Ahşap Formasyonu ve İkincil Kök Gelişimi ile ilgilendim Genler ve Promoters incelenmesi için Kaynaklı Somatik Sektör Analizi (ISSA) Kullanımı

İndüklenmiş Somatik Sektör Analizinin genel amacı, ağaç sekonder gövde dokusundaki gen ve promotör yapıların fonksiyonel karakterizasyonu için karşılaştırmalı olarak kısa zaman dilimleri içinde orta ila yüksek kapasiteli bir teknik sağlamaktır. Bu yöntem, genlerin nerede ve ne zaman ifade edildiğinin yanı sıra odun oluşumu ve sekonder gövde gelişimi gibi biyolojik açıdan önemli süreçlerdeki rollerine ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı; verimli, kolay ve geniş bir ağaç türü yelpazesine uygulanabilen nispeten hızlı bir prosedür olmasıdır.

Başlamak için, bakteriyel seleksiyon için uygun antibiyotikleri içeren 19 mililitre taze, 28 derece Celsius LB besiyeri ile temiz, 50 mililitrelik vidalı kapaklı bir tüp hazırlayın. Bir mililitre A.tumefaciens kültürü ekleyin ve 600 nanometredeki optik yoğunluğu veya OD'yi kontrol edin. Eğer OD 0,1'in üzerindeyse, ılık LB ile daha fazla seyreltin. OD 600 değeri 0,4 ile 0,6 arasına gelene kadar A.tumefaciens kültürünü çalkalayıcı bir inkübatöre yerleştirin.

Bu işlem tamamlandığında, hücreleri 4 °C'de ve 1,000 x g'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Tüpteki sıvıyı dökün ve hücre peletini derhal 1 mL soğutulmuş MS besiyeri ile yeniden süspanse edin. Süspansiyonu temiz, 2 mL'lik bir mikrotüpe aktarın ve ihtiyaç duyulana kadar buz üzerinde saklayın.

Deneye ilkbaharda veya yaz başında başlayın ve aktif, hızlı büyüyen bir kambiyuma sahip bitkiler seçin. Floemin ksilemden kolayca soyulabildiği durumlar bu durumu doğrular. Bitkinin tabanına yakın, düz bir gövde bölümü belirleyin ve buradaki tüm yaprak veya dalları temizleyin.

Keskin bir bistüri kullanarak, floem boyunca aralarında 5 mm mesafe olacak şekilde iki paralel 20 mm'lik kesi atarak ve ardından taban ucunda bu iki dikey kesiyi ikiye bölen tek bir yatay kesi yaparak bir santimetrekarelik bir kambiyum penceresi açın. Gelişmekte olan ksilem dokusunu açığa çıkarmak için floem şeridini yukarı doğru kaldırın. Ardından, bir pipet kullanarak, açığa çıkan ksilem yüzeyini tamamen ıslatacak kadar yeterli inokülasyon besiyeri ekleyin.

Florim şeridini hemen gövdeye yeniden yerleştirin ve parafilm ile sıkıca sabitleyin. Bu inokülasyon adımlarını, mevcut pencerelerin en az bir santimetre yukarısında veya aşağısında ve 90 derece açıyla yeni kambiyum pencereleri oluşturarak ilgi duyulan tüm genler veya promotörler için tekrarlayın. Ayrıca, deneysel inokülasyonlar gibi, aynı gövde veya gövdelerdeki pencereleri pozitif ve negatif kontrol vektörleri ile inoküle edin.

Gövde büyümesini periyodik olarak izleyin ve en az beş milimetrelik bir radyal büyüme gözlemlendiğinde, beta-glukuronidaz veya GUS analizi için dokuyu hasat edin. Test materyalini hasat etmek için, öncelikle yeni büyümenin parçası olmayan tüm dokuları temizleyerek kambiyum penceresini gövdeden kesin. Olgun ksilem ve floem hücre veya doku morfolojisi ile ilgili çalışmalar için, floemi ksilemden soyun.

Alternatif olarak, kambiyum bölgesinin bozulmamasını gerektiren incelemeler veya promotör ekspresyon paternlerinin değerlendirilmesi için, kambiyum penceresini bir jilet yardımıyla enine dilimleyerek 0,5 ile 1 milimetre arasında kalınlıkta diskler oluşturun. Toplanan kambiyum penceresi dokularını ayrı ayrı 14 mililitrelik yuvarlak tabanlı tüplere yerleştirin ve dokunun tamamen daldığından emin olarak, pH 7'deki 0,1 molar fosfat tamponu ile her biri beş dakika sürecek şekilde iki kez durulayın. İkinci durulamanın sonunda, tüm fazla çözeltiyi dikkatlice uzaklaştırın.

Ardından, her tüpe beş mililitre GUS reaktifi ekleyin. Eğer bu miktar doku örneğini tamamen örtmüyorsa, ek reaktif ekleyin. Tüpleri karanlıkta, 55 °C'de on dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, tüpleri hafif ajitasyon kullanarak karanlıkta, 37 °C'de bir çalkalayıcıda 12 ila 16 saat daha inkübe edin. İnkübatörden çıkardığınızda, tüplerden rastgele bir alt küme alın ve sıfır ile yedi pH aralığına sahip turnusol kağıdı kullanarak GUS reaktifinin pH'ını kontrol edin. Eğer bunlardan herhangi birinin pH değeri altıdan düşükse, bunları etiketleyin ve geri kalan tüpleri kontrol edin.

pH değeri altıdan düşük olan tüm tüpleri etiketleyin ve hariç tutun. Tüplerdeki GUS reaktifini boşaltın ve dokuyu örtecek miktarda %70 etanol ile değiştirin. Numuneleri ihtiyaç duyulana kadar 4 °C'de saklayın.

Temiz bir pens kullanarak, tüm kambiyum pencere dokusunu örnek tüpünden çıkarın ve mikroskobik görüntüleme için küçük bir tepsiye veya petri kabına yerleştirin. Örneği 1X ile 4X büyütme arasındaki bir diseksiyon mikroskobunun lensi altına yerleştirin; parlak mavi boyanma gösteren hücre veya dokuları belirleyin ve sayılarını kaydedin. Floemin çıkarıldığı örneklerde, gelişen ksilem yüzeyinde bulunan kambiyum dokusundaki sektörlerin sayısını sayın.

Disk şeklinde kesilmiş örnekler için, farklı hücre veya doku tiplerinde bulunan sektörlerin sayısını belirleyin. Diskin her iki tarafının da incelendiğinden ve sayıların olduğundan fazla hesaplanmaması için iki disk arasında kalan sektörlerin eşleştirildiğinden emin olun. Sadece sektör içeren dokuları %70 etil alkol içeren tüpe geri yerleştirin ve ihtiyaç duyulana kadar saklayın.

Pozitif ve negatif kontroller dahil olmak üzere, hasat edilen diğer tüm kambiyum pencereleri için analizi tekrarlayın. Sektörlerin sınıflandırılmasında ve doğru tanımlanmasında yardımcı olması için, gövdenin yaralanmalara verdiği yanıtlar da dahil olmak üzere ikincil gövde anatomisi ve gelişimine aşina olmanızı öneririz. Bu şekil, burada mavi boyanma bölgeleri olarak görülen birkaç başarılı transformasyonu göstermektedir.

Örnek bir floem soyma penceresi çok sayıda transforme olmuş sektör göstermektedir ve iki ağaç türünden hasat edilen diskler, transformasyon sektörlerini ve ardından gelen radyal büyümeyi sergilemektedir. Bir dizi doku tipindeki transformasyon da gözlemlenebilir. Burada, beyaz kavak ağacının periderm, floem, yara parankiması ve diğer birkaç doku bölgesindeki gövde sektörleri görülebilir.

Bu görüntü, kambiyum türevlerindeki gen promotör ekspresyonu sonuçlarını göstermektedir. Bu örnekte, eucalyptus grandis'ten alınan bir dizi CesA promotörünün okaliptüs hibritlerinin gövdelerine transforme edildiği bir deneyde, her bir doku tipindeki boyanma oranını görüyoruz. Floemde, gelişmekte olan ve gelişmiş ksilemlerdeki ekspresyon yüzde olarak temsil edilmiştir.

İnoküle edilen kambiyumun santimetre başına düşen ortalama transformasyon olayı sayısı da her bir promotör veya ilgi duyulan gen için hesaplanabilir. Bu tablo, disk hasadı yöntemi kullanılarak analiz edilen, pozitif kontrol veya ilgi duyulan promotör ile transforme edilmiş okaliptüs ve kavak deneklerinde tanımlanan tipik sektörlere ait verileri göstermektedir. Uzmanlaşıldığında bu teknik, sekonder gövde gelişimi sırasında oluşan kambiyum farklılaşmasının karmaşık yapısını incelemek için hızlı, verimli ve yaygın olarak uygulanabilir bir yöntem sağlayabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, bitkilerin ve bakterilerin nasıl hazırlanacağı, transformasyonun nasıl yapılacağı, gövdelerin nasıl büyütülüp hasat edileceği ve fenotipik değerlendirme için transgenik dokuların nasıl tanımlanıp sınıflandırılacağı konularında kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız.