Adenofection: tükenmesi-Kurtarma Experiments Hücresel Morphodynamics Moleküler şaperonlar Rolü incelenmesi için Bir Yöntem

Bu yöntemin genel amacı, hücresel bütünlüğü ve protein homeostazını koruyan koşullar altında tükenme kurtarma deneylerinin yapılmasını sağlamaktır. Tek hücre düzeyinde biyolojik süreçlerin fonksiyonel analizleri için. Bu yöntem, mitoz ve hücre farklılaşması gibi hücre dinamiklerinde protein fonksiyonları ve yapı gereksinimleri ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin ana avantajı, ilgilenilen bir proteini tüketmek ve aynı zamanda bu proteinin varyantını bir hücre popülasyonunun ölçülmesinde neofizyolojik düzeyde yeniden tanıtmaktır. Cam alt tabakları fribronektin ile kaplayarak başlayın. Bunu yapmak için, steril PBS ile mililitre firbronektin stoğu bir ila 100 arasında bir miligram seyreltin.

Tüm yüzeyi kaplamak için her 35 mililitrelik tabağa bir mililitre ekleyin. 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir saat inkübe edin. İnkübasyon sırasında, ön sıcak alfa MEM,% 10 FBS ve% 0.05 tripsin EDTA'lık bir alikot ile 37 santigrat dereceye kadar desteklenmiştir.

45 dakikalık inkübasyondan sonra hücre çözeltisini hazırlamaya başlayın. Ortamı 10 santimetrelik bir HeLa RFP H2B hücresi plakasından aspire edin. Ve 1.5 mililitre% 0.05 tripsin EDTA ile iki kez nazikçe durulayın.

Son aspirasyondan sonra plakada 0,5 mililitre tripsin EDTA bırakın. Ve hücreleri 37 santigrat derecede iki ila üç dakika inkübe edin. Ve% 5 karbondioksit.

Plakaya hafifçe vurun. Ve tüm hücrelerin ayrıldığını doğrulamak için mikroskop altında hücre katmanını gözlemleyin. Daha sonra 10 mililitre ortam ekleyin ve hücreleri ayırmak ve hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarmak için birkaç kez hafifçe pipetleyin.

Bir hemositometre kullanarak hücre süspansiyonunun 10 mikrolitrelik bir örneğini sayın. Daha sonra, fibronektin çözeltisini cam alt tabaklardan aspire edin. Hücre kaplamasından önce fibronektinin kurumasına izin vermeyin.

İki mililitre ortamda 35 milimetrelik çanak başına 1.5 çarpı on ila beşinci hücreye plakalamak için bir hücre süspansiyon çözeltisi hazırlayın. Birinci plaka, virüs transdüksiyonundan önceki hücre sayısını saymak için koşul sayısına ek olarak 35 milimetrelik plaka. 30 ila 45 dakika inkübe edin.

Kuluçka süresi geçtikten sonra, hücrelerin iyi ayrıldığından emin olmak için hücreleri mikroskop altında kontrol edin. Burada görüldüğü gibi. Plakaları inkübatöre geri koyun ve hücreleri ertesi güne kadar büyütün.

Kaplamadan sonraki gün, hücrelerin en az %50 yoğunluğa ulaştığından emin olun, bu da virüs iletim verimliliğinin azalmasına neden olan %50'den düşük bir hücre yoğunluğuna neden olur. Hücre başına protein ekspresyonunun artan varyasyonu ve artan hücre toksisitesi. Ardından, hücreleri daha önce olduğu gibi ek kaplanmış tabaktan toplayın.

Ve hücre sayısını sayın. Hücrelerin verimli bir şekilde transdüksiyonu için gereken virüs hacmini hesaplayın. Her koşul için 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünü etiketleyin.

Ve 400 mikrolitre ılık alfa MEM eksi ekleyin. Virüslerin alikotları buz üzerinde yavaşça çözüldükten sonra, her bir virüsün gerekli hacmini tüplere ekleyin ve pipetleyerek hafifçe karıştırın. Daha sonra, ortamı hücrelerden aspire ettikten sonra, virüs karışımını yavaşça damla damla ekleyin.

Hücreleri 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile inkübe edin. Bir saatlik bir süre boyunca her 15 dakikada bir, hücreleri virüsle kaplamak için plakaları steril başlığın altında dikkatlice çalkalayın. Az miktarda besiyeri kullanmak virüsün hücrelerle temasını kolaylaştırır.

İnkübasyondan sonra, toplam iki mililitre hacim elde etmek için her plakaya 1.6 mililitre alfa MEM eksi pipetleyin. Ardından, hücreleri iki saat daha inkübe etmeden önce iki milimolar timidin ekleyerek hücre senkronizasyonunu başlatın. Bu arada, bir mikrotüpe 139 mikrolitre steril su, 50 mikrolitre bir molar kalsiyum klorür ve 11 mikrolitre 20 mikromolar siRNA ekleyerek siRNA transfeksiyon karışımını hazırlayın.

siRNA gerekmiyorsa, boş bir transfeksiyon gerçekleştirmek için siRNA miktarını steril su ile değiştirin. HBSS2X çözeltisini kalsiyum klorür siRNA karışımına yavaşça damlatın. 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak hava enjeksiyonu ile iki kez hafifçe karıştırın.

Daha küçük çökeltiler daha iyi transfeksiyon verimliliği ile sonuçlanır. Daha sonra karışımı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, her bir plakaya yavaşça 200 mikrolitre damla damla ekleyin ve karıştırmak için çalkalayın.

Plakaları 37 santigrat derecede,% 5 karbondioksitte 16 saat inkübe edin. Ertesi gün, bulaşıkları inkübatörden çıkarın ve bir doku kültürü başlığına taşıyın. Hücreleri iki mililitre ılık hipis ile iki kez duruladıktan sonra, inkübatöre geri dönmeden önce iki mililitre alfa MEM eksi ekleyin.

Yedi saat sonra, inkübatöre geri koymadan önce plakalara iki milimolar timidin ekleyin. Sıcaklık değişimleri hücre döngüsünün uzunluğunu etkilediğinden, bir seferde en fazla dört hücre plakasıyla çalışın. Ertesi gün, siRNA transfeksiyonu ve virüs enfeksiyonundan 48 saat sonra, hücreleri iki mililitre ılık PBS ile iki kez durulayın, ardından canlı hücre görüntüleme için fenol kırmızısı içermeyen iki mililitre alfa MEM ekleyin.

Yedi saat kuluçkaya yatırın. Nemlendirilmiş% 5 karbondioksit termo ayarlı oda ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskopla mitotik hücreler üzerinde kısa süreli canlı hücre görüntüleme deneyleri yapın. Satın almadan önce, odanın 37 santigrat derece uygun sıcaklığa ulaştığını doğrulayın.

Ortamın uygun şekilde dengelenmesini sağlamak ve sıcaklık değişimlerinden dolayı odak kaymasını önlemek için kültürlü kapları alımdan bir saat önce mikroskop odasına yerleştirin. Hücrelerin mitotik durumunu inceleyin. Bu noktada.

Hücrelerin %10 ila 15'i mitozun erken evrelerinde olmalıdır. Dengeleme süresi boyunca, önceki deneylerde belirlendiği gibi edinme parametrelerini ayarlayın. Foto ağartma olmadan uygun çözünürlüğü elde etmek önemlidir.

Bu hücre hasarına neden olur ve mitotik ilerlemeyi bozar. Alım aralığını aşmadan analiz etmek üzere önemli sayıda hücre elde etmek için koşul başına mitotik girişte olan hücreleri içeren birkaç alan seçin. Tüm alanlar seçildikten sonra, odağı sıfırlayın ve alıma mümkün olan en kısa sürede başlayın.

Dönen bir disk kullanmak sistemi odaklayabilir. Tipik bir kurulum dört farklı koşul içerecektir. Plaka başına yedi alan.

Ve 75 dakikalık bir süre boyunca 1,5 ila iki dakikalık aralıklarla iki renkli kanal. Kullanılan floresan belirteçlere bağlı olacak hücrelerdeki mitotik feno tiplerini analiz etmek için iyi tanımlanmış kriterler belirleyin. Solda görüldüğü gibi BAG3 GFP, plazmik DNA'nın transfeksiyonunun aksine, burada sağda gösterilen reyetkin adenovirüslerle adenofeksiyon, BAG3 GFP'nin daha homojen ve verimli bir ekspresyonunu sağlar.

Hücre popülasyonunun çoğunluğunda düşük enfeksiyon çokluğunda. Bu temsili western blot, BAG3'e özgü siRNA'lar ve rekompotent adenovirüs BAG3 GFP ile adenofeksiyonun, endojen BAG3'ün verimli bir şekilde tükenmesine ve BAG3 GFP proteininin yakın endojen seviyelerde yeniden sokulmasına izin verdiğini göstermektedir. Burada gösterildiği gibi, adenofeksiyon protein homeostazını koruyabilir, çünkü adenofekte edilmiş HeLa hücrelerinde strese bağlı ısı şoku proteinlerinin seviyelerinde saptanabilir bir artış yoktur.

Proteotoksik stres indükleyicisi MG132 ile tedavi edilen HeLa hücrelerinin aksine. Burada, hücrelerin mitoz yoluyla ilerlemesinin, kontrol siRNA'sı ve BacMam GFP alfa Tubulin ile adenefekte edilmiş HeLa hücrelerinden elde edilen bu konfokal zaman atlamalı görüntülerde gösterildiği gibi, adenofeksiyon tarafından önemli ölçüde bozulmadığını görüyoruz. ve BacMam FRP aktin.

Grafik, anormal mitozlu hücrelerin oranını gösterir. Tek başına BAG3'e özgü siRNA ile adenefekte edilen hücreler, mitotik kusurların seviyesinde yaklaşık iki kat artış sergiledi. Kırmızı çubukla gösterildiği gibi.

Bu, siyah çubukla gösterilen BAG3 GFP'nin yeniden eklenmesiyle kontrol hücresi seviyesine yakın bir seviyeye geri yüklendi. Bu videoyu izledikten sonra, adenofeksiyon kullanarak tükenme kurtarma deneylerinin nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu yöntem, çoklu hücresel arka planda yapı fonksiyon analizi için hipomorfik yıkıntılar oluşturmak için hızlı ve basit bir sistem sağlar.

Bu yöntemi takiben, belirli bir fonksiyon için ilgilenilen protein üzerindeki temel yapısal gereksinimler tanımlanabilir. Genom düzenlemenin diğer yaklaşımları daha sonra ilgili mekaniği derinleştirmek için kullanılabilir.