HIV-1 ile infekte Canlı İlköğretim İnsan Makrofagların Ölçülen fagosom Göç ve Hız

Bu analizin genel amacı, basit bir manuel izleme yöntemi kullanarak HIV-1 ile enfekte makrofajlarda fagozom hızını ölçmektir. Bu protokolün avantajı, hareket edebilen veya deforme olabilen bir hücre içindeki nesne gruplarının göreceli hareketlerini hesaplamak için kolay bir yöntem sağlamaktır. Bu yöntem, GFP pozitif enfekte makrofajlardaki fagozomların hareketi hakkında bilgi sağlar, ancak floresan etiketli hücrelerdeki diğer hücreler arası bölmeler için kullanılabilir.

Metin protokolüne göre, insan monositinden türetilmiş makrofajları enfekte ettikten ve koyun yetiştirilen kan hücrelerini opsonize ettikten sonra, 37 santigrat derecede bir ısıtma odası ile donatılmış, dönen disk mikroskobu gibi konfokal bir görüntüleme sistemi kullanarak bir fagositoz testi oluşturun. Deneyden önce, mikroskop aşamasını 37 santigrat dereceye ısıtmak için ısıtma odasını açın. Ardından mikroskobu ve bilgisayarı açın ve görüntüleme yazılımını yükleyin.

Tarama hızı, büyütme, çözünürlük vb. gibi görüntüleme ayarlarını, alan başına en az bir hücreye sahip olacak ve 60 ila 120 dakika arasında dakikada bir kare görüntüleyecek şekilde optimize edin. Görüntüleme kabını mikroskop tablasına yerleştirin. Alanda yalnızca bir tam HIV-1 enfekte makrofaj bulmak için odağı ve konumu ayarlayın.

Kullanılan hayal sistemine ve proba bağlı olarak uygun uyarma ve emisyon ayarlarını kullanın. Parlak bir alan kanalı ekleyin. Pozlama süresini ayarlayarak görünümünü optimize edin.

Daha sonra, görüntüleme kabını çıkarın ve tabağa mililitre başına altıncı SRBC'lerin onda yedisinde bir mililitre koyun yetiştirilmiş kan hücresi veya SRBC süspansiyonu ekleyin. Fagositozu senkronize etmek için çanağı oda sıcaklığında iki dakika boyunca 500 kez g'de santrifüjleyin, ardından santrifüjlemenin sonundaki süreyi kaydedin ve çanağı sahneye geri koyun. Odağı optimize edin ve yığının üstünü ve altını 0,3 mikrometrelik bir adım mesafesiyle ayarlayın.

Hücrenin kalınlığı boyunca GFP ve BF görüntülerinin Z yığınlarını almaya başlayın ve hızlandırılmış videoyu görüntüleme sisteminin yerel dosya biçiminde kaydedin. Video düzenlemeyi gerçekleştirmek için, video düzenleme yazılımında, açılır menüye tıklayın Uygulamalar ve sekmede Çok Boyutlu Verileri Gözden Geçir. Dosyayı açmak için Temel Dosya Seç'e ve ardından Dizin Seç'e tıklayın.

Veri Kümeleri kutusunda, analiz edilecek alımı seçin ve Görüntüle'ye tıklayın. Enfeksiyonu bir Z projeksiyonunda temsil etmek için, Dalga Boyları kutusunda 491 nanometre dalga boyunu seçin ve tüm düzlemleri içeren Z projeksiyonu sekmesine tıklayın. Ardından, bir zaman dizisini analiz etmek için, Dalga Boyları kutusunda BF dalga boyunu seçin ve dış SRBC'leri, iç SRBC'leri ve çekirdeği ayırt etmek için Z ekseninde en uygun düzlemi seçin.

Seçim Xs sekmesine ve ardından Görüntüleri Yükle'ye tıklayarak video montajlarını kaydedin. Son olarak, yüklenen görüntüleri tif formatında kaydedin. Image J manuel izleme eklentisini indirdikten sonra, eklentiyi Image J'de açın, ardından analiz edilecek görüntü dizisini açın.

Bitişik kareler arasındaki süreyi temsil eden zaman aralığı ve piksel başına mesafeyi temsil eden XY kalibrasyonu gibi ayarları girin. İzlemeyi başlatmak için Parça Ekle'ye tıklayın ve içselleştirildiğinde ilk kez bir SRBC merkezine tıklayın. Sonraki kare otomatik olarak görünür.

Kolaylık sağlamak için, BF kanalında SRBC'leri görmek için izleme sırasında parlaklık ve kontrast penceresini kullanın. Zaman içinde farklı konumlara sahip olmak için tüm çerçevelerde SRBC merkezine tıklamaya devam edin. Her SRBC izlemesi arasında, yeni bir parça başlatmak için İzlemeyi Sonlandır'a ve ardından İzleme Ekle'ye tıklayın.

Takip numarası, sonuçlar tablosunun ikinci sütununda değişecektir. Daha önce yapıldığı gibi merkezine tıklayarak tüm çerçevelerdeki konumunu elde etmek için çekirdeği izlemeye başlayın. Verileri bir hesap tablosuna kaydedin, ardından hesap tablosu yazılımında açın ve yeni bir hesap tablosu dosyası oluşturun.

Bu yeni dosyaya SRBC ve çekirdeğin saatini, X ve Y koordinatlarını aktarın. Son olarak, SRBC'leri içeren fagozomların çekirdeğe doğru kat edilen mesafesini ve metin protokolüne göre SRBC'lerin içselleştirilmesinden sonraki ilk beş dakika boyunca fagozomların hızını hesaplamak için elektronik tablo yazılımını kullanın. Canlı HIV ile enfekte makrofajlarda fagozom hareketinin eğirme diski konfokal mikroskobu kullanılarak gerçek zamanlı olarak analizi burada gösterilmektedir.

Parlak alan kanalı ayarları, çekirdeği görmek ve dışsal olanı içselleştirilmiş SRBC'lerden ayırt etmek için kritik öneme sahiptir. Bu grafik, bir SRBC'nin içselleştirilmesinden sonraki ilk beş dakika içinde enfekte olmayan HMDM'lerde bir fagozom için kat edilen mesafeyi zamana karşı çizer. Fagozomun hızı, burada gösterilen doğrusal regresyon eğrisinin eğimidir.

Son olarak, bu çalışmada, HIV ile enfekte HMDM'lerde içselleştirmeden sonraki ilk beş dakika boyunca fagozom hızının, enfekte olmayan HMDM'lere göre daha düşük olduğu gözlenmiştir. Bu yöntemler, HIV ile enfekte makrofajlarda hücre merkezine fagozom hareketinin ve dolayısıyla fagozomun fagolizozomlara olgunlaşmasının bozulduğunu göstermiştir. Elde edildikten sonra, bir hücre korelasyon elektron mikroskobu için daha fazla işlenebilir veya tüm hücre popülasyonu klasik immünofloresan mikroskobu ve istatistiksel analiz için sabitlenebilir.

Fagositoz sıcaklığa karşı çok hassastır ve bu nedenle ısıtma odası ve kültür kabı ortamı içindeki sıcaklık, prosedür boyunca sabit 37 santigrat derecede tutulmalıdır. Patojenlerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve biyo-güvenlik odasında çalışmak ve kişisel koruyucu ekipman giymek gibi önlemlerin yerel mevzuata göre alınması gerektiğini unutmayın.