Name: CD4 hazırlanması + Mikroskopi GD3 ve GD2 Gangliozidleri Membran İfade Analizi T hücreleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Öğrenin, CD4+ T hücrelerinde GD3 ve GD2 gangliozidlerinin membran lokalizasyonunu düşük hücre sayılarıyla analiz etme yöntemini. Bu teknik, T hücre lösemisi araştırmalarında gangliozid ekspresyonunu değerlendirmeyi mümkün kılar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yorumları için Dr. José Luis Daniotti'ye minnettarız. Dr. J. Arturo Pimentel'e ve Laboratorio Nacional de Microscopìa Avanzada-UNAM'a konfokal görüntülerin elde edilmesindeki yardımları için teşekkür ederiz. İ.M.-D. ve T.M.V.C., Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologìa (CONACYT), Sociedad Latinoamericana de Glicobiologìa, A.C.T.M.V.-C.'den 157634 ve 253596 hibelerle desteklenmiştir. CONACYT'den burs (245192) almıştır. Ayrıca Red Temática Glicociencia en Salud - CONACYT'in (253596) desteğine de teşekkür ederiz.

Sağlıklı erkek vericilerden alınan periferik kan aydınlatılmış onam ve Centro de INVESTIGACION en DINAMICA Celular- Universidad Autonoma del Estado de Morelos Biyoetik Komitesi onayı ile elde edilmiştir. 1. İzolasyon ve insan naif CD4 + T hücrelerinin aktivasyonu <ol><li> bilgilendirilmiş rıza ile Sağlıklı insan donörlerden elde edilen periferal kan 2 mL kan ve steril PBS-EDTA, 2 ml seyreltin (1x Fosfat tamponlu tuz (PBS), 2 mM EDTA, pH 7.4) eklenmiştir. Daha önce tarif edildiği gibi 8 1.077 yoğunlukta sukroz çözeltisi 3 ml üzerine yavaşça seyreltilir kan ekleyin. Not: yoğunluğundaki farklar nedeniyle santrifüj sırasında Diferansiyel geçiş eritrositler tamamen çöktürmek için neden olur ve daha az yoğun bir mononükleer hücre tabakası, yukarıda oluşturacaktır. Periferik kan 2 mi cevap verecek sonra yaklaşık 0.5 x 10 6 naif CD4 + T hücrelerinin hale getirecekadımlar. </li><li> Resim arası 21 ° C (30 mm ayarlanmış bir açıyla yuvarlak tabanlı borular için kullanımı rotor) 250 x g&#39;de santrifüjleyin 30 dakika periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) gradyanı üretir. Santrifüj işleminden sonra PBMC&#39;ler açık beyaz bir halka olarak gözlemlenebilir. bir pipet PBMC&#39;lerin toplamak ve yıkama için steril bir tüpe transfer. </li><li> 10 dakika boyunca 250 x g&#39;de PBS-EDTA çözeltisi ile üç yıkamadan sonra, saf CD4 + T hücrelerinin saflaştırılması geçin. Sıralama metodları veya saflaştırma kitleri çeşitli tipleri bu amaçla kullanılabilir. Tercihen, saflaştırma için&gt; 1 x 10 7 PBMC&#39;ler kullanın. <ol><li> Manyetik boncuklar ile negatif seleksiyon tarafından naif CD4 + T hücreleri arındırmak. Anti CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, anti-TCRγ / δ, anti-HLA-DR ve CD235a (glikoforin A) antikorları ile negatif seçim gerçekleştirin. f ile CD4 + CD45RA + hücrelerinin belirlenmesi ile saflık yüzdesi değerlendirilmesiDüşük sitometri. Not: İsteğe bağlı olarak, bir gece boyunca 37 ° C&#39;de ve% 5 monosit yapışmasını teşvik etmek ve naif CD4 + T hücresi saflaştırılmadan devam etmek için takviye edilen ortam, 10 ml, 1 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir yoğunluğa sahip CO 2 PBMC&#39;lerin inkübasyonundan geçin. Periferik kandan naif CD4 + T hücrelerinin etkili bir şekilde geri ölçüde saflaştırma sistemine bağlıdır. </li></ol></li><li> 5 ug / ml anti CD3 monoklonal antikor ile PBS göz başına 250 ul ilave edilerek 24-iyi hücre kültür plakaları hazırlayın ve 37 ° C&#39;de en az 2 saat süreyle inkübe edin. Not: 96 kuyucuklu levhalar kullanılabilir naif CD4 + T hücrelerinden daha az sayıda kullanıldığında (örneğin, 2 x 10 -1 x 10 5 4). </li><li> 24 de ya da 96 gözlü levhalar anti CD3 antikoru seyreltme çıkarın ve iki kez steril 1 x PBS kullanarak plakaları yıkayın. </li><li> + Saflık&gt;% 95 ile naif CD4 + T hücreleri (CD4 sulandırmakFetal sığır serumu% 3 ile takviye edilmiş, gelişmiş RPMI 1640 ortamı içinde 1 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir yoğunluğa CD45RA +) (veya RPMI serumu% 10), 2 mM glutamin ve antibiyotikler (1 U / ml penisilin, 1 ile desteklenmiş ug / ml streptomisin). Not: Gangliozidleri yerelleştirme ölçülerek gerekiyorsa aşağıda tarif edildiği gibi, seyreltme ve uyarılması için aynı protokolü uygulayın. </li><li> Anti CD3 kaplı oyuklara 24 plaka olmayan kaplı oyuklara (kontrol hücreleri) hücre seyreltme 500 ul ekle. Seçenek olarak ise, 96 gözlü bir levhanın gözleri hücre seyreltme 100 ul ilave edin. </li><li> Anti CD28 antikoru 1 ug / ml ekleyerek, anti CD3 kaplı kuyucuklara naif CD4 + T hücrelerinin uyarılması koşulları doldurun. </li><li> Anti CD28 antikorlarının ilavesi olmadan olmayan kaplanmış kuyucuklara kontrol olarak dinlenme CD4 + T hücreleri tutun. 37 ° &#39;lik standart koşullar altında 72 saat için 0 dinlenme ve aktive CD4 + T hücresi inkübeC ve% 5 CO2. </li><li> 37 ° C&#39;de inkübe naif CD4 + T hücreleri olarak CD69 erken aktivasyon işaretleme (16 saat sonra aktivasyon) ya da CD25 geç aktivasyon işaretleme (48 saat sonra etkinleştirme) ekspresyonu akış sitometresi ile değerlendirilmesi ve aktive edilmiş uygun bir aktivasyon kontrol etmek için ve% 5 yokluğunda veya anti CD3 / CD28 antikorları 9,10 mevcudiyetinde CO2. </li></ol> 2. İstirahat ve bağlılık Olmadan Naif CD4 + T hücreleri <ol><li> en az 15 dakika süre ile otoklavlama ve UV ışığı maruz bırakılarak 12 mm yuvarlak lamelleri sterilize edin. </li><li> Steril 24 oyuklu hücre kültür plakalarında yer lamelleri. Not: 1&#39;den daha x 10 5 hücre olan kültürler için, lamel hücre kaybını önlemek üzere uyarlanmış küçük kuyu slayt odaları kullanılması tercih edilir. </li><li> Kat lamelleri poli-L-lisin, 200 ul (veya sürgülü bölmesi) (MA 150-300 kDa),% 0.1 (ağırlık / hacim) çözeltisi ve r, 5 dakika boyunca inkübeoom sıcaklığında (RT), oda sıcaklığında en az 1 saat boyunca çıkarın ve kurutulur. </li><li> Dikkatli bir şekilde karıştırın ve 24 oyuklu plakalar istirahat ve aktif naif CD4 + T hücreleri toplamak. Hücre sayımı ve gerekirse poli-L-lizin kaplı kapak 1 x 10 5 hücre transferi taze desteklenen ortamda ile ayarlayın. 37 o C&#39;de 6 saat minimum ve% 5 CO 2 hücreleri inkübe. </li></ol> 3. Naif CD4 + T Hücreleri Toplama ve İstirahat Fiksasyon Olmadan <ol><li> Dikkatle kültürlü dinlenme ve aktif naif CD4 + T hücrelerinde bulunan ortamı çıkarın. </li><li> RT steril PBS&#39;nin 500 ul yavaş yavaş yapın. Not: kuyu çözümleri dikkatli toplama ve çıkarma lamel hücreleri çıkmasını engeller. </li><li> PBS atın ve iyice kültür ortamı çıkarmak için başka bir 500 ul PBS ekleyin. </li><li> 500 ul süzüldü% 4 paraformaldehid ilave (filt hücreleri saptamakrasyon mikroskopi analizi ile müdahale) ve (tercih edilen) veya gece boyunca 4 ° C&#39;de oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir olabilir mikro kaldırır. Dikkat: Paraformaldehit toksik ve uçucu bir bileşiktir. Bir insan kanserojen olduğu bilinmektedir. Uygun bir güvenlik protokolü ile dikkatlice kullanın. </li><li> Fiksatif çıkarın ve oda sıcaklığında PBS ile en az iki kez yıkayın. </li><li> bir sonraki adıma devam veya boyama kadar birkaç gün 4 ° C&#39;de 500 ul PBS ile plaka kuyuları korumak. Not: Bu işlem sırasında Sterilite mikroorganizma büyümesini önlemeye yardımcı olur. </li></ol> 4. Boyama, Konfokal Mikroskopi Montaj ve Görselleştirme <ol><li> kuyulardan PBS kaldırmak. Soğuk bloke edici tampon 500 ul ekle (1X PBS,% 0.5 Standart kalite sığır serum albümini,% 1 fetal inek serumu, pH 7.4) eklenmiştir. Buz üzerinde 20 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> dikkatlice engelleme tamponu çıkarın ve primer antikorlar ekleyin (anti GD3 klon R24, GD2 klon 14G2a),PE-konjuge anti CD25 ve APC-konjuge anti TCR ve 2.5 ug / ml bloklama tamponu içerisinde seyreltilmiş kontrol izotipleri. </li><li> Buz üzerinde 2 saat veya gece boyunca 4 ° C inkübe edin. Not: Yavaş yörünge ajitasyon tercih edilir. </li><li> dikkatlice antikor çıkarın ve PBS yavaşça 500 ul ekleyin. İki kez tekrarlayın. </li><li> İkincil antikorlar 0.1 ug / ml bloklama tamponu içinde seyreltilmiş (R24, anti GD3, Alexa Fluor 14G2a karşı GD2 488-konjuge veya Alexa Fluor 647-bağlı anti IgG2a için FITC ile birleşik anti-IgG3) ekleyin. </li><li> çalkalamadan karanlıkta buz üzerinde 1 saat süreyle inkübe edin. </li><li> 4.4&#39;de tarif edildiği gibi) PBS içinde üç kez yıkanır. Örneklerin dehidratasyon önlemek için yeterli PBS ile tutun. </li><li> 0.1 ug / ml, PBS içinde seyreltilmiş Hoechst 333.258 leke ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe ve çıkarın. PBS içinde üç kez yıkanır. </li><li> bir kağıt havlu üzerinde slaytlar yerleştirin ve montaj çözeltisi (PBS içinde% 50 gliserol) veya ticari monte çözeltisinin 20 uls solma ve numunelerden söndürme önlemek için. </li><li> Dikkatlice ince cımbız ile lamel pick up ve montaj çözümü üzerine yerleştirin. Hücreler bağlandıkları lamel yan çözeltisi ile temas içinde olduğundan emin olun. oje ile lamelleri Seal ve floresan veya konfokal mikroskopi kullanılarak analiz. </li></ol> RNA izolasyonu 5. <ol><li> Anti CD3 antikoru (5 ug / ml) kaplı 96 oyuklu plakalar hazırlamak. Uyaran tamamlamak için 4 x 10 4 naif CD4 + T hücre / oyuk anti CD28 antikoru (1 ug / ml) ile takviyeli kültür ortamında 100 ul inkübe edin. 0 ila 72 saat boyunca CO2 37 ° C&#39;de inkübe edilir ve% 5. </li><li> Farklı sonrası aktivasyon süreleri sonra bir mikrosantrifüj tüp içine hücreleri yerleştirin. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 250 x g&#39;de 500 ul PBS ve santrifüj ekleyin. </li><li> Süpernatantı ve 1 ml Trizol reaktifi ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin ve en örnek devam -8076, en az 24 saat bekletilmiştir. gerektiğinde RNA izolasyonu ile devam edin. Not: en az 24 saat boyunca -80 ° C&#39;de örnek bırakılması RNA verimini geliştirir. Ayrıca, el eldiven kullanımı RNases RNA bozulmasını önlemek için gereklidir. </li><li> Bir su banyosu içinde 2 dakika için 37 ° C&#39;de inkübe edilerek örnek Defrost. </li><li> 200 ul kloroform ilave edin ve 30 sn (vorteks RNA agresif karışmasını önlemek için) boyunca elle kuvvetli bir şekilde çalkalanır. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 12,000 x g&#39;de santrifüjleyin 15 dakika. </li><li> Yeni bir mikrosantrifüj tüpü içine, sulu faz yeniden elde. </li><li> 500 ul izopropanol ekleyin ve tüpü üç kez ters çevirin. </li><li> 4 ° C&#39;de 12,000 x g&#39;de 10 dakika süre ile 10 dakika oda sıcaklığında ve santrifüj inkübe edin. </li><li> tersine çevirerek süpernatant atın. </li><li> 4 ° C&#39;de 12,000 x g&#39;de buz soğukluğundaki% 75 etanol ve santrifüj 10 dakika için 1 ml ilave edilir. </li><li> Tamamen süpernatantı atmak ve açık tüpün kapağını bırakarak RNA pelet kurulayın. Değile: Bu noktada pelet açıkça görülebilir değildir. Yine de devam edin. </li><li> moleküler sınıf eden 20 ul pelletini. Nanodrop kullanılarak 260 nm ve 280 nm absorbans ölçümü ile konsantrasyon ve nükleik asitlerin saflık hesaplayın. </li><li> alışılmış herhangi bir ters transkriptaz kiti kullanılarak ve imalatçının protokolü izlenerek cDNA sentezi için dikkatli bir şekilde devam ediniz. Not: Yaklaşık 0.5-2 ug RNA, 4 x 10 4 naif CD4 + T hücrelerinden elde edilir. cDNA, RNA, 100 ng sentezlenmiş ve düşük RNA giriş kitleri gerek kalmadan, gerçek zamanlı PCR reaksiyonlarında kullanılabilir. </li></ol>

<ol><li>Mazzon, C., Viola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+tango+to+quadrilla%3A+current+views+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">From tango to quadrilla: current views of the immunological synapse.</a> Cell Adh Migr. 1 (1), 7-12 (2007).</li>
<li>Hamann, D., Pa Baars,, Hooibrink, B., van Lier, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+the+human+CD4%2B+T-cell+population%3A+two+distinct+CD4%2B+T-cell+subsets+characterized+by+coexpression+of+CD45RA+and+CD45RO+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of the human CD4+ T-cell population: two distinct CD4+ T-cell subsets characterized by coexpression of CD45RA and CD45RO isoforms.</a> Blood. 88 (9), 3513-3521 (1996).</li>
<li>Zhong, L., Zhang, Z., Lu, X., Liu, S., Chen, C. Y., Chen, Z. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSOM+%2F+QD-Based+Visualization+of+GM1+Serving+as+Platforms+for+TCR+%2F+CD3+Mediated+T-Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">NSOM / QD-Based Visualization of GM1 Serving as Platforms for TCR / CD3 Mediated T-Cell Activation.</a> Biomed Res Int. , 276498(2013).</li>
<li>Nagafuku, M., Okuyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PNAS+Plus%3A+CD4+and+CD8+T+cells+require+different+membrane+gangliosides+for+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Procs+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">PNAS Plus: CD4 and CD8 T cells require different membrane gangliosides for activation.</a> Procs Natl Acad Sci USA. 109 (6), E336-E342 (2012).</li>
<li>Schnaar, R. L., Gerardy-Schahn, R., Hildebrandt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sialic+acids+in+the+brain%3A+gangliosides+and+polysialic+acid+in+nervous+system+development%2C+stability%2C+disease%2C+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Sialic acids in the brain: gangliosides and polysialic acid in nervous system development, stability, disease, and regeneration.</a> Physiol Rev. 94, 461-518 (2014).</li>
<li>Villanueva-Cabello, T. M., Mollicone, R., Cruz-Muñoz, M. E., Lòpez-Guerrero, D. V., Martìnez-Duncker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+human+na%C3%AFve+Th+cells+increases+surface+expression+of+GD3+and+induces+neoexpression+of+GD2+that+colocalize+with+TCR+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Activation of human naïve Th cells increases surface expression of GD3 and induces neoexpression of GD2 that colocalize with TCR clusters.</a> Glycobiology. 25 (12), 1454-1464 (2015).</li>
<li>Müthing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLC+in+structure+and+recognition+studies+of+glycosphingolipids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">TLC in structure and recognition studies of glycosphingolipids.</a> Methods Mol Biol. 76 (17), 183-195 (1998).</li>
<li>de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+human+peripheral+blood+monocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Mem+Inst+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">A simple method for human peripheral blood monocyte isolation.</a> Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).</li>
<li>O'Neil-Andersen, N. J., Lawrence, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+modulation+of+surface+and+intracellular+protein+expression+by+T+cells+after+stimulation+in+the+presence+of+monensin+or+brefeldin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential modulation of surface and intracellular protein expression by T cells after stimulation in the presence of monensin or brefeldin A.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9 (2), 243-250 (2002).</li>
<li>Mannering, S. I., Zhong, J., Cheers, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+activation%2C+proliferation+and+apoptosis+in+primary+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection.</a> Immunology. 106 (1), 87-95 (2002).</li>
<li>Marconi, S., Acler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-GD2-like+IgM+autoreactivity+in+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mult+Scler%22%5BJournal%5D)">Anti-GD2-like IgM autoreactivity in multiple sclerosis patients.</a> Mult Scler. 12 (3), 302-308 (2006).</li>
<li>Park, J. E., Wu, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+specificity+of+natural+killer+T+cells+against+GD3+ganglioside+and+identification+of+GM3+as+an+inhibitory+natural+killer+T-cell+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Fine specificity of natural killer T cells against GD3 ganglioside and identification of GM3 as an inhibitory natural killer T-cell ligand.</a> Immunology. 123 (1), 145-155 (2008).</li>
<li>Simon, B. M., Malisan, F., Testi, R., Nicotera, P., Leist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disialoganglioside+GD3+is+released+by+microglia+and+induces+oligodendrocyte+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Disialoganglioside GD3 is released by microglia and induces oligodendrocyte apoptosis.</a> Cell Death Differ. 9 (7), 758-767 (2002).</li>
<li>Beske, O., Reichelt, M., Taylor, M. P., Kirkegaard, K., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poliovirus+infection+blocks+ERGIC-to-Golgi+trafficking+and+induces+microtubule-dependent+disruption+of+the+Golgi+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Poliovirus infection blocks ERGIC-to-Golgi trafficking and induces microtubule-dependent disruption of the Golgi complex.</a> J Cell Sci. 120 (18), 3207-3218 (2007).</li>
<li>Zuber, C., Spiro, M. J., Guhl, B., Spiro, R. G., Roth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golgi+apparatus+immunolocalization+of+endomannosidase+suggests+post-endoplasmic+reticulum+glucose+trimming%3A+implications+for+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Golgi apparatus immunolocalization of endomannosidase suggests post-endoplasmic reticulum glucose trimming: implications for quality control.</a> Mol Biol Cell. 11 (12), 4227-4240 (2000).</li>
<li>Yamashiro, S., Okada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+%28GD3+synthase%29+gene+in+human+cancer+cell+lines%3A+high+level+expression+in+melanomas+and+up-regulation+in+activated+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Expression of (GD3 synthase) gene in human cancer cell lines: high level expression in melanomas and up-regulation in activated T lymphocytes.</a> Glycoconj J. 12 (6), 894-900 (1995).</li>
<li>Wipfler, D., Srinivasan, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentially+regulated+expression+of+9-O-acetyl+GD3+%28CD60b%29+and+7-O-acetyl-GD3+%28CD60c%29+during+differentiation+and+maturation+of+human+T+and+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Differentially regulated expression of 9-O-acetyl GD3 (CD60b) and 7-O-acetyl-GD3 (CD60c) during differentiation and maturation of human T and B lymphocytes.</a> Glycobiology. 21 (9), 1161-1172 (2011).</li>
<li>Pukel, C. S., Lloyd, K. O., Travassos, L. R., Dippold, W. G., Oettgen, H. F., Old, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GD3%2C+a+prominent+ganglioside+of+human+melanoma.+Detection+and+characterisation+by+mouse+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">GD3, a prominent ganglioside of human melanoma. Detection and characterisation by mouse monoclonal antibody.</a> J Exp Med. 155 (4), 1133-1147 (1982).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Açıklanan protokol, CD4 + T hücreleri ya da küçük bir hücre sayısı başlayarak, diğer bağışıklık hücreleri (örneğin, ekspresyonu analiz edilmiştir, Şekil 5) hücre süspansiyonlarında gangliosidler veya protein lokalize etmek için de kullanılabilir. Çünkü T hücreleri ve yapışmaz özellikleri küçük boyutu, kötü bilgi veya düşük kalitede floresan mikroskobik görüntüleri sonuçların elde edilmesi hücreleri doğru yapıştırılır değilse. O yol, tedavi sıra...

CD4 + T hücreleri, antijen sağlayan hücreler 1 tarafından aktive edildikten sonra, bunların etki edici fonksiyonları ile bağışıklık yanıtını yönlendirirler. etkinleştirme sırasında modüle hücresel mekanizmaların çalışma bağışıklık fonksiyonunun temel bir süreci içine fikir verir. Kan çevre 2 hücrelerinin çok küçük bir popülasyonu temsil Ancak, saf CD4 + T hücrelerinin çalışması zor olabilir. Floresan mikroskobu aracılığıyla çeşitli raporlar CD4 + T hücresi aktivasyonu yer alan farklı moleküller plazma membranında 3 ile ilişkili temel protein lokalizasyonu inceledik. Gangliositler sialik asit içeren glikosfingolipidler ve onlar yaygın böyle bağışıklık hücreleri gibi bol, diğer hücreler sinir hücreleri incelenmiştir rağmen, aynı zamanda biyolojik ilgili fonksiyonları 4,5 ile gangliositler ifade eder. Biz daha önce tha bildirdiST8Sia 1 (GD3 sentaz) ve GM2 / GD2 sentaz sıyalıltransferaz α2,8 bir düzenlenmesi görülür, insan naif CD4 + T hücrelerinin aktivasyonu sırasında bulunan t, yani GD2 önemli yüzey neoexpression ve GD3 gangliozide 6 düzenlenişini uyarmaktadır. bağışıklık hücrelerinde GD3, GD2 ve gangliosidler daha başka çalışma, bağışıklık fonksiyonunun bir protein bazlı kısmi görünümü güzelleştirmek için gereklidir. Genel olarak, gangliosid ifade çalışması, ince tabaka kromatografisi (TLC), 7 gibi teknikler dayanan, ancak bu teknik, biyolojik analizi sınırlayıcı plazma membranı veya hücre içi bölümlerinde gangliosidler uzamsal lokalizasyonu izin vermez. Bu çalışmada, anti-CD3 / anti-CD28 aktivasyonundan sonra, insan naif CD4 + T hücreleri ve PBMC&#39;de GD3 ve GD2 antikor aracılı tanımlama ve lokalizasyonu için bir protokol açıklamaktadır. Bu protokolü i ilelenfositlerin küçük boyutlu (9 mm) dikkate alınarak, yüksek kaliteli görüntüler 6 satın alınmasından sonra, süspansiyon hücrelerin düşük sayıda gangliosidler geni ve moleküler ifadesini analiz etmek de mümkündür.

<table><tbody><tr><td>Gelişmiş RPMI 1640&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12633-012</td><td>% 3 FBS</td></tr><tr><td>fare anti insan CD3 antikoru</td><td>eBioscience</td><td>16-0037-81</td><td>OKT3 klon</td></tr><tr><td>fare anti insan CD28 antikoru</td><td>ebioscience</td><td>16-0288-81</td><td>CD28.6 klon</td></tr><tr><td>fare anti insan GD3 & nbsp; antikor</td><td>Abcam</td><td>ab11779</td><td>R24 klon</td></tr><tr><td>fare anti insan GD2 antikoru</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-53831</td><td>14G2a klonu</td></tr><tr><td>FITC-konjuge anti-fare IgG3 antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab97259</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 konjuge antimouse</td><td>Thermo Fisher Scieni&iexcl; tific</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a antikoru</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 konjuge antimouse</td><td>Thermo Fisher Scieni&iexcl; tific</td><td>A-21241</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a antikoru</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 333258</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861405</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Ficoll Paque-Plus</td><td>GE</td><td>17-1440-02&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trizol Reaktifi</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Naif CD4 + T Hücre İzolasyon Kiti II, insan</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Sıralama&nbsp;</td></tr><tr><td>Nunc Lab-tek odacıklı kızak sistemi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7182</td><td></td></tr><tr><td>Olympus FV 1000 Lazer Konfokal Mikroskop (Olympus)&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td>Dik BX61WI ve IX81&nbsp;</td></tr><tr><td>İleri dizi primer GD3 sentaz</td><td>5&akut;-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3&akut;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Ters dizi primer GD3 sentaz</td><td>5&akut;-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3&akut;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>İleri dizi primer GM2/GD2 sentaz</td><td>5&akut;-CAACACAGCACACAGTCC-3&akut;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Ters dizi astarı GM2/GD2 sentaz</td><td>5&akut;-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3&akut;</td><td></td><td>Referans 7</td></tr></tbody></table>

cd4 hazırlanması<sup&gt; +</sup&gt; mikroskopi gd3 ve gd2 gangliozidleri membran İfade analizi t hücreleri

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Süspansiyonda saf CD4 + T hücrelerinin aktivasyonu için, burada tarif edilen yöntem ve konfokal mikroskopi analizi için lamelleri bunların yapışma deneyleri profil komplemanın sentezleme akış sitometrisi gibi, CD4 + T hücresi aktivasyonunda rol gangliosidler uzamsal lokalizasyonu ve görselleştirme izin batı blotting ya da gerçek-zamanlı PCR. akış sitometrisi ve mikroskopi yoluyla hücresel lokalizasyon yoluyla gangliosid ifadesinin ölçümü, yüksek yakınlık ve özgüllük ile anti-gangliosid antikorların kullanılması ile elde edilebilir. Bununla birlikte, süspansiyon içinde hücrelerin yeterli bir kullanım floresan veya konfokal mikroskopi edinimi için gerekli olan yapışma teşvik etmek için kültür plakaları muamele edilmesini içerir. Bu çalışmada, saf CD4 + T hücresi aktivasyonu sırasında GD3 ve GD2 gangliozid ekspresyonunu ve TCR ile ko saptanması için bir protokol açıklar. Ayrıca, gerçek-t&lt;40,000 hücre kullanılarak ime PCR deneyleri hücre düşük sayıda ilave düşük giriş RNA kitleri gerek kalmadan gerçekleştirilebilir bu gen analiz deneyleri gösteren, GD3 ve GM2 / GD2 sintaz genlerinin belirlenmesi için tarif edilmiştir.

Bu yazıda anlatılan protokol kültürlü kaliteli ve yapıştırılır dinlenme ve aktif insan naif CD4 + T hücreleri (Şekil 1) işler. Aktive edilmiş CD4 + T hücreleri durumda (Şekil 1A) kıyasla karakteristik bir proliferatif profil (Şekil 1B) göstermektedir. CD25 Geç aktivasyon işaretleme konfokal mikroskopi (Şekil 1C) tarafından gözlemlenen 72 saatte etkin aktivasyonunu değerlendirmek için yararlıdır. CD6...

Istirahat bölgesindeki gangliosidler ve aktive edilmiş insan naif CD4 + T hücrelerinin membran ekspresyonunu ve sınırlandırılmasını belirlemek için mikroskopla kullanılmak için bir standart antikor boyama protokolü tarif eder. Ayrıca gerçek zamanlı PCR deneyleri &lt;ek düşük giriş RNA kitleri gerekmez 40.000 hücreleri kullanarak tarif edilir.

CD4 hazırlanması<sup&gt; +</sup&gt; Mikroskopi GD3 ve GD2 Gangliozidleri Membran İfade Analizi T hücreleri

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

Bu protokolün genel amacı, düşük sayıda hücre kullanarak hücre yüzeyindeki GD3 ve GD2 gangliozit lokalizasyonunu görüntülemek için boyamaya yönelik bir CD4+T hücresi süspansiyonu hazırlığının gösterilmesidir. Bu yöntem, mononükleer hücrelerde olduğu gibi, düşük sayıdaki küçük süspansiyon hücrelerinde membran glikolipitlerinin görselleştirilmesini sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, örnek kullanımını optimize ederek düşük miktarlardaki CD4+T hücrelerinde gangliozit ekspresyonunu ve lokalizasyonunu değerlendirebilmenizdir.Bu tekniğin etkileri, bazı T hücresi lökemisi türlerinin araştırılmasına ve teşhisine kadar uzanabilir. Tespit ettiğimiz üzere, bazı lösemi hücre hatları GD3 ve GD2 gangliozid ekspresyonunu yukarı regüle eder. Sağlıklı insan donörlerden alınan iki mililitre periferik kanı, iki mililitre steril PBS EDTA ile seyreltmekle başlayın.Seyreltilmiş kanı, 1,077 yoğunluktaki üç mililitre sakroz çözeltisinin üzerine yavaşça ekleyin. Ardından, periferik kan mononükleer hücre gradyanını oluşturmak için 21 °C'de, 250 ×g'de 30 dakika boyunca, frenleme yapmadan santrifüjleyin. Santrifüj sonrası PBMC'ler beyaz bir halka şeklinde net bir şekilde gözlemlenebilir.PBMC'leri bir pipetle toplayın ve yıkama işlemi için steril bir tüpe aktarın. Hücreleri PBS EDTA ile yıkadıktan sonra, ticari olarak mevcut bir kit kullanarak manyetik boncuklarla negatif seçim yoluyla naive CD4+T hücrelerini saflaştırın. %95'ten daha yüksek saflıkta bir CD4+T hücresi popülasyonu elde edildiğinde, her kuyucuğa PBS içinde 5 µg/mL anti-CD3 monoklonal antikorun 250 µL'sini ekleyerek 24 kuyucuklu hücre kültür plakalarını hazırlayın.Plakayı 37 °C'de en az iki saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, anti-CD3 antikor dilüsyonunu plakalardan uzaklaştırın ve steril 1x PBS kullanarak iki kez yıkayın. Ardından, naive CD4+T hücrelerini, takviye edilmiş advanced RPMI 1640 medyumu ile 1 × 10⁶ hücre/mL yoğunluğa gelecek şekilde dilüe edin.Ardından, 24 kuyucuklu plakanın anti-CD3 kaplı kuyucuklarına 500 µL dilüe edilmiş hücre ekleyin. Daha sonra, anti-CD3 kaplı kuyucuklara 1 µg/mL anti-CD28 antikoru ekleyerek naive CD4+T hücrelerinin stimülasyonunu tamamlayın. Dinlenmiş ve aktive edilmiş CD4+T hücrelerini 37 °C ve %5 CO2 ortamında 0 ila 72 saat boyunca inkübe edin.Belirlenen inkübasyon süresi dolduktan sonra, dinlenmiş ve aktive edilmiş naive CD4+T hücrelerini 24 kuyucuklu plakalardan toplayın. Hücre sayımı yapın ve gerekirse, hücreleri taze takviyeli medium ile mililitre başına 1x10⁶ hücre konsantrasyonuna gelecek şekilde seyreltin. Seyreltilmiş hücrelerden 500 µL'sini, poly-L-lysine kaplı lameller içeren 24 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına veya bir lam slayt odasına ekleyin ve 37 °C'de, %5 CO₂ ortamında minimum altı saat inkübe edin.İnkübasyonun ardından, CD4+T hücreleri lamellerine yapışmış olacaktır. Besiyerini kuyucuklardan dikkatlice uzaklaştırın ve ardından yavaşça 500 microliters steril PBS ekleyin. Yıkama sırasında PBS ekleme işlemi, özellikle kuyucuk başına 50.000'den az hücrenin hazırlandığı lam şeritlerinde çok dikkatli bir şekilde yapılmalıdır.PBS'yi aspire edin ve kültür ortamını tamamen uzaklaştırmak için kuyucuklara 500 mikrolitre daha PBS ekleyin. Tüm PBS'yi uzaklaştırdıktan sonra, hücreleri sabitlemek için 500 mikrolitre filtrelenmiş %4 paraformaldehit ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Sabitleme işleminin ardından, sabitleyiciyi uzaklaştırın ve en az iki kez PBS ile yıkayın.İstenirse, plaka her kuyucukta 500 µL PBS ile dört derece santigrat sıcaklıkta birkaç gün boyunca saklanabilir. İlk olarak, fikse edilmiş hücrelerdeki PBS'yi uzaklaştırın ve 500 µL soğuk bloklama tamponu ekleyin. Buz üzerinde 20 dakika inkübe edin.İnkübasyon sırasında, plakayı şiddetli bir şekilde sallamamak kritik önem taşır; çünkü sallama işlemi hücrelerin kopmasına neden olacaktır. Bloklama tamponunu dikkatlice aspire edin ve mililitre başına 2,5 mikrogram primer antikorlardan birini veya PE konjugatlı anti-CD25, APC konjugatlı anti-TCR veya bir izotip kontrolü içeren bloklama tamponu ekleyin. Buz üzerinde iki saat boyunca ve ışıktan koruyarak veya dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin.İnkübasyonun ardından, antikor çözeltisini dikkatlice uzaklaştırın ve yavaşça 500 µL PBS ekleyin. Ardından, bloklama tamponunda 0,1 µg/mL konsantrasyona seyreltilmiş uygun sekonder antikorları ekleyin. Işıktan koruyarak ve çalkalamamaya özen göstererek buz üzerinde bir saat boyunca inkübe edin.Daha önce yapıldığı gibi PBS ile üç kez yıkadıktan sonra, PBS içinde 0,1 micrograms per milliliter olacak şekilde seyreltilmiş Hoecht boyası ekleyin ve oda sıcaklığında, ışıktan koruyarak 15 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, yıkanmış lamları bir kağıt havluya yerleştirin ve floresanın solmasını ve sönmesini önlemek için 20 microliters miktarda montaj solüsyonu veya ticari montaj solüsyonu ekleyin. Son olarak, ince bir cımbızla bir lam örtüsü alın, ters çevirin ve hücrelerin yapışık olduğu taraf solüsyonla temas edecek şekilde montaj solüsyonunun üzerine yerleştirin.Kapak lamlarını oje ile mühürleyin ve floresan veya konfokal mikroskopi kullanarak analiz edin. Bu görüntü, aktivasyondan 72 saat sonra fikse edilmiş CD4+T hücrelerinin parlak alan görselleştirmesini göstermektedir. Boyama sonrası etkin aktivasyonun doğrulanması, kırmızı renkte gösterilen anti-CD25 antikoru kullanılarak değerlendirilir.Yeşil renkte gösterilen anti-GD3 antikoru ile yapılan boyama sonucunda, GD3 gangliyozidinin aktive edilmiş CD4+ T hücrelerinin hücre içi bölgelerinde ve hücre yüzeyinde lokalize olduğu görülmektedir. Anti-GD3 ve anti-TCR antikoru boyamalarıyla değerlendirildiğinde, yine yeşil renkte gösterilen GD3, kırmızı renkte gösterilen TCR ile ko-lokalizasyon göstermemektedir. Bununla birlikte, yeşil renkte gösterilen anti-GD2 ve kırmızı renkte gösterilen anti-TCR antikoru boyamalarıyla değerlendirildiğinde, GD2 gangliyozidinin TCR ve CD4+ T hücreleri ile ko-lokalizasyon gösterdiği görülmektedir.GD3 gangliyozid boyaması, aktive edilmiş PBK'ların bir alt kümesinde hücre içi ve hücre yüzeyi lokalizasyonunu göstermektedir. GD2 gangliyozid boyaması ise tüm aktive edilmiş PBK'larda hücre içi ve hücre yüzeyi lokalizasyonunu göstermektedir. CD4+ T hücrelerinin adezyon ve manipülasyon prosedürünün ardından, gangliyozidlerin spesifik hücre içi lokalizasyonu veya işlenmesi gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla hücre içi kompartman boyaması gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, gangliozit ekspresyonunu analiz etmek için yüksek kaliteli floresan mikroskopi görüntüleri elde etmek amacıyla az sayıda CD4+T hücresinin nasıl işleneceği ve yüzeye nasıl yapıştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

preparation-cd4-t-cells-for-analysis-gd3-gd2-ganglioside-membrane

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu prosedür, arıtma gösteriyor ve in vitro antijen spesifik CD4 + T hücreleri, tüm periferik kan ve MHC sınıf II tetramers kullanarak görselleştirme genişleme. Tetramers tek bir antijen özgüllüğü ve tanımlanan MHC sınıf II kısıtlama ile T hücrelerinin doğrudan görselleştirme izin verir.

Görselleştirme Antijen spesifik CD4 + T hücreleri MHC Sınıf II Tetramers kullanarak

Bu video, granülosit-makrofaj-koloni uyarıcı faktör veya GM-CSF üreten T yardımcı hücrelerinin (THGM) in vitro farklılaşmasını göstermektedir. İzole edilmiş naif T hücreleri, yüksek hücre içi GM-CSF üretimi ve diğer T yardımcı hücreye özgü sitokinlerin düşük ekspresyonu ile doğrulanan THGM'ye farklılaşma için uyarılır.

GM-CSF Üreten T Yardımcı Hücrelerini Naif T Hücrelerinden Ayırt Etmek İçin İn Vitro Bir Teknik

Bu video, floresan bazlı test yoluyla immünomodülatör bileşiklerin taranmasını göstermektedir. Yeşil floresan protein ekspresyon kasetlerine sahip transgenik fare kaynaklı T lenfositleri bu bileşiklerle tedavi edilir. Geliştirilmiş ve azaltılmış GFP sinyalleri, sırasıyla bileşiklerin uyarıcı ve inhibitör etkilerinin tanımlanmasını sağlar.

İmmünomodülatör Bileşiklerin Taranması için Tasarlanmış Lenfositlerin Kullanıldığı Floresan Bazlı Bir Test

Bu video, farklı hücre döngüsü aşamalarında antijene özgü CD8+ T hücrelerini analiz etmek için bir testi göstermektedir. Floresan etiketli canlı hücreler, akış sitometrisi kullanılarak seçilir ve farklı hücre döngüsü aşamalarındaki hücreler, hücre çoğalması ile ilişkili nükleer proteine ve bir nükleik asit boyasına karşı antikorlar kullanılarak DNA içerikleri ile tanımlanır.

Antijene Özgü CD8+ T Hücrelerinin Hücre Döngüsü Analizi için Bir Test

Naif CD4 Coxsackie adenovirüs reseptör transgenik ekspresyonu ile T-hücreleri içine adenoviral gen transferi düzenleyici T hücre farklılaşmasının moleküler analiz...

Naif CD4 adenoviral İletimi Treg Farklılaşma Eğitim Hücreler T

Makrofajlar hematopoietik sistemin koruyucu immünite ve homeostazda önemli bir role sahip plastik hücrelerdir. Bu raporda, tolerogenik koşullar altında nakledilen organda biriken greft infiltrasyon düzenleyici makrofajları fenotipik ve fonksiyonel olarak karakterize eden optimize in vitro teknikler açıklanmaktadır.

Greft Reaktif Bağışıklığı Engelleyen Düzenleyici Makrofajların Fonksiyonel Karakterizasyonu

Burada, intraepitelyal gama delta T hücrelerinin analizi için insan endoservikal intraepitelyal lenfositlerini elde etmek için bir izolasyon yöntemini açıklıyoruz. Bu protokol, endoservikal gama delta T hücrelerinin manyetik boncuklar veya hücre sınıflandırması ile saflaştırılması için genişletilebilir.

İnsan Endoservikal Gamma Delta T Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

Bu protokol, akış sitometrisi ile yetişkin fare merkezi sinir sisteminde makrofaj alt popülasyonlarının bir analizini sağlar ve bu hücrelerin eksprese ettiği çoklu belirteçlerin çalışması için yararlıdır.

Akış Sitometresi ile Merkezi Sinir Sisteminden Mikroglia ve Monosit Türevi Makrofajların Analizi

Gangliosidler, beyinde özellikle bol miktarda bulunan sialik asit taşıyan glikozfingolipidlerdir. Amfipatik doğaları, optimum geri kazanım ve doğru analizler sağlamak için organik / sulu ekstraksiyon ve saflaştırma teknikleri gerektirir. Bu makalede, analitik ve hazırlayıcı ölçekli ganglioside ekstraksiyonu, saflaştırma ve ince tabaka kromatografisi analizine genel bakış sunulmaktadır.

Ganglioside Ekstraksiyonu, Saflaştırma ve Profilleme

Bu çalışma, 3D hücre invazyonu ve göçü gibi dinamik süreçler sırasında plazma zarı üzerindeki proteinlerin ekspresyonunu gerçek zamanlı olarak incelemek için yararlı olan, pediatrik diffüz orta hat glioma hücre hattına uygulanan bir canlı 3D hücre immünositokimyası protokolü sunmaktadır.

Pediatrik Diffüz Orta Hat Gliomunun Canlı 3D Hücre İmmünositokimya Testleri

Burada Boncuk Destekli Lipid Bilayers kullanılarak sentetik antijen sunan hücrelerin adım adım yeniden uzlaştırılması ve aktif T hücrelerinden sinaptik çıkışı sorgulamak için kullanımları için protokolü sunuyoruz.

T Hücreli İmmün Sinapsların Partikül Çıkışını İncelemek için Boncuk Destekli Lipid Bilayerlerin Hazırlanması

Öğrenin, CD4+ T hücrelerinde GD3 ve GD2 gangliozidlerinin membran lokalizasyonunu düşük hücre sayılarıyla analiz etme yöntemini. Bu teknik, T hücre lösemisi araştırmalarında gangliozid ekspresyonunu değerlendirmeyi mümkün kılar.

CD4 hazırlanması

Daha fazla video keşfet