İzolasyon, Farklılaşma ve Niceleme İnsan Kanı B Hücreleri Antikor salgılayan: ELISPOT Hümoral Bağışıklık bir Fonksiyonel Göstergesi'nin olarak

Bu ELISpot metodolojisinin genel amacı, kandan İnsan Antikoru salgılayan B hücrelerinin miktarının belirlenmesine izin vermektir. Bu yöntem, biyomedikal alanda B hücrelerinin immünolojisi ve aşı araştırmaları ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, anti-kor salgılayan B hücrelerinin tek hücre düzeyinde tespit edilmesine ve ölçülmesine izin vermesidir.

Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Tsung-Chih Tseng olacak. Potasyum takviyeli EDTA içeren 15 ml'lik bir tüpe median kübital venden 10 ml'lik bir kan örneği alındıktan hemen sonra, pıhtı oluşumunu önlemek için tüpü birkaç kez ters çevirin. Daha sonra, oda sıcaklığında beş dakikalık bir inkübasyon için hücrelere 35 ml otoklavlanmış kırmızı kan hücresi lizis tamponu ekleyin.

Tüpten ışık gözlemlendiğinde, kanı santrifüjleyin ve beyaz bir topağın varlığını onaylayın. 10 ml otoklavlanmış PBS ile kalan lizis tamponunu çıkarın ve peleti 10 ml RPMI 1640 ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri, 37 santigrat derece ve yüzde beş karbondioksitte 30 dakikalık bir inkübasyon için 10 cm'lik bir kültür kabına koyun.

Daha sonra kültür kabını birkaç kez hafifçe döndürün ve yüzen hücreleri 15 ml'lik plastik bir konik tüpe aktarın. Santrifüjleme ile iki yıkamadan sonra, peleti 200 mikro litre soğuk PBS tamponunda ml konsantrasyonu başına altı hücrenin beş ila 10 katı oranında yeniden süspanse edin ve altıncı hücrelerin onda biri başına kan hücrelerine özgü 5 mikro litre biyotinile anti-insan anti-vücut kokteyli ekleyin. Buz üzerinde 30 dakikalık bir inkübasyondan sonra, hücreleri 10 kat fazla steril PBS hacminde yıkayın ve peleti, buz üzerinde 30 dakikalık bir inkübasyon için altı hücrenin onda biri başına beş mikro litre streptavidin konjuge mikro boncuk içinde yeniden süspanse edin.

İnkübasyonun sonunda, hücrelere iki ml PBS tamponu ekleyin ve tüpü oda sıcaklığında sekiz dakika boyunca manyetik bir stand üzerine yerleştirin. Mikro boncuklar tüpün duvarına tutturulduğunda, süpernatanı dikkatlice yeni bir konik tüpe aktarın ve hücrelere 2 ml daha PBS tamponu ekleyin. İkinci süpernatant toplamasından sonra, havuzlanmış hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve hücreleri, ml konsantrasyonu başına yedi hücrenin onda biri oranında beş ml'lik bir polistiren tüpe ve taze PBS tamponuna aktarın.

Spesifik olmayan bloklamayı önceden oluşturduktan sonra, buz üzerinde 30 dakikalık bir inkübasyon için hafifçe karıştırarak tüpe altı hücrenin onda biri başına her seçim antikorunun bir mikrogramını ekleyin. İnkübasyonun son beş dakikasında, hücrelere beş mikro litre 7-AAD ekleyin. Daha sonra hücrelere iki mililitre taze PBS ekleyin ve santrifüjlemeden önce girdap yapın.

Peletleri, mili litre konsantrasyonunda yedi hücrenin onda biri ila beş katı oranında taze ayırma tamponunda yeniden askıya alın ve hücreleri 40 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirerek beş mili litrelik yeni bir polistiren tüpe süzün. Daha sonra hücreleri akış sitometrisine göre saf B hücrelerini, bellek B hücrelerini ve plazmablast plazma hücrelerini toplamak için 5 ml taze RPI ortamı içeren üç adet 15 ml'lik tüpe sıralayın. Tüm hücreler hasat edildiğinde, alt kümeleri, taze RPMI ortamında mili litre konsantrasyonunda beşinci hücrelerin onda biri ila on katı oranında 12 oyuklu bir hücre kültürü plakasının ayrı kuyucuklarına tohumlayın.

Daha sonra, B hücrelerini, beş gün boyunca hücre kültürü inkübatöründe kuyu başına mili litre başına altıncı hücrelerin onda biri başına beş mikrogram CPG ODN 2006 ile aktive edin. Aktivasyonun sonunda, ELISpot plakalarının her bir kuyucuğuna 30 saniye boyunca 30 mikro litre% 35 etanol ve damıtılmış su ekleyin. Daha sonra her bir oyuktaki etanolü 150 mikro litre otoklavlanmış çift damıtılmış su ile değiştirin ve kalan etanolü çıkarmak için plakaları oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Bir PBS yıkaması gerçekleştirin ve ardından her bir oyuğa 50 mikro litre poliklonal FAB2 anti-insan IG parçası ekleyin. Plakaları gösterildiği gibi PBS ile iki kez yıkayın. Oda sıcaklığında iki saat boyunca BSA'lı 200 mikro litre taze PBS ile her bir oyuktaki spesifik olmayan bağlanmayı bloke edin.

Başka bir PBS yıkama serisinden sonra, kuyuları 37 santigrat derecede 100 mikro litre taze RPMI 1640 ortamında inkübe edin. Daha sonra her bir ELISpot'taki besiyerini uygun sayıda aktive edilmiş B hücresi ile değiştirin. Her bir oyuğun son hacmini taze RPMI ortamı ile 150 mikro litreye getirin, ardından ELISpot plakasını sekiz ila 14 saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri koyun.

Kuluçka süresinin sonunda, ortamı atın ve kuyuları 200 mikro litre PBS artı tween20 ile beş, üç dakikalık yıkamalar için yıkayın. Son yıkamadan sonra, uygun tespit antikorlarını karşılık gelen kuyucuklara ekleyin ve plakaları karanlıkta iki saat inkübe edin. Başka bir PBS yıkama serisinden sonra, oda sıcaklığında beş ila 15 dakika boyunca her bir oyuğa 50 mikro litre BCIPMBT substratı ekleyin.

Mor lekeler ortaya çıktığında, oyuk başına 100 mikro litre çift damıtılmış su ile reaksiyonu durdurun ve plakayı akan musluk suyu ile durulayın. Daha sonra havayla kurutun, ELISpot membranı ışıktan korunacaktır. Bu donör PBMC örneğinde, kırmızı kan hücresi lizisi ve yapışık hücre tükenmesinden sonra lenfositlerin yaklaşık yüzde 10'u CD19 pozitif B hücreleriydi.

B hücre bölmesinde, hücrelerin yaklaşık yüzde 50'si CD27 negatif naif B hücreleri ve yüzde 50'si CD27 ifade eden bellek B hücreleriydi. Saflaştırılmış insan B hücrelerinin ve CD19 + CD27 + 'nın beş gün boyunca CPG tedavisi, tipik olarak, bir kez on ila dördüncü aktive edilmiş B hücresinden 50 ila 200 IgM ve 10 ila 50 IgG anti-kor salgılayan hücrelerin üretilmesiyle sonuçlanır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu ELISpot tekniği düzgün bir şekilde uygulanırsa üç saat içinde tamamlanabilir.

Bu işleme başlamadan önce, anti-kor salgılayan hücreleri tespit etmek için yeri uygun yakalama reaktifleri ile kodlamayı unutmamak önemlidir. Geliştirilmesinden sonra bu teknik, aşı bilimi alanındaki araştırmacıların büyük ölçekli denemelerde ve boylamsal takiplerde aşı etkinliğini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, insan B hücrelerinin kandan nasıl arındırılacağını iyi anlamış olmalısınız.

Farklılaşmaları için naif ve bellek B hücrelerini ayırın ve anti-kor salgılayan hücreleri nitelendirmek için bir ELISpot denemesi yapın. İnsan kanı ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman eldiven giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.