Ölçümü İn Vitro HIV-1 Preintegration Kompleksleri Entegrasyon Etkinliği

Bu prosedürün genel amacı, HIV-1 ile enfekte SupT1 hücrelerinden izole edilen ön entegrasyon komplekslerinin veya PIC'lerin in vitro entegrasyon aktivitesini ölçmektir. Bu yöntem, HIV biyolojisindeki bazı önemli sorulara, özellikle de belirli konak faktörlerinin ve viral faktörlerin, örneğin viral kapsidin, HIV-1 DNA entegrasyonunda nasıl bir rol oynadığına cevap verecek ve bunu yapmak, antiretroviral tedavi için yeni hedefler tasarlamamıza veya tanımlamamıza yardımcı olacaktır. Bu yöntemin temel avantajı, entegrasyon aktivitesini in vitro olarak ölçmek için nispeten küçük miktarda ön entegrasyon kompleksi veya PIC hazırlığı gerektirmesidir.

Bu tekniğin etkileri, HIV-1 AIDS'in teşhisine ve tedavisine kadar uzanabilir ve bunun nedeni, bu tekniğin önceki versiyonlarının, günümüzde klinik kullanımda en önemli anti-HIV ilaçlarından biri olan HIV-1 integraz inhibitörlerinin keşfinde kritik öneme sahip olmasıdır, bu nedenle bu yöntem sadece HIV-1 entegrasyonunu anlamak için kullanılamaz, ancak RSV ve MLV gibi diğer retrovirüsleri incelemek için de uygulanabilir. Bu protokolü gösteren, laboratuvarda doktora sonrası araştırmacı olan Dr.Muthukumar Balasubramaniam olacak. SupT1'i HIV-1 ile enfekte etmek için, bir BSL-2 laboratuvarında, SupT1 hücrelerini Roswell Park Memorial Enstitüsü'nde veya %10 FBS ve Pen-Strep ile desteklenmiş RPMI ortamında mililitre başına 10 ila altıncı hücre arasında bir ila iki kez tutun.

Metin protokolüne göre yüksek enfeksiyöz HIV-1 titreleri oluşturduktan sonra, SupT1 hücrelerini kültür şişelerinden toplayın, pipetleyerek iyice karıştırın ve canlı hücre sayısını belirlemek için bir hemositometrede tripan mavisi dışlama boyaması kullanın. 50 mililitrelik konik santrifüj tüplerinde virüs enfeksiyonu başına sekiz kez 106 hücre alikot, daha sonra hücreleri beş dakika boyunca 500 kez g ve 25 santigrat derecede sallanan bir kova rotorunda santrifüjleyin. Hücre kültürü ortamını çıkarmadan, peletlenmiş hücreler içeren tüpleri daha sonraki işlemler için BSL-3 laboratuvarına aktarın, ardından peleti bozmadan ortamı tüpten dikkatlice aspire edin.

Daha sonra, hücrelere 30 mililitre DNaz I ile muamele edilmiş virüs aşısı ekleyin ve hafifçe pipetleyerek karıştırın, ardından karışımı iki altı kuyulu doku kültürü plakası arasında eşit olarak dağıtın. Spinokülasyon için, kültür plakalarını plaka taşıyıcılara yerleştirin ve iki saat boyunca 480 kez g ve 25 santigrat derecede sallanan bir kova rotorunda santrifüjleyin, ardından hücreleri beş saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Enfekte olmuş hücreleri toplamak ve parçalamak için, her enfeksiyona karşılık gelen hücreleri 50 mililitrelik bir konik santrifüj tüpüne toplayın.

Hücreleri 10 dakika boyunca 300 kez g ve 25 santigrat derecede santrifüjleyin, ardından süpernatanı dikkatlice aspire edin veya pipetleyin. Artık virüs partiküllerini çıkarmak için, her bir peleti iki mililitre tampon K eksi eksi ekleyerek yıkayın ve numuneyi tekrar döndürün, ardından peleti bozmadan, yıkamayı bir kez daha tekrarlamadan önce süpernatanı aspirasyon veya bir pipetle dikkatlice çıkarın. Artık tamponu bir mikropipetle dikkatlice çıkardıktan sonra, her bir peleti nazikçe yeniden süspanse etmek ve iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için buz gibi soğuk lizis tamponu K plus plus kullanın.

Sitoplazmik ön entegrasyon kompleksleri veya PIC'ler hazırlamak için, numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika boyunca sallayın, daha sonra tüpleri dört santigrat dereceye kadar önceden soğutulmuş bir rotora yerleştirin ve dört dakika boyunca 1.500 kez g ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Peleti bozmadan, süpernatanı dikkatlice yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve bir dakika boyunca 16.000 kez g ve dört santigrat derecede döndürün. Süpernatanı dikkatlice taze bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın, ardından RNase A'yı mililitre başına 20 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona ekleyin ve içeriği 30 dakika boyunca sallanmadan oda sıcaklığında inkübe edin.

% 7'lik bir nihai konsantrasyona sükroz ekleyin ve hafifçe pipetleyerek iyice karıştırın, ardından mikrosantrifüj tüplerinde PIC'lerin alikotlarını hazırlayın. Sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun ve uzun süreli saklama için eksi 80 santigrat derece dondurucuya koyun. İn vitro entegrasyonda veya IVI testinde kullanılan hedef DNA'yı hazırlamak için, özel yapım phiX174-Forward ve phiX174-Reverse primerlerini kullanarak phiX174 plazmit DNA'sından 2.0 kilobazlık bir bölgeyi amplifiye etmek için PCR karışımlarını birleştirin ve programı metin protokolüne göre kullanarak PCR gerçekleştirin.

Numuneyi jel saflaştırdıktan ve alikosyondan sonra, 200 mikrolitre PIC'e 600 nanogram hedef DNA ekleyin. İyice karıştırın ve 37 santigrat derecede 45 dakika inkübe edin. SDS, EDTA ve proteinaz K ekleyerek IVI reaksiyonunu durdurun, ardından reaksiyon içeriğini iyice karıştırın ve gece boyunca 56 santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, IVI reaksiyonundan toplam DNA'yı saflaştırmak için, deproteinize edilmiş numuneye eşit miktarda fenol ekleyin. Girdap yaparak kuvvetlice karıştırın ve iki dakika santrifüjleyin. Fenol ekstraksiyonunu tekrarlamadan önce üst sulu fazı dikkatlice çıkarın ve taze bir tüpe aktarın, ardından eşit hacimde bir fenol kloroform ekleyin.

Numuneyi girdaplayarak karıştırın ve tüpü iki dakika santrifüjleyin, ardından üst sulu fazı yeni bir tüpe aktarın. Metin protokolüne göre kloroform ile ekstrakte edildikten sonra, mikrolitre başına 0.1 mikrogram glikojen, 0.3 molar sodyum asetat ve 2.5 hacim buz gibi soğuk %100 etanol ekleyerek DNA'yı sulu fazdan çökeltin. Tüpü gece boyunca eksi 80 santigrat dereceye yerleştirin.

Ertesi gün, numuneyi 30 dakika boyunca 16.000 kez g ve dört santigrat derecede santrifüjleyin, ardından peleti bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın. PIC aktivitesini ölçmek için PCR gerçekleştirmek için, entegre HIV-1 DNA'sının bağlantılarını amplifiye etmek için viral LTR ve phiX174 DNA'sını hedefleyen primerler kullanarak ilk geleneksel PCR turu ile başlayın. Ana karışımı eksi şablon DNA'yı burada belirtildiği gibi birleştirin, ardından 45 mikrolitrelik alikotları ayrı PCR tüplerine dağıtın ve kontrol olarak beş mikrolitre şablon DNA veya nükleaz içermeyen su ekleyin.

Metin protokolünde belirtilen programı kullanarak reaksiyonu bir termodöngüleyicide çalıştırın, ardından ikinci bir kantitatif PCR turu gerçekleştirin ve verileri metin protokolüne göre analiz edin. Bu IVI testinde, SupT1, HIV-1 ile tedavi edilen DNAse I ve HIV-1 integraz inhibitörü Raltegravir'in yokluğu veya varlığı ile spinoküle edildi. İnkübasyondan sonra, PIC'ler izole edildi ve saflaştırılmış DNA, viral DNA'nın entegrasyonu için analiz edildi.

Burada gösterildiği gibi, HIV-1 PIC'ler, ilişkili viral DNA'yı hedef DNA'ya sağlam bir şekilde entegre eder ve PIC'lerin IVI verimliliği, bu testte ölçülen entegrasyon aktivitesini HIV-1 integrazına güçlü bir şekilde ima eden Raltegravir ile desteklenen reaksiyonlarda büyük ölçüde azalmıştır. Kontrol reaksiyonları herhangi bir entegrasyon aktivitesi göstermedi. Ek olarak, PCR'nin ilk turunda Taq polimerazı dışlayan kontrol, entegrasyon ürünlerini amplifiye etmedi.

Özellikle, tek başına PIC'lerin kontrolünden elde edilen veriler, iç içe geçmiş qPCR stratejisinin spesifik olarak entegre viral DNA'yı ölçtüğünü, ancak PIC ile ilişkili viral DNA'yı ölçmediğini gösterdi. Toplu olarak, bu veriler PIC ile ilişkili entegrasyon etkinliğini gösterir. Bir kez ustalaştıktan sonra, PIC aktivitesini ölçmek için virüs hazırlama ve PCR testleri bir hafta içinde tamamlanabilir.

SupT1 hücrelerinin enfekte olması ve PIC'lerin enfekte hücrelerden izolasyonu bir günde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, HIV-1 PIC'lerin nasıl izole edileceğini ve in vitro entegrasyon aktivitesinin nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız. Yüksek bulaşıcı HIV-1 titreleri ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken önlük ve önlük, çift eldiven ve koruyucu gözlük gibi koruyucu giysiler de dahil olmak üzere uygun önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.