Adenofection: tükenmesi-Kurtarma Experiments Hücresel Morphodynamics Moleküler şaperonlar Rolü incelenmesi için Bir Yöntem

Bu yöntemin genel amacı, tek hücre düzeyindeki biyolojik süreçlerin fonksiyonel analizleri için hücresel bütünlüğü ve protein homeostazını koruyan koşullar altında eksiltme kurtarma (depletion rescue) deneylerinin gerçekleştirilmesini sağlamaktır.

Bu yöntem, mitoz ve hücre diferansiyasyonu gibi hücre dinamiklerindeki protein fonksiyonları ve yapısal gereksinimlere ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hedeflenen bir proteini tüketirken, aynı zamanda bu proteinin bir varyantını hücre popülasyonunun büyük bir kısmında fizyolojik seviyeye yakın düzeyde yeniden tanıtmaktır.

İşleme cam tabanlı kapları fibronectin ile kaplayarak başlayın. Bunun için, 1 mg/mL'lik fibronectin stok çözeltisini steril PBS ile 1:100 oranında seyreltin.

Tüm yüzeyi kaplamak için her 35 mL'lik kaba bir mililitre ekleyin. 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında bir saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon sırasında, %10 FBS ile desteklenmiş alpha MEM'i ve 0,05% trypsin EDTA'nın bir alikotunu 37 °C'ye kadar önceden ısıtın.

45 dakikalık inkübasyonun ardından, hücre solüsyonunu hazırlamaya başlayın. 10 santimetrelik bir HeLa-RFP-H2B hücre plağındaki besiyerini aspire edin. Ve %0,05 tripsin EDTA'nın 1,5 mililitresi ile nazikçe iki kez durulayın.

Son aspirasyondan sonra plakada 0.5 milliliters trypsin EDTA bırakın ve hücreleri 37 °C ve %5 carbon dioxide koşullarında iki ila üç dakika inkübe edin.

Plakaya hafifçe vurun ve tüm hücrelerin ayrıldığını doğrulamak için hücre tabakasını mikroskop altında gözlemleyin. Ardından 10 milliliters besiyeri ekleyin, hücreleri ayırmak için birkaç kez nazikçe pipetleyin ve hücre süspansiyonunu 15 milliliters bir tüpe aktarın.

Hücre süspansiyonunun 10 µL'lik bir örneğini hemositometre kullanarak sayın. Ardından, cam tabanlı kaplardaki fibronectin çözeltisini aspire edin. Hücre ekimi öncesinde fibronectin'in kurumasına izin vermeyin.

35 mm'lik kap başına 2 ml besiyerinde 1,5 x 10⁵ hücre ekmek için bir hücre süspansiyon çözeltisi hazırlayın. Virüs transdüksiyonu öncesinde hücre sayısını saymak amacıyla, koşul sayısına ek olarak bir adet 35 mm'lik plak ekleyin. 30 ila 45 dakika inkübe edin. İnkübasyon süresi dolduktan sonra, burada görüldüğü gibi hücrelerin iyice ayrıldığından emin olmak için hücreleri mikroskop altında kontrol edin. Plakları inkübatöre geri yerleştirin ve hücreleri ertesi güne kadar büyütün.

Ekimden bir gün sonra, hücrelerin en az %50 yoğunluğa ulaştığından emin olun. %50'den düşük hücre yoğunluğu; virüs transdüksiyon verimliliğinin azalmasına, hücre başına protein ekspresyonundaki varyasyonun artmasına ve hücre toksisitesinin artmasına neden olur. Ardından, ek olarak ekilen kapla hücreleri daha önce olduğu gibi hasat edin ve hücre sayısını belirleyin. Hücrelerin verimli transdüksiyonu için gereken virüs hacmini hesaplayın. Her bir koşul için 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünü etiketleyin ve içine 400 mikrolitre ılık alpha MEM minus ekleyin. Virüs alikotlarını buz üzerinde yavaşça çözdükten sonra, her bir virüsün gerekli hacmini tüplere ekleyin ve pipetleyerek nazikçe karıştırın. Daha sonra, hücrelerdeki besiyerini aspire ettikten sonra, virüs karışımını damla damla nazikçe ekleyin. Hücreleri 37 degrees Celsius sıcaklıkta ve %5 carbon dioxide ortamında inkübe edin. Bir saatlik süre boyunca her 15 dakikada bir, hücrelerin virüsle kaplanması için plakları steril kabin altında dikkatlice çalkalayın. Az miktarda besiyeri kullanmak, virüsün hücrelerle temasını kolaylaştırır.

İnkübasyonun ardından, toplam hacmi 2 mL'ye tamamlamak için her plakete nazikçe 1,6 mL alpha MEM minus ekleyin. Ardından, hücreleri iki saat daha inkübe etmeden önce 2 mM timididin ekleyerek hücre senkronizasyonunu başlatın.

Bu sırada, bir mikrotüpe 139 µL steril su, 50 µL 1 M kalsiyum klorür ve 11 µL 20 µM siRNA ekleyerek siRNA transfeksiyon karışımını hazırlayın. siRNA gerekmiyorsa, boş bir transfeksiyon gerçekleştirmek için siRNA miktarını steril su ile değiştirin. HBSS-2X çözeltisini kalsiyum klorür siRNA karışımının üzerine yavaşça, damla damla ekleyin. Daha küçük çökeleklerin daha iyi transfeksiyon verimliliği sağladığını göz önünde bulundurarak, 200 µL'lik bir pipet kullanarak hava enjeksiyonu ile iki kez nazikçe karıştırın. Ardından karışımı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, her bir plakaya yavaşça damla damla 200 µL ekleyin ve karıştırmak için çalkalayın. Plakaları 37 °C'de, %5 CO2 ortamında 16 saat boyunca inkübe edin.

Ertesi gün, kapları inkübatörden çıkarın ve bir doku kültürü kabinine taşıyın. Hücreleri iki mililitre ılık HEPES ile iki kez duruladıktan sonra, tekrar inkübatöre yerleştirmeden önce iki mililitre alfa MEM minus ekleyin.

Yedi saat sonra, plakaları inkübatöre geri yerleştirmeden önce plakalara iki milimolar timidin ekleyin. Sıcaklık değişimleri hücre döngüsünün uzunluğunu etkilediğinden, aynı anda en fazla dört hücre plakası ile çalışın. Ertesi gün, siRNA transfeksiyonu ve virüs enfeksiyonundan 48 saat sonra, hücreleri iki mililitre ılık PBS ile iki kez durulayın ve ardından canlı hücre görüntüleme için fenol kırmızısı içermeyen iki mililitre alfa MEM ekleyin. Yedi saat boyunca inkübe edin.

Nemlendirilmiş %5 karbon dioksit termoregüle bir hazne ile donatılmış ters bir mikroskop kullanarak mitotik hücreler üzerinde kısa süreli canlı hücre görüntüleme deneyleri gerçekleştirin. Görüntüleme işleminden önce, haznenin 37 °C uygun sıcaklığa ulaştığını doğrulayın.

Besiyerinin uygun şekilde dengelenmesini sağlamak ve sıcaklık değişimlerine bağlı odak kaymasını önlemek için kültür kaplarını görüntülemeden bir saat önce mikroskop haznesine yerleştirin. Hücrelerin mitotik durumunu inceleyin. Bu aşamada, hücrelerin %10 ila %15'i mitozun erken evrelerinde olmalıdır.

Dengeleme süresi boyunca, önceki deneylerde belirlenen görüntüleme parametrelerini ayarlayın. Hücre hasarına yol açtığı ve mitotik ilerlemeyi bozduğu için, fotobeyazlama (photo-bleaching) olmadan uygun çözünürlüğü elde etmek önemlidir. Görüntüleme aralığını aşmadan analiz etmek için anlamlı sayıda hücre elde etmek amacıyla, her koşul için mitotik girişte olan hücrelerin bulunduğu birkaç alan seçin. Tüm alanlar seçildikten sonra, odağı yeniden ayarlayın ve görüntüleme işlemini mümkün olan en hızlı şekilde başlatın.

Dönen disk konfokal sisteminin kullanıldığı tipik bir düzenek; dört farklı koşul, plaka başına yedi alan ve 75 dakikalık bir süre boyunca 1,5 ila iki dakikalık aralıklarla iki renk kanalını içerecektir. Kullanılan floresan markörlere bağlı olarak, hücrelerdeki mitotik fenotipleri analiz etmek için iyi tanımlanmış kriterler belirleyin.

Solda görülen BAG3-GFP plazmid DNA transfeksiyonunun aksine, sağda gösterilen rekombinant adenovirüsler ile yapılan adenofeksiyon, düşük enfeksiyon multiplicitiesinde hücre popülasyonunun çoğunluğunda daha homojen ve verimli bir BAG3-GFP ekspresyonu sağlar. Bu temsili western blot, BAG3 spesifik siRNA'lar ve rekombinant adenovirüs BAG3-GFP ile yapılan adenofeksiyonun, endojen BAG3'ün verimli bir şekilde tüketilmesine ve BAG3-GFP proteininin endojen seviyelere yakın düzeylerde yeniden tanıtılmasına olanak tanıdığını göstermektedir. Burada görüldüğü üzere, proteotoksik stres indükleyici MG132 ile işlem görmüş HeLa hücrelerinin aksine, adenofeksiyon yapılmış HeLa hücrelerinde stres kaynaklı ısı şok proteinlerinin seviyelerinde saptanabilir bir artış olmadığı için adenofeksiyon protein homeostazını koruyabilmektedir. Kontrol siRNA ile BacMam-GFP alpha Tubulin ve BacMam-RFP Actin adenofeksiyonu uygulanmış HeLa hücrelerinden alınan bu konfokal zaman ayarlı görüntülerde, hücrelerin mitoz ilerleyişinin adenofeksiyondan önemli ölçüde etkilenmediği görülmektedir.

Grafik, anormal mitoz gösteren hücrelerin oranını belirtmektedir. Sadece BAG3'e özgü siRNA ile adenofekte edilen hücreler, kırmızı çubukla gösterildiği üzere mitotik defekt seviyesinde yaklaşık iki kat artış sergilemiş; bu durum, siyah çubukla gösterilen BAG3-GFP'nin yenidenlendirilmesiyle kontrol hücresi seviyesine yakın bir düzeye geri dönmüştür.

Bu videoyu izledikten sonra, adenofeksiyon kullanarak eksiltme kurtarma (depletion rescue) deneylerinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu yöntem, birden fazla hücresel arka planda yapı-fonksiyon analizleri için hipomorfik nakavtlar (knock-downs) oluşturmak amacıyla hızlı ve basit bir sistem sağlar. Bu yöntem izlenerek, hedeflenen proteinin belirli bir fonksiyon için gerekli olan temel yapısal gereksinimleri belirlenebilir. Ardından, ilgili mekanizmaları daha derinlemesine incelemek için diğer genom düzenleme yaklaşımları kullanılabilir.