Name: Ölçümü İn Vitro HIV-1 Preintegration Kompleksleri Entegrasyon Etkinliği (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Öğrenin HIV-1 preintegrasyon komplekslerinin entegrasyon aktivitesini in vitro ölçme yöntemini. SupT1 hücrelerinden izole edilen PIC'lerle viral DNA entegrasyonunu nicelendirin ve antiretroviral tedavi hedefleri geliştirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen CD NIDA / NIH hibe DA024558, DA30896, DA033892 ve DA021471 tarafından desteklenmektedir. Biz de RCMI hibe G12MD007586 kabul, Vanderbilt CTSA UL1RR024975 hibe, Meharry Translational Araştırma Merkezi NCRR / NIH, NIMHD / NIH U54 hibe MD007593 ve Tennessee CFAR hibe P30 AI110527 dan (MeTRC) CTSA hibe U54 RR026140.

1. Virüs Üretimi Not: bulaşıcı HIV-1&#39;in yüksek titrelerini üretmek bir aktive dendrimer bazlı transfeksiyon reaktifi kullanarak bir enfeksiyon, HIV-1, moleküler klon, insan embriyonik böbrek (HEK) hücre çizgisi 293T transfekte etmek. Kalsiyum fosfat transfeksiyon yöntemi karşılaştırılabilir sonuçlar verir gözlenmiştir. <ol><li> Bir Biyolojik Güvenlik Seviye 2 (BSL2) Laboratuarda, tohum, 8 10 cm tabak başına 3 x 10 6 293T hücreleri mL% 10 fetal sığır serumu (FBS), penisilin ve streptomisin ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) içinde. Kültür, bir 37 ° C &#39;ye ayarlanmış inkübatör ve% 5 hücreleri CO2 O / N. </li><li> Sonraki gün, her biri 10 cm tabak hücreleri transfekte etmek için, serum ve antibiyotik yoksun DMEM 300 uL nihai hacim pNL4-3 plazmid DNA (bakınız Materyaller Tablo) 8 ug seyreltin. Transfeksiyon reaktifi 80 mcL pipetleme iyice karıştırın ve oda sıcaklığında inkübe5 - transfeksiyon kompleksi oluşumu için 10 dakika. </li><li> Aspirasyon ile yemeklerin orta çıkarın ve serum ve antibiyotik içeren taze DMEM çanak başına 7 mL ekleyin. </li><li> Transfeksiyon kompleksi DMEM içeren serum ve antibiyotik 1 ml ekleyin pipetleme karışım ve hücreler bu karışıma ekleyin. Yavaşça transfeksiyon komplekslerinden eşit dağılımını kolaylaştırmak için çanak girdap. </li><li> Hemen, 48 saat boyunca hücre CO2, 37 ° C ve% 5 ayarlanmış bir kuluçka makinesi içinde BSL3 laboratuar yerde hücreleri transferi, ve kültür. </li><li> bir pipet kullanılarak virüs içeren bir doku kültür süpernatant toplamak ve daha sonra bir santrifüj tüpüne transfer. 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj hücreleri ve yıkıntıları pelet haline, ve daha sonra bir 0.45 mikron gözenek boyutlu şırınga filtre ile süpernatant filtre. </li><li> Bu hücresiz virüsü hazırlanmasında herhangi bir devir plazmid DNA ortadan kaldırmak için 1 saat süreyle 37 ° C &#39;de DNase 1 (20 ug / ml) ile tedavi edilir. </li><li> ölçmek içinBu rutin kullanım 22 için hızlı ve müsait yöntem olarak, HİV-1 titre, p24-özel enzim bağlı immünosorbent deneyi (ELISA) kullanın. Not: p24 ELISA fiziksel titresi (virüs parçacıklarının sayısı) ölçen Belirtilmelidir. Seçenek olarak ise, virüs ilişkili RT aktivitesi (ekzojen RT deneyi) veya virüs enfeksiyonu (tzm-BL endikatör hücre hattı bazlı enfekte deneyleri) ölçüm enfeksiyonlu virüs parçacığı özel olarak okunmasını sağlayacaktır. </li></ol> Sup-T1 Hücreleri 2. Virüs Enfeksiyonu (BSL3 Lab) <ol><li> Bir BSL2 Laboratuarda, 1 6 ila 10 x 10 x 1,0 ile 6 ve 2.0 hücre / Roswell Park Memorial Institute (RPMI),% 10 ısı ile inaktive edilmiş FBS, penisilin ile desteklenen ortamda ve streptomisin mL (bölünme oranı Sup-T1 hücreleri korumak : 2 her 2-3 d). , Kültür şişeler Sup-T1 hücreleri havuz pipetle iyice karıştırın ve bir hemasitometre ve tripan mavisi dışlama st kullanarak canlı hücre sayısını belirlemekyöntemi Aining. <ol><li> 50 ml konik santrifüj tüpleri içinde (virüs enfeksiyonu başına) 80 x 10 6 hücre hacimde gerekli sayıda hazırlayın. </li><li> 500 xg bir sallanan kepçeli rotor hücreleri santrifüj ve 5 dakika boyunca 25 ° C. Hücre kültürü ortamı çıkarmadan daha fazla işlem için BSL-3 laboratuara tanelenmiş hücreler ihtiva eden tüpler aktarın. Dikkatle hücre pelletini bozmadan tüpten hücre kültür ortamı aspire. </li></ol></li><li> tüp içinde hücrelere DNase I ile tedavi edilen virüs aşı maddesi, uygun bir miktarda eklenir ve yavaşça pipetleme ile iyice karıştırın. 80 x 10 6 hücre için, DNase I ile tedavi edilen virüs (P24 eşdeğer virüsün 50 ug), 30 mL kullanımı. Not: Fonksiyonel PIC izolasyonu enfeksiyonun yüksek çokluklar ile (MOI) hedef hücreleri enfekte gerektirir. </li><li> Eşit, yani iki adet 6 oyuklu doku kültür plakaları (12 x 2.5 ml alikotları arasındaki karışım dağıtın, Infect başına 2 tabak kullanıniyon). </li><li> spinoculation için, sallanan bir kova 480 xg&#39;de rotor ve 2 saat 25 ° C ile plakası taşıyıcılar ve santrifüj kültür plakaları yerleştirin. </li><li> 5 saat boyunca CO2 37 ° C&#39;de spinoculated hücreleri inkübe ve% 5. </li></ol> Enfekte Hücre 3. Hasat ve Lizis (BSL3 lab) <ol><li> 50 ml konik santrifüj tüpüne kültür plakalarından her enfeksiyona karşı gelen hücreler (~ toplam 30 mL) havuz. </li><li> 300 x g&#39;de santrifüj ile hücreler hasat edilir ve 10 dakika için 25 ° C. Dikkatle tüpten aspire (alternatif, bir pipet kullanın). </li><li> Herhangi bir artık viral partikülleri çıkarmak için, tampon K 2 mL eklenerek her bir hücre pelletini yıkama - / - (150 mM KCI, 20 mM HEPES, pH 7.6, 5 mM MgCI2) ve 300 x g hızında numune ve 25 ° C sıcaklıkta santrifüj 10 dakika. Sonra, pelet bozmadan özenle aspirasyon veya bir pipet kullanarak süpernatant kaldırmak. </li><li> Repeat adım 3.3. </li><li> Dikkatlice mikropipet kullanarak herhangi bir kalıntı tampon kaldırmak. Buz soğukluğunda parçalama tamponu K 2 mL her bir hücre pelletini + / + (Tampon K - / -% 0.025 digitonin, 1 mM DTT, 20 ug / ml aprotinin ile takviye edilmiş), nazik bir pipetleme ile karıştırın ve transfer 2 ml mikrosantrifüj tüpü. </li></ol> Sitoplazmik PIC 4. Hazırlama (BSL3 lab) <ol><li> 10 dakika boyunca oda sıcaklığında bir döner çalkalayıcıda örnekleri sallayın. </li><li> 1.500 x g&#39;de 4 ° C&#39;ye soğutulmuş, rotor, numuneler santrifüj ve 4 dakika için 4 ° C. </li><li> pelet bozmadan, dikkatli bir şekilde 16,000 xg&#39;de taze mikrosantrifüj tüpü ve santrifüj süpernatantı transfer ve 1 dakika boyunca 4 ° C. </li><li> Dikkatle taze mikrosantrifüj tüp süpernatantı aktarın. 30 dakika (Resim sallanan), oda sıcaklığında ve içeriği 20 mg / ml (PIC 2 mL 2 uL) bir son konsantrasyona kadar, RNaz A (20 mg / ml) ilave edin ve inkübe edilir. &lt;/ Li&gt; <li> % 7 oranında bir nihai konsantrasyona kadar ve yumuşak pipetle iyice karıştırın - (- / tampon K 60 w% / hac) sakroz ekleyin. Sıvı nitrojen içinde flaş dondurma ve yer -80 uzun süreli depolama için ° C derin dondurucuda, mikrosantrifüj tüplerinde PIC hacimde (örneğin, 200 uL) hazırlayın. </li></ol> In Vitro Entegrasyon 5. (IVI) Tahliller, HIV-1 pics kullanma <ol><li> ölçüye primerler phiX174-F phiX174-R kullanılarak PCR ile phiX174 plazmid DNA&#39;sından 2.0 kb bölgenin amplifikasyonuyla IVI deneyinde kullanılan hedef DNA hazırlamak. <ol><li> Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi PCR karışımı bir araya getirin. Tablo 2&#39;de önerilen termal döngü koşulları kullanılarak, bir termal döngü PCR gerçekleştirin. (Üretici tarafından tavsiye edilen protokole göre) bir jel saflaştırma kiti kullanılarak PCR ürünü jelle saflaştırılması, ve kullanılana kadar -80 ° C &#39;de parçalar olarak saflaştırılmış bir hedef DNA saklayın. </li></ol></li><li> 200 hedef DNA&#39;nın 600 ng ekleyin - &amp; #181; PIC L tümböleni, iyice karıştırın ve 45 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. Not: Bir integraz inhibitörü (örn Raltegravir) hedef DNA atlama da dahil IVI reaksiyonları kontrol reaksiyonları tavsiye edilir. </li><li> % 0.5, 8 mM, sırasıyla 0.5 mg / mL, nihai konsantrasyonları SDS, EDTA, ve proteinaz K eklenerek IVI reaksiyonu durdurun. İyice reaksiyon içeriğini karıştırın ve gece boyunca 56 ° C kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Sonraki gün, fenol / kloroform ekstraksiyonu ve etanol çökeltmesiyle IVI reaksiyonu toplam DNA arındırmak. 16.000 xg ve oda sıcaklığında bütün santrifüj adımları uygulayın. </li><li> 2 dakika boyunca, deproteinize örnek fenol eşit hacmi ekleme vorteks ile kuvvetli bir şekilde karıştırın ve santrifüjlenir. Dikkatle üst sulu faz kaldırmak ve yeni bir tüp aktarın. </li><li> Adımı tekrarlayın 5.5. yeni bir tüp, üst sulu faz transfer. </li><li> , Kloroform karışımı vorteks ile kuvvetlice karıştırın ve santrifüj fo: 1 fenol: 1 eşit hacimde ekleR 2 dak. yeni bir tüp, üst sulu faz transfer. </li><li> Kloroform eşit hacmi ekleme vorteks ile kuvvetli bir şekilde karıştırın ve 2 dakika boyunca santrifüj. yeni bir tüp, üst sulu faz transfer. </li><li> DNA çökeltilmesi 0.3 M bir son konsantrasyona kadar 0.1 mg / ml, sodyum asetat 3 M nihai konsantrasyona glikojen ekleyin ve% 100 etanol (buz soğukluğunda) 2.5 hacim için. Vortex içeriğini toplamak için, santrifüj kısaca karıştırın ve -80 ° CO / N tüp yerleştirmek için. </li><li> Sonraki gün, 16,000 x g&#39;de 30 dakika boyunca örnek santrifüj ve 30 dakika boyunca 4 ° C. Dikkatle pelet bozmadan süpernatant kaldırmak. </li><li> 16.000 x g&#39;de topak ve santrifüj% 80 etanol (buz soğukluğunda) 500 uL ilave edin ve 10 dakika boyunca 4 ° C. Oda sıcaklığında, DNA topağı hava-kurutun ve iyice nükleaz içermeyen su, 50 uL yeniden süspanse edin. -20 ° C&#39;de DNA örnekleri saklayın. </li></ol> Ükler PIC Aktivitesi 6. PCR tahlilleri <ol><li> Entegre HIV-1 DNA kavşaklar çoğaltmak için (sırasıyla LTR ve phiX174 astar,), viral LTR ve phiX174 DNA hedefleyen primerler kullanılarak ilk turda geleneksel PCR gerçekleştirin. <ol><li> Tablo 3 de tarif edildiği gibi birinci fasıl PCR karışımı bir araya getirin. Şablon DNA hariç bütün bileşenlerin bir ana karışımı birleştirin, ayrı PCR tüpleri içine 45-uL&#39;lik dağıtmak ve şablon DNA veya nükleaz içermeyen su (kontrol) 5 mcL ekleyin. </li><li> Tablo 4 &#39;de tavsiye edilen termal döngü koşulları kullanılarak, bir termal döngü PCR gerçekleştirin. </li></ol></li><li> seçici olarak birinci ro entegre vDNA dizilerini amplifiye etmek için virüs LTR (LTR-R ve LTR-U primerler) kısa bir bölgeye yanaşan primerler kullanılarak ikinci tur qPCR gerçekleştirmekund PCR ürünleri. Entegre vDNA numara kopyalamak belirlemek için, bilinen kopya numaralarının 10x seri dilüsyonları kullanılarak standart bir eğri oluşturmak (örneğin, 10 0-10 8), HIV-1, moleküler klon. <ol><li> Tablo 5&#39;te tarif edildiği gibi ikincil qPCR karışımı bir araya getirin. 96 oyuklu bir PCR reaksiyonu plaka kuyuları uygun sayıda 25. uL&#39;lik tevzi dikkatle, şablon DNA hariç bütün bileşenlerin bir ana karışımı monte ve saflaştırılmamış birinci tur PCR ürünleri ya nükleaz içermeyen su 5 mcL (kontrol). üç kez tüm qPCR reaksiyonları gerçekleştirmek. </li><li> Real-time PCR aracı haline PCR plakasını yükleyin ve Tablo 6&#39;da tavsiye edilen bisiklet koşulları kullanılarak qPCR gerçekleştirin. </li><li> Uygun bir yazılım kullanarak verileri analiz edin. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Sattentau, Q. J., Weiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD4+antigen%3A+physiological+ligand+and+HIV+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The CD4 antigen: physiological ligand and HIV receptor.</a> Cell. 52 (5), 631-633 (1988).</li>
<li>Wilen, C. B., Tilton, J. C., Doms, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+HIV+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of HIV entry.</a> Adv Exp Med Biol. 726, 223-242 (2012).</li>
<li>Bowerman, B., Brown, P. O., Bishop, J. M., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nucleoprotein+complex+mediates+the+integration+of+retroviral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A nucleoprotein complex mediates the integration of retroviral DNA.</a> Genes Dev. 3 (4), 469-478 (1989).</li>
<li>Bukrinsky, M. I., Sharova, N., Dempsey, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+nuclear+import+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+preintegration+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Active nuclear import of human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes.</a> Proc Natl Acad Sci. 9 (14), 6580-6584 (1992).</li>
<li>Hansen, M. S., Smith, G. J. 3rd, Kafri, T., Molteni, V., Siegel, J. S., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+complexes+derived+from+HIV+vectors+for+rapid+assays+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integration complexes derived from HIV vectors for rapid assays in vitro.</a> Nature biotechnol. 17 (6), 578-582 (1999).</li>
<li>Farnet, C. M., Haseltine, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+DNA+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Integration of human immunodeficiency virus type 1 DNA in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci. 87 (11), 4164-4168 (1990).</li>
<li>Fujiwara, T., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+DNA+integration%3A+structure+of+an+integration+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retroviral DNA integration: structure of an integration intermediate.</a> Cell. 54 (4), 497-504 (1988).</li>
<li>Brown, P. O., Bowerman, B., Varmus, H. E., Bishop, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correct+integration+of+retroviral+DNA+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Correct integration of retroviral DNA in vitro.</a> Cell. 49 (3), 347-356 (1987).</li>
<li>Lewinski, M. K., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+DNA+integration--mechanism+and+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">Retroviral DNA integration--mechanism and consequences.</a> Adv Genet. 55, 147-181 (2005).</li>
<li>Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+DNA+integration%3A+mechanism+of+viral+DNA+cleavage+and+DNA+strand+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer.</a> Cell. 67 (6), 1211-1221 (1991).</li>
<li>Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+retroviral+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+rev+gen%22%5BJournal%5D)">Genetics of retroviral integration.</a> Ann rev gen. 26, 527-544 (1992).</li>
<li>Panganiban, A. T., Temin, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+terminal+nucleotides+of+retrovirus+DNA+are+required+for+integration+but+not+virus+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The terminal nucleotides of retrovirus DNA are required for integration but not virus production.</a> Nature. 306 (5939), 155-160 (1983).</li>
<li>Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+HIV-1+virion+genesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+host+microbe%22%5BJournal%5D)">The cell biology of HIV-1 virion genesis.</a> Cell host microbe. 5 (6), 550-558 (2009).</li>
<li>Sherman, P. A., Fyfe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+integration+protein+expressed+in+Escherichia+coli+possesses+selective+DNA+cleaving+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus integration protein expressed in Escherichia coli possesses selective DNA cleaving activity.</a> Proc Natl Acad Sci. 87 (13), 5119-5123 (1990).</li>
<li>Katzman, M., Katz, R. A., Skalka, A. M., Leis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+avian+retroviral+integration+protein+cleaves+the+terminal+sequences+of+linear+viral+DNA+at+the+in+vivo+sites+of+integration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The avian retroviral integration protein cleaves the terminal sequences of linear viral DNA at the in vivo sites of integration.</a> J Virol. 63 (12), 5319-5327 (1989).</li>
<li>Craigie, R., Mizuuchi, K., Bushman, F. D., Engelman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+in+vitro+assay+for+HIV+DNA+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+acid+res%22%5BJournal%5D)">A rapid in vitro assay for HIV DNA integration.</a> Nucl acid res. 19 (10), 2729-2734 (1991).</li>
<li>Bushman, F. D., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activities+of+human+immunodeficiency+virus+%28HIV%29+integration+protein+in+vitro%3A+specific+cleavage+and+integration+of+HIV+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Activities of human immunodeficiency virus (HIV) integration protein in vitro: specific cleavage and integration of HIV DNA.</a> Proc Natl Acad Sci. 88 (4), 1339-1343 (1991).</li>
<li>Pauza, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+bases+are+deleted+from+the+termini+of+HIV-1+linear+DNA+during+integrative+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Two bases are deleted from the termini of HIV-1 linear DNA during integrative recombination.</a> Virology. 179 (2), 886-889 (1990).</li>
<li>Engelman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+analysis+of+HIV-1+preintegration+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and analysis of HIV-1 preintegration complexes.</a> Meth Mol Biol. 485, 135-149 (2009).</li>
<li>Engelman, A., Oztop, I., Vandegraaff, N., Raghavendra, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+HIV-1+preintegration+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of HIV-1 preintegration complexes.</a> Methods. 47 (4), 283-290 (2009).</li>
<li>Addai, A. B., Pandhare, J., Paromov, V., Mantri, C. K., Pratap, S., Dash, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+modulates+HIV-1+integration+in+primary+CD4%2B+T+cells%3A+implications+in+HIV-1+pathogenesis+in+drug-abusing+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leuk+Biol%22%5BJournal%5D)">Cocaine modulates HIV-1 integration in primary CD4+ T cells: implications in HIV-1 pathogenesis in drug-abusing patients.</a> J Leuk Biol. 97 (4), 779-790 (2015).</li>
<li>Wehrly, K., Chesebro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p24+antigen+capture+assay+for+quantification+of+human+immunodeficiency+virus+using+readily+available+inexpensive+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents.</a> Methods. 12 (4), 288-293 (1997).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali ve mali olmayan çıkarları beyan ederim.

retroviral PIC biyokimyasal analizler retroviral DNA entegrasyonu mekanizması içine kritik bilgiler sağladı. Retroviral PIC entegrasyonu faaliyetinin ölçülmesi plak formasyonu deneyi, Güney benek analizi, ve iç içe geçmiş qPCR elde edilebilir. Plak deneyi deneysel strateji zahmetlidir ve entegrasyonu 6, 7, 18 ölçmek için dolaylı bir yöntem kullanmaktadır. Güney benek bazlı deneyler ölçer entegrasyonu doğrudan değil, PIC <sup cl...

Erken ve geç olayların: hedef hücre içinde, HIV-1 replikasyon genel olarak iki faza gruplanmış birden fazla aşamasını içerir. HİV-1, sırasıyla, hedef hücre yüzeyi reseptörü, CD4 ve iki ko-reseptörleri (CCR5 ya da CXCR4) 1 birine bağlandığı zaman, erken olayları başlar. Sonuç olarak, virüs-hücre membranları sigorta ve viral kapsid (CA), çekirdek sitoplazmaya 2 salınır. CA temel viral ve kaynaklı hücresel hem de viral genomik tek şeritli RNA (ssRNA) ve çeşitli proteinleri içerir. CA-ilişkili viral proteinler ters transkriptaz (RT) ve integraz (İN), viral replikasyon erken olaylan sırasında kritik adımları aracılık iki enzimler bulunmaktadır. RT ve nükleoprotein kompleksleri, yani ters transkripsiyon kompleksi (RTC) ve ön-uyum kompleksi (PIC), sırasıyla, 3, 4, 5 kapsamında işlevin &lt;sup&gt;, 6. &#39;(Sonunda 3&#39;ün at) (sonu ve U3 viral ssRNA genom liman terminal tekrarı (R) 5&#39; ucunda) &#39;eşsiz dizileri U5 bitişik elemanları biter. RTC çift-şeritli (ds) DNA kopyasını (vDNA) viral ssRNA genomu dönüştürür. Bu ters transkripsiyon işlemi, bu şekilde vDNA 7, 8 her iki ucunda uzun terminal tekrarları (LTR) üretilmesi, U5 ve U3 dizilerinin çoğaltılması ile sonuçlanır. Daha sonra, PIC-ilişkili IN konukçu kromozom 9, 10, 11 içine vDNA entegrasyonunu sağlayan iki sıralı biyokimyasal reaksiyonları katalize eder. İlk olarak, sitoplazmada, multimerler her iki LTR 12 meşgul ve 3&#39;-terminal uçlarının her birinden bir dinükleotid bölmektedir. Bu 3&#39;-uç işleme, her 3&#39;-ucunda vDNA (Ca OH) bir hidroksil grubu oluşturur.Zikzaklı bir şekilde kromozomal DNA&#39;nın her iki kolunu kesmek için bir nükleofil olarak OH vDNA CA; buradaki sonra, PIC çekirdeğe trafik işlemlerini gerçekleştirir. Aynı zamanda, İN koordineli kromozomal DNA karşı sarmalda elde fosfodiester bağlarına vDNA her iki ucunu birleşim yerlerinin. Bu şerit transferi adımından sonra, konak hücre makine entegrasyonu sitenin kavşakta 5 &#39;vDNA uçlarına ve onarım takip eden tek sarmallı boşluklar iki eşleşmemiş nükleotidleri kaldırır. Erken olaylar dolayısıyla HIV-1 genomunun entegre DNA kopyası (provirus) kurulmasıyla sonuçlanacak. Provirüs virüs kodlanmış proteinlerin ekspresyonu dahil olmak üzere, daha sonraki olayları başlattığı etkin viral gen ekspresyonu için uygun bir ortam sağlar; olgunlaşmamış virüs montaj; ve bulaşıcı virionlar 13 içine tomurcuklanma, serbest ve olgunlaşma. Saflaştırılmış rekombinant retroviral IN yetkili olduğunuin vitro, yürütmek, hem 3&#39;-uç işleme ve iplik aktarma faaliyetleri Eksojen LTR-benzeri DNA ana madde sağladı. Arıtılmış yeniden birleştirici kullanarak biyokimyasal çalışmalar, vDNA entegrasyonu 14, 15, 16, 17 kritik yönleri ortaya koymuştur. Bununla birlikte, doğal enfeksiyon farklı olarak, bu in vitro biyokimyasal reaksiyon, hedef DNA&#39;ya alt-tabaka DNA&#39;nın her iki ucundan ortak entegre desteklemez. Bunun aksine, akut olarak enfekte olan hücrelerden izole retroviral PIC concertedly heterolog hedef DNA&#39;ya endojen vDNA her iki ucunu birleştirmek. Bu izole yerli Pics kullanarak yaygınlaşmasının ve ben n Vitro Entegrasyonu (IVI) deneyleri sonraki iyileştirmelere yol açtı. İlk olarak retroviral IVI deneyi, bir rekombinant sıçan ile enfekte edilmiş hücrelerden alınan sitoplazmik özler raporBunu LTR E. coli supF genini barındıran Lösemi Virüsü (MLV) aktivite kaynağı ve litik büyüme hatalı dışsal, hedef DNA olarak verilen bir mutan lambda faj DNA olarak görev yaptı. rekombinant DNA MLV Başarılı entegrasyon faj DNA kopyalamak ve supF takip eden ifade rekombinant faj plak oluşturan yeteneğini restorasyonu yol açtı. Bununla birlikte, bu deneysel strateji dolaylı şekilde zahmetli ve önlemler entegrasyondur. Bu uyarılar gidermek için, eksojen doğrusallaştırılmış bakteriyofaj phiX174 DNA&#39;sına entegre endojen vDNA bir ölçüsü olarak, PIC ilişkili IVI aktivitesi nicelleştiren bir Güney benek tabanlı dolaylı uç işaretleme analizi, 18 7, 6 geliştirilmiştir. Bu yöntem entegrasyon olayların doğrudan ölçüsünü verir rağmen, PIC hazırlık nispeten yüksek miktarlarda teknik olarak oldukça zor kalır, gerekligayret. Bu aşmak için, PIC bölgesinin sadece az miktarda gereken iç içe PCR bazlı deneyler, 19 5, 4 geliştirilmiştir. Bu yazıda güncelleştirilmiş bir sürümünü tanımlayan bir iç içe doğal enfeksiyon sırasında meydana gelen HIV-1 PIC-aracılı entegrasyon faaliyeti özetlemek için tasarlanmış in vitro yöntem PCR tabanlı. Bu yöntem, bir gerçek zamanlı kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qPCR) ölçülen endojen PIC aktivite kaynağı olarak, HİV-1 ile enfekte edilmiş hedef hücrelerin sitoplazmik özler kullanılır. Onların entegrasyon faaliyetlerini PICS izole ve ölçmek için prosedürler Engelman laboratuvar 20 tarafından yayınlanan protokollerden, değişikliklerle, adapte edilir. Bu yöntemde PIC ilişkili entegrasyon aktivitesi eksojen bir doğrusal hedef DNA 21 ve elde edilen DNA ürünleri temin edilmesiyle başlatılırBu entegrasyon, reaksiyon saf hale getirilir ve daha sonra, PCR tabanlı bir miktar tayini için başlangıç ​​malzemesi olarak kullanılır. Birinci turda, geleneksel PCR, viral hedef DNA, kavşaklar, uygun primerler kullanılarak yükseltilir. ikinci turda qPCR, LTR-özel primerler, özellikle ilk tur PCR ürünlerinden vDNA popülasyonu ettirecek kullanılır. Bu yöntemin ayrıntılı bir açıklama için protokol bölümüne bakın. Retroviral PIC ile in vitro çalışmalar retroviral DNA entegrasyon mekanizması anlayışımızda ve IN inhibitörlerinin gelişiminde önemli ilerlemelere yol açmıştır. HIV-1 entegrasyon viral ve konak faktörlerin rolünü belirlemek ve ilaç direncini mücadele yolunda yeni antiviral ilaçlar geliştirmek, haritalama, HIV-1 bütünleşme sitelerinde son artan odak dayanarak, IVI deneylerinin bir artış ilgi ve yaygın kullanımı tasavvur Bu raporda açıklanan gibi. Bu da, yol açacaktıryönteminde gelecek iyileştirmeler, böylece onun uygulamalarının kapsamını çeşitlendirilmesi.

<table><tbody><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 10437-028 </td><td></td></tr><tr><td>Isıyla İnaktive Fetal Sığır Serumu (Hi-FBS)</td><td> GIBCO/Invitrogen < </td><td> p>10438-026 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s ortamı (DMEM) </td><td> GIBCO / Invitrogen </td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 orta </td><td> GIBCO / Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfat tamponlu Salin (PBS) (1x) </td><td> GIBCO / Invitrogen </td><td> 20012-027 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsin-EDTA (%0.25) </td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin-Streptomisin çözeltisi (100x) </td><td> Cellgro/Mediatech </td><td> 30-002-CI HEK293T </td><td></td></tr><tr><td> hücreleri (293T) </td><td> Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC)</s> </td><td> CRL-3216 </td><td></td></tr><tr><td> HIV-1 proviral moleküler klon pNL4-3 </td><td> NIH AIDS Araştırma ve Referans Reaktif Programı </td><td> 114 </td><td></td></tr><tr><td> PolyFect transfeksiyon reaktifi </td><td> Qiagen </td><td> 301107 </td><td></td></tr><tr><td>DNase 1 </td><td> Calbiochem/Merckmillipore </td><td> 260913 </td><td></td></tr><tr><td>Sup-T1 hücreleri</td><td> Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC) </td><td> CRL-1942 </td><td></td></tr><tr><td>HEPES pH 7.2 - 7.5 (kullanıma hazır çözelti)</td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> potasyum klorür (KCl) çözeltisi </td><td> Sigma-Aldrich< </td><td> 60142 </td><td></td></tr><tr><td> p>Magnezyum klorür (MgCl2) çözelti </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1028 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 43815 </td><td></td></tr><tr><td> Aprotinin </td><td> Sigma-Ald<rich /s> </td><td> A6106 </td><td></td></tr><tr><td> Digitonin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D141 </td><td></td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Invitrogen </td><td> 12091-021 </td><td></td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> phiX174 Replikatif Form 1 DNA </td><td> Promega </td><td> D1531 </td><td></td></tr><tr><td> PhiX174-F astar: 5'-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3' PhiX174-R astar: 5'-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3' </td><td> canlandırıcı ve/veya IDT-DNA </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> dNTP karışımı </td><td> Promega </td><td> U1515 </td><td></td></tr><tr><td> Go Taq DNA Polimeraz </td><td> Promega </td><td> M3005 </td><td></td></tr><tr><td> Qiaquick jel ekstraksiyon kiti </td><td> Qiagen </td><td> 28706 </td><td></td></tr><tr><td> Ultra saf damıtılmış su </td><td> Invitrogen </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE) tamponu (100x)</td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9285 </td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)</td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L3771 </td><td></td></tr><tr><td> Etilendiamin tetraasetik asit, disodyum tuzu (EDTA) çözeltisi, 0,5 M, pH 8,0 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7889 </td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K (20 mg/mL kullanıma hazır solüsyon)</td><td> Qiagen </td><td> 19131 </td><td></td></tr><tr><td> Fenol (10&nbsp; mM Tris HCl, pH&nbsp; 8.0 ve 1&nbsp; mM EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4557 </td><td></td></tr><tr><td> Kloroform </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 288306 </td><td></td></tr><tr><td>Glikojen (5 mg/</td><td> Ambion/Invitrogen </td><td> AM9510 </td><td></td></tr><tr><td>Sodyum asetat (3 M, pH 5.2)</td><td> Sigma-Aldrich </td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7023 </td><td></td></tr><tr><td>İlk tur LTR astarı: 5'-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3' İlk tur phiX174 astar: 5'-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3' </td><td> Canlandırıcı ve/veya IDT-DNA </td><td> --- </td><td></td></tr><tr><td>İkinci tur LTR-R astar: 5'-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3' İkinci tur LTR-U astar: 5'-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3' İkinci tur Taqman probe: &nbsp; 5'-6- FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC CTTGAGTGC/6-TAMRA/-3' </td><td> Invitrogen ve/veya IDT-DNA </td><td> --- </td><td></td></tr><tr><td> iQ Supermix </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8862 </td><td></td></tr></tbody></table>

Ölçümü İn vitro hiv-1 preintegration kompleksleri entegrasyon etkinliği

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 kaplama proteinleri sitoplazmaya Viral kapsid (CA) çekirdeğin serbest ardından viral hücre zarı birleşmesine yol açar, hedef hücre yüzeyi üzerinde aynı kökenli reseptörleri girerler. Daha sonra, viral ters transkriptazı (RT), bir adaşı nükleoprotein kompleksinin bir parçası olarak karmaşık Ters Transkripsiyon (RTC), çift iplikçikli bir DNA kopyasını (vDNA) viral tek iplikli RNA genomunu dönüştürür olarak adlandırılır. Bu, başka bir nukleoprotein kompleksinin biyogeneze açar, vDNA ve ilişkili virüs proteinleri ve konak faktörlerinin oluşan ön entegrasyon kompleksi (PIC) olarak adlandırılan. PIC-ilişkili viral integraz (İN), bir geçici ve mekansal olarak düzenlenmiştir, iki aşamalı bir işlemde konak kromozomal DNA içine vDNA entegrasyonunu yönetir. İlk olarak, PIC çekirdeğine trafik işlemlerini sonra, kromozomal DNA içine işlenmiş vDNA entegrasyonunu aracılık ikinci sitoplazmada vDNA 3 &#39;uçları işler ve. PIC izolebunlar, bir eksogen olarak ilave heterolog hedef DNA&#39;ya ilişkili vDNA entegre yetkinliğe sahip olan akut HIV-1 ile enfekte edilmiş hedef hücrelerden in vitro fonksiyonel. Böyle bir PIC tabanlı in vitro entegrasyon tayinlerde anlamlı retroviral entegrasyon mekanik ayrıntılarını ortaya koymayı amaçlayan ve inhibitörleri IN keşfetmek katkıda bulunmuştur. Bu yazıda, izole yerli PIC in vitro entegrasyon aktivitesini ölçmek için iç içe geçmiş bir gerçek zamanlı kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qPCR) tabanlı bir strateji benimseyerek güncelleştirilmiş bir HIV-1 PIC tahlil üzerine ayrıntılı.

HIV-1 PIC bölgesinin izolasyonu Akut enfekte Sup-T1 hücreleri, HIV-1 PIC bölgesinin izolasyonu için kullanılan protokolün bir şeması, Şekil 1 'de tasvir edilmiştir. Bu protokol, Engelman ve ark anlatılan yöntemlerle elde edilir. 19, 20. HIV-1 PIC enfekte olmuş hücreler toplandı ve ters-transkribe vDNA oluşmaktadır nükleoprotei...

Bu rapor, akut enfekte olmuş hücrelerin sitoplazmik ekstraktlarında insan immün yetmezlik virüsü tip 1 (HIV-1) ön entegrasyon kompleksi (PIC) ile ilişkili entegrasyon aktivitesini ölçmek için bir in vitro testi açıklar. PIC ile ilişkili HIV-1 DNA'sının heterolog hedef DNA'ya entegrasyonu, iç içe geçmiş bir gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu stratejisi kullanılarak ölçülür.

Ölçümü İn Vitro HIV-1 Preintegration Kompleksleri Entegrasyon Etkinliği

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

Bu prosedürün genel amacı, HIV-1 ile enfekte SupT1 hücrelerinden izole edilen ön entegrasyon komplekslerinin veya PIC'lerin in vitro entegrasyon aktivitesini ölçmektir. Bu yöntem, HIV biyolojisindeki bazı önemli sorulara, özellikle de belirli konak faktörlerinin ve viral faktörlerin, örneğin viral kapsidin, HIV-1 DNA entegrasyonunda nasıl bir rol oynadığına cevap verecek ve bunu yapmak, antiretroviral tedavi için yeni hedefler tasarlamamıza veya tanımlamamıza yardımcı olacaktır. Bu yöntemin temel avantajı, entegrasyon aktivitesini in vitro olarak ölçmek için nispeten küçük miktarda ön entegrasyon kompleksi veya PIC hazırlığı gerektirmesidir.Bu tekniğin etkileri, HIV-1 AIDS'in teşhisine ve tedavisine kadar uzanabilir ve bunun nedeni, bu tekniğin önceki versiyonlarının, günümüzde klinik kullanımda en önemli anti-HIV ilaçlarından biri olan HIV-1 integraz inhibitörlerinin keşfinde kritik öneme sahip olmasıdır, bu nedenle bu yöntem sadece HIV-1 entegrasyonunu anlamak için kullanılamaz, ancak RSV ve MLV gibi diğer retrovirüsleri incelemek için de uygulanabilir. Bu protokolü gösteren, laboratuvarda doktora sonrası araştırmacı olan Dr.Muthukumar Balasubramaniam olacak. SupT1'i HIV-1 ile enfekte etmek için, bir BSL-2 laboratuvarında, SupT1 hücrelerini Roswell Park Memorial Enstitüsü'nde veya %10 FBS ve Pen-Strep ile desteklenmiş RPMI ortamında mililitre başına 10 ila altıncı hücre arasında bir ila iki kez tutun.Metin protokolüne göre yüksek enfeksiyöz HIV-1 titreleri oluşturduktan sonra, SupT1 hücrelerini kültür şişelerinden toplayın, pipetleyerek iyice karıştırın ve canlı hücre sayısını belirlemek için bir hemositometrede tripan mavisi dışlama boyaması kullanın. 50 mililitrelik konik santrifüj tüplerinde virüs enfeksiyonu başına sekiz kez 106 hücre alikot, daha sonra hücreleri beş dakika boyunca 500 kez g ve 25 santigrat derecede sallanan bir kova rotorunda santrifüjleyin. Hücre kültürü ortamını çıkarmadan, peletlenmiş hücreler içeren tüpleri daha sonraki işlemler için BSL-3 laboratuvarına aktarın, ardından peleti bozmadan ortamı tüpten dikkatlice aspire edin.Daha sonra, hücrelere 30 mililitre DNaz I ile muamele edilmiş virüs aşısı ekleyin ve hafifçe pipetleyerek karıştırın, ardından karışımı iki altı kuyulu doku kültürü plakası arasında eşit olarak dağıtın. Spinokülasyon için, kültür plakalarını plaka taşıyıcılara yerleştirin ve iki saat boyunca 480 kez g ve 25 santigrat derecede sallanan bir kova rotorunda santrifüjleyin, ardından hücreleri beş saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Enfekte olmuş hücreleri toplamak ve parçalamak için, her enfeksiyona karşılık gelen hücreleri 50 mililitrelik bir konik santrifüj tüpüne toplayın.Hücreleri 10 dakika boyunca 300 kez g ve 25 santigrat derecede santrifüjleyin, ardından süpernatanı dikkatlice aspire edin veya pipetleyin. Artık virüs partiküllerini çıkarmak için, her bir peleti iki mililitre tampon K eksi eksi ekleyerek yıkayın ve numuneyi tekrar döndürün, ardından peleti bozmadan, yıkamayı bir kez daha tekrarlamadan önce süpernatanı aspirasyon veya bir pipetle dikkatlice çıkarın. Artık tamponu bir mikropipetle dikkatlice çıkardıktan sonra, her bir peleti nazikçe yeniden süspanse etmek ve iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için buz gibi soğuk lizis tamponu K plus plus kullanın.Sitoplazmik ön entegrasyon kompleksleri veya PIC'ler hazırlamak için, numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika boyunca sallayın, daha sonra tüpleri dört santigrat dereceye kadar önceden soğutulmuş bir rotora yerleştirin ve dört dakika boyunca 1.500 kez g ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Peleti bozmadan, süpernatanı dikkatlice yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve bir dakika boyunca 16.000 kez g ve dört santigrat derecede döndürün. Süpernatanı dikkatlice taze bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın, ardından RNase A'yı mililitre başına 20 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona ekleyin ve içeriği 30 dakika boyunca sallanmadan oda sıcaklığında inkübe edin.% 7'lik bir nihai konsantrasyona sükroz ekleyin ve hafifçe pipetleyerek iyice karıştırın, ardından mikrosantrifüj tüplerinde PIC'lerin alikotlarını hazırlayın. Sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun ve uzun süreli saklama için eksi 80 santigrat derece dondurucuya koyun. İn vitro entegrasyonda veya IVI testinde kullanılan hedef DNA'yı hazırlamak için, özel yapım phiX174-Forward ve phiX174-Reverse primerlerini kullanarak phiX174 plazmit DNA'sından 2.0 kilobazlık bir bölgeyi amplifiye etmek için PCR karışımlarını birleştirin ve programı metin protokolüne göre kullanarak PCR gerçekleştirin.Numuneyi jel saflaştırdıktan ve alikosyondan sonra, 200 mikrolitre PIC'e 600 nanogram hedef DNA ekleyin. İyice karıştırın ve 37 santigrat derecede 45 dakika inkübe edin. SDS, EDTA ve proteinaz K ekleyerek IVI reaksiyonunu durdurun, ardından reaksiyon içeriğini iyice karıştırın ve gece boyunca 56 santigrat derecede inkübe edin.Ertesi gün, IVI reaksiyonundan toplam DNA'yı saflaştırmak için, deproteinize edilmiş numuneye eşit miktarda fenol ekleyin. Girdap yaparak kuvvetlice karıştırın ve iki dakika santrifüjleyin. Fenol ekstraksiyonunu tekrarlamadan önce üst sulu fazı dikkatlice çıkarın ve taze bir tüpe aktarın, ardından eşit hacimde bir fenol kloroform ekleyin.Numuneyi girdaplayarak karıştırın ve tüpü iki dakika santrifüjleyin, ardından üst sulu fazı yeni bir tüpe aktarın. Metin protokolüne göre kloroform ile ekstrakte edildikten sonra, mikrolitre başına 0.1 mikrogram glikojen, 0.3 molar sodyum asetat ve 2.5 hacim buz gibi soğuk %100 etanol ekleyerek DNA'yı sulu fazdan çökeltin. Tüpü gece boyunca eksi 80 santigrat dereceye yerleştirin.Ertesi gün, numuneyi 30 dakika boyunca 16.000 kez g ve dört santigrat derecede santrifüjleyin, ardından peleti bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın. PIC aktivitesini ölçmek için PCR gerçekleştirmek için, entegre HIV-1 DNA'sının bağlantılarını amplifiye etmek için viral LTR ve phiX174 DNA'sını hedefleyen primerler kullanarak ilk geleneksel PCR turu ile başlayın. Ana karışımı eksi şablon DNA'yı burada belirtildiği gibi birleştirin, ardından 45 mikrolitrelik alikotları ayrı PCR tüplerine dağıtın ve kontrol olarak beş mikrolitre şablon DNA veya nükleaz içermeyen su ekleyin.Metin protokolünde belirtilen programı kullanarak reaksiyonu bir termodöngüleyicide çalıştırın, ardından ikinci bir kantitatif PCR turu gerçekleştirin ve verileri metin protokolüne göre analiz edin. Bu IVI testinde, SupT1, HIV-1 ile tedavi edilen DNAse I ve HIV-1 integraz inhibitörü Raltegravir'in yokluğu veya varlığı ile spinoküle edildi. İnkübasyondan sonra, PIC'ler izole edildi ve saflaştırılmış DNA, viral DNA'nın entegrasyonu için analiz edildi.Burada gösterildiği gibi, HIV-1 PIC'ler, ilişkili viral DNA'yı hedef DNA'ya sağlam bir şekilde entegre eder ve PIC'lerin IVI verimliliği, bu testte ölçülen entegrasyon aktivitesini HIV-1 integrazına güçlü bir şekilde ima eden Raltegravir ile desteklenen reaksiyonlarda büyük ölçüde azalmıştır. Kontrol reaksiyonları herhangi bir entegrasyon aktivitesi göstermedi. Ek olarak, PCR'nin ilk turunda Taq polimerazı dışlayan kontrol, entegrasyon ürünlerini amplifiye etmedi.Özellikle, tek başına PIC'lerin kontrolünden elde edilen veriler, iç içe geçmiş qPCR stratejisinin spesifik olarak entegre viral DNA'yı ölçtüğünü, ancak PIC ile ilişkili viral DNA'yı ölçmediğini gösterdi. Toplu olarak, bu veriler PIC ile ilişkili entegrasyon etkinliğini gösterir. Bir kez ustalaştıktan sonra, PIC aktivitesini ölçmek için virüs hazırlama ve PCR testleri bir hafta içinde tamamlanabilir.SupT1 hücrelerinin enfekte olması ve PIC'lerin enfekte hücrelerden izolasyonu bir günde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, HIV-1 PIC'lerin nasıl izole edileceğini ve in vitro entegrasyon aktivitesinin nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız. Yüksek bulaşıcı HIV-1 titreleri ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken önlük ve önlük, çift eldiven ve koruyucu gözlük gibi koruyucu giysiler de dahil olmak üzere uygun önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

measurement-vitro-integration-activity-hiv-1-preintegration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Uncoating HIV-1 yaşam döngüsünün ilk aşamasında önemli bir adım ve kapsid kabuk sökülmesi ve viral ribonükleoprotein kompleksi (vRNP) serbest bırakılması olarak tanımlanır. Burada, HIV-1 virionlar sağlam çekirdek tecrit ve bunların uncoating ölçülmesi için teknikleri...

HIV-1 Çekirdek in vitro Uncoating

Bu makale toplam iç yansıma floresans (TIRF) mikroskop camı desteklenen düzlemsel bilayers bir HIV-1 zarf kaynaklı virolojik sinaps oluşumu görselleştirmek için bir yöntem açıklanır. Yöntem ayrıca, HIV-1 zarfı ile endüklenen virolojik sinaps oluşumu sırasında meydana gelen sinyal molekülleri aktivasyonu ve dağıtılması algılamak için immünfloresans boyama yöntemi ile kombine edilebilir.

Görüntülemede HIV-1 Zarf bağlı Virolojik Synapse ve Sentetik Lipid Bilayers üzerine Sinyal

Bu video, plazmositoid dendritik hücrelerin HIV-1 Enfekte CD4+ T hücreleri tarafından uyarılmasını takiben salınan tip-I interferonları (IFNler) ölçmek için HEK-Blue interferon-α/β raportör hücreleri kullanılarak salgılanan embriyonik alkalin fosfataz testini göstermektedir.

Salgılanan Embriyonik Alkalen Fosfataz Raportör Testi Kullanılarak Biyoaktif Tip-I İnterferonların Miktar Tayini

Viral yüzey antijenleri konformasyonlarını anlamak, antikor nötralizasyonunu değerlendirmek ve etkili aşı immünojenlerinin tasarımına rehberlik etmek için gereklidir. Burada, spesifik anti-Env antikorları tarafından transfekte edilmiş hücrelerin yüzeyinde eksprese edilen trimerik HIV-1 Env'nin tanınmasının çalışmasına izin veren hücre bazlı bir ELISA testini açıklıyoruz.

Bir Hücre temelli bir ELISA testi kullanarak, HIV-1 zarf trimerik Glikoproteinler konformasyonel Değerlendirilmesi

İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) partiküllerinden eksozomları ayırmak için bir gradyan prosedürünü tanımlayan teknikler açıklanmıştır. Bu prosedür, HIV ile enfekte olmuş bireylerden insan plazmasındaki HIV partiküllerinden eksozomları izole etmek için kullanıldı. İzole edilen eksozomlar sitokin / kemokin içeriği açısından analiz edildi.

HIV-1 pozitif Bireylerin Plazma eksozomlann izolasyonu

Enfekte hücrelerin genomik DNA'sından retroviral entegrasyon bölgelerini amplifiye etmek, amplifiye edilmiş virüs-konak bağlantılarını dizilemek ve daha sonra bu dizileri bir referans genoma eşlemek için bir protokol açıklıyoruz. Ayrıca, BEDTools kullanarak çeşitli genomik açıklamalara göre entegrasyon bölgelerinin dağılımını ölçmek için teknikler de açıklıyoruz.

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

HIV-1 replikasyon döngüsünün entegrasyon sonrası adımlarını hedefleyen RNA moleküllerinin etkinliğini ve toksisitesini değerlendirme yöntemleri açıklanmıştır. Bu yöntemler, yeni molekülleri taramak ve mevcut moleküllerin formatını optimize etmek için kullanışlıdır.

Bir gen ya da ilaç terapisinde kullanım için, HIV-1 üretim yapan RNA&#39;lar etkinlik ve toksisite Değerlendirilmesi

Bu el yazması, aynı anda yukarı akış ve aşağı akış vektör-konakçı bağlantı DNA'sını analiz edebilen çift yönlü bir entegrasyon alanı tahlilinin deneysel prosedürünü ve yazılım analizini anlatmaktadır. Çift yönlü PCR ürünleri, herhangi bir aşağı akım sıralama platformu için kullanılabilir. Ortaya çıkan veriler, entegre DNA hedeflerinin yüksek verimli, niceliksel bir karşılaştırması için kullanışlıdır.

Çift Yönlü Retroviral Entegrasyon Sitesi PCR Metodolojisi ve Kantitatif Veri Analizi İş Akışı

İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) ex vivo insan kurcalayarak enfeksiyon virüs Patogenez değerli bir 3D modeli sağlar. Burada, işlemek ve doku örnekleri insan bademcikler ve kadın genital mucosae HIV-1 enfekte ve kültür sıvı-AIR arabirimiyle, proje için bir protokol açıklayın.

Ex Vivo İnsan lenfoid doku ve erkek Genital mukoza insan immün yetmezlik virüsü 1 ve Histoculture ile enfeksiyonun

HIV-1 füzyon yoluyla üzerinde akış sitometresi veya floresan mikroskopi tarafından algılanabilir yeşil flüoresan proteinin ifade bildirmek için bir hücre tabanlı tahlil açıklar. İnhibitörleri (füzyon aşamada özellikle) viral girdisinin boş hücre ve hücre-hücre enfeksiyonu sistemlerinde test etmek için kullanılabilir.

Bir yüksek-den geçerek Cre-Lox Viral membran Fusion tahlil inhibitörleri HIV-1 Viral membran füzyon tanımlamak için aktive

Burada, özellikle HIV-1 enfeksiyonuna vurgu yaparak, endoplazmik retikulum (ER) stresini ve katlanmamış protein yanıtı (UPR) aktivasyonunu belirlemek için bazı yerleşik yöntemleri açıklıyoruz. Bu makalede ayrıca ER stresi/UPR'nin HIV-1 replikasyonu ve virion enfektivitesi üzerindeki etkisini araştırmak için bir dizi protokol açıklanmaktadır.

HIV-1 ile Enfekte T Hücrelerinde Endoplazmik Retikulum Stresi ve Katlanmamış Protein Yanıtının Ölçülmesi ve HIV-1 Replikasyonundaki Rolünün İncelenmesi

Öğrenin HIV-1 preintegrasyon komplekslerinin entegrasyon aktivitesini in vitro ölçme yöntemini. SupT1 hücrelerinden izole edilen PIC'lerle viral DNA entegrasyonunu nicelendirin ve antiretroviral tedavi hedefleri geliştirin.

Ölçümü İn Vitro HIV-1 Preintegration Kompleksleri Entegrasyon Etkinliği

Daha fazla video keşfet