Bir Ayarlanabilir Nanopore aracılığıyla Nanopartikül Translokasyon Hızları aracılığıyla Zeta Potansiyeli Belirlenmesi: Bir Örnek olarak DNA modifiye Parçacıklar kullanma

Bu prosedürün genel amacı, ayarlanabilir dirençli son algılama veya TRPS kullanarak nano parçacıkların yüzey kimyasını karakterize etmek ve malzemenin zeta potansiyelini belirlemektir. Bu, DNA'sı modifiye edilmiş nano parçacıkları karakterize ederek göstermektedir. Bu yöntem, nanomalzemelerin karakterizasyonu ve biyo-tahlilin geliştirilmesindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, partikül analizini partikül analizi ile tamamlayabilmenizdir. Her DNA parçacık sinyali, analiz edilen numunenin tam bir resmini sağlayan bir zeta potansiyeli ölçümüne çevrilir. En eski yöntem, malzemelerin karakterizasyonu hakkında fikir verebilir.

Hücrelerin, virüslerin, DNA'nın ve proteinlerin tespiti için biyo-tahlilin geliştirilmesi gibi diğer uygulamalara da uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişi mücadele edecektir çünkü bu basit bir örnekleme enjekte etmek ve sonra cevabı beklemek değildir. İhtiyaç duyulan bilim insanından bazı girdiler var.

Bu prosedüre başlamak için, mono dağılımı sağlamak için 80 watt'ta iki dakika boyunca sonikasyondan önce 30 saniye boyunca streptavidin kaplı parçacıkları vorteksleyin. Streptavidin kaplı partikülleri PBST tamponunda yüzde bir oranında seyreltin ve mililitre başına on ila dokuz partikül arasında bir konsantrasyon elde edin. Ardından parçacıkları 30 saniye boyunca girdaplayın.

Elde edilen 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140 ve 210 nanomolar konsantrasyonlar için partiküllere uygun DNA konsantrasyonunda miligram başına 4.352 pikomol bağlanma kapasitesine dayanmaktadır. Numuneleri 10 saniye boyunca girdapladıktan sonra, DNA'nın bir streptavidin biyotin etkileşimi yoluyla parçacık yüzeylerine bağlanmasına izin vermek için 30 dakika boyunca oda sıcaklığında döner bir tekerleğe yerleştirin. Yakalanan DNA eklendikten ve parçacıklarla inkübe edildikten sonra, numuneleri 30 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirerek fazla DNA'yı ve çözeltiyi manyetik ayırma yoluyla çıkarın.

Bunu takiben, mıknatısa en yakın olan yeni oluşan parçacık kümesini rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatanı çıkarın. Ardından süpernatanı aynı hacimde taze PBST tamponu ile değiştirin. Şimdi, mümkün olan maksimum hedef bağlanmaya ulaşıldığından emin olmak için her örneğe gerekli miktarda hedef DNA ekleyin.

Örnekleri 10 saniye boyunca vorteksleyin. Ve bunları 30 dakika boyunca oda sıcaklığında döner tekerleğe yerleştirin. Hibridizasyon tamamlandıktan sonra, numuneleri 30 dakika boyunca manyetik rafa yerleştirerek fazla hedef DNA'yı manyetik ayırma yoluyla çıkarın.

Daha sonra, mıknatısa en yakın olan yeni oluşan parçacık kümesini rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatanı çıkarın. Ardından süpernatanı aynı hacimde taze PBST tamponu ile değiştirin. Yinelenen numuneler için önceki adımları tekrarladıktan sonra, DNA hibridizasyon sürelerini araştırmak için numuneleri oda sıcaklığında 16 saat boyunca döner tekerleğe yerleştirin.

Bu noktada, bir TRPS cihazını, yazılımın yerinde olduğu bir bilgisayar sistemine takın. Kaliperler kullanarak, iki paralel çenenin dışı arasındaki mesafeyi ölçün. Cihaz ayarları sekmesindeki esneme alanına mesafeyi yazın ve sekmenin altındaki esnemeyi kalibre et seçeneğine tıklayın.

Bunu takiben, nano gözenek kimlik numarası yukarı bakacak şekilde çenelere analiz için uygun boyutta bir poliüretan nano gözenekli membranı yanal olarak yerleştirin. Ardından, aletin yan tarafındaki esneme ayar kolunu kullanarak çeneleri analiz için gereken esneme seviyesine kadar gerin. Nano gözeneğin altındaki alt sıvı hücresine 80 mikrolitre PBST tamponu yerleştirin ve ölçümü etkileyebilecek kabarcık olmadığından emin olun.

Şimdi üst sıvı hücresini yerine oturtun ve kabarcık olmadığından emin olarak 40 mikrolitre tampon ekleyin. Ardından sistemin üzerine bir faraday kafesi yerleştirin ve metin protokolünde açıklandığı gibi harici bir basınç uygulayın. 40 mikrolitre kalibrasyon partikülünü üst sıvı hücresine yerleştirdikten sonra, uygulanan üç voltajda bir TRPS ölçümü yapın.

Yazılımdaki cihaz ayarları sekmesindeki voltaj ölçeğindeki artı ve eksi düğmelerine tıklayarak voltajı değiştirin. Üç voltajın uygun arka plan akımlarını döndürdüğünü kontrol edin. Ve orta voltajda, kalibrasyon parçacıklarının en az 0,3 nanoamperlik bir ortalama blokaj büyüklüğü ürettiğinden emin olun.

Metin protokolünde belirtilen koşullar sağlandıktan sonra, veri toplama sekmesindeki yazılımda başlat'a tıklayarak çalıştırmayı başlatın. Ölçümü tamamlamak için, veri toplama sekmesinde durdur'a tıklayın ve veri dosyasını kaydedin. Kalibrasyon partiküllerini 40 mikrolitre PBST tamponlu ile değiştirerek sistemi birkaç kez üst sıvı hücrelerine yıkayın.

Ve daha fazla blokaj olayı kalmayana kadar çeşitli basınçlar uygulayarak artık partikül ve çapraz kontaminasyon olmadığından emin olun. Uygun taban çizgisi akımı elde edildikten sonra, üst sıvı hücresindeki elektroliti 40 mikrolitre numune ile değiştirin. Veri alma sekmesinde başlat'a tıklayarak örnek çalıştırmayı başlatın.

En az 500 parçacık kaydedin ve çalışma süresinin en az 30 saniye olduğundan emin olun. Ölçümü tamamlamak için, veri toplama sekmesinde durdur'a tıklayın ve veri dosyasını kaydedin. Modifikasyon yapılmayan streptavidin kaplı partiküllerin ve yüzeyde tek sarmallı DNA ile doyurulmuş streptavidin kaplı partiküllerin boyut ve zeta potansiyeli analizinin bir örneği burada gösterilmiştir.

Her iki örnek de benzer büyüklükte olmasına rağmen, DNA parçacık yüzeyine işlevselleştirildiğinde zeta potansiyeli önemli ölçüde farklıydı ve çok daha büyüktü. Streptavidin kaplı partiküllere hibritlenmiş en düşük ve en yüksek DNA konsantrasyonlarına sahip numuneler için sergilenen boyut ve zeta potansiyeli verileri burada gösterilmektedir. Daha yüksek bir DNA konsantrasyonu ile hibritlenmiş parçacıklar için daha büyük bir zeta potansiyel değeri kaydedilir.

Sadece yakalanan problu DNA, tamamen tamamlayıcı bir DNA hedefi, bir orta bağlayıcı DNA hedefi, bir uç bağlayıcı DNA hedefi ve sarkan bir DNA hedefi için ölçülen zeta potansiyelindeki değişiklik burada gösterilmektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 20 dakika içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, numuneler arasında çapraz kontaminasyon olmadığından emin olmak ve herhangi bir nanopol tıkanmasını önlemek için her kalibrasyon ve numune arasında bir nanopolü iyice yıkamayı unutmamak önemlidir.

Geliştirilmesinden sonra bu teknik, biosenses alanındaki araştırmacıların multipleks tahlillerde protein-protein ve protein-DNA etkileşimlerini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, TRPS kullanarak zeta potansiyelinin nasıl elde edileceğini ve biyo-tahliller için DNA modifiye parçacıkların nasıl hazırlanacağını iyi anlamalısınız.