttur ve kompetisyon şeridinde azalmıştır. Girdi fraksiyonunun dahil edilmesi, antikorun çalıştığını ve ilgilenilen proteinin lizatta tespit edilebildiğini doğrular. Pulldown örneklerinin moleküler ağırlığındaki hafif artış, kovalent olarak bağlı olan probdan kaynaklanmaktadır.

Protokoldeki belirli adımların doğru şekilde gerçekleştirilmemesinin sonuçları gösterilmiştir. Fazla flor-azidin eksik olarak uzaklaştırılması, floresan taramalı jelin altında büyük siyah lekelerin oluşmasına neden olurken; lizatların yetersiz ön temizlenmesi ve/veya boncukların yetersiz yıkanması, gümüş boyamalı jelde çok yüksek arka plan boyanmasıyla sonuçlanır. Pulldown deneyi, başlangıçtan bitişe kadar toplam iki ila üç gün sürer.

Hedef protein kütle spektrometrisi veya western blotting ile izole edilip tanımlandıktan sonra, hedefin ilaçla indüklenen fenotip ile olan ilgisini değerlendirmek için ileri düzey hedefe özgü doğrulama deneyleri gerçekleştirilmelidir.