Ahşap Formasyonu ve İkincil Kök Gelişimi ile ilgilendim Genler ve Promoters incelenmesi için Kaynaklı Somatik Sektör Analizi (ISSA) Kullanımı

İndüklenmiş Somatik Sektör Analizinin genel amacı, nispeten kısa zaman dilimleri içinde ağaç ikincil gövde dokusundaki gen ve promotör yapılarının fonksiyonel karakterizasyonu için orta ila yüksek verimli bir teknik sağlamaktır. Bu yöntem, tehlikenin nerede ve ne zaman ifade edildiğinin yanı sıra odun oluşumu ve ikincil gövde gelişimi gibi biyolojik olarak önemli süreçlerdeki rolleri ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, çok çeşitli ağaç türlerine uygulanabilen verimli, kolay ve nispeten hızlı bir prosedür olmasıdır.

Başlamak için, bakteri seçimi için uygun antibiyotiklerle 19 mililitre taze, 28 santigrat derece LB ortamı içeren temiz, 50 mililitrelik vidalı kapaklı bir tüp hazırlayın. Bir mililitre A.tumefaciens kültürü ekleyin ve optik yoğunluğu veya OD'yi 600 nanometrede kontrol edin. OD 0.1'in üzerindeyse, ılık LB ile daha fazla seyreltin. A.tumefaciens kültürünü, OD 600 0,4 ile 0,6 arasında olana kadar çalkalanan bir inkübatöre yerleştirin.

Bu elde edildikten sonra, hücreleri dört santigrat derece ve 1.000 x g'da 15 dakika santrifüjleyin. Sıvıyı tüpten boşaltın ve hücre peletini hemen bir mililitre soğutulmuş MS ortamı ile yeniden süspanse edin. Süspansiyonu temiz, iki mililitrelik bir mikrotüpe aktarın ve gerekene kadar buz üzerinde saklayın.

Deneye ilkbahar veya yaz başında başlayın ve aktif ve hızlı büyüyen bir kambiyum içeren bitkileri seçin. Bu, floemin ksilemden kolayca soyulup soyulamayacağı konusunda doğrulanır. Bitkinin tabanına yakın düz bir sap bölümü belirleyin ve yaprakları veya dalları çıkarın.

Keskin bir neşter kullanarak, floem boyunca beş milimetre aralıklarla iki paralel, 20 milimetrelik kesi oluşturarak bir santimetre karelik bir kambiyal pencere kesin ve ardından bazal uçtaki iki dikey kesimi ikiye bölen tek, yatay bir kesim yapın. Gelişmekte olan ksilem dokusunu açığa çıkararak floem şeridini yukarı doğru iyileştirin. Ardından, bir pipet kullanarak, maruz kalan ksilemin yüzeyini tamamen ıslatmak için yeterli aşılama ortamı ekleyin.

Hemen, floem şeridini gövdeye tekrar yerleştirin ve parafilm ile sıkıca yerine bağlayın. Bu aşılama adımlarını, mevcut pencerelerin en az bir santimetre üstünde veya altında ve 90 derecelik bir kaymada yeni kambiyal pencereler oluşturarak tüm genler veya ilgili destekleyiciler için tekrarlayın. Ek olarak, pencereleri, deneysel aşılarla aynı gövde veya gövdeler üzerinde pozitif ve negatif kontrol vektörleri ile aşılayın.

Gövde büyümesini periyodik olarak izleyin ve en az beş milimetrelik radyal büyüme gözlendiğinde, dokuyu bir beta-glukuronidaz veya GUS testi için hasat edin. Test materyalini hasat etmek için, önce kambiyal pencereyi gövdeden kesin ve yeni büyümenin parçası olmayan herhangi bir dokuyu çıkarın. Olgun ksilem ve floem hücresi veya doku morfolojisi ile ilgili çalışmalar için, floemi ksilemden soyun.

Alternatif olarak, kambiyal bölgenin sağlam kalmasını gerektiren araştırmalar veya promotör ekspresyon modellerinin değerlendirilmesi için, 0,5 ila bir milimetre kalınlığında diskler oluşturmak için kambiyal pencereyi bir tıraş bıçağı kullanarak enine kesin. Hasat edilen kambiyal pencere dokularını 14 mililitrelik yuvarlak tabanlı tüplere yerleştirin ve dokunun tamamen suya batırıldığından emin olmak için her seferinde beş dakika boyunca pH 7'de 0.1 molar fosfat tamponunda iki kez durulayın. İkinci durulamanın sonunda, tüm fazla çözeltiyi çıkarmaya özen gösterin.

Ardından, her tüpe beş mililitre GUS reaktifi ekleyin. Bu, doku örneğini tamamen kapsamıyorsa, ek reaktif ekleyin. Tüpleri karanlıkta 55 santigrat derecede on dakika inkübe edin.

Bunu takiben, tüpleri karanlıkta 37 santigrat derecede bir çalkalayıcı üzerinde hafif çalkalama kullanarak 12 ila 16 saat daha inkübe edin. İnkübatörden çıkarıldıktan sonra, tüplerin rastgele bir alt kümesini alın ve pH aralığı sıfır ila yedi olan turnusol kağıdı kullanarak GUS reaktifinin pH'ını kontrol edin. Bunlardan herhangi birinin pH'ı altıdan düşükse, bunları etiketleyin ve tüplerin geri kalanını kontrol edin.

PH'ı altıdan düşük olan tüpleri etiketleyin ve hariç tutun. GUS reaktifini tüplerden boşaltın ve dokuyu kaplamak için yeterli yüzde 70 etanol ile değiştirin. Numuneleri ihtiyaç duyulana kadar dört santigrat derecede saklayın.

Temiz bir forseps çifti kullanarak, tüm kambiyal pencere dokusunu bir numune tüpünden çıkarın ve mikroskobik görselleştirme için küçük bir tepsiye veya petri kabına yerleştirin. Numuneyi 1X ile 4X büyütme arasında bir diseksiyon mikroskobunun merceğinin altına yerleştirin ve parlak mavi lekelenme gösteren hücre veya dokuların sayısını belirleyin ve hesaplayın. Floemin çıkarıldığı örneklerde, gelişmekte olan ksilemin yüzeyinde bulunan kambiyal dokudaki sektörlerin sayısını sayın.

Diskler halinde kesilmiş numuneler için, farklı hücre veya doku tiplerinde bulunan sektörlerin sayısını sayın. Sayıların fazla tahmin edilmemesini sağlamak için diskin her iki tarafının da görüntülendiğinden ve iki disk arasında oluşan sektörlerin eşleştiğinden emin olun. Yüzde 70 etanol içeren tüpe sadece doku içeren sektörleri geri yerleştirin ve ihtiyaç duyulana kadar saklayın.

Pozitif ve negatif kontroller de dahil olmak üzere hasat edilen ek kambiyal pencereler için analizi tekrarlayın. Sektörlerin sınıflandırılmasında doğru tanımlamaya yardımcı olmak için, yaralamaya gövde tepkileri de dahil olmak üzere ikincil kök anatomisi ve gelişimi hakkında bilgi sahibi olmanızı öneririz. Bu şekil, burada mavi lekelenme bölgeleri olarak görülen birkaç başarılı dönüşümü göstermektedir.

Örnek bir floem kabuğu penceresi, birden fazla dönüştürülmüş sektörü gösterir ve iki ağaç türünden hasat edilen diskler, dönüşüm sektörlerini ve müteakip radyal büyümeyi gösterir. Bir dizi doku tipinde dönüşüm de gözlemlenebilir. Burada kök sektörleri periderm, floem, yara parankimi ve beyaz kavağın diğer bazı doku bölgelerinde görülebilir.

Bu görüntü, kambiyal türevlerde gen promotör ekspresyonunun sonuçlarını göstermektedir. Bu örnekte, okaliptüs melezlerinin gövdelerine dönüşen okaliptüs grandis'ten bir dizi CesA promotörünü içeren bir denemede her doku tipindeki lekelenme oranını görüyoruz. Floemdeki ekspresyon, gelişen ve gelişen ksilemler yüzde olarak temsil edilir.

İlgilenilen her bir promotör veya gen için aşılanan kambiyumun santimetre başına ortalama dönüşüm olayı sayısı da hesaplanabilir. Bu tablo, disk toplama yöntemi kullanılarak analiz edilen pozitif bir kontrol veya ilgi destekleyicisi ile dönüştürülen okaliptüs ve kavak konularında tanımlanan tipik sektörler için verileri göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, ikincil gövde gelişiminde oluşum ile kambiyal farklılaşmanın karmaşık doğasını incelemek için hızlı, verimli ve yaygın olarak uygulanabilir bir yöntem sağlayabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, bitkilerin ve bakterilerin nasıl hazırlanacağı, sapların nasıl dönüştürüleceği, büyütüleceği ve hasat edileceği ve ayrıca fenotipik değerlendirme için transgenik dokunun nasıl tanımlanacağı ve sınıflandırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.