Fare jejunal ve Kolon Segmentlerde Mezenterik Afferent Sinir Faaliyet Vitro kaydedilmesi

Bu tekniğin genel amacı, ramp genişletmelere ve bileşik uygulamalarına yanıt olarak, tek bir jejunal veya kolonik sinir demetinden in vitro splanknik afferent sinir aktivitesini kaydetmektir. Bu yöntem, gastrointestinal sistemi besleyen afferent sinirlerin çeşitli hastalık durumlarında aşırı duyarlı hale gelip gelmediği veya duyarsızlaşıp duyarsızlaşmadığı gibi, nörobilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, in vitro ortamda sinir boşalımı kaydına izin vermesi ve sinir aktivitesini merkezi sinir sisteminin modülasyonu veya girdileri olmadan miktarlandırmaya olanak tanımasıdır.

Sinir duyarlılaşması patogenezde önemli bir rol oynadığından, bu tekniğin uygulama alanı irritabl bağırsak sendromu gibi birçok ağrı sendromunun tedavisine veya teşhisine kadar uzanmaktadır. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, sinir demetlerinin diseksiyonu ve kaydedilen sinyalin tek birim analizinin ciddi miktarda eğitim gerektirmesi nedeniyle zorluk yaşayacaklardır. Bu prosedüre başlamak için, sakrifiye edilen fareyi sırt üstü pozisyona getirin.

Bir skalpel kullanarak, ksifoid çıkıntıdan pubik kemiğe kadar uzanan, cilt ve karın kas tabakası boyunca abdominal orta hat insizyonu yapın. Ardından, karın içi dokuların kurumasını önlemek için abdominal kaviteyi soğuk Krebs solüsyonu ile yıkayın. Daha sonra, duodenojejunal fleksurdan başlayarak ince bağırsağın yaklaşık 20 santimetresini çıkarıp tüm jejunumu keskin makaslar yardımıyla hızla eksize edin.

Çevredeki yapılara zarar vermemeye dikkat edin ve jejunal kan damarları ile afferent sinirleri içeren bağırsağın mezenterini sağlam tutun. Ardından, eksize edilen jejunumu, Carbigen ile sürekli oksijenlendirirken buz üzerinde soğuk Krebs solüsyonuna yerleştirin. Daha sonra, jejunumu yaklaşık üç santimetre uzunluğunda halkalar halinde kesin.

Bağırsak loop'unun kayıt odasına yerleştirilmesini kolaylaştırmak için, ilgili loop'un merkezine yakın bölgede damarları ve splanknik siniri içeren mezenterik demeti bulun. Ardından, lüminal içeriği ve kimusu uzaklaştırmak için her segmenti küt uçlu bir kateter kullanarak Krebs solüsyonu ile yıkayın; çünkü bu içerikler, doku örneğinin in vitro ortamdaki bozulmasını hızlandıracak sindirim enzimleri içerir. Bundan sonra, afferent sinir aktivitesini ölçmek için bir segment seçin ve bunu silikon elastomer tabakasıyla kaplanmış kayıt odasına yerleştirin.

Kayıt odasındaki Krebs sıcaklığını 34 °C'de tutun. Ardından, oral ucun lüminal akışı sağlayan şırınga sürücüsüne ve aboral ucun çıkışa bağlandığı şekilde jejunal segmenti organ banyosuna yerleştirin. Segmenti hafifçe gerin ancak aşırı gerginlik uygulamamaya dikkat edin.

Her iki ucu ipek ligatürler kullanarak giriş ve çıkış portlarına sıkıca sabitleyin. Ardından, şırınga sürücüsünü oral uca bağlayın ve jejunum segmentini intralüminal olarak saatte 10 milliliters Krebs çözeltisi ile perfüze edin. Monte edilen intestinal segmentin mezenterini, silikon elastomer alt tabakaya düz olacak şekilde iğneleyin.

Ardından, mezenterik demetin görselleştirilmesini optimize etmek için mezenteri gerin. Daha sonra, monte edilen segmentten herhangi bir intralüminal Krebs çözeltisi sızmadığını doğrulamak için, bağırsak segmentinin intralüminal basıncı 60 mmHg seviyesine ulaşana kadar çıkış portunu kapatarak ramp gerilme testi gerçekleştirin. İntralüminal basınçta kesinti olmaksızın düzgün bir artış gözlemleyin.

İlk genişletme aşaması sırasında segmentte küçük kasılmalar bekleyin. Gerekirse, Krebs çözeltisine bir mikromol L-tipi kalsiyum kanal blokeri nifedipin ekleyerek peristaltik aktiviteyi engelleyin. Bir stereo mikroskop altında, yağ dokusunda gömülü olan damarlara ve afferent sinire zarar vermemeye dikkat ederek, yağ dokusunu iki küçük cımbızla nazikçe çekerek mezenterden soymaya başlayın.

Mezenterik demet içindeki her iki kan damarını açığa çıkarmak için, jejunumdan bir miktar uzaktaki yağ dokusunu soymaya başlayın. Adipoz doku içine kapsüllenmiş ince beyaz bir iplik şeklinde, her iki damar arasında yer alan aferen jejunal siniri tanımlayın. Ardından, cımbız yardımıyla yağ dokusunu nazikçe sıyırarak siniri jejunum yönünde daha proksimale doğru diske edin.

Ardından, sinire yapışık olan adipöz dokuyu uzaklaştırarak segmentin jejunal mezenterik sinirini disseke edin. Siniri keskin doku makasları kullanarak kesin. Gerekirse, hafifçe çekerek geri kalan yağı ve bağ dokusunun yanı sıra epineural kılıfı da soyun.

Bu prosedürde, bir mikromanipülatör kullanarak vakum elektrodunun ucunu organ banyosuna indirin. Ardından, elektrodun ucunun Krebs solüsyonuna gömülmesi için organ banyosundan nazikçe bir miktar Krebs solüsyonu aspire edin. Krebs solüsyonunun, vakum elektrodunun içindeki tel elektrodu kapladığından emin olun.

Ardından, vakum elektrodunun ucunu kesilmiş aferent sinir demetinin hemen yanına yerleştirin ve kesilmiş sinir demetini tüm uzunluğu boyunca kılcal borunun içine çekin. Elektrodun ucunu yağ dokusuna doğru yönlendirin ve piston yardımıyla bu dokuyu cam kılcal boruya aspire edin; böylece siniri, organ banyosunun içeriğinden mekanik olarak kılcal boru içerisinde mühürlemiş olursunuz. Çevredeki yağ dokusunun bir kısmının kılcal boruya aspire edilmesiyle cam kılcal borunun kayıt odasından uygun şekilde mühürlenmesi, nihai analizi engelleyecek olan gereksiz arka plan gürültüsünü minimize etmek açısından kritik öneme sahiptir.

Afferent sinir aktivitesi kaydını doğrulamak için, bağırsak segmentindeki basıncın kademeli olarak artmasını sağlamak amacıyla çıkış portunu kapatarak ramp distansiyonla tetiklenen afferent ateşleme artışını gerçekleştirin. Yalnızca üç ardışık ramp distansiyon yeniden üretilebilir multi-unit boşalımı sağladığında istenen deneysel protokolü uygulayın. Sinir izolasyonunun ardından, asıl deneyleri gerçekleştirmeden önce stabil spontan afferent sinir aktivitesi elde etmek için preparasyonu 15 dakika boyunca stabilize edin.

Burada, mekanosensitif profillerine göre farklı afferent lif birimlerinin şematik bir gösterimi sunulmuştur. Düşük eşikli lifler, ağırlıklı olarak düşük genişleme basınçlarında artmış sinir aktivitesi göstererek %55'in üzerinde bir LT yüzdesi ile sonuçlanır; buna karşılık, yüksek eşikli birimler sadece noksiöz basınçlarda ateşleme hızında artış gösterir. Geniş dinamik aralıklı lifler, tüm genişleme süreci boyunca sinir aktivitesinde kademeli bir artış sergilerken, mekanik olarak insensitif lifler artan genişleme basınçlarına yanıt vermezler.

Bu şekil, ramp distansiyon sırasında vahşi tip farelerdeki mezenterik afferent sinir boşalımını göstermektedir. Bifazik distansiyon profilinde, sinir boşalımındaki ilk yükselmenin düşük eşikli ve geniş dinamik aralıklı liflerden kaynaklandığını, yüksek eşikli ve geniş dinamik aralıklı liflerin ise boşalımdaki ikinci artışa katkıda bulunduğunu unutmayın. Teknik üzerinde uzmanlaşıldığında, jejunal sinirin izolasyonu ve başlangıç bazal kaydı, uygun şekilde gerçekleştirilirse bir saatten kısa sürede tamamlanabilir.

Organ banyosuna uygulanan bileşiklerin etkisini incelerken daha fazla süreye ihtiyaç duyulur. Bu prosedür uygulanırken, tüm deneyler için aynı segmentin tutarlı bir şekilde belirlenmesi gibi iyi standardize edilmiş bir yaklaşımın sürdürülmesini hatırlamak önemlidir. Bu prosedürün ardından, gastrointestinal sinir sistemindeki hangi aktarma istasyonlarının çeşitli hastalıkların patogenezinde rol oynadığını değerlendirmek amacıyla, dorsal kök ganglionlarının izolasyonu ve ardından kalsiyum görüntüleme gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Bu teknik, geliştirilmesinin ardından, nörobilim alanındaki araştırmacıların gastrointestinal araştırmalarda çeşitli ağrı sendromlarının patogenezini keşfetmelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, fare gastrointestinal sisteminden jejunal afferent sinirlerin nasıl izole edileceği ve rampa distansiyonları sırasında bunlardan nasıl aktivite kaydedileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olacaksınız.