Yetişkin fareler ile Sinoatriyal Düğüm miyositlerin İzolasyonu, Kültür ve Fonksiyonel Karakterizasyonu Yöntemleri
23 Ekim 2016
Yöntemler yama kelepçe elektrofizyoloji veya görüntüleme çalışmaları için yetişkin farelerin sinoatriyal düğüm miyosit (SAMs) izolasyonu için gösterilmiştir. İzole edilmiş hücreler, doğrudan kullanılabilir ya da bu tür genetik olarak kodlanmış muhabir olarak ilgi proteinlerin ekspresyonuna izin vermek için kültür içinde muhafaza edilebilir.
Bu prosedürün genel amacı, kısa veya orta süreli elektrofizyolojik veya görüntüleme deneyleri için spontan olarak aktif sinoatriyal düğüm miyositlerini farelerden izole etmektir. İzole sinoatriyal düğüm miyositleri, kardiyak kalp pili yapım mekanizmalarının, özellikle spesifik iyon akımlarının incelenmesi veya hücre içi kalsiyum salınımının zamanlaması için önemlidir. Ancak nispeten az sayıda laboratuvar, kısmen farelerden izole edilmiş sinoatriyal miyositleri kullanır, çünkü prosedürü yalnızca yazılı yöntemlerden öğrenmek çok zordur.
İzolasyon için gerekli tüm çözeltileri hazırladıktan sonra, kürkü hayvanın göğsünden makasla çıkarın. Daha sonra dış doku forsepsleri ve diseksiyon makası kullanarak göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için göğüs kafesini kesin. Göğüs boşluğunu iki mililitre ısıtılmış tam Tyrode ile heparinle durulayın.
Diseksiyon mikroskobu altında, iç makas ve diseksiyon forsepsleri kullanarak akciğerleri ve timusu dikkatlice çıkarın. Kalbin tepesini nazikçe tutarken, kalbi göğüs boşluğundan çıkarmak için inferior vena kava ve aortu dikkatlice kesin. Daha sonra kalbi silikon diseksiyon kaplarından birine aktarın ve ardından iki ila dört mililitre ısıtılmış heparinize tam Tyrode ile durulayın.
Kalbi, arka damarlar görünecek ve yukarı bakacak şekilde yönlendirin. Daha sonra, kalbi apeksten silikon diseksiyon kabına sabitleyerek hareketsiz hale getirin. Daha sonra, ventriküller ve kulakçık arasındaki oluğu bulun.
İç diseksiyon makasını kullanarak, ventriküllere yakın tutarak olukta bir kesi yapın. Atriyumun ve valflerin net bir şekilde görülebilmesi için oluğu ve insizyonu gerektiği gibi ek ısıtılmış heparinize tam Tyrode ile yıkayın. Ardından, kulakçıkları ventriküllerden ayırmak için oluk boyunca kesmeye devam edin.
Daha sonra, atriyal dokuyu ikinci silikon diseksiyon kabına aktarın ve üç mililitre ısıtılmış heparinize tam Tyrode ile durulayın. Daha sonra, preparatı nazikçe gererken, dokuyu inferior vena kavadan geçirin. Daha sonra dokuyu, hayvanın sağ atriyumu şimdi deneycinin sol tarafında ve sol atriyum deneycinin sağ tarafında olacak şekilde çevirin.
Doğru dokuyu izole etmek için oryantasyonu elde etmek ve tanımak çok önemlidir. Dokuyu superior vena kava, ardından sağ ve sol atriyal eklerden geçirmeye devam edin. Preparatın net bir şekilde görülebilmesi için kalan yağı veya diğer dokuları çıkarın.
Daha sonra, vena kavalarını keserek kulakçıkların ön duvarını açın. Hem üst hem de alt vena kavalarını incelemek için çanağı gerektiği gibi döndürün. İnter-atriyal septumu görselleştirmek için pimleri gerektiği gibi yeniden konumlandırın.
Daha sonra sol atriyumu çıkarmak için inter-atriyal septum boyunca kesin. Preparatı yeniden sabitleyin, hafifçe gerin ve yağı sinoatriyal düğümün arkasından çıkarın. Bundan sonra, sağ atriyal apendiksiyi çıkarın ve ardından atriyal apendiksiyi çevreleyen koyu turuncu bir çizgi olarak görünen crista terminalis boyunca keserek sinoatriyal düğümü serbest bırakın.
Düğüm dokusunu yeniden sabitleyin veya çıkarın ve eşit büyüklükte üç şerit oluşturmak için yanal olarak kesin. Bu prosedürde, dar ateşle parlatılmış pipeti kullanarak, üç şerit sinoatriyal düğüm dokusunu 2,5 mililitre düşük kalsiyumlu magnezyum Tyrode içeren üç küçük yuvarlak tabanlı tüpün ilkine aktarın ve beş dakika inkübe edin. Beş dakika sonra, doku şeritlerini 2,5 mililitre düşük kalsiyumlu magnezyum Tyrode içeren ikinci küçük yuvarlak tabanlı tüpe aktarın.
Tüpü hafifçe döndürerek veya dar pipetle hafifçe pipetleyerek doku şeritlerini yıkayın. Tüpü ters çevirmeyin. Daha sonra doku şeritlerini 2,5 mililitre düşük kalsiyumlu magnezyum Tyrode içeren üçüncü küçük yuvarlak tabanlı tüpe aktarın ve yıkama adımını tekrarlayın.
Daha sonra, şeritleri enzimlerle birlikte 2,5 mililitre düşük kalsiyumlu magnezyum Tyrode içeren büyük yuvarlak tabanlı tüpe aktarın. Tüpü hafifçe döndürerek her beş dakikada bir karıştırın. Enzim sindirimini takiben, doku şeritlerini modifiye edilmiş KB çözeltisi içeren üç küçük yuvarlak tabanlı tüpün ilkine nazikçe aktarmak için dar bir ateşle parlatılmış pipet kullanın.
Daha sonra, KB çözeltisi içeren büyük yuvarlak alt tüpe aktarmadan önce dokuyu yıkamak için şeritleri ikinci ve üçüncü küçük yuvarlak alt tüplerden geçirin. Daha büyük ateşle parlatılmış pipeti kullanarak, ayrışma tüpünü 35 santigrat derece su banyosuna batırılmış halde tutmaya ve çözeltiye kabarcıklar girmesini önlemeye dikkat ederek, büyük yuvarlak tabanlı tüpteki hücreleri sürekli eziyetle ayırın. Çözeltinin yaklaşık saniyede bir veya bir Hertz frekansında zorla atılmasının en iyi sonucu verdiğini bulduk.
Şimdi dokulara 75 mikrolitre sodyum klorür kalsiyum klorür adaptasyon çözeltisi ekleyin. Karıştırmak ve beş dakika inkübe etmek için hafifçe döndürün. Yazılı protokolde belirtildiği gibi artışlarla kalsiyum eklemeye devam edin.
Kalsiyumun yeniden adaptasyonunu takiben, sinoatriyal miyositleri yaklaşık 10 dakika bekleterek veya üç dakika boyunca 2.000 kez g'de santrifüjleyerek toplayın. Akut olarak izole edilmiş hücreler için, bir transfer pipeti kullanarak süpernatanın yaklaşık beş mililitresini nazikçe çıkarın ve atın. Ardından, yama kelepçesi deneyleri için hücreleri oda sıcaklığında sekiz saate kadar saklayın.
Daha sonra, izole edilmiş sinoatriyal miyositlerin fonksiyonel değerlendirmeleri, spontan aksiyon potansiyelleri ve membran akımları için yama kelepçe kayıtları kullanılarak yapılabilir. Spontan olarak aktif sinoatriyal miyositler kültürde altı güne kadar korunabilir. Kültürlenmiş hücreler, akut olarak izole edilmiş hücrelere kıyasla kültürlenmiş hücrelerin ortalama uzunluk, genişlik, kesit alanı veya membran kapasitansında önemli bir değişiklik olmaksızın, akut olarak izole edilmiş sinoatriyal miyositlerinkine çok benzer bir genel morfolojiyi korur.
Hücreler, akım ve gerilim kelepçe kayıtları gibi bir dizi deneysel çalışma için uygundur. Burada örnek olarak spontan aksiyon potansiyelleri ve komik akım gösterilmektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, sinoatriyal düğüm diseksiyonu, izolasyonu ve kalsiyumun yeniden girişi yaklaşık iki saat içinde tamamlanabilir, böylece hücrelerin deneyleriniz için hazır hale getirilmesini sağlayabilirsiniz.
Bu prosedürü denerken, dokunun oryantasyonunun iyi bir diseksiyon için kritik olduğunu ve enzimatik ve mekanik dissosiyasyon adımlarının metinde belirtildiği gibi optimize edilmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, izole edilen sinoatriyal düğüm miyositleri, tek hücreli elektrofizyoloji, kalsiyum görüntüleme ve immünositokimya dahil olmak üzere çeşitli deneyler için kullanılabilir. Hücreler ayrıca gen manipülasyonu veya raportör moleküllerin ekspresyonu gerektiren deneyler için kültürde de tutulabilir.
Bu videoyu izledikten sonra, sinoatriyal miyositleri yetişkin farelerden nasıl izole edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Deneylerinizde iyi şanslar.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, elektrofizyolojik ve görüntüleme çalışmaları için kritik öneme sahip olan erişkin farelerden sinoatriyal düğüm miyositlerinin (SAM'ler) izole edilmesine yönelik yöntemleri sunmaktadır. İzole edilen hücreler doğrudan kullanılabilir veya ilgilenilen proteinleri eksprese etmek için kültüre edilebilir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kardiyak fizyoloji
- Elektrofizyoloji
- Hücre kültürü teknikleri
Arka Plan
- Sinoatriyal düğüm miyositleri, kardiyak pacemaker (kalp pili) mekanizmalarının incelenmesi için temel öneme sahiptir.
- İyon akımlarının ve hücre içi kalsiyum salınım zamanlamasının anlaşılması kritik bir rol oynar.
- İzolasyon tekniklerini yalnızca yazılı yöntemlerle öğrenmek genellikle zordur.
- Başarılı bir izolasyon, ileri düzey deneysel çalışmalara olanak sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Yetişkin farelerden SAM'lerin izole edilmesi için güvenilir bir yöntem sağlamak.
- Kardiyak pacemaker hücreleri ve iyon akımı dinamikleri üzerine yapılan araştırmaları kolaylaştırmak.
- Bu tekniklerin araştırmacılar için erişilebilirliğini artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- İzolasyon için çözeltilerin hazırlanması.
- Hayvanın göğüs bölgesindeki tüylerin temizlenmesi.
- Göğüs boşluğuna erişmek için göğüs kafesinin kesilmesi.
- Göğüs boşluğunun ısıtılmış tam Tyrode çözeltisi ile durulanması.
Temel Sonuçlar
- Spontan olarak aktif sinoatriyal düğüm miyositlerinin başarılı izolasyonu.
- İzole edilen hücreler kısa veya orta vadeli deneyler için kullanılabilir.
- Kardiyak pacemaker mekanizmalarının daha iyi anlaşılması.
- İyon akımları ve kalsiyum dinamiği üzerine gelecekteki çalışmalar için potansiyel.
Sonuçlar
- Tanımlanan yöntemler, SAM'lerin etkili bir şekilde izole edilmesini sağlar.
- Bu teknikler, kardiyak araştırmaların kapsamını genişletebilir.
- Bu yöntemlere erişimin artması, laboratuvarlarda kullanımlarını artırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Alanları
Yetişkin farelerden sinoatrial düğüm miyositlerinin (SAM'ler) güvenilir şekilde izole edilmesi ve kültürü, kardiyak pacemaker mekanizmalarının hücresel düzeyde doğrudan sorgulanmasına olanak tanır. Bu yetenek, iyon kanalı modülatörleri ve kardiyak ritim terapötikleri için mekanistik risk azaltma ve hedef doğrulama süreçlerini destekler. Bu yöntem, erken keşif ve preklinik kardiyak araştırma süreçlerindeki öngörücü güveni artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Doğrudan elektrofizyolojik değerlendirme yoluyla kardiyak kalp pili hedeflerinin fonksiyonel validasyonuna olanak tanır.
- Spesifik iyon akımlarının ve kalsiyum döngüsünün etkilerini izole ederek mekanistik risk azaltımını destekler.
- Kardiyak ritim bozukluklarının moleküler temelleri üzerine hipotez odaklı çalışmaları kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Kantitatif patch clamp ve görüntüleme analizleri için valide edilmiş bir primer hücre sistemi sağlar.
- Spontan aksiyon potansiyellerinin ve membran akımlarının tekrarlanabilir ölçümüne olanak tanır.
- Kardiyak pacemaker hücrelerini hedefleyen bileşik taramaları için analiz standardizasyonunu destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Kardiyak pacemaker fonksiyonunun in vitro ortamda hastalıkla ilişkili modellenmesine olanak tanır.
- Moleküler keşiften kardiyak hedeflerin preklinik doğrulamasına kadar olan sürekliliği sağlar.
- Elektrofizyolojik çıktıların doğrudan ölçümü yoluyla translasyonel biyobelirteç geliştirmeyi destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, SAM izolasyonunu ve kültürünü; erken keşif, hedef doğrulama ve preklinik kardiyak araştırmalar arasında köprü kuran temel bir adım olarak konumlandırmaktadır.
- Keşif Biyolojisi: Kalp pili mekanizmaları ve iyon kanalı işlevi üzerine hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Tekrarlanabilir elektrofizyolojik ve görüntüleme çıktıları için analize hazır primer hücreler sağlar.
- Analitik: Farklı deneysel koşullar altında aksiyon potansiyeli parametrelerinin ve akım genliklerinin kantitatif karşılaştırmasına olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Kardiyak ritim bozukluklarıyla ilgili gen manipülasyonu ve protein ekspresyonunun değerlendirilmesi için bir platform sunar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla araştırma programına uygulanabilir, kalp hücresi izolasyonu için yeniden kullanılabilir bir iş akışı oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Kardiyak hedef validasyonu ve mekanistik çalışmalardaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirlik için izolasyon ve kültür protokollerini standartlaştırır.
- Stratejik Değer: Kardiyak ilaç keşfi portföyleri için devam/dur karar verme sürecini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Kardiyak ritim terapötik adaylarının riskle ayarlanmış önceliklendirmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Kardiyak mikrodiseksiyon ve enzimatik doku disosiyasyonu konusunda uzmanlık gerektirir.
- Fonksiyonel karakterizasyon için elektrofizyoloji ve görüntüleme cihazlarına erişim gerektirir.
- İzolasyon ve kültür koşullarının ekipler arasında titiz bir şekilde standardize edilmesini gerektirir.
- Farklı fare suşları veya kardiyak hastalık modelleri için adaptasyon gerekebilir.
- Verim ve hücre canlılığı, prosedürel optimizasyona ve doku oryantasyonuna karşı duyarlıdır.
