Name: Adenofection: tükenmesi-Kurtarma Experiments Hücresel Morphodynamics Moleküler şaperonlar Rolü incelenmesi için Bir Yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: Öğrenin, hücresel bütünlüğü koruyarak protein tükenmesi-kurtarma deneyleri yapma yöntemini. Adenofection tekniği ile mitoz ve miyogenez gibi süreçlerde protein fonksiyonlarını tek hücre düzeyinde analiz edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (Hibe no: 7077) ve Bellini Vakfı ve Roby Fondazione tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).</li>
<li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).</li>
<li>Boettcher, M., McManus, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+the+Right+Tool+for+the+Job%3A+RNAi%2C+TALEN%2C+or+CRISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR.</a> Mol Cell. 58 (4), 575-585 (2015).</li>
<li>Natarajan, K., Rajala, M. S., Chodosh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+IL-8+expression+following+adenovirus+infection+is+mediated+by+c-Src+activation+in+human+corneal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Corneal IL-8 expression following adenovirus infection is mediated by c-Src activation in human corneal fibroblasts.</a> J Immunol. 170 (12), 6234-6243 (2003).</li>
<li>Yousuf, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolin-1+associated+adenovirus+entry+into+human+corneal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Caveolin-1 associated adenovirus entry into human corneal cells.</a> PLoS One. 8 (10), e77462(2013).</li>
<li>Morton, P. E., Hicks, A., Nastos, T., Santis, G., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+regulates+epithelial+cell+junction+stability+through+control+of+E-cadherin+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">CAR regulates epithelial cell junction stability through control of E-cadherin trafficking.</a> Sci Rep. 3, 2889(2013).</li>
<li>Carra, S., Seguin, S. J., Lambert, H., Landry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HspB8+chaperone+activity+toward+poly%28Q%29-containing+proteins+depends+on+its+association+with+Bag3%2C+a+stimulator+of+macroautophagy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">HspB8 chaperone activity toward poly(Q)-containing proteins depends on its association with Bag3, a stimulator of macroautophagy.</a> J Biol Chem. 283 (3), 1437-1444 (2008).</li>
<li>Fuchs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+key+structural+motifs+involved+in+HspB8%2FHspB6-Bag3+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Identification of the key structural motifs involved in HspB8/HspB6-Bag3 interaction.</a> Biochem J. 425 (1), 245-255 (2010).</li>
<li>Rosati, A., Graziano, V., De Laurenzi, V., Pascale, M., Turco, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAG3%3A+a+multifaceted+protein+that+regulates+major+cell+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">BAG3: a multifaceted protein that regulates major cell pathways.</a> Cell Death Dis. 2, e141(2011).</li>
<li>Guilbert, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuilbert%2C+SM+%22The+Big+Book+of+Small+Heat+Shock+Proteins%22">The Big Book of Small Heat Shock Proteins</a>. Tanguay, R. M., Hightower, L. E. , Springer International Publishing AG. 435-456 (2015).</li>
<li>Fasbender, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexes+of+adenovirus+with+polycationic+polymers+and+cationic+lipids+increase+the+efficiency+of+gene+transfer+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Complexes of adenovirus with polycationic polymers and cationic lipids increase the efficiency of gene transfer in vitro and in vivo.</a> J Biol Chem. 272 (10), 6479-6489 (1997).</li>
<li>Toyoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+polymer+and+lipids+enhance+adenovirus-mediated+gene+transfer+to+rabbit+carotid+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Cationic polymer and lipids enhance adenovirus-mediated gene transfer to rabbit carotid artery.</a> Stroke. 29 (10), 2181-2188 (1998).</li>
<li>Fasbender, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+adenovirus+in+calcium+phosphate+precipitates+enhances+gene+transfer+to+airway+epithelia+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Incorporation of adenovirus in calcium phosphate precipitates enhances gene transfer to airway epithelia in vitro and in vivo.</a> J Clin Invest. 102 (1), 184-193 (1998).</li>
<li>Fuchs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Role+for+the+Chaperone+Complex+BAG3-HSPB8+in+Actin+Dynamics%2C+Spindle+Orientation+and+Proper+Chromosome+Segregation+during+Mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A Role for the Chaperone Complex BAG3-HSPB8 in Actin Dynamics, Spindle Orientation and Proper Chromosome Segregation during Mitosis.</a> PLoS Genetics. 11 (10), e1005582(2015).</li>
<li>Champagne, C., Landry, M. C., Gingras, M. C., Lavoie, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+adenovirus+type+2+early+region+4+ORF4+cytoplasmic+death+function+by+direct+binding+to+Src+kinase+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of adenovirus type 2 early region 4 ORF4 cytoplasmic death function by direct binding to Src kinase domain.</a> J Biol Chem. 279 (24), 25905-25915 (2004).</li>
<li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact%3A+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li>
<li>Takahashi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+Akt+signaling+regulates+blood+vessel+recruitment+during+myofiber+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Myogenic Akt signaling regulates blood vessel recruitment during myofiber growth.</a> Mol Cell Biol. 22 (13), 4803-4814 (2002).</li>
<li>Murray, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-apoptotic+role+for+caspase-9+in+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A non-apoptotic role for caspase-9 in muscle differentiation.</a> J Cell Sci. 121 (Pt 22), 3786-3793 (2008).</li>
<li>Terada, K., Misao, S., Katase, N., Nishimatsu, S., Nohno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+Wnt+Signaling+with+BMP%2FSmad+Signaling+during+the+Transition+from+Cell+Proliferation+to+Myogenic+Differentiation+in+Mouse+Myoblast-Derived+Cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interaction of Wnt Signaling with BMP/Smad Signaling during the Transition from Cell Proliferation to Myogenic Differentiation in Mouse Myoblast-Derived Cells).</a> Int J Cell Biol. 2013, 616294(2013).</li>
<li>Hindi, S. M., Tajrishi, M. M., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+mechanisms+in+mammalian+myoblast+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Signaling mechanisms in mammalian myoblast fusion.</a> Sci Signal. 6 (272), re2(2013).</li>
<li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+%283rd+edition%29%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada, stokiyometri ve protein kompleksleri ve moleküler yapıların dinamiklerini etki proteinlerin aşın özellikle hassas olan hücre biyolojik süreçlerin işlevsel analizleri için de geçerlidir tükenmesi kurtarma deneyler için sağlayan bir yöntem açıklanmaktadır. Mitoz hücre bölünmesi, bir hücrenin genel yapısı içinde en dramatik ve muhteşem değişiklikleri içeren ince ayarlı hücre morphodynamics aşırı bir örnektir. hücre görüntüleme için aktin ve tubulin belirteçlerin düşük ama algılanabilir miktarlarda tanıtmak ticari o...

Memeli hücrelerinde gen ifadesinin fonksiyonel inaktivasyonu proteinlerin fonksiyonları incelemek için altın standarttır. Yeni tür Çinko parmak nükleazlara gibi site-spesifik nükleazların kullanımına dayanan genom düzenleme teknolojileri geliştirmiş ve kümelenmiş düzenli interspaced kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) / CAS9 şimdi hedeflenen gen silme ve mutasyon 1,2 ile hücre hatlarının üretilmesini sağlar. Bu yeni yaklaşımlar biz protein fonksiyonu ve insan hastalıklarının genetik anlayışımızı okuyan yol devrim olmalıdır. Bazı durumlarda ise, uzun vadeli veya tam gen nakavt arzu edilmez ve sekonder hücre telafi mekanizmaları provoke edebilir. Genetik olarak tadil edilmiş hücre çizgilerinin üretimi de sınırlı bir proliferasyon kapasitesi, ya da farklı hücre tiplerinde mutasyonların büyük bir set tarama aranan primer hücre kültürleri ile uğraşırken sınırlayıcı olabilir. Bu genellikle, bir hücre b bağımlılığı belirlemek için gereklidirbir proteinin yapısal gereksinimleri malarla proses. Bu amaçla, çeşitli hücresel geçmişleri geçici tükenmesi-kurtarma deneyleri sağlayan RNA müdahalesi ile geri dönüşümlü demonte hala yapı-işlev ilgi 3&#39;ün bir protein analizleri gerçekleştirmek için basit ve güçlü bir yaklaşım olmaya devam etmektedir. Ancak, bu yaklaşımın önemli bir dezavantajı zorluk verimli susturulması elde etmek ve hücre popülasyonunun bir çoğunluğu yakın fizyolojik düzeyde ilgi ya da türevleri protein reintroduce etmektir. Bu protein-protein etkileşimleri ile ilgili, örneğin hücre popülasyonu bazlı deneylerde görülen, tek hücreler (hypomorphic fenotipi) seviyesinde görülen işlevsel etkileri ilişkili girişimi kapsamlı çalışmalar sağlamak için çok önemlidir. Klasik transfeksiyon yöntemleri kullanarak, bir güçlükle hücrelerin büyük bir nüfus eksojen proteinlerin homojen ve düşük ifadesini elde edebilirsiniz. Rekombinant virüs hücrelerin İletimiadenovirüsler gibi genellikle eksojen proteinin daha normal ifadesini sağlar. Bununla birlikte, adenovirüs alımı insan olmayan hücrelerde mevcut değildir veya sadece zayıf bir insan hücre tiplerinde ifade edilir ARAÇ reseptörü ile sınırlıdır. Ayrıca, adenovirüsler hücreye girişi hücre şekli ve yapışma 4-6 düzenleyen sinyal yollarının aktive eder. Hücre morphodynamics düzenleyici mekanizmaları okuyan bu besbelli istenmemektedir. Biz hücre bölünmesi ve aktin dinamikleri, bir koruyucuya kompleksi, BAG3-HSPB8 fonksiyonel analizleri üstlendi zaman biz bu sorunlu bakan. Öncü iş stresi 7,8 sırasında protein kalite kontrol ve otofaji bu hastabakıcı kompleksi için bir rol tarif etmişti. Bu çalışmaların çoğu, ancak, chaperones normalde stres sırasında düzenlenen varsayarak, protein aşırı ekspresyonu dayanıyordu. Bu HSPB8 ile kompleks içinde, ister BAG3 sorusunu açık bıraktı, th ifade bölünen hücrelerin normal çalışmasına katkıda bulunabilirBirçok kanser hücre tipleri 9 gibi ese şaperonlar. Özellikle, hastabakıcı kompleksi HspB&#39;dir şaperonlar ve iskelet dinamikleri 10 arasında ortaya çıkan bağlantıları verilen büyük ilgi oldu mitoz ilerlemesini kontrol aktin-tabanlı yapıların yeniden bir katkısı olup olmadığını. Bu sorunu gidermek için, biz mitoz ilerlemesi veya hücresel morfoloji müdahale olmaz ve hücre şekil değişiklikleri düzenleyen makromoleküler kompleksleri dinamikleri ikincil pertürbasyon önlemek için, protein homeostazisini korumak hangi tükenmesi-kurtarma deneyler için etkili bir yöntem geliştirmeyi aramaktadır . Bu nedenle, ideal olarak söz konusu genin tükenmesi ekleyin geri eş zamanlı olarak yapılmalıdır. Bir katyonik polimer veya lipidler ile adenovirüs komplekslerinin kullanımı, in vitro ve in vivo 11,12 gen transferini teşvik etmek için tarif edilmiştir. Örneğin, kalsiyum fosfat (Capi) sahip bir çökelti oluşturmak için görünürBir CAR-bağımsız yolunun 13 üzerinden virüs bağlayıcı girişi geliştirmek adenovirüs. Gerçekten de, katyonik bileşikler ile adenovirüs bazlı hücre transdüksiyonu ve transfeksiyon birleştiren tükenmesi kurtarma deneyler etkinliğini arttırabildiği bulunmuştur. Bu çoğunda yakınındaki endojen seviyelerde ekzojen proteinlerin ekspresyonunu ayarlamak için daha geniş bir pencere hücre hattı ve ilgi dahilindeki gen ve yarar bağlı olarak, US 20-kat 3- virüsün miktarını düşürmek için izin hücresel morfoloji üzerinde asgari etki ile ilgi bir hücre popülasyonunun. Bu koşullar altında, daha da endojen protein ekspresyonu (&gt;% 75) yüksek verimli demonte elde edebiliriz. Biz burada fizyolojik ro fonksiyonel analizler için yöntem uygun hale adım yöntem adım tarif ve Isı Şoku Protein ailesinin stres kaynaklı chaperones değişmeden seviyeleri ile değerlendirilen protein homeostazı önemli ölçüde tedirgin olmadığını kanıttime-lapse video mikroskobu ile moleküler şaperonlar le. Protokol hücre senkronizasyon prosedürlere ve mitotik ilerlemesi sırasında, normal aktin bazlı ve mil dinamikleriyle en az müdahale ile flüoresan işaretlerin düşük seviyelerde, ko-ekspresyonu için ticari olarak temin edilebilir bakulovirüslerin kullanımı elverişlidir. Biz daha in vitro myotubes myoblast farklılaşma üzerinde önemli bir etkiye sahip fare C2C12 hücreleri, &quot;uyum sağlamak zor&quot; uygulanabilir yöntem çok yönlülüğünü gösteriyor.

<table><tbody><tr><td>C2C12 Fare Miyoblastları</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Adenovirüs özel tasarım</td><td>Welgen</td><td>Özel tasarım</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>CellLight&reg; Aktin-GFP, BacMam 2.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>C10582</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Işığı&reg; Tübülin-RFP, BacMam 2.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>C10614</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s orta (DMEM), Yüksek Glikoz</td><td>Thermo Fisher</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Cam alt tabaklar, 35 mm</td><td>MatTek Corperation</td><td>P35G-1.5-20-C Kasa</td><td></td></tr><tr><td>HeLa-RFP-H2B</td><td>Dr Sabine Elowe'nin nazik hediyesi, Soru; bec, Kanada</td><td></td><td>Klebig C et al. 2009</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>At Serumu, Yeni Zelanda</td><td>Thermo Fisher</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin&reg; RNAiMAX Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Thermo Fisher</td><td>13778-150</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Esansiyel Orta (MEM) Alfa</td><td>Wisent</td><td>310-101-CL</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Esansiyel Orta (MEM) Desoksiribosülfürler/Ribonükleozitler içermeyen Alfa</td><td>Thermo Fisher</td><td>12000-022</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Esansiyel Orta (MEM) Fenol içermeyen Alfa Kırmızı</td><td>Thermo Fisher</td><td>41061-029</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Biyobazik</td><td>S0404</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>rAVCMV-LifeAct-TagGFP2</td><td>IBIDI</td><td>60121</td><td></td></tr><tr><td>siRNA dubleksler</td><td>Dharmacon</td><td>Özel tasarım</td><td></td></tr><tr><td>Timidin</td><td>Sigma</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin% 2.5</td> <td>Termo Balıkçı</td><td>15090-046</td><td></td></tr></tbody></table>

adenofection: tükenmesi-kurtarma experiments hücresel morphodynamics moleküler şaperonlar rolü incelenmesi için bir yöntem

Adenofection: A Method for Studying the Role of Molecular Chaperones in Cellular Morphodynamics by Depletion-Rescue Experiments

Böyle mitoz ve hücre farklılaşması gibi hücresel süreçleri büyük ölçüde hücre iskelet yapılarının doğru yeniden güvenmek hücre şekli değişiklikleri ile yönetilmektedir. Bu, belirli bir zaman ve yerde daha yüksek dereceden moleküler yapıların bağlanma-çözülme, proteinlerin aşırı ifadesi ile neden olduğu düzensizlikler, özellikle hassas olan bir işlemi içerir. yakın--normal hücre morfolojisi, protein homeostazını koruyan ve korumak yöntemler hücresel süreçlerin çeşitli ilgi konusu bir proteinin fonksiyonel katkı belirlenmesi yüksek ölçüde istenebilecektir. RNA müdahalesi dayalı geçici baskılanma-kurtarma deneyleri, protein fonksiyonları ve yapısal gereksinimlerini analiz güçlü yaklaşımlardır. Ancak, fizyolojik seviyesinden en az sapma ile hedef proteinin reintroduction gerçek bir mücadeledir. Burada moleküler şaperonlar rolünü incelemek için geliştirilmiş bir yöntem olarak adlandırılan adenofection açıklayan bird bölünen hücrelerin normal çalışma ortakları ve aktin biçimlenme ile ilişkisi. HeLa hücreleri siRNA dubleksler 3&#39;UTR bölgeyi hedefliyor ile BAG3 tükenmiş bulundu. GFP etiketli BAG3 proteinleri transfeksiyon reaktifleri bağlanmış rekombinant adenovirüsler kullanarak hücrelerin&gt;% 75 içine eş zamanlı olarak yeniden dahil edilmiştir. Adenofection stres yanıt verilmemesi halinde, BAG3 yoksun HeLa hücrelerinde yakın fizyolojik seviyede BAG3 GFP proteinleri ifade etmek için etkin. Etkisiz endojen ısı şoklu protein şaperonlar protein homeostazı ana stresle uyarılabilir düzenleyiciler düzeyde gözlenmiştir. Ayrıca, hücre iletimi-transfeksiyon sırasında floresan belirteçlerin ifadesini süren bakulovirüsleri ekleyerek, biz time-lapse mikroskobik tarafından mitotik hücre dinamiklerini incelemek olabilir, normal mitotik ilerlemesi minimum pertürbasyon ile analiz eder. Adenofection myoblast fark fonksiyonel analiz için zor enfekte fare hücreleri de uygulanabilir ve uygunmyotubes farklılık yaratmak. Böylece adenofection yapı-fonksiyon üst düzey iskelet dinamikleri güveniyor hassas biyolojik süreçlerde yer proteinlerin analizi gerçekleştirmek için çok yönlü bir yöntem sağlar.

Katyonik lipidler ile BAG3-gfp plazmit DNA&#39;sı transfeksiyonu HeLa hücrelerinde heterojen ekspresyonu ile bağlantılı, çok yüksek BAG3 seviyeleri (Şekil 2A) taşıyan zor tespit protein seviyelerini ve diğerleri gösteren bazı hücreler. Bu hücrelerde protein homeostazı kaybı perinükleer agregatları (Şekil 2A, oklar) içine BAG3-GFP birikmesi ile kanıtlanmıştır. Bunun aksine, BAG3-GFP taşıyan adenovirüsler hücre transdüksiyonu daha homojen düşük bir ifade v...

Hücresel bütünlüğü ve protein homeostazını koruyan tükenme-kurtarma deneyleri için bir yöntem tanımlıyoruz. Adenofeksiyon, tek hücre düzeyinde mitotik hücre bölünmesi ve miyogenez gibi ince ayarlanmış aktin bazlı dinamiklere dayanan biyolojik süreçler içindeki proteinlerin fonksiyonel analizlerini sağlar.

Adenofection: tükenmesi-Kurtarma Experiments Hücresel Morphodynamics Moleküler şaperonlar Rolü incelenmesi için Bir Yöntem

Cellular processes such as mitosis and cell differentiation are governed by changes in cell shape that largely rely on proper remodeling of the cell ...

Bu yöntemin genel amacı, tek hücre düzeyindeki biyolojik süreçlerin fonksiyonel analizleri için hücresel bütünlüğü ve protein homeostazını koruyan koşullar altında eksiltme kurtarma (depletion rescue) deneylerinin gerçekleştirilmesini sağlamaktır.Bu yöntem, mitoz ve hücre diferansiyasyonu gibi hücre dinamiklerindeki protein fonksiyonları ve yapısal gereksinimlere ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hedeflenen bir proteini tüketirken, aynı zamanda bu proteinin bir varyantını hücre popülasyonunun büyük bir kısmında fizyolojik seviyeye yakın düzeyde yeniden tanıtmaktır.İşleme cam tabanlı kapları fibronectin ile kaplayarak başlayın. Bunun için, 1 mg/mL'lik fibronectin stok çözeltisini steril PBS ile 1:100 oranında seyreltin.Tüm yüzeyi kaplamak için her 35 mL'lik kaba bir mililitre ekleyin. 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında bir saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon sırasında, %10 FBS ile desteklenmiş alpha MEM'i ve 0,05% trypsin EDTA'nın bir alikotunu 37 °C'ye kadar önceden ısıtın.45 dakikalık inkübasyonun ardından, hücre solüsyonunu hazırlamaya başlayın. 10 santimetrelik bir HeLa-RFP-H2B hücre plağındaki besiyerini aspire edin. Ve %0,05 tripsin EDTA'nın 1,5 mililitresi ile nazikçe iki kez durulayın.Son aspirasyondan sonra plakada 0.5 milliliters trypsin EDTA bırakın ve hücreleri 37 °C ve %5 carbon dioxide koşullarında iki ila üç dakika inkübe edin.Plakaya hafifçe vurun ve tüm hücrelerin ayrıldığını doğrulamak için hücre tabakasını mikroskop altında gözlemleyin. Ardından 10 milliliters besiyeri ekleyin, hücreleri ayırmak için birkaç kez nazikçe pipetleyin ve hücre süspansiyonunu 15 milliliters bir tüpe aktarın.Hücre süspansiyonunun 10 µL'lik bir örneğini hemositometre kullanarak sayın. Ardından, cam tabanlı kaplardaki fibronectin çözeltisini aspire edin. Hücre ekimi öncesinde fibronectin'in kurumasına izin vermeyin.35 mm'lik kap başına 2 ml besiyerinde 1,5 x 10⁵ hücre ekmek için bir hücre süspansiyon çözeltisi hazırlayın. Virüs transdüksiyonu öncesinde hücre sayısını saymak amacıyla, koşul sayısına ek olarak bir adet 35 mm'lik plak ekleyin. 30 ila 45 dakika inkübe edin. İnkübasyon süresi dolduktan sonra, burada görüldüğü gibi hücrelerin iyice ayrıldığından emin olmak için hücreleri mikroskop altında kontrol edin. Plakları inkübatöre geri yerleştirin ve hücreleri ertesi güne kadar büyütün.Ekimden bir gün sonra, hücrelerin en az %50 yoğunluğa ulaştığından emin olun. %50'den düşük hücre yoğunluğu; virüs transdüksiyon verimliliğinin azalmasına, hücre başına protein ekspresyonundaki varyasyonun artmasına ve hücre toksisitesinin artmasına neden olur. Ardından, ek olarak ekilen kapla hücreleri daha önce olduğu gibi hasat edin ve hücre sayısını belirleyin. Hücrelerin verimli transdüksiyonu için gereken virüs hacmini hesaplayın. Her bir koşul için 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünü etiketleyin ve içine 400 mikrolitre ılık alpha MEM minus ekleyin. Virüs alikotlarını buz üzerinde yavaşça çözdükten sonra, her bir virüsün gerekli hacmini tüplere ekleyin ve pipetleyerek nazikçe karıştırın. Daha sonra, hücrelerdeki besiyerini aspire ettikten sonra, virüs karışımını damla damla nazikçe ekleyin. Hücreleri 37 degrees Celsius sıcaklıkta ve %5 carbon dioxide ortamında inkübe edin. Bir saatlik süre boyunca her 15 dakikada bir, hücrelerin virüsle kaplanması için plakları steril kabin altında dikkatlice çalkalayın. Az miktarda besiyeri kullanmak, virüsün hücrelerle temasını kolaylaştırır.İnkübasyonun ardından, toplam hacmi 2 mL'ye tamamlamak için her plakete nazikçe 1,6 mL alpha MEM minus ekleyin. Ardından, hücreleri iki saat daha inkübe etmeden önce 2 mM timididin ekleyerek hücre senkronizasyonunu başlatın.Bu sırada, bir mikrotüpe 139 µL steril su, 50 µL 1 M kalsiyum klorür ve 11 µL 20 µM siRNA ekleyerek siRNA transfeksiyon karışımını hazırlayın. siRNA gerekmiyorsa, boş bir transfeksiyon gerçekleştirmek için siRNA miktarını steril su ile değiştirin. HBSS-2X çözeltisini kalsiyum klorür siRNA karışımının üzerine yavaşça, damla damla ekleyin. Daha küçük çökeleklerin daha iyi transfeksiyon verimliliği sağladığını göz önünde bulundurarak, 200 µL'lik bir pipet kullanarak hava enjeksiyonu ile iki kez nazikçe karıştırın. Ardından karışımı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, her bir plakaya yavaşça damla damla 200 µL ekleyin ve karıştırmak için çalkalayın. Plakaları 37 °C'de, %5 CO2 ortamında 16 saat boyunca inkübe edin.Ertesi gün, kapları inkübatörden çıkarın ve bir doku kültürü kabinine taşıyın. Hücreleri iki mililitre ılık HEPES ile iki kez duruladıktan sonra, tekrar inkübatöre yerleştirmeden önce iki mililitre alfa MEM minus ekleyin.Yedi saat sonra, plakaları inkübatöre geri yerleştirmeden önce plakalara iki milimolar timidin ekleyin. Sıcaklık değişimleri hücre döngüsünün uzunluğunu etkilediğinden, aynı anda en fazla dört hücre plakası ile çalışın. Ertesi gün, siRNA transfeksiyonu ve virüs enfeksiyonundan 48 saat sonra, hücreleri iki mililitre ılık PBS ile iki kez durulayın ve ardından canlı hücre görüntüleme için fenol kırmızısı içermeyen iki mililitre alfa MEM ekleyin. Yedi saat boyunca inkübe edin.Nemlendirilmiş %5 karbon dioksit termoregüle bir hazne ile donatılmış ters bir mikroskop kullanarak mitotik hücreler üzerinde kısa süreli canlı hücre görüntüleme deneyleri gerçekleştirin. Görüntüleme işleminden önce, haznenin 37 °C uygun sıcaklığa ulaştığını doğrulayın.Besiyerinin uygun şekilde dengelenmesini sağlamak ve sıcaklık değişimlerine bağlı odak kaymasını önlemek için kültür kaplarını görüntülemeden bir saat önce mikroskop haznesine yerleştirin. Hücrelerin mitotik durumunu inceleyin. Bu aşamada, hücrelerin %10 ila %15'i mitozun erken evrelerinde olmalıdır.Dengeleme süresi boyunca, önceki deneylerde belirlenen görüntüleme parametrelerini ayarlayın. Hücre hasarına yol açtığı ve mitotik ilerlemeyi bozduğu için, fotobeyazlama (photo-bleaching) olmadan uygun çözünürlüğü elde etmek önemlidir. Görüntüleme aralığını aşmadan analiz etmek için anlamlı sayıda hücre elde etmek amacıyla, her koşul için mitotik girişte olan hücrelerin bulunduğu birkaç alan seçin. Tüm alanlar seçildikten sonra, odağı yeniden ayarlayın ve görüntüleme işlemini mümkün olan en hızlı şekilde başlatın.Dönen disk konfokal sisteminin kullanıldığı tipik bir düzenek; dört farklı koşul, plaka başına yedi alan ve 75 dakikalık bir süre boyunca 1,5 ila iki dakikalık aralıklarla iki renk kanalını içerecektir. Kullanılan floresan markörlere bağlı olarak, hücrelerdeki mitotik fenotipleri analiz etmek için iyi tanımlanmış kriterler belirleyin.Solda görülen BAG3-GFP plazmid DNA transfeksiyonunun aksine, sağda gösterilen rekombinant adenovirüsler ile yapılan adenofeksiyon, düşük enfeksiyon multiplicitiesinde hücre popülasyonunun çoğunluğunda daha homojen ve verimli bir BAG3-GFP ekspresyonu sağlar. Bu temsili western blot, BAG3 spesifik siRNA'lar ve rekombinant adenovirüs BAG3-GFP ile yapılan adenofeksiyonun, endojen BAG3'ün verimli bir şekilde tüketilmesine ve BAG3-GFP proteininin endojen seviyelere yakın düzeylerde yeniden tanıtılmasına olanak tanıdığını göstermektedir. Burada görüldüğü üzere, proteotoksik stres indükleyici MG132 ile işlem görmüş HeLa hücrelerinin aksine, adenofeksiyon yapılmış HeLa hücrelerinde stres kaynaklı ısı şok proteinlerinin seviyelerinde saptanabilir bir artış olmadığı için adenofeksiyon protein homeostazını koruyabilmektedir. Kontrol siRNA ile BacMam-GFP alpha Tubulin ve BacMam-RFP Actin adenofeksiyonu uygulanmış HeLa hücrelerinden alınan bu konfokal zaman ayarlı görüntülerde, hücrelerin mitoz ilerleyişinin adenofeksiyondan önemli ölçüde etkilenmediği görülmektedir.Grafik, anormal mitoz gösteren hücrelerin oranını belirtmektedir. Sadece BAG3'e özgü siRNA ile adenofekte edilen hücreler, kırmızı çubukla gösterildiği üzere mitotik defekt seviyesinde yaklaşık iki kat artış sergilemiş; bu durum, siyah çubukla gösterilen BAG3-GFP'nin yenidenlendirilmesiyle kontrol hücresi seviyesine yakın bir düzeye geri dönmüştür.Bu videoyu izledikten sonra, adenofeksiyon kullanarak eksiltme kurtarma (depletion rescue) deneylerinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu yöntem, birden fazla hücresel arka planda yapı-fonksiyon analizleri için hipomorfik nakavtlar (knock-downs) oluşturmak amacıyla hızlı ve basit bir sistem sağlar. Bu yöntem izlenerek, hedeflenen proteinin belirli bir fonksiyon için gerekli olan temel yapısal gereksinimleri belirlenebilir. Ardından, ilgili mekanizmaları daha derinlemesine incelemek için diğer genom düzenleme yaklaşımları kullanılabilir.

adenofection-method-for-studying-role-molecular-chaperones-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol ısı şok sonra hücre içi protein refolding ölçmek için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, faaliyetlerini etkilemek için moleküler şaperonlar ve bunların eş-faktörleri veya bileşikleri gibi foldases incelemek için kullanılabilir. Firefly lusiferaz aktivitesini muhabir olarak hastabakıcı refolding aktivitesini ölçmek için kullanılır.

Hücre içi Refolding Testi

Kaynak: Dahl, J. ve ark. Escherichia coli Chaperone HdeB'nin pH-Bağımlı Aktivitesinin Tespiti In Vitro ve In Vivo. J. Vis. Exp. (2016)Bu video, asit ve ısı stresi altında bir substrat proteininde çaperon aktivitesini değerlendirmek için floresans spektrofotometre tabanlı bir testi göstermektedir. Işık saçılması yoluyla substratın açılması ve toplanmasının izlenmesi adımlarını, eşlikçi ile ve olmadan koşulları karşılaştırarak açıklar.

Bir Model Proteinin Termal Açılması Yoluyla Bakteriyel Şaperon Aktivitesinin Değerlendirilmesi

Bu makalede, araştırmak için bir ateş böceği lusiferaz-GFP füzyon proteini tanımının kullanımını tarif...

İzlenmesi protein refolding için birleştiğinde Tahliller<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Bu çalışma, asidik pH koşulları altında E. coli HdeB bir şaperon aktivitesinin karakterize edilmesi için, biyofiziksel, biyokimyasal ve moleküler teknikler tarif eder. Bu yöntemler, örneğin başarılı bir şekilde HdeA gibi diğer asit koruma şaperonlar için uygulanmış ve diğer şaperonlar ve stres koşullarında çalışmak için modifiye edilebilir.

pH bağımlı aktivitenin tespiti<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; İn Vitro</em&gt; ve<em&gt; İn Vivo</em

Biz nasıl sıkı BAĞLAMAK ve photoactivation gibi mikro - ve photomanipulation teknikleri hareketliliği parametreleri belirlenmesi etkinleştirmek ve proteinler geçiş içinde kronolojik zamanmekansal dinamikleri hücreleri tanımlamak. Deneysel veriler hücre altı dinamikleri ve ciro hareketliliği düzenleyiciler veya temel aktin sitoiskeleti içerir.

Morfogenetik dinamiklerini analiz ve hücre iskeleti düzenleyiciler ciro sağlayan Embriyolardan teknikleri

Organizmalar hayatları boyunca karşılaştığınız en zor stres koşulları oksidanlar birikimi içerir. Oksidatif stres sırasında hücreleri moleküler chaperones güveniyorsun. Burada, redoks düzenlenir anti-toplama etkinliği, de araştırmak için refakatçi işlev HDX-MS kullanarak yöneten yapısal değişiklikleri izlemek için kullanılan bir yöntem mevcut.

Hsp33'ın redoks düzenlenir refakatçi etkinlik tanımlama ve Hsp33 konformasyon değişiklikleri hidrojen-döteryum Exchange kütle spektrometresi kullanarak eşleme

Cognate J-etki proteinleri hsp70 şaperon ile protein katlama bozulması arasında değişen biyolojik süreçler sayısız yardımcı olmak için işbirliği. Burada, bakteriyel, maya ve insan hücrelerinde geçici olarak oluşan bu şaperon makinelerinin izlenmesine olanak sağlayan bir in situ yakınlık ligasyon tetkikini tanımlıyoruz.

Bakteri, Maya ve İnsan Hücrelerinde Geçici Olarak Oluşan Moleküler Şaperon Meclislerinin Yerinde İzlenmesinde

Refakatçi-refakatçi ve refakatçi-substrat etkileşimlerini incelemek için, hafif mutasyonlar veya refakatçilerin aşırı ekspresyumu ile birlikte RNA paraziti kullanarak Caenorhabditis elegans'ta sentetik etkileşim ekranları gerçekleştiriyoruz ve dokuya özgü protein disfonksiyonunu organizma düzeyinde izliyoruz.

Dokuya Özgü Chaperone Etkileşimlerini Taramak için Caenorhabditis elegans'ı Kullanma

Bu protokol, GST ile kaynaşmış TPR motifli yardımcı refakatçiler ve Hsp90 türevli peptit ile birleştirilmiş alıcı boncuklar ile glutatyon bağlantılı donör boncuklar kullanarak protein-protein etkileşimlerini yoklama tekniği sunar. Bu tekniği, Hsp90-FKBP51 veya Hsp90-FKBP52 etkileşimlerini bozmak için küçük molekülleri taramak için kullandık ve güçlü ve seçici Hsp90-FKBP51 etkileşim inhibitörlerini belirledik.

Homojen Boncuk Bazlı Test Kullanılarak Chaperone-Cochaperone Etkileşimleri Çalışmaları

Bu protokol, histon şaperon oligomerizasyonu ve stabilitesini incelemek için analitik boyut dışlama kromatografisini, histon şaperon-histon etkileşimlerini çözmek için aşağı çekme testini, protein komplekslerinin stokiyometrisini analiz etmek için AUC'yi ve in vitro varsayılan bir histon şaperonu işlevsel olarak karakterize etmek için histon chaperoning testini içeren bir dizi yöntemi tanımlamaktadır.

İn Vitro Histon Chaperonlarının Analitik, Pull-Down ve Chaperoning Testleri Kullanılarak Karakterizasyonu

Yüksek verimli tek moleküllü bir görüntüleme tekniği olan DNA perdesi, çeşitli protein-DNA etkileşimlerinin gerçek zamanlı görselleştirilmesi için bir platform sağlar. Mevcut protokol, bir Schizosaccharomyces pombe bromodomain içeren AAA+ ATPaz olan Abo1'in biyolojik rolünü ve moleküler mekanizmasını araştırmak için DNA perdesi tekniğini kullanmaktadır.

Histon Düzeneğinin Moleküler Mekanizmasının DNA Perde Tekniği ile Deşifre Edilmesi

Öğrenin, hücresel bütünlüğü koruyarak protein tükenmesi-kurtarma deneyleri yapma yöntemini. Adenofection tekniği ile mitoz ve miyogenez gibi süreçlerde protein fonksiyonlarını tek hücre düzeyinde analiz edin.

Adenofection: tükenmesi-Kurtarma Experiments Hücresel Morphodynamics Moleküler şaperonlar Rolü incelenmesi için Bir Yöntem

Daha fazla video keşfet