Name: Etkili belirlenmesi tahlillerinde Peptit Agonistlerinin seri Seyreltme için Dağıtım Otomatik Akustik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Öğrenin peptit örneklerinin seri seyreltmesi için otomatik akustik yöntemi; plastik malzemelere adsorpsiyonu en aza indirerek ilaç keşfinde etkinlik belirleme doğruluğunu artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Peptid seri seyreltme <ol><li> deney tamponu hazırlayın: Hanks, 25 mM HEPES,% 0.1 BSA ve 0.5 mM 3-izobutil-1-metilksantin (IBMX), pH 7.4 ile takviye edilmiş tuz çözeltisi (HBSS) tamponlu. </li><li> sistematik beş 384-düşük hacimli deney plakalarının her çukuruna deney tamponu 5 ul bir hacim tepkin madde dağıtıcı kullanın. <ol><li> üreticinin talimatlarına göre 384 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 5 ul hacmi ilave edilmesi için bir dağıtma programı oluşturmak için iç yazılım kullanın. </li><li> deney tamponu ve prime sıvısında kaset boru dağıtım daldırın. </li><li> plaka taşıyıcısı üzerindeki 384 de düşük hacimli tahlil plaka koyun. </li><li> Başlata basınız. </li></ol></li><li> 100x peptid stokunun üretilmesi için deney tamponu içine ne olursa olsun, bir depolama aracı, her peptit örnekleri seyreltilir. Not: tarama gerektiren peptidlerdir örneğin, DMSO (w uygun görüldüğü şekilde fosfat-tamponlu salin (PBS) veya dimetil sülfoksit (DMSO) içinde temin edilebilirHasta bu PEGilasyon gibi sekonder değişikliklerin) sahip peptidler üzerinde zararlı bir etkiye sahiptir. </li><li> sütunlar akustik nitelikli 384-polipropilen mikroplaka 1-5 içine 25 ul 100x peptid stokları koyun. Bu plaka &#39;kaynak plaka A&#39; belirlenmiştir. bu kaynak plakaları olun, ancak hedef plakaları, düz dipli ve akustik enstrümanlar üreticisi tarafından tanımlanan belirli akustik toleranslar uygundur. </li><li> kuyular A23 içine 25 ul 100x referans kontrolü dağıtın ve kaynak plaka A. A24 </li><li> Kaynak plaka A. sütun 21-22 içine sütun 11-15 ve 30 ul tahlil tamponu içine 10 ul deney tamponu dağıtın </li><li> sütunlar ikinci akustik nitelikli 384 polipropilen mikroplaka 6-10 ve sütunları 16-20 içine 10 ul deney tamponu koyun. Bu plaka &#39;kaynak plaka B&#39; belirlenmiştir. </li><li> 1 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin kaynağı A ve B levhalarının. uygun bir denge levhasını içerir. </li><li> akustik flui kullanınKaynak A sütun 1 100x peptid stokları (deney tamponu içinde), 100, ara seyreltiler: D dağıtıcılar, sıralı üç 1 hazırlanması için bir otomatik robotlu sisteme entegre NOT: Programlama kaynak A ve kaynak B (plaka düzenleri için bakınız Şekil 1) arasında üç akustik transferlerine izin plaka yeniden biçimlendirme ve (akustik sıvı dağıtıcısının üreticisi tarafından sağlanan gibi) doz-yanıt yazılım gerektirir. Özellikle 1,9 ayrıntıları otomatik robot kontrolü altında bu laboratuvarda kullanılan sıvı dağıtıcıları kullanımı Adım (Malzeme Tablo bakınız): <ol><li> robotik plaka otel bölümünde yükleyin kaynak plakaları ve tahlil plakaları. </li><li> Açık, otomatik robotlu yazılım ve yük plakası yeniden biçimlendirme ve doz-yanıt programı genişletme protokolleri. &#39;Çalıştır&#39; düğmesine tıklayın. NOT: Otomasyon kaynak plakası B sütunları 6-10 içine kaynak plakası A sütunları 1-5 250 nl aktarmak için bir akustik sıvı dağıtıcı talimatı ve ikinci akustik birkarıştırmak için 15 ul deney tamponu ile doldurmak için büyük sıvı hacimlerini işleme yeteneğine c sıvı dağıtıcısı. Otomasyon sonra entegre santrifüj ve 1 dakika boyunca 300 xg&#39;de santrifüj (uygun bir denge plakası tüm santrifüj adımları dahildir) kaynak plakası B aktarır. Kaynak plaka B kaynak plakası A sütunları 11-15 içine kaynak plakası B sütunları 6-10 250 nl transferi için akustik sıvı dağıtıcı döndü ve karıştırmak için 15 ul deney tamponu ile dolgu edilir. Entegre santrifüj ve 1 dakika boyunca 300 xg&#39;de santrifüj Otomasyon transferleri kaynak plakası A. Kaynak levhası ardından kaynak plakası B sütunları 16-20 içine kaynak plakası A sütunları 11-15 250 nl transferi için akustik sıvı dağıtıcı döndü ve karıştırmak için 15 ul deney tamponu ile dolgu edilir. Otomasyon sonra 1 dakika boyunca 300 xg&#39;de entegre santrifüj ve santrifüjler kaynak plakası B aktarır. NOT: Son olarak doz tepki protokolü aktarmak için akustik dağıtılmasını yönlendirir(Kaynak levhasının ve kaynak plakası B hem de) 4 seri olarak seyreltilmiş, kaynak plakası kuyularının her biri gerekli hacmi deney plakalarında iki kez tam 11 noktalı eğri oluşturmak için (yukarıda Adım 1.2&#39;de 5 ul deney tamponu ile önceden doldurulmuş ). Otomasyon Entegre santrifüj transferler tahlil plaka ve santrifüjler 1 dakika boyunca 300 xg&#39;de. </li></ol></li></ol> 2. Hücre Hazırlanması <ol><li> 20 mi tayin tamponu içinde 37 ° C bir su banyosu ve tekrar süspansiyon hızla hedef fare, GLP-1 reseptörü eksprese eden çözülme dondurulan Çin hamsteri yumurtalık (CHO) hücreleri. </li><li> Oda sıcaklığında 200 xg (RT), 5 dakika boyunca santrifüj hücre süspansiyonu. uygun bir denge ekleyin. </li><li> Süpernatant atın ve 10 ml tahlil tamponu hücre pelletini. </li><li> Tripan mavi 1 ve otomatik bir hücre sayacı kullanılarak, canlı hücrelerin yoğunluğunu belirler: hücre stoku: 1 seyreltin. Wel 8.000 hücrelerine (eşdeğer, ml başına 1.6 x 10 6 hücre olarak tahlil tamponu içinde yeniden süspanse hücreleriDeney plakaları l). </li><li> 30 dakika boyunca oda sıcaklığında (5 ul deney tamponu içinde seri halinde seyreltilmiş peptid içeren) deney plakalarının her çukuruna hücre süspansiyonu 5 ul ve inkübasyona bir kütle reaktif dağıtıcı kullanın. </li></ol> 3. HTRF cAMP tespitinde <ol><li> kullanımdan önce, 30 dakika boyunca oda sıcaklığına HTRF cAMP tahlili kiti getirin. </li><li> (CAMP tarama deneyinde üreticisi tarafından sağlanan özel formülasyon) liziz tamponu içinde 1:20 seyreltide ayrı ayrı HTRF reaktif (cryptate ve D2) hazırlayın. NOT: DİKKAT: Lizis tampon potasyum zehirlidir florid (KF) ve teratojen 13 içerir. Atıkları, KF içeren tahlil tabak mühürlü ve yakılarak ve herhangi bir sıvı atık önce lavaboya aşağı elden su ile &lt;1 mg / L seyreltilmiş gerekmektedir edilmelidir. </li><li> deney plakalarının tüm oyuklara 5 ul kriptat reaktif ekleme bir kütle reaktif dağıtıcı kullanın. </li><li> colum 5 ul d2 reaktifi eklemek için toplu reaktif dağıtıcı kullanınns tahlil plakaları 1-22. </li><li> Hemen el ile spesifik olmayan bağlanma (NSB) kontrol kuyuları ve kuyu E23-P24 içinde D2 reaktif 5 ul elde deney plakaları kuyu A23-D24 içinde 5 ul lizis tamponu pipetle. </li><li> kuyu karıştırmak oda sıcaklığında 200 xg&#39;de 1 dakika için deney plakaları santrifüjleyin. </li><li> buharlaşma ve foto-ağartma en aza indirmek ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe tahlil plakaları örtün. </li><li> 620 nm&#39;de bir plaka okuyucu kullanılarak 665 nm &#39;de 320 nm&#39; de bir eksitasyon ve emisyon ile flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) sinyali ölçer. </li></ol> 4. Veri Analizi <ol><li> tüm kuyulardan arka plan çıkarmak için NSB ortalama kullanın. </li><li> aşağıdaki şekilde 665 nm / 620 nm oranından% Delta F hesaplanır: Oran = (A 665nm / A 620) 10 4 x Delta F = ((Numune Oranı - Oran NSB) / Oran NSB)) x 100 nerede Oran NSB hiçbir d2 reaktifi ile kuyu =. </li><li> % Activat hesaplayınaşağıda uyarılmamış hücrelerde ve hücreler arasında iyon maksimum GLP-1 ligand ile uyarılmış: % Aktivasyon = (% Delta Fsample -% DeltaFunstimulated hücreleri) / (% DeltaFGLP-1 uyarılan hücreler -% DeltaF uyarılmamış hücreler) x 100 </li><li> Referans kontrol 1 ile tanımlanan,% aktivasyonu gibi 4-parametreli lojistik analizi ve grafik ile konsantrasyon-tepki eğrileri analiz edin. </li></ol>

<ol><li>Naylor, J., Rossi, A., Hornigold, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+Dispensing+Preserves+the+Potency+of+Therapeutic+Peptides+throughout+the+Entire+Drug+Discovery+Workflow%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">Acoustic Dispensing Preserves the Potency of Therapeutic Peptides throughout the Entire Drug Discovery Workflow.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 90-96 (2016).</li>
<li>Campbell, J. E., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacology%2C+physiology%2C+and+mechanisms+of+incretin+hormone+action%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.Metab%22%5BJournal%5D)">Pharmacology, physiology, and mechanisms of incretin hormone action.</a> Cell.Metab. 17 (6), 819-837 (2013).</li>
<li>Hui, H., Farilla, L., Merkel, P., Perfetti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+short+half-life+of+glucagon-like+peptide-1+in+plasma+does+not+reflect+its+long-lasting+beneficial+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.J.Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The short half-life of glucagon-like peptide-1 in plasma does not reflect its long-lasting beneficial effects.</a> Eur.J.Endocrinol. 146 (6), 863-869 (2002).</li>
<li>Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient%2C+contact-free+volume+transfers+minimize+compound+loss+in+dose-response+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomol.Screen%22%5BJournal%5D)">Gradient, contact-free volume transfers minimize compound loss in dose-response experiments.</a> J.Biomol.Screen. 15 (1), 86-94 (2010).</li>
<li>Ekins, S., Olechno, J., Williams, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispensing+Processes+Impact+Apparent+Biological+Activity+as+Determined+by+Computational+and+Statistical+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dispensing Processes Impact Apparent Biological Activity as Determined by Computational and Statistical Analyses.</a> PLoS ONE. 8 (5), 62325(2013).</li>
<li>Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Tache, Y., Reeve, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+using+the+optimal+plasticware+and+glassware+in+studies+involving+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.Biochem%22%5BJournal%5D)">The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides.</a> Anal.Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).</li>
<li>McDonald, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+Contaminants+Leach+from+Disposable+Laboratory+Plasticware%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bioactive Contaminants Leach from Disposable Laboratory Plasticware.</a> Science. 322 (5903), 917(2008).</li>
<li>Belaiche, C., Holt, A., Saada, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonylphenol+ethoxylate+plastic+additives+inhibit+mitochondrial+respiratory+chain+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonylphenol ethoxylate plastic additives inhibit mitochondrial respiratory chain complex I.</a> Clin Chem. 55 (10), 1883-1884 (2009).</li>
<li>Sackmann, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+That+Enable+Accurate+and+Precise+Nano-+to+Milliliter-Scale+Liquid+Dispensing+of+Aqueous+Reagents+Using+Acoustic+Droplet+Ejection%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 166-177 (2016).</li>
<li>Grant, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+accurate+compound+concentration+in+cell-based+screening%3A+validation+of+acoustic+droplet+ejection+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomol.Screen%22%5BJournal%5D)">Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology.</a> J.Biomol.Screen. 14 (5), 452-459 (2009).</li>
<li>Turmel, M., Itkin, Z., Liu, D., Nie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Innovative+Way+to+Create+Assay+Ready+Plates+for+Concentration+Response+Testing+Using+Acoustic+Technology%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">An Innovative Way to Create Assay Ready Plates for Concentration Response Testing Using Acoustic Technology.</a> J.Lab.Autom. 15 (4), 297-305 (2010).</li>
<li>Butler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+site-specific+retargeting+jump-in+platform+cell+line+to+support+biologic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomol.Screen%22%5BJournal%5D)">Use of the site-specific retargeting jump-in platform cell line to support biologic drug discovery.</a> J.Biomol.Screen. 20 (4), 528-535 (2015).</li>
<li>Panchal, S., Verma, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+sodium+fluoride+in+maternal+and+offspring+rats+and+its+amelioration%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Pac.J.Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of sodium fluoride in maternal and offspring rats and its amelioration.</a> Asian Pac.J.Reprod. 3 (1), 71-76 (2014).</li>
<li>Hanson, S. M., Ekins, S., Chodera, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+error+in+experimental+assays+using+the+bootstrap+principle%3A+understanding+discrepancies+between+assays+using+different+dispensing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22J.Comput.+Aided+Mol.Des%22%5BJournal%5D)">Modeling error in experimental assays using the bootstrap principle: understanding discrepancies between assays using different dispensing technologies.</a> J.Comput. Aided Mol.Des. 29 (12), 1073-1086 (2015).</li>
<li>Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient%2C+Contact-Free+Volume+Transfers+Minimize+Compound+Loss+in+Dose-Response+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Gradient, Contact-Free Volume Transfers Minimize Compound Loss in Dose-Response Experiments.</a> J.Biomol. Screen. 15 (1), 86-94 (2010).</li>
<li>Chan, G. K. Y., Wilson, S., Schmidt, S., Moffat, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlocking+the+potential+of+high-throughput+drug+combination+assays+using+acoustic+dispensing%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">Unlocking the potential of high-throughput drug combination assays using acoustic dispensing.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 125-132 (2016).</li>
<li>Roberts, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+and+challenges+of+direct+acoustic+dosing+into+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">Implementation and challenges of direct acoustic dosing into cell-based assays.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 76-89 (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu protokol, seri örnek 1 &#39;den az ul gerektiren, 3 x 10 6 bir konsantrasyon aralığı üzerinde peptid örnekleri seyreltilmesi için otomatik bir akustik dağıtma başarılı bir uygulama açıklanmaktadır. Bu yöntemin en önemli avantajı, normal reaktif ve karıştırmak için gerekli olan deney kapları (örneğin, pipet uçları gibi) plasticware örneklerin düşük maruz kalma ile plasticware peptit adsorpsiyonu en aza indirmek suretiyle veri kalitesinin artırmaktır. akustik dağıtım tamamen plasticware kullanımını ekarte et...

GLP-1 R tip 2 diyabet 2 tedavisinde kurulu bir ilacın bir hedeftir. Bu reseptör için yerli peptit agonisti, GLP-1, 2-3 dakika 3 bir in vivo yarı-ömrü vardır. adenilil siklaz aktivasyonuna doğal G protein bağlanması yoluyla ikinci haberci cAMP&#39;nin alt üretimindeki G protein bağlı hedef reseptör sonuçlarına GLP-1 bağlanması. biriken cAMP ölçümü sağlam bir tahlil reseptör aktivasyonunun izlemek ve tercih edilen bir fiziko-kimyasal özellikleri, aktif GLP-1 analogları taranması için içerir. Böyle bir deney, konsantrasyon-tepki eğrilerini oluşturmak için test numunelerinin seri seyreltme gerektirir ve peptid örnekleri teslim Bu, özellikle karmaşıktır. Ucu tabanlı seri seyreltme hazırlanmasından potansiyel hatalar, daha önce 1,4,5 tarif edilmiştir. Peptidler güvenilmez potens tahminlerinde sonuçlanan plasticware yapışır. Peptit kaybı t yoluyla minimize edilebilirO sığır serum tamponlarda albümini (BSA) ve silikonlu plasticware kullanımı, ama bağlayıcı proteinin eklenmesi düzensiz kalmaktadır. Özel olarak, deney kaplarına GLP-1 bağlanması değişim 6 tarif edilmiştir. Sulu tahlil tampon içine ipuçları ve mikrotiter plakaları liç ve protein fonksiyonu 7, 8 engelleyebilir laboratuvar plasticware kullanılan bu istikrar ajanlar daha da komplikasyon var. Bu nedenle, yöntemler plasticware maruziyeti azaltmak için ölçümlerin doğruluğunu artırmak için gereklidir. Akustik Sıvı dağıtıcıları bitişik tahlil plaka 9 içinde hassas nanolitre damlacıklarının ejeksiyon sonuçlanan bir sıvı numunesinin yüzeyi üzerine, yüksek frekanslı akustik sinyal odaklanır. Akustik ejeksiyon kullanımı hazırlanması ve büyük sentetik bileşik kütüphanelerinin taranması için ilaç endüstrisinde standart ve teknoloji de küçük Moleküller için valide edilmiştires 10. Bildiğimiz kadarıyla, rekombinant ve sentetik peptidlerin hazırlanması için akustik dağıtılmasını tanımlamak için birinci grup ve daha önce bilinen ucu tabanlı yöntem 1 ile karşılaştırıldığında geliştirilmiş doğruluk bildirmiştir. Bu makalede, bir tam otomatik plaka taşıma robotik sistem üzerine temassız akustik transferi ile peptid seri ve direkt dilüsyonları hazırlanması entegrasyonunu anlatmaktadır. Örneklerin akustik transfer kapsayan bir dizi yöntem, daha önce, 11 tarif edilmiştir. Bu, iki aşamalı bir yöntem, ara stok konsantrasyonları hazırlamak için ve seri olarak tam doz-tepki eğrisi oluşturacak şekilde peptit analoglarını seyreltmek için kullanmaktadır. hazırlanan peptidler, hedef hücreler, fare GLP-1R ifade ile inkübe edilir, ve peptid agonisti activ bir okuma olarak, bu hücreler içinde, cAMP birikiminin ölçülmesi için ticari olarak elde edilebilen homojen zaman çözümlü bir fluoresans (HTRF) deneyi kullanımıSığ. Deney sağlam ve yüksek verimli bir 384-gözlü formata müsait ve rutin olarak, her iki deney geliştirme tatbik edildi ve ilaç tarama 12 çıkıntı olan.

<table><tbody><tr><td>Hanks'in Dengeli Tuz çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>3-İzobutil-1-metilksantin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7018</td> DMSO GLP-1 (7-36) amid Bachem H-6795'te <td>0,5 M'lik bir stok olarak hazırlanmıştır</td></tr>.<tr><td></td><td></td><td></td><td>PBS'de 1 mg / ml'lik bir stok olarak hazırlanır, '100x referans kontrolü' olarak adlandırılırTest</td></tr> <tr><td>peptitleri</td><td>MedImmunite'de</td><td></td> şirket içinde üretilir <td>Uygun şekilde DMSO veya PBS'de çeşitli konsantrasyonlarda sağlanır</td></tr><tr><td>100x peptit stoğu</td><td>MedImmune</td><td></td> Test'te şirket içinde üretilir <td>peptit, 100x nihai gerekli konsantrasyona kadar tahlil tamponuna seyreltilir</td></tr><tr><td>Tripan Blue Solüsyonu,% 0.4</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Cedex XS Hücre Analiz Cihazı</td><td>Innovatis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning 384 kuyulu plakalar, düşük hacimli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4514</td><td></td></tr><tr><td>Yankı Nitelikli 384 Kuyulu Polipropilen Mikroplaka</td><td>Labcyte Inc.</td><td>P-05525</td><td></td></tr><tr><td>Yankı Nitelikli Rezervuar</td><td>Labcyte Inc.</td><td>ER-0055</td><td></td></tr><tr><td>Echo 550 Sıvı İşleyici</td><td>Labcyte Inc.</td><td></td><td>2,5 nl'lik artışlarla damlacık transfer hacimleri</td></tr><tr><td>Echo 525 Liquid Handler</td><td>Labcyte Inc.</td><td></td><td>25 nl'lik artışlarla damlacık transfer hacimleri</td></tr><tr><td>ACell Tezgah Üstü Otomasyon&nbsp;</td><td>HighRes Biosolutions</td><td>MC522</td><td></td></tr><tr><td>Yaşam Bilimleri Robotları için Cellario Lab Automation Planlama yazılımı</td><td>HighRes Biosolutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultidropCombi Reaktif Dispenseri</td><td>ThermFisher Scientific</td><td>5840300</td><td>'Toplu reaktif dağıtıcısı' olarak anılırHTRF</td></tr> <tr><td>cAMP Dinamik 2 kiti</td><td>Cisbio Biyotahliller</td><td>62AM4PEJ</td><td></td></tr><tr><td>EnVision Çoklu Etiket Okuyucu</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

etkili belirlenmesi tahlillerinde peptit agonistlerinin seri seyreltme için dağıtım otomatik akustik

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

küçük moleküllü ilaç keşfi olduğu gibi, peptid agonistleri için eleme konsantrasyon-tepki eğrileri elde etmek peptidlerin seri seyreltme gerektirir. peptidler Tarama geleneksel uç tabanlı numune alma yöntemleri adsorpsiyon yoluyla peptid kaybı için artan bir fırsat sağlayarak, plasticware geniş bir yüzey alanına peptidler maruz olarak karmaşıklık ek bir katman tanıyor. Plasticware aşırı maruz kalma önlenmesi plastik bağlılık yoluyla peptid kaybını azaltır ve böylece gücü tahmininde yanlışlıklar en aza indirir, ve biz daha önce peptid agonistleri 1 in vitro yüksek verimli tarama için dağıtım temassız akustik faydalarını tarif var. Burada fare glukagon benzeri peptit-1 reseptörü (GLP-1 R) peptit agonistlerinin taranmasında örnek kullanılarak mikrotiter plakalarında peptid seri dilüsyonları temassız akustik hazırlanması için bir tam entegre bir otomasyon çözümü tartışılmıştır. Bizim yöntemler yüksek izin-throughput agonistlerinin taranmasında da tahlilleri hücre bazlı ve kolay bir şekilde yüksek bir numune test etme desteklemek için, ya da (daha fazla hedef hücre çizgilerinin bir panel için, örneğin) deney plakası kopya sayısında artış sağlamak için büyütülebilir.

<html> Biz rutin akustik havalesiyle peptidler sulandırmak için iki adımlı bir yöntemini kullanın. İlk adımda, otomasyon ile uyumlu bir akustik dağıtıcı iki kaynak plakalar arasındaki dört stok peptid ara dilüsyonları oluşturmak için kullanılır (Şekil 1a, b). İkinci adım olarak, biz daha fazla her test peptid (Şekil 1c) için 11 maddelik konsantrasyon aralığı oluşturmak için kaynak plakaları A ve B hisse senedi dilüsyonları sulandırmak içi...

Geleneksel uç bazlı seri seyreltmeler sırasında plastik malzemelere peptit adsorpsiyonu, potens tayinini önemli ölçüde etkileyebilir ve ilaç keşfinin kurşun tanımlama ve kurşun optimizasyon aşamaları için kullanılan yapı-aktivite ilişkilerinin anlaşılmasını zorlaştırabilir. Burada, peptit numunelerinin otomatik akustik temassız seri seyreltilmesi için yöntemler açıklanmaktadır.

Etkili belirlenmesi tahlillerinde Peptit Agonistlerinin seri Seyreltme için Dağıtım Otomatik Akustik

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Peptit numunelerinin seri dilüsyonu için hazırlanan bu otomatik protokolün genel amacı, plastik malzemelere peptit adsorpsiyonunu minimuma indirerek ilaç keşfi için doğru potens belirlemesini sağlamaktır. Bu yöntem, verilerin kalitesini ve tekrarlanabilirliğini artırabilir; ayrıca uç bazlı pipetleme işleminin kaldırılması, numune taşınmasını önleyerek hataların tüm seri dilüsyon boyunca yayılmasını engeller. Bu tekniğin temel avantajı, plastik malzemelere peptit adsorpsiyonunu minimize ederek veri kalitesini artırmasıdır.Bu durum, özellikle ilaç keşfinde bir yapı-aktivite ilişkisi veya öncü bileşik belirleme kampanyasını yürütmek için önemlidir. Metin protokolüne göre analiz tamponunu hazırlayıp bir toplu dağıtıcı için dağıtım programı oluşturduktan sonra, dağıtım kaseti tüplerini analiz tamponuna daldırın ve sıvı ile doldurarak havayı tahliye edin. Bir plaka taşıyıcısına 384 kuyucuklu düşük hacimli analiz plağı yerleştirin.Ardından başlat düğmesine basın. Kaynak plaka A olarak belirlenen, akustik uyumlu 384 kuyucuklu düz tabanlı polipropilen mikroplakanın bir ile beş arasındaki sütunlarına 25 µL 100 kat peptit stok çözeltisi dağıtın. A23 ve A24 kuyucuklarına 25 µL 100 kat referans kontrolü dağıtın. Ardından 11 ile 15 arasındaki sütunlara 10 µL analiz tamponu ve 21 ile 22 arasındaki sütunlara 30 µL analiz tamponu dağıtın.Ardından, kaynak plaka B olarak belirlenen, akustik olarak uygun ikinci bir 384 kuyucuklu polipropilen mikroplakanın altı ile 10 ve 16 ile 20 arasındaki sütunlarına 10 µL analiz tamponu dağıtın. Kaynak plaka A ve B'yi 300 ×g hızında bir dakika boyunca santrifüjleyin. Daha sonra, kaynak ve analiz plakalarını robotik sistemin plaka oteli bölümüne yerleştirin.Ardından, metin protokolüne uygun olarak robotik yazılımı çalıştırın ve üç ardışık 1/100'lük ara dilüsyon hazırlamak için sisteme entegre akustik sıvı dağıtıcıları kullanın. Kaynak plaka A'nın bir ila beşinci sütunlarından, kaynak plaka B'nin altı ila onuncu sütunlarına aktarım yaparak başlayın. İlk 1/100'lük dilüsyonu hazırladıktan sonra, otomasyonun kaynak plaka B'yi entegre santrifüje aktarmasını sağlayın ve plakayı akustik sıvı dağıtıcıya geri döndürmeden önce bir dakika boyunca 300 ×g hızında döndürün. Daha sonra, ikinci 1/100'lük dilüsyon için çözeltiyi kaynak plaka B'den kaynak plaka A'ya aktardıktan sonra, otomasyon kaynak plaka A'yı santrifüje aktaracak ve plakayı sıvı dağıtıcıya döndürmeden önce döndürecektir.Son olarak, otomasyon sistemi çözeltiyi 100 kat dilüsyon için üçüncü kez A plakasından B plakasına aktardıktan sonra, B plakası tekrar santrifüj edilir. Kaynak plaka A ve kaynak plaka B'deki bu peptit dilüsyonları, ardından metin protokolünde açıklandığı üzere analizde tam konsantrasyon yanıt eğrileri hazırlamak için kullanılır. Karşılaştırmalı uç bazlı bir metodoloji, peptitlerin plastik malzemelere absorpsiyonu nedeniyle örnek potansiyelinde ciddi bir kayba yol açtığından, bu adım kritik öneme sahiptir.Hedef fare GLP1 reseptörünü eksprese eden kriyoprezerve CHO hücrelerini 37 °C'lik bir su banyosunda hızla çözdürün ve hücreleri resüspande etmek için 20 mL assay tamponu kullanın. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 200 ×g'de beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı uzaklaştırın ve hücre peletini resüspande etmek için 10 mL assay tamponu kullanın.Trypan Blue ile hücre stokunu bire bir oranında seyreltin ve canlı hücre yoğunluğunu belirlemek için otomatik bir hücre sayıcı kullanın. Ardından, hücreleri mililitre başına 1,6 milyon hücre konsantrasyonunda resüspande etmek için assay tamponu kullanın. Bir dökme reaktif dağıtıcı kullanarak, seri seyreltilmiş peptitler içeren assay plakasının her kuyucuğuna beş mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.Siklik AMP tespit analizini gerçekleştirmek için, her bir homojen zaman çözünürlüklü floresan veya HTRF reaktifinin 20'de 1'lik dilüsyonlarını hazırlamak üzere lizis tamponu kullanın. Analiz plakalarının tüm kuyucuklarına beş mikrolitre kriptat reaktifi eklemek için toplu reaktif dağıtıcı kullanın. Ardından, plakanın 1 ile 22 arasındaki sütunlarına beş mikrolitre D2 reaktifi ekleyin.Ardından, E23'ten P24'e kadar olan kuyucuklara beş mikrolitre D2 reaktifi ekleyin. Spesifik olmayan bağlanma kontrol kuyucukları olarak kullanılacak olan A23'ten D24'e kadar olan kuyucuklara hemen bir manuel pipet kullanarak beş mikrolitre lizis tamponu ekleyin. Kuyucukları karıştırmak için analiz plakalarını 200 ×g'de ve oda sıcaklığında bir dakika boyunca santrifüj edin.Ardından plakaların üzerini kapatın ve bir saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, 320 nanometre eksitasyon ile 620 ve 665 nanometre emisyonda fret sinyalini ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın. Verileri metin protokolüne göre analiz edin.Siklik AMP tespit analizi için akustik transferin ilk adımı, burada gösterildiği gibi iki kaynak plakada dört stok peptit ara dilüsyonu oluşturmaktır. İkinci adımda, akustik dağıtıcı, 16 farklı peptit için her bir test peptidinin çift örneği şeklinde 11 noktalı bir konsantrasyon aralığı oluşturmak amacıyla A ve B kaynak plakalarındaki stok çözeltileri daha da dilüye eder. Analiz plakası boyunca kuyu başına sabit bir hacim sağlamak için analiz tamponu geri dolumu gerçekleştirilir.Burada, siklik AMP birikim deneyi ile çalışılmış, 16 peptidin duplikasyon şeklinde bulunduğu örnek bir plakaya ait ısı haritası gösterilmektedir. Mor renkle gösterilen düşük değerler, yüksek siklik AMP konsantrasyonunu temsil etmektedir. Bu konsantrasyon yanıt eğrileri, duplikasyon noktalarının tekrarlanabilirliğini örneklendirmektedir.Birinci örnek, analiz için pozitif kontrolü temsil etmektedir. İkinci, üçüncü ve dördüncü örnekler inaktiftir ve grafikteki düz çizgilerle gösterilmektedir. Beşinci ile on altıncı örnekler arasındaki örnekler aktif test peptidlerini temsil etmektedir.Burada sunulan yöntem, geniş bir potens aralığında tam konsantrasyon yanıt eğrilerinin oluşturulmasına olanak tanır. Uzmanlaşıldığında, bu teknik üç saat içinde tamamlanabilir ancak bu süre, hazırlanması gereken örnek sayısına bağlı olacaktır. Bu prosedür uygulanırken, peptidlerin biyolojik örnekler olduğu ve buna uygun şekilde işlenmesi gerektiği unutulmamalıdır.Bütünlüklerini korumak adına, tekrarlayan dondurma-çözme döngülerinden kaçınılmalıdır. Bu teknik, peptid ilaç keşfi alanındaki araştırmacıların önünü açacak ve yapı-aktivite ilişkilerini desteklemek için gereken doğru potens tahminlerinin yapılmasına olanak sağlayacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, peptidlerin seri dilüsyonu için otomatik akustik dağıtım hakkında kapsamlı bir bilgiye sahip olacaksınız; bu işlem, absorbsiyon yoluyla oluşacak peptid kaybını minimize edecek ve ölçümlerinizin doğruluğunu artıracaktır.Pikomolar düzeyde potense sahip biyolojik olarak aktif peptidlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve kişisel koruyucu ekipman gibi önlemlerin her zaman kullanılması gerektiğini unutmayın.

automated-acoustic-dispensing-for-serial-dilution-peptide-agonists

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Kararlı İzotop Standartlar ve Anti-Peptid Antikorlar (SISCAPA) kendi proteinler için vekilleri olarak peptidler kantitatif ölçüm sağlamak için kararlı izotop dilüsyon kütle spektrometresi (MRM-MS) ile peptitler çiftler yakınlık zenginleştirme yakalayın. Burada kısmen otomatik bir biçimde manyetik parçacıklar kullanarak protokol açıklar.

Proteinler Peptid immunoaffiniti Zenginleştirme kullanarak Niceleme Kütle Spektrometresi ile birleştiğinde

Adenilat siklaz sinyal duyarlanmasına inhibitör G protein-eşli reseptörler sonuçları Kalıcı aktivasyonu. Temel moleküler yolları belirlemek için, nonbiased yaklaşımlar gereklidir, ancak bu strateji ölçeklenebilir hücre bazlı cAMP hassaslaşması testin geliştirilmesini gerektirmektedir. Burada, küçük molekül ve siRNA taranması için olan bir hassaslaşma deneyi tarif eder.

Adenilat siklaz uyuşturucu kaynaklı Sensitizasyonu: Küçük Molekül ve siRNA Tarama Uygulamaları için Deney düzene ve minyatür

Rekombinant insan MHC II molekülleri ile biyokimyasal analizler hızlı, kantitatif immünojenik epitop tanımlaması içine anlayışlar, silme ya da tasarım sağlayabilir. Burada, 384 oyuklu plakalara ölçekli bir peptid MHC-II bağlama deneyi açıklanmıştır. Bu maliyet etkin biçim protein deimmunization ve aşı tasarım ve geliştirme alanlarında yararlı ispatlamak zorundadır.

Peptid Epitopların Kantitatif Analiz için bir yüksek veri akışı MHC II Bağlanma Deneyi

Basitleştirilmiş (analog) bir okuma ile nükleik asitleri ölçmek için bir uç nokta dijital testi tanımlıyoruz. Damlacık bazlı dijital tahlillerin toplu floresansını özel enstrümantasyon yerine standart bir qPCR makinesi kullanarak ölçüyoruz ve sonuçlarımızı mikroskopi ile doğruluyoruz.

Dijital Nükleik Asit Kantifikasyon Tahliller Basit Toplu Saati

Otomatik IMMUNO-maldı (iMALDI) teknolojisini kullanarak karmaşık biyolojik sıvı protein miktar için bir protokol sunulmuştur.

Peptid ve Protein miktar kullanarak otomatik IMMUNO-maldı (iMALDI)

Bu kağıt malzemelerin ve monosit hedefleme peptid Amfifil micelles içeren bir yöntem sunar ve Biyouyumluluk ve monosit için bağlamak için micelle yeteneğini sınamak için ilgili deneyleri.

Monosit hedefleme peptid Amfifil Micelles için düşsel ateroskleroz sentezi

Bu protokol, etiketsiz empedans ölçümleri kullanılarak tek bir mikroelektrot üzerinde yetiştirilen tek bir hücre tabakasından agonist kaynaklı GPCR aktivasyonu için tam doz-yanıt ilişkilerinin gerçek zamanlı kaydını göstermektedir. Yeni dosing şeması, zaman çözümlü zaman kaybı olmadan iş buzunu önemli ölçüde artırır.

Label-Free Empedans Tabanlı GPCR Denemelerinde Artırılmış İş İlerletme Protokolü

Bu iş akışı, nicel küresel proteomik analiz için aynı anda birden fazla protein çeviri sonrası modifikasyonun (PtM) zaman ve maliyet-etkin zenginleşmesinin performansını açıklar. Protokol, ptm çapraz konuşmasına biyolojik kavrayışlar kazandırmak için birden fazla konjuge antikorla peptid düzeyinde PTM zenginleştirme, ardından da veri bağımsız iktisap kütle spektrometresi analizini kullanmaktadır.

Niceleme ve Site Yerelleştirmesi Için İki Çeviri Sonrası Modifikasyonun Eşzamanlı Affinity Zenginleştirmesi

Bu çalışmada, rekombinant G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) üzerindeki küçük molekül kütüphanelerini taramak için 384 kuyucuklu plakalar için yüksek verimli, hücre içi kalsiyum floresan testi açıklanmaktadır. Hedef, sığır ateşi kenesinden kinin reseptörü, Rhipicephalus microplus, CHO-K1 hücrelerinde eksprese edilir. Bu tahlil, aynı hücreleri tek bir "çift eklemeli" tahlilde kullanarak agonistleri ve antagonistleri tanımlar.

Rekombinant G Proteinine Bağlı Reseptörlerin Yüksek Verimli Taraması için "Çift İlaveli" Bir Kalsiyum Floresan Testi

Burada, çeşitli hücre tiplerinin hücre yüzeyi proteomunun karakterizasyonu için bir proteomik iş akışını açıklıyoruz. Bu iş akışı, hücre yüzeyi proteini zenginleştirmeyi, müteakip numune hazırlamayı, bir LC-MS/MS platformu kullanarak analizi ve özel yazılımla veri işlemeyi içerir.

Hücre yüzeyi proteomunun etiketsiz miktar tayini için "hücre yüzeyi yakalama" iş akışı

Öğrenin peptit örneklerinin seri seyreltmesi için otomatik akustik yöntemi; plastik malzemelere adsorpsiyonu en aza indirerek ilaç keşfinde etkinlik belirleme doğruluğunu artırır.

Etkili belirlenmesi tahlillerinde Peptit Agonistlerinin seri Seyreltme için Dağıtım Otomatik Akustik

Daha fazla video keşfet