Name: HIV-1 ile infekte Canlı İlköğretim İnsan Makrofagların Ölçülen fagosom Göç ve Hız (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Keşfedin HIV-1 ile enfekte insan makrofajlarında fagozom hızını ölçme yöntemini. Döner disk konfokal mikroskopi ve manuel izleme kullanarak canlı hücrelerde fagozom dinamiklerini analiz edin. Bu protokol viral enfeksiyon sırasında hücresel hareketleri anlamak için değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Makaleyi okuduğu için Dr. Jamil Jubrail'e teşekkür ederiz. Bu çalışma, CNRS, Inserm, Université Paris Descartes, Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ20130326518 GLB için doktora bursu dahil) ve Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales (ANRS, CD için doktora sonrası burs dahil) tarafından FN'ye verilen hibelerle desteklenmiştir. A. Dumas, Université Paris Descartes ve Sidaction'dan doktora bursları ile desteklenmiştir.

protokol, ulusal ve uluslararası mevzuata ve yerel yönetmeliklere tam uyum içinde yapılmalıdır. araştırma amaçlı kan bağışı için rızalarını verdi sağlıklı donörlerden kan Kurumları anlaşma imzaladı hangi ile Kan Transfüzyon Merkezleri elde edilmiştir. İnsan kanı kullanılması özel bir koruma alınmalıdır. HIV-1 ile yapılan deneyler 3 veya 2 (BSL-3 veya 2) laboratuvar, yerel mevzuata uygun bir biyogüvenlik seviyesinde yapılmalıdır. Yapışma yoğunluk gradyan santrifüjü ve seçim İnsan monosit türevli makrofajlar (hMDMs) hazırlanması 1. <ol><li> Sağlıklı vericilerden (9 mi) taze kan başla. 70 ml&#39;lik bir son hacim elde etmek için Ca + 2 ve Mg + 2 olmaksızın, steril 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile taze kan tüm hacmi seyreltilir ve hafifçe iki 50 ml konik tüp içine seyreltilmiş kan eklemek (tüp başına 35 mi) bir 15 ml üstündekieutral, yüksek her bir tüp içinde daha önce çözelti içinde, yüksek kütle, hidrofilik polisakarit dallanmış. </li><li> fren olmaksızın 20 ° C de 20 dakika boyunca 537 x g&#39;de santrifüje kan her iki tüp. Daha sonra ara yüzeyde parçalı hücre halkasında bulunan periferal kan mononükleer hücreleri (PBMC&#39;ler) toplamak ve Ca + 2 ve Mg + 2 olmadan 1x 15 ml PBS içeren yeni bir 50 mL tüp içine transfer edin. </li><li> Santrifüj 20 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 218 x g&#39;de hücreleri Ca + 2 ve Mg olmayan 1x PBS 45 ml pelet 2+. </li><li> Santrifüj 20 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 218 xg&#39;de hücreleri, Ca + 2 ve Mg + 2 olmadan 1x PBS, 10 ml pelet tekrar süspansiyon ve Tripan Mavisi 1/200 nihai seyreltme seyreltilerek hücreleri sayın. </li><li> 20 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 218 x g&#39;de hücreleri santrifüj ve 1640 ortamında 2 mM L-glutamin ve 100 ug / ml Penic ile desteklenmiş RPMI (Roswell Park Memorial Institute) peletillin-streptomisin, 6 gözlü bir plakanın her bir gözünde ortam 2 ml oyuk başına 7 x 10 6 PBMC&#39;ler için. </li><li> 2 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de inkübe edin. 2 saat sonra monositler plastik yapışmış olur. </li><li> Taze izole edilmiş monositlerin, hMDMs içine ayırt orta aspire ile takviye edilmiş 2 ml hMDM ortamı (RPMI 1640, fetal buzağı serumu (FCS decomplemented% 10), 2 mM L-glutamin ve% 1 penisilin-streptomisin) ile değiştirmek için izin vermek için rekombinant insan makrofaj koloni uyarıcı faktör, 10 ng / ml&#39;lik bir son konsantrasyonda (RHM-CSF) vardır. </li><li> 11 gün sonra (Şekil 1),% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de inkübe hücreleri. </li><li> 11. günde de orta kaldırmak ve oyuk başına soğuk hMDM ortam, 2 ml ile 2 kez yıkanır. Sonraki soğuk 1 x PBS, 1 ml her bir çukura 2 kez yıkayın. </li><li> (2 mM ethylenediaminetetraacetatic asit ile, soğuk 1 x PBS, 1 ml her bir 1 kez yıkama, tam olarak farklılaşmış hMDMs ayırmak içinEDTA) ve 4 ° C&#39;de 15-60 dakika boyunca oyuk başına 2 mM EDTA, soğuk 1 x PBS, 2 ml hücreleri inkübe edin. NOT: Hücreler var ayırmak için alternatif yöntemleri (örneğin, tripsin veya tripsin benzeri faaliyetler) iyi sonuçlar 11 verebilir. </li><li> (Yukarı ve aşağı kuyuda hafifçe pipetleme tamamlandı) ayrıldıktan sonra, hücreleri toplamak ve soğuk hMDM orta 10 ml içeren buz üzerinde bir 50 ml tüp koyun. </li><li> Santrifüj 20 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 218 x g&#39;de hücreler soğuk hMDM ortamı 10 ml pelet tekrar süspansiyon ve Tripan Mavisi 1/20 seyreltilerek hücreleri sayın. </li><li> 35 mm mikroskopi dereceli cam alt tabak başına 1 x 10 6 hMDMs hücreleri tohum ve 1 gün için% 5 CO2 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol> HIV-1 viral Hisse Senedi 2. Üretim ve Niceleme Not: NLR4.3 HIV-1 Gag-iGFP (yeşil floresan protein) M. SCHINDL bir R5-tropik zarf, hediye taşıyanER 10 makrofajlan enfekte etmek ve gerçek zamanlı olarak enfekte olan hücreleri görmek için kullanılmaktadır. <ol><li> Ticari bir transfeksiyon reaktifi kullanılarak karşılık gelen proviral DNA 6 ug insan embriyonik böbrek 293T hücreleri (2 x 10 6, 100 mm çanak) transfeksiyonu ile viral stoklar üretir. </li><li> hücreler ve sayılmasına yönelik bir beta-galaktosidaz renk ardından viral stoklar seri dilüsyonları kullanılarak (HIV-1 LTR kontrolü altında beta-galaktosidaz genini taşıyan) HeLa tzm-BL göstergesi hücreleri kullanılarak virüs stoklarının enfeksiyon niceliğini mavi hücreler 12. </li></ol> HIV-1 ile hMDMs 3. Enfeksiyon <ol><li> hMDMs (1.13 kaplanmıştır hücreler) enfeksiyon (MOI) bir çokluğunda hMDM ortamının 0.02-0.03 1 ml virüs ekleyin. Kuyular hMDM ortamının sadece 1 ml ilave kontrol ve 2 gün (Şekil 1),% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de yemekler kuluçkalanması. </li><li> günde 2 hMDM Med hücreleri yıkayın3 kez amonyum ve tabak başına taze hMDM ortamının 1 ml. 6 gün (Şekil 1),% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de inkübe hücreleri. </li></ol> Koyu kırmızı kan hücrelerine 4. Opsonizasyon <ol><li> Tabak başına 7 x 10 6 SRBClere hazırlanması için, 4 dakika boyunca 600 x g&#39;de santrifüj ile 1x PBS içinde% 0.1 Sığır Serum Albumin (BSA) ihtiva eden çözeltinin 100 ul SRBClere iki kez yıkayın. </li><li> SRBClere 5 ul başına alt aglütinasyon konsantrasyonda tavşan IgG, anti-SRBClere PBS / BSA% 0.1 1 x 500 ul yıkandı SRBClere yeniden süspanse edin ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında dönme ile inkübe edilir. Not: anti-SRBC&#39;ler IgG alt aglütinasyon konsantrasyonunu belirlemek 96 oyuklu bir plaka içerisinde 20 ul 1 / 25.600 1/50 arasında (13.1 mg / ml stok konsantrasyonunda) IgG seri dilüsyonları hazırlanması. Her oyuktaki 20 ul 2 x 10 6 SRBClere ekleyin ve birkaç saat boyunca, karanlık bir odada tabak koydu. alt aglütinasyon konsantrasyonudurhemen önce iyice aglütinasyon (IgG + SRBC&#39;ler bir ağ oluşturan) ile kuyu seyreltme. </li><li> Dönme sonra 4 dakika boyunca 600 x g&#39;de IgG opsonize-SRBClere santrifüj ve 4 dakika için 600 x g&#39;de santrifüj ile 1X PBS / BSA% 0.1, 100 ul ile yıkayın. </li><li> 2 mM L-glutamin ve% 1 penisilin-streptomisin (1 ml / kutu) ile desteklenmiş önceden ısıtılmış fenol kırmızısız RPMI ortamında IgG opsonize-SRBClere yeniden süspanse edin. </li></ol> 5. Canlı Hücre video Mikroskopi Fagositoz Assay <ol><li> Bu CO2 nemlendirme su ile bir şişe içinden geçen 37 ° C&#39;de bir ısıtma odası ile donatılmış bir döner disk sistemi gibi bir konfokal görüntüleme sistemi kullanın. </li><li> fagositoz testinde başlangıcından önce 37 ° C &#39;de mikroskop aşamasında için deney öncesinde ısıtma odasına açın. mikroskop ve bilgisayarı açın ve görüntüleme yazılımı yükleyin. </li><li> Böyle tarama hızı, Magnificat gibi görüntüleme ayarlarını optimizeiyon, çözünürlük, vs 60 ila 120 dakika arasında her dakika sahada başına ve görüntü tek bir karede en az bir hücre var. NOT: Burada, örnek 63X lens ile 60 dakika boyunca bir kare her dakika görüntülü. </li><li> Mikroskop sahnede görüntüleme çanak yerleştirin. Odağı ayarlamak ve konum alanına sadece bir bütün HIV-1 ile enfekte makrofaj bulmak için. kullanılan görüntüleme sistemi ve prob göre uygun uyarma / emisyon ayarlarını kullanın. Fagozomların gözlemlemek için parlak bir alan (BF) kanalı ekleyin (Şekil 1ii). iletilen ışık ve maruz kalma süresi yüzdesini ayarlayarak farklı kanal görüntülerin görünümünü optimize edin. NOT: Burada, NLR4.3 HIV-1 Gag-iGFP lazer% 20 (Şekil 1i) ile zaman maruz kalma 50 ms ile 491 nm lazer kullanarak heyecanlıydı. </li><li> Görüntüleme tabağı çıkarın ve çanağın 7 x 10 6 SRBC&#39;ler / ml (Şekil 1) SRBC süspansiyonu 1 ml. </li><li> 500 xg&#39;de santrifüjOda sıcaklığında 2 dakika, fagositozu senkronize bu santrifüj sonunda zamanını kaydetmek ve sahneye çanak dönün. </li><li> en az 1 saat süreyle her dakika - (genellikle 20 uçakları 0.3 mikron adım mesafe ile hücre kalınlığı boyunca) Z-yığınlarının içinde odaklama ve çekim GFP ve BF görüntüleri optimize. kullanılan görüntüleme sisteminin yerel dosya formatında zaman atlamalı video kaydetmek. NOT: Burada, zaman atlamalı filmleri yerli formatında kaydedilen, * .stk dosyaları. </li></ol> Time-lapse Filmler 6. Analizi <ol><li> video düzenleme için, menü &quot;Uygulamalar&quot; aşağı ve video düzenleme yazılımı sekmesi &quot;Değerlendirme Çok Boyutlu Veriler&quot; konulu damla tıklayın. <ol><li> Dosyayı açmak için, ardından &quot;Dizin Seç&quot; &quot;Select Bankası Dosyası&quot; üzerine tıklayın. &quot;Veri setleri&quot; kutusuna, (Kara Delikler formatında) analiz ve &quot;Görünüm&quot; tıklayın edinimi seçin. veri sütunu An zamanla bir tablo temsil edilmektedirdoğrultusunda d Z-planı. </li><li> Z-projeksiyon (Şekil 2, sol panel) enfeksiyonu temsil etmek, &quot;Dalgaboyları&quot; kutusuna 491 nm dalga boyu seçmek ve &quot;tüm uçakları&quot; ile &quot;Z projeksiyon&quot; sekmesine tıklayın. </li><li> (Bir zaman dizisini analiz &quot;Dalgaboyları&quot; kutusuna BF dalga boyunu seçin ve dış SRBClere (Şekil 2, kırmızı ok ucu), iç SRBC&#39;ler (Şekil 2, kırmızı daire) ve çekirdeği ayırt etmek için Z-ekseni üzerinde optimum düzlemi seçmek için Şekil 2, mavi daire). </li><li> video montajı kaydetmek için, &quot;Seçim [X]&quot; sekmesini ve ardından &quot;Load Image (lar)&quot; üzerine tıklayın. Son olarak, .tif formatta yüklü görüntüleri kaydetmek ve ImageJ yazılım sonraki açın. </li></ol></li><li> Çekirdeğin konumunu ve BF kanalda gözlenen farklı fagozomların (Şekil 3) ölçmek için ImageJ yazılım üzerinde eklenti &quot;Manuel İzleme&quot; kullanın. <ol><li> DowImageJ sitesinde &quot;Manuel İzleme&quot; eklentisi nload. ImageJ üzerinde (Şekil 3, aşama 1 ve 2) eklentisi ve görüntü dizisi analiz edilecek açın. </li><li> Böyle komşu kareler arasındaki süreyi temsil eden &quot;Zaman Aralığı&quot;, ve piksel başına mesafeyi temsil eden &quot;x / y kalibrasyon&quot; (Şekil 3, adım 3) gibi ayarları girin. NOT: 63X zoom ve 6.45 x 6.45 mikron 2 piksel boyutunda bir kamera kullanıldığı için Burada, her kare ve 0.205 mikron x / y kalibrasyon arasında 1 dakikalık bir zaman aralığı ile görüntü dizisi kaydedin. </li><li> Izleme başlatmak için, (Şekil 3, adım 4) &quot;Add track&quot; üzerine tıklayın ve içselleştirildiği zaman ilk kez bir SRBC merkezinde tıklayın. Bir sonraki kare otomatik olarak görüntülenir. </li><li> Süre içinde farklı pozisyonlarda (Şekil 3, kırmızı kutu içinde adım 6) sahip tüm karelerde SRBC merkeze tıklayın devam edin. <ol><li> kendi merkezinde tıklayarak bütün karelerde konumunu var çekirdeği izlemek için başlayın. Sonraki zaman SRBClere fonksiyonu farklı onların içselleştirme (kare), en tek tek (kendi merkezine tıklayarak) fagozomların izleyebilirsiniz. Kolaylık BF kanalda SRBC görmek için, izleme (Şekil 3, adım 5) sırasında &quot;Parlaklık ve kontrast&quot; penceresini kullanın. </li></ol></li><li> Her SRBC izleme arasında, yeni bir parça var (Şekil 3, adım 4) &quot;Add track&quot; üzerine tıklayın. Izleme sayısı ikinci sütunda değişmiş olacak, sonuç tablonun &quot;Parça n °&quot; (Şekil 3, adım 6). </li><li> Analizin bir sonraki adıma devam etmek için bir e-tablodaki verileri kaydetmek. </li></ol></li><li> (Çekirdek ve SRBClere içselleştirilmesi sonra ilk 5 dakika boyunca fagozomların hızı doğru SRBClere içeren fagozomların bir seyahat mesafe hesaplamak için Fi tablo yazılımını kullanınşekil 4). <ol><li> tablo tablo ve yeni bir tablo dosyasını açın. Bu yeni Aşağıdaki parametreler sadece dosyaya, zaman, x-içine aktarın ve çekirdek ve tüm SRBClere (Şekil 4A) koordinatı y. </li><li> Sadece kendi koordinatlar ile SRBClere ve çekirdek arasındaki mesafeyi hesaplamak XY koordinat düzleminde (Şekil 4B) çekirdeği ve SRBC dikkate alın. Not: iki nokta arasındaki mesafe onları bağlayan yolun uzunluğudur. düzlemde, SRBC ve çekirdek arasındaki mesafe Pisagor teoremi ile verilir. <ol><li> C (nukleus ve SRBC arasındaki mesafe) hipotenüs ve a uzunluğunu gösterir b diğer iki tarafın uzunluklarını göstermek durumunda, Pisagor denklemi olarak Pisagor teoremini ifade: <img alt="denklem 1" src="/files/ftp_upload/54568/54568eq1.jpg" /> Not: Aynı zamanda, Ortonormal üzerinde yatay mesafe(x çekirdeği -x SRBC) ve dikey mesafe b (SRBC -y y çekirdeği) &#39;dir. </li><li> Böylece, çekirdek ve SRBC (Şekil 4A, mor kutu) ile arasındaki mesafeyi hesaplamak: <img alt="denklem 2" src="/files/ftp_upload/54568/54568eq2.jpg" /> NOT: mikron mesafe olması x / y kalibrasyon (piksel) elde mesafe değeri çarpın. Burada, x / y kalibrasyon 0.205 mm. </li><li> Her zaman, çekirdek ve başlangıç ​​mesafesi (Şekil 4C) için SRBC arasındaki mesafeyi çıkarın. </li><li> İlk 5 dakika için zamana karşı ölçüm çizilir. Arsa doğrusal eğilim çizgisi (Şekil 5A) uygulayın ve SRBC içselleştirme sonra ilk 5 dakika boyunca çekirdeğin doğru fagosom hızını temsil doğrusal trend çizgisinin eğimini belirler. </li><li> ortalama ve istatistiki hatayı hesaplamak için veri harmanlamakhız değerleri uygun yazılımı (Şekil 5B) kullanılarak uygun bir biçimde bunları çizmek ve. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Niedergang, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNiedergang%2C+F+%22Encyclopedia+of+Cell+Biology%22">Encyclopedia of Cell Biology</a>. 2, Academic Press. Waltham, MA. 751-757 (2016).</li>
<li>Blocker, A., Griffiths, G., Olivo, J. C., Hyman, A. A., Severin, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+microtubule+dynamics+in+phagosome+movement%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A role for microtubule dynamics in phagosome movement.</a> J Cell Sci. 111 (Pt 3), 303-312 (1998).</li>
<li>Blocker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+requirements+for+bi-directional+movement+of+phagosomes+along+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular requirements for bi-directional movement of phagosomes along microtubules.</a> J Cell Biol. 137, 113-129 (1997).</li>
<li>Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+mechanisms+of+phagocytes+and+bacterial+evasion+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies.</a> Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).</li>
<li>Feasey, N. A., Dougan, G., Kingsley, R. A., Heyderman, R. S., Gordon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+non-typhoidal+salmonella+disease%3A+an+emerging+and+neglected+tropical+disease+in+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Invasive non-typhoidal salmonella disease: an emerging and neglected tropical disease in Africa.</a> Lancet. 379, 2489-2499 (2012).</li>
<li>Mazzolini, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+phagocytosis+in+HIV-1-infected+macrophages+relies+on+Nef-dependent+alteration+of+focal+delivery+of+recycling+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Inhibition of phagocytosis in HIV-1-infected macrophages relies on Nef-dependent alteration of focal delivery of recycling compartments.</a> Blood. 115, 4226-4236 (2010).</li>
<li>Dumas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+protein+Vpr+impairs+phagosome+maturation+by+controlling+microtubule-dependent+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 protein Vpr impairs phagosome maturation by controlling microtubule-dependent trafficking.</a> J Cell Biol. 211, 359-372 (2015).</li>
<li>Greenberg, S., el Khoury, J., Kaplan, E., Silverstein, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+technique+to+distinguish+attached+from+ingested+erythrocytes+and+zymosan+particles+in+phagocytosing+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A fluorescence technique to distinguish attached from ingested erythrocytes and zymosan particles in phagocytosing macrophages.</a> J. Immunol. Methods. 139, 115-122 (1991).</li>
<li>Koppensteiner, H., Banning, C., Schneider, C., Hohenberg, H., Schindler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+internal+HIV-1+is+protected+from+neutralizing+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Macrophage internal HIV-1 is protected from neutralizing antibodies.</a> J Virol. 86, 2826-2836 (2012).</li>
<li>Gartner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+and+HIV%3A+basic+concepts+and+methodologies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies.</a> Methods Mol Biol. 1087, 207-220 (2014).</li>
<li>Wei, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+resistant+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+patients+receiving+fusion+inhibitor+%28T-20%29+monotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Emergence of resistant human immunodeficiency virus type 1 in patients receiving fusion inhibitor (T-20) monotherapy.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46, 1896-1905 (2002).</li>
<li>Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosomes+fuse+with+late+endosomes+and%2For+lysosomes+by+extension+of+membrane+protrusions+along+microtubules%3A+role+of+Rab7+and+RILP%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagosomes fuse with late endosomes and/or lysosomes by extension of membrane protrusions along microtubules: role of Rab7 and RILP.</a> Mol Cell Biol. 23, 6494-6506 (2003).</li>
<li>Toyohara, A., Inaba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+phagosomes+in+mouse+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Transport of phagosomes in mouse peritoneal macrophages.</a> J Cell Sci. 94 (Pt 1), 143-153 (1989).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu teknik pek çok kritik adımlar vardır. enfeksiyon yüzdesi donör bağımlı olduğundan İlk olarak, HİV-1 ile hMDMs hazırlanması ve enfeksiyon önemlidir. Potansiyel in vivo virüs tarafından karşılaşılan makrofajlar durumu iyi şimdiye kadar karakterize edilmemiştir, çünkü notun, biz, enfeksiyon öncesinde in vitro polarize olmayan makrofajlar kullanmaya karar verdik. Bu makrofajlar de M1 veya M2 olduğunu gösteren çok sayıda yüzey markerlerinin ifadesiyle kontrol ve CD4 ve CCR5 ifade sunmaktadır. enfeksiyon ...

Makrofajlar doğuştan gelen bağışıklık sisteminde ve homeostazda önemli bir rol oynar. Fagositoz 1,2 adı verilen bir işlemle patojenleri ve kalıntıları içselleştiren ve ortadan kaldıran profesyonel fagositlerdir. Parçacıklı materyalin yutulmasından sonra oluşan kapalı bölme olan fagozom, endositik bölmelerle bir dizi füzyon ve fisyon olayına uğrar ve bu da fagolizozom adı verilen parçalayıcı bir bölmeye yol açar. Bu bölme, proton pompalayan v-ATPazların edinilmesi nedeniyle asidik bir pH'a sahiptir, hidrolitik enzimler içerir ve lizozomal ilişkili zar proteinleri (LAMP'ler) bakımından zenginleştirilmiştir. Fagozomların olgunlaşmasına, lizozomların biriktiği perinükleer bir konuma ulaşmak için hücre merkezine doğru 3,4 mikrotübüller üzerindeki göçleri eşlik eder.
Birçok patojenin, bulundukları vakuolar ortamı değiştiren hücre içi yaşam tarzlarına sahip bakteriler de dahil olmak üzere fagozom olgunlaşmasını kaçırdığı bildirilmiştir 5. İnsan İmmün Yetmezlik Virüsü (HIV)-1, T hücrelerine ek olarak makrofajları da hedef alır. Makrofajlar, T hücrelerinden farklı olarak virüsün sitopatik etkilerine karşı dirençli olduklarından, virüs için bir rezervuar olarak düşünülebilirler. Ek olarak, HIV-1 ile enfekte olan makrofajlar kusurlu fagositik fonksiyonlar gösterir ve fırsatçı hastalıkların ortaya çıkmasına katkıda bulunur. Özellikle, Salmonella Typhimurium ST313'ün neden olduğu şiddetli invaziv tifo dışı Salmonella hastalığı, HIV 6 ile enfekte olmuş Sahra altı Afrikalı çocuklarda veya yetişkinlerde son otuz yıldır yaygındır. HIV ile yaşayan kişilerde tüberküloz gelişme riskinin, HIV enfeksiyonu olmayanlara göre 20 kat daha fazla olduğu tahmin edilmektedir. 
Tüm bu nedenlerden dolayı, HIV ile enfekte makrofajlardaki fagositik defektlerin altında yatan moleküler mekanizmaların daha iyi tanımlanması önemlidir. HIV ile enfekte makrofajlarda partikül materyal, opsonize partiküller, bakteri veya mantarların alımının inhibe edildiğini gösterdik 7. Bu inhibisyonun kısmi olduğu göz önüne alındığında, daha sonra HIV ile enfekte olmuş insan makrofajlarındaki içselleştirilmiş fagozomların kaderini analiz etmeye başladık 8. Fagozom olgunlaşması, hücre merkezine göç ve lizozomlarla füzyon ile sıkı bir şekilde bağlantılı olduğundan, fagozomal olgunlaşmadaki bir kusur, enfekte hücredeki kaçakçılık modalitelerinin modifikasyonlarına bağlı olabilir. Burada tarif edilen yöntem, reseptör aracılı fagositozu ve özellikle immünoglobulinlerin (FcR) Fc kısmı için reseptörleri hedeflemek için bir model olarak IgG-opsonized Koyun Kırmızı Kan Hücrelerini (IgG-SRBC'ler) kullanır. Bu parçacıkların parlak alanda (BF) görüntülenmesi lateks boncuklara göre daha kolaydır, çünkü hücre dışı ve hücre içi SRBC'ler farklı kırılma özellikleri gösterir 9. HIV ile enfekte makrofajlarda çekirdeğe doğru hareket eden fagozomların hızını ölçmek için bir floresan virüs 10 kullandık ve burada açıklanan basit bir manuel izleme yöntemi oluşturduk. Yöntem gelişmiş programlama gerektirmez ve sadece ImageJ'yi kullanır. Parlak alan mikroskobu veya floresan görüntüleme ile görüntülenebilen yapışık hücrelere ve her türlü parçacık veya patojene uygundur.

<table><tbody><tr><td>Falcon 100 mm TC ile İşlenmiş Hücre Kültürü Kabı</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>Viral üretim için</td></tr><tr><td>Cam Alt Tabaklar 35 mm kaplamasız 1.5</td><td>MatTek şirketi</td><td>P35G-1.5-14-C Satın</td><td>alma çantası</td></tr><tr><td>Falcon Doku Kültürü Plakaları 6 kuyulu</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Corning. Inc. 353934</td><td>İnsan monosit türevi makrofajlar için</td></tr><tr><td>Ficoll-Plaque PLUS</td><td>Dominique Dutscher</td><td>17-1440-03</td><td>yoğunluk santrifüjleme için çözelti içinde nötr, çok dallı, yüksek kütleli, hidrofilik polisakkarit</td></tr><tr><td>DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yok</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>14190-094</td><td>RT</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) 1x, sıvı (Yüksek Glikoz)</td><td>GIBCO, Moleküler problar</td><td>31966-021</td><td>4 °C'de korunmuştur; C ; HEK hücre kültürü için</td></tr><tr><td>RPMI 1640 orta GLUTAMAX&nbsp; Takviye</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>61870-010</td><td>4 °C'de korunmuştur; C; hMDM'lerin kültürü</td></tr><tr><td>için F&oelig; tal Baldır Serumu (FCS)&nbsp;</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVF0001</td><td>-20 °C'de korunmuştur; C ; dekomplene</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U / ml)</td> <td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15140-122</td><td>-20 °C'de korunmuştur; C ; hMDM kültürü için</td></tr><tr><td>RPMI 1640 orta, fenol kırmızısı yok (10x 500 ml)</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>11835-105</td><td>37 °C sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu; fagositoz testi için</td></tr><tr><td>FuGENE6 Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>4 ° C'de korunmuştur; C ; viral üretim için</td></tr><tr><td>Koyun kırmızı kan hücreleri (SRBC'ler)</td><td>Eurobio</td><td>DSGMTN00-0Q</td><td>4 °C'de Alsever tamponunda korunur; Kullanmadan önce C</td></tr><tr><td>Anti-koyun kırmızı kan hücreleri IgG</td><td>MP Biyomedikaller</td><td>55806</td><td>4 ° C'de korunur; C</td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin ısı şoku fraksiyonu, pH 7, &ge; %98 ve nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>-20 ° C'de korunmuştur; C</td></tr><tr><td>Ters mikroskop DMI600</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokal İplik Disk Ünitesi&nbsp; CSU-X1M1</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>491 nm 50 mW lazer</td><td>COBOLT CALYPSO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCX PL APO CS Objectif</td><td>Leica</td><td></td><td>Objektif lens ; Büyütme 100X ; Sayısal açıklık 1.40 ; Daldırma yağı</td></tr><tr><td>CoolSnap HQ2 (FireWire) Kamera</td><td>Fotometrisi</td><td></td><td>Piksel boyutu 6.45 ve mikro; m x 6,45 ve mikro; m ; Tanım 1,392 x 1,040 ; Görüntünün 14 Bit</td></tr><tr><td>Metamorph 7.7.5 yazılımında</td> kodlanması <td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td>Mikroskobun kontrolü için</td></tr><tr><td>GraphPad Prism yazılımı</td><td></td><td></td><td>İstatistik analizi için</td></tr></tbody></table>

hiv-1 ile infekte canlı İlköğretim İnsan makrofagların Ölçülen fagosom göç ve hız

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Makrofajlar, doğuştan gelen ve özgül bağışıklık arasındaki kavşakta önemli bir rol oynayan fagositik hücrelerdir. İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV)-1 ile enfekte olabilirler ve sitopatik etkilerine karşı dirençleri nedeniyle kalıcı viral rezervuarlar olarak kabul edilebilirler. Ek olarak, HIV ile enfekte makrofajlar, fırsatçı hastalıkların gelişmesine katkıda bulunan kusurlu işlevler sergiler.
HIV-1'in makrofajların fagositik tepkisini bozduğu kesin mekanizma bilinmiyordu. Daha önce, HIV-1 ile enfekte olduklarında makrofajlar tarafından çeşitli partikül materyallerin alımının inhibe edildiğini göstermiştik. Bu inhibisyon sadece kısmiydi ve fagozomlar HIV ile enfekte makrofajlar içinde oluştu. Bu nedenle, bu fagozomların kaderini analiz etmeye odaklandık. Fagozom olgunlaşmasına, bu bölmelerin hücre merkezine doğru göçü eşlik eder, burada lizozomlarla birleşirler ve yutulan materyalin bozulmasından sorumlu olan fagolizozomlar üretirler. Fagositoz için hedef olarak IgG-opsonized Koyun Kırmızı Kan Hücreleri kullandık. Bireysel HIV ile enfekte makrofajlarda fagozomların merkezcil hareket hızını ölçmek için, parlak alan ve floresan konfokal mikroskopinin bir kombinasyonunu kullandık. Fagozomların çekirdeğe olan mesafesini hesaplamak ve ardından fagozomların hızını hesaplamak için bir yöntem oluşturduk. HIV ile enfekte olmuş hücreler, GFP eksprese eden bir virüs sayesinde tanımlandı, ancak yöntem enfekte olmayan hücrelere veya herhangi bir enfeksiyon veya tedaviye uygulanabilir.

HIV-1 ile enfekte edilmiş ve enfekte olmayan hMDMs ile fagositozu FcR aracılı modeli hedefleri olarak IgG opsonize SRBClere (Şekil 1) kullanılarak burada tarif edilmektedir. Bu protokol kritik adım hMDMs hazırlanması ve HIV-1 enfeksiyonu bulunmaktadır. Gerçekten de, farklı makrofaj verim ve kalite donörler arasında değişir, ve% 10-40 aralığında verimliliği ile enfeksiyon oranı. Buna ek olarak, IgG-opsonize-SRBClere hazırlanması Bu, tanıma neden ve artık olarak yerine FcR...

İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) tip 1 ile veya bu virüs olmadan enfekte olmuş canlı hücrelerde hücre merkezine doğru hareket eden fagozomların hızını, floresan enfekte hücreleri tanımlamak için eğirme disk konfokal floresan mikroskobu ve fagozomları tespit etmek için parlak alan mikroskobu kullanarak ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz.

HIV-1 ile infekte Canlı İlköğretim İnsan Makrofagların Ölçülen fagosom Göç ve Hız

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

Bu analizin genel amacı, basit bir manuel takip yöntemi kullanarak HIV-1 enfekte makrofajlardaki fagozom hızını nicelleştirmektir. Bu protokolün avantajı, bir hücre içindeki hareket edebilen veya deforme olabilen nesne gruplarının göreceli hareketlerini hesaplamak için kolay bir yöntem sunmasıdır. Bu yöntem, GFP-pozitif enfekte makrofajlardaki fagozomların hareketi hakkında bilgi sağlar ancak floresan işaretli hücrelerdeki diğer hücre içi kompartmanlar için de kullanılabilir.Metin protokolüne uygun olarak, insan monosit kaynaklı makrofajları enfekte edip koyun kaynaklı kan hücrelerini opsonize ettikten sonra, karbon dioksit içeren ve 37 °C'ye ayarlı bir ısıtma odasına sahip döner disk mikroskobu gibi bir konfokal görüntüleme sistemi kullanarak fagositoz testi düzeneğini kurun. Deneyden önce, mikroskop tablasını 37 °C'ye ısıtmak için ısıtma odasını açın. Ardından mikroskobu ve bilgisayarı çalıştırıp görüntüleme yazılımını yükleyin.Her görüş alanında en az bir hücre bulunacak şekilde ve 60 ile 120 dakika arasında her dakika bir kare görüntüleyecek biçimde tarama hızı, büyütme, çözünürlük vb. gibi görüntüleme ayarlarını optimize edin. Görüntüleme kabını mikroskop tablasına yerleştirin

phagosome-migration-velocity-measured-live-primary-human-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu görüntülenmiştir deney canlı konfokal görüntüleme deneyleri için HIV floresan moleküler klon kullanan için bir rehber.

HIV ve Live Konfokal Mikroskop Floresan Klonlar kullanılarak HIV görselleştirme Hücre-hücre Transferi

Phagokinetic motilite parça tahlil hücre hareketi değerlendirmek için kullanılan bir yöntemdir. Özellikle, tahlil, bir nicel bir şekilde, zaman içinde chemokinesis (rastgele hücre hareketliliğinin) ölçer. Tahlil, koloidal altın kaplama lameller üzerine onların hareket ölçülebilir bir parça oluşturmak için hücrelerinin yeteneği yararlanır.

Phagokinetic Parça Motilite Testi sayesinde Hücre Göç Kantitatif Değerlendirilmesi

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

Bu video, kemik iliği kaynaklı makrofajlardaki (BMM'ler) parazitlerin hücre içi büyümesini ölçmek için bir testi göstermektedir. Makrofaj hücreleri, sırasıyla Leishmania'nın motil ve non-motil invaziv evreleri, metasiklik promastigotlar ve amastigotlar ile enfekte olur. Parazitler makrofajları istila eder, parazitoforöz bir vakuol içinde içselleşir ve içinde çoğalır. Hücre içi parazit büyümesi, makrofaj ve parazit çekirdeklerinin floresan olarak boyanması üzerine bir mikroskop kullanılarak...

Makrofajlarda Parazitin Hücre İçi Büyümesini Ölçmek için Bir İn Vitro Test

Biz canlı hücre Video mikroskopi yöntemleri...

Fungal Patojen Fagositoz Canlı hücre video Mikroskopi

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Canlı Makrofagların içinde Phagolysosome Biogenesis&#39;den Çalışması

Burada, florometrik bir yöntem kullanarak yapışık makrofaj hücre hattı ile floresan parçacıkların fagositozunu ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, partikül içselleştirmesinin yanı sıra ortaya çıkan aktin polimerizasyonunun yüksek verimli bir miktar tayinini kolaylaştırır.

Makrofaj Fagositoz ve Aktin Polimerizasyon Değerlendirme Yüksek Verimli Florimetrik Tekniği

Bütün patojenik LEISHMANIA türler bulunur ve omurgalı onların ana makrofajlar içinde çoğaltmak. Burada, fare kemik iliği türevi makrofajlar kültür ile hücre içi büyüme Kinetik kesin miktar tarafından takip LEISHMANIA, bulaştırmak için bir protokol mevcut. Ana bilgisayar-patojen etkileşim ve LEISHMANIA virülans etkileyen bireysel faktörler eğitim için yararlı bir yöntemdir.

Hızlı ve güvenilir yöntem LEISHMANIA parazit virülans değerlendirmek için hücre içi büyüme makrofajlar içinde miktar olduğunu

Burada dönen disk confocal mikroskobu görüntüsü tek fagositik olayları için fare ikamet periton makrofajlar tarafından kullanma yöntemleri açıklanmaktadır. İletişim kuralları diğer fagositik hücreler için genişletilebilir.

Fagositoz fare makrofajlar tarafından hızlandırılmış 3D görüntüleme

Leishmania enfeksiyonunda fagositoz ile ilişkili mekanizma tam olarak anlaşılamamıştır. Burada, Leishmania etkileşimi sırasında konakçı hücrelerle meydana gelen erken olayları değerlendirmek için yöntemler açıklanmaktadır.

Konfokal Mikroskopi ile Leishmania Fagositozunun İncelenmesi

Keşfedin HIV-1 ile enfekte insan makrofajlarında fagozom hızını ölçme yöntemini. Döner disk konfokal mikroskopi ve manuel izleme kullanarak canlı hücrelerde fagozom dinamiklerini analiz edin. Bu protokol viral enfeksiyon sırasında hücresel hareketleri anlamak için değerli bir araç sunar.

HIV-1 ile infekte Canlı İlköğretim İnsan Makrofagların Ölçülen fagosom Göç ve Hız

Daha fazla video keşfet