Name: İzolasyon, Farklılaşma ve Niceleme İnsan Kanı B Hücreleri Antikor salgılayan: ELISPOT Hümoral Bağışıklık bir Fonksiyonel Göstergesinin olarak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Öğrenin, ELISpot yöntemiyle insan kanından antikor salgılayan B hücrelerini izole edin, farklılaştırın ve nicelendirin. Bu teknik, hücresel düzeyde ölçüm yaparak aşı araştırmalarına ve bağışıklık bilimine katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Tayvan İdari Yuanı Bilim ve Teknoloji Bakanlığı'ndan (NSC99-2320-B-002-011) bir araştırma bursu ile desteklenmiştir. Ulusal Tayvan Üniversitesi Tıp Fakültesi'ndeki Birinci Çekirdek Laboratuvarının Akış Sitometrik Analiz ve Sıralama Çekirdeği tarafından sağlanan mükemmel hizmeti takdir etmek isterim.

İnsan periferal kan aydınlatılmış onam altında sağlıklı donörlerden elde edilen edilmeli ve kan örneklerinin kullanılması bireysel kurumsal inceleme kurulları tarafından kurulan onaylanan yönergelere uyması gerekir. Bu çalışmada, protokol Ulusal Tayvan Üniversitesi Hastanesi İç İnceleme Kurulu (protokol numarası 201307019RINB) tarafından onaylandı akış sitometri (Şekil 1) ve ELISpot deneyleri (Şekil 3) sonuçlarının bir gösteriye insan kanı kullanmak için. 1. İzolasyon ve insan çevre kan B hücreleri ile saflaştırılması <ol><li> K 2 EDTA (1,5-2,0 mg / ml kan) içeren bir 15 ml tüp içine (dirsek kübital fossa anterior) medyan kübital damardan kan ~ 10 mL çizme ve Tüp hemen pıhtı önlemek için birkaç kez ters çevirin oluşumu. </li><li> Kırmızı kan hücresi (RBC), tampon (150 mM NH4CI, 10 mM KHCO 3 ve 1 mM EDTA lizis (121 ° C, 15 dakika) otoklava 35 mL ekleme sTaze kan örneği (≥ 3 içeren tüp H 7.4): 1 hacim / hacim) ve bundan sonra daha 5 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) enkübe edilir. NOT: tüp aracılığıyla ışık geçirgenliği görünümü RBC lizis tamamlandığını gösterir. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 600 x g&#39;de santrifüjleyin. pelet beyaz renklidir olduğundan emin olun. </li><li> 10, otoklavdan geçirilmiş fosfat tamponlu tuz mL pelletini (PBS, 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 4.3 mM Na 2 HPO 4 ve 1.47 mM KH 2 PO 4; pH 7.4) ve 1.3 adım olarak santrifüj. </li><li> Süpernatantı atın ml RPMI 1640 ortamında (takviyeleri:% 10 fetal buzağı serumu, 100 U / ml penisilin / streptomisin, 0.25 ug / ml amfoterisin B ve 2 mM L-glutamin) 10 pelletini, ve sonra plaka 10 cm&#39;lik bir kültür tabağı içine hücreleri (tabak başına 10 ml kan). 30 dakika boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C inkübatör çanak yerleştirin. </li><li> Yavaşça kültür çanak birkaç kez girdap ve koyun15 ml plastik konik tüpler içine kültür ortamı (süspansiyon hücreleri). kültür yemekleri yapışık hücrelere (çoğunlukla makrofajlar) atın. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 600 x g&#39;de santrifüjleyin. süpernatant atın. </li><li> RPMI 1640 ortamı içinde 1 mL pelletini. Bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacı ile hücre sayısını sayın. Not: İzole lökositlerin canlılığı normal tripan mavi dışlama% 90 daha büyüktür. </li><li> Aşama 1.7 olarak santrifüj ve 5 konsantrasyonda soğuk PBS tampon (% 0.5 inek serumu albümini (BSA) ve 2 mM EDTA) içinde ~ 200 uL hücreler tekrar süspansiyon - 10 x 10 6 hücre / mL idi. </li><li> 10 6 hücre başına (B hücrelerinin negatif seçim için) kan hücrelerine spesifik biyotinile edilmiş anti-insan antikor kokteyli 5 uL ilave edin ve 30 dakika 21 buz üzerinde inkübe edilir. Not: Anti-insan antikor kokteyli, en azından CD2 (ya da CD3), CD14, CD16 özgü Abs içermelidir. </li><li> 10 kat fazla hacim eklemesteril PBS hücreleri, 5 dakika boyunca 600 x g&#39;de santrifüj ve süpernatant atmak. </li><li> Eşit streptavidin-konjuge mikroboncuk miktarda pelet (10 6 hücre başına 5 uL) ilave edin ve iyice karıştırın. </li><li> 15 ml plastik konik bir tüp içinde, 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. </li><li> tüpe PBS tamponu 2 mL ekleyin. </li><li> Manyetik bir stand içine tüp yerleştirilir ve 8 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir. Kahverengi mikroboncuklarının yavaş yavaş yanında mıknatıs 22 tüp duvar eklenecektir. </li><li> Manyetik stand kalan tüp ile, dikkatli bir şekilde yeni bir steril 15-ml tüp 22 içine süpernatant aktarın. </li><li> Tekrarlayın 1.16 ile 1.14 arasındaki adımları ve el değmemiş B hücrelerini içeren iki süpernatantlar birleştirir. mikrobilyeleri atın. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 600 x g&#39;de santrifüjleyin. süpernatant atın. </li><li> alt deneyler için RPMI 1640 ortamında pelletini. NOT: Genellikle, 1-5 x 10 5 B hücreleri zekâhektar periferik kan, 10 mL% 95 daha yüksek saflıkta 23 izole edilebilir. </li></ol> İzole B Hücreleri 2. saflaştırılması ve Bellek Ayırma ve naif B Hücreleri <ol><li> Adım 1 saflaştırılmış hücreleri kullanın ve bir hemasitometre ya da otomatik hücre sayıcı kullanarak hücre sayısını belirlemek. </li><li> 5 dakika boyunca 600 x g&#39;de santrifüj ve oda sonra soğuk PBS tampon 100 ul hücrelerin tekrar. </li><li> Kapalı 1 - 10 6 hücre başına biyotinile CD27 mAb&#39;nin 2 ug ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. </li><li> 5 dakika boyunca 600 x g&#39;de tüp ve santrifüj PBS tamponu 10 mL ekleyin. </li><li> Süpernatantı atın ve PBS tampon 50 mcL hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> 15 ml plastik konik tüp hücrelere - (2 ug / 10 6 hücre 1) streptavidin manyetik mikro boncuklar eşit miktarda ekleyin. </li><li> Yavaşça karıştırın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. </li><li> tüpe PBS tamponu 3 mL - 2 ekleyin. </li><li> YeriManyetik bir stand içine boru ve kahverengi bir mikro-mıknatıs en yakın tarafına takmak için izin 8 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> manyetik stand tüp ile, dikkatli bir şekilde yeni bir steril tüpe süpernatant fraksiyonu aktarın. Naif B hücreleri - Bu fraksiyon zenginleştirilmiş CD27 içerir. </li><li> Mikroboncuklar içeren tüp 5 ml ilave edilir ve yavaşça, mikro-boncuklar tekrar süspansiyon (örneğin, CD27 + bellek B hücrelerinin zenginleştirilmiş fraksiyon) 24-25. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 600 x g&#39;de santrifüjleyin. alt deneyler için RPMI 1640 ortamı ile pelet yeniden süspanse edin. Not: Genellikle, ~ 30 - B hücreleri% 60 sağlıklı donörden 7, 25-26 PBMC&#39;lerden CD27 + bellek hücresi saflaştırılabilir. </li></ol> Naif B Hücreleri, Bellek B Hücreleri ve PB / PC&#39;ler Tahsil sıralama 3. Hücre <ol><li> 1 aşamasından gelen arıtılmış, hücreleri kullanarak, bir hemocytome kullanılarak hücre sayısını belirlemekter ya da otomatik hücre sayacı. </li><li> 5 ml polistiren tüp içinde 10 7&#39;deki mL konsantrasyonda soğuk PBS tamponunda tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Kapalı 1 - 10 6 hücre başına, insan IgG 2 ug ve Fc blok için, 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. </li><li> 1 ug her bir ekleme, anti-CD19-APC (klon: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (klon: O323) ve anti-CD38-PE (klon: HIT2), 10 6 hücre başına; karıştırın ve 30 dakika 4, 27 için buz üzerinde inkübe edilir. </li><li> Adım 3.4 son 5 dakika içinde, ticari 7-aminoactinomycin D (7-AAD) 5 mcL ekleyin. </li><li> 5 dakika boyunca 600 x g&#39;de tüp, girdap ve santrifüj 2 mL PBS ekleyin. </li><li> 15 ml bir tüp içinde mL başına 5 x 10 7 hücre - 1 bir konsantrasyonda (% 2 BSA ve 2 mM EDTA ile, steril PBS) tampon sıralama tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> hücre kümeleri ortadan kaldırmak için bir naylon örgü hücre süzgecinden (40 mikron gözenek boyutu) aracılığıyla hücrelere Filtre. </li><li> bir akış sitometri tür hücreleri ayırınmor (405 nm), mavi (488 nm) ve kırmızı (640 nm): er üç lazer ile donatılmış. NOT: 3 renkli sitometri 27-28 akış yalnız mavi lazer yeterlidir. </li><li> Sıralama, üç saf B hücrelerinin aynı anda toplama (5 ml RPMI ortamı ihtiva eden) 15 ml tüpler (CD19 + CD27 -) içine hücreleri, hafıza B hücreleri (CD19 + CD27 +), ve PBS / PC (CD19 + CD27 + / hi CD38 +) 3-4, 28. Not: Aşama 4&#39;te tarif edildiği gibi kriteri naif ve bellek B hücreleri, kültürlenebilir. </li></ol> Naiv B hücreleri - izole edilmiş insan CD19 + B hücreleri, CD19 + CD27 + hafıza B hücreleri, ve CD19 + CD27 in vitro ayrımında 4. <ol><li> adımlarda 1.19, 2.10, 2.11 ve 3.10 olarak saflaştırılmış hücreleri kullanarak, bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacı ile hücre sayısını belirlemek. </li><li> RPMI 1640 ortamı ile tekrar süspansiyon hücreleri1 bir konsantrasyonda - ve ml başına 10 X 10 5, 12 oyuklu plakanın kuyularına kısım. </li><li> / Ml 18, 29 5 mg / 10 6 hücre CpG (ODN 2006) ekleyin. </li><li> Kültür, 5 gün boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C inkübatör hücreleri. </li><li> Her bir oyuğa hücreleri hasat 15 ml tüpler içinde ayrı ayrı yer, her tüpe 5 ml PBS ekleyin ve 5 dakika boyunca 600 x g&#39;de ve oda sıcaklığında santrifüj. </li><li> Hemasitometre ya da otomatik hücre sayıcı kullanarak hücreleri saymak. RPMI 1640 ortamı ile mL başına 10 X Ekim 5-1 arasında bir konsantrasyonda tekrar süspansiyon hücreleri. </li></ol> 5. ELISPOT testi <ol><li> 30 s için ELISPOT levhaların her çukuruna damıtılmış su içinde% 35 etanol içinde 30 uL ekleyin. NOT: pipetlerken zaman her zaman kuyularda membran dokunmaktan kaçının. </li><li> etanol kaldırmak için ELISpot plakları ters çevirin. </li><li> Her kuyuya 150 ul otoklava GKD 2 O koyun ve inkübe5 dakika boyunca oda sıcaklığında bunları bakiye Etanol temizlemek için; 3 dakika boyunca oda sıcaklığında steril PBS yıkama ile takip edin. NOT: 5.3 5.1 plakaların imalatı bağlı isteğe bağlı olabilir adımlar. </li><li> Adına 5 ug / ml poliklonal F (ab &#39;) anti-insan Ig (IgG + IgM + IgA) 2 fragmanı, 50 uL bir gece boyunca 4 ° C&#39;de inkübe (PBS içinde) ELISPOT plakaların her kuyuya ve (tercih edilir) ya da 2 saat 11 süreyle 37 ° C. NOT: kullanılıncaya kadar Parafilm ile plakaların kenarları mühür. </li><li> 3 dakika her zaman için oda sıcaklığında iki bağlanmamış Abs kaldırmak her iyi PBS 200 mcL ekleyin ve bunları inkübe plakları ters çevirin. </li><li> de bloke edilmesi için her bir% 5 BSA (ya da RPMI 1640 ortamı) 200 ul PBS ekleyin ve 2 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe. </li><li> engelleme tampon kaldırmak için plakları ters çevirin. Aşama 5.5 olarak PBS, 200 uL her bir iki kez yıkayın. </li><li> Her bir oyuğa RPMI 1640 ortamı, 100 uL ilave edin ve 37 ° C&#39;de inkübe. </li><li> hazır hücreleri tohum olduğunda, RPMI 1640 orta kaldırmak için plakları ters çevirin. </li><li> Tohum 100 uL (5 x 10 4), 50 uL (2.5 x 10 4) ve bir kuyu içine 25 uL hücre (1.25 x 10 4) (adımlar 1.19, 2.10, 2.11, 3.10 ile ilgili ve 4.6) ELISpot plaka. RPMI 1640 ortamı ile, / oyuk 150 uL hacim getir. Not: hücreleri kaplama için bir ya da iki 2-kat seri seyreltiler en az tavsiye edilir. </li><li> 14 saat 18-8 için% 5 CO 2 ile 37 ° C inkübatör inkübe edin. inkübasyon sırasında plakalar hareket kaçının. </li><li> hücreleri ve RPMI 1640 orta kaldırmak için plakları ters çevirin. </li><li> 3 dakika boyunca, oda sıcaklığında, her zaman 5 kez (% 0.05 Tween 20 ile PBS) 200 uL / ​​göz PBS-T ilave edin ve inkübe. 5 yıkar her biri arasındaki yıkama tamponu çıkarmak için plakayı ters çevirin. </li><li> Keçi anti-insan IgG-alkalin fosfataz (AP), Fcy özgü Abs ya ekleme (IgG tespiti, 1: 5000 PBS-T içinde) Ya da keçi anti-insan IgM-AP, Fcμ fragmanı spesifik Abs (IgM algılama, 1: PBS-T içinde 5,000) tahsis edilen gözleri içinde ve karanlıkta, 2 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> Aşama 5.5 olarak PBS, 200 uL her bir iki kez yıkayın. </li><li> 50 uL / ​​oyuk bromochloroindolyl fosfat nitro mavi tetrazolyum (BCIP / NBT) alt-tabaka çözeltisi ekleyin. 15 dakika - Mor renkli lekeler normalde 5 görünür. </li><li> Noktalar aşırı gelişimini önlemek için 100 uL / oyuk GKD 2 O ekleyin. </li><li> tüm noktalar tam gelişiminden sonra akan musluk suyu ile plakaları durulayın. </li><li> Plakaların Alt drenaj çıkarın ve onları karanlıkta kuru hava için izin verir. </li><li> Bir görüntü alıcı / analiz ünitesi (örneğin, otomatik bir tarayıcı veya manuel bir mikroskop ile) ile otomatik bir plaka okuyucusu kullanılarak noktalar sayın. NOT: plakalar, karanlıkta oda sıcaklığında saklanır ve daha sonra analiz edilebilir. </li></ol>

<ol><li>Bemark, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+transitions+-+how+to+decipher+peripheral+human+B+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Res%22%5BJournal%5D)">Translating transitions - how to decipher peripheral human B cell development.</a> J. Biomed. Res. 29 (4), 264-284 (2015).</li>
<li>Odendahl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+migratory+antigen-specific+plasmablasts+and+mobilization+of+resident+plasma+cells+in+a+secondary+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Generation of migratory antigen-specific plasmablasts and mobilization of resident plasma cells in a secondary immune response.</a> Blood. 105 (4), 1614-1621 (2005).</li>
<li>Jackson, S. M., Wilson, P. C., James, J. A., Capra, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+B+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human B cell subsets.</a> Adv. Immunol. 98, 151-224 (2008).</li>
<li>Sanz, I., Wei, C., Lee, F. E., Anolik, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+heterogeneity+of+human+memory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional heterogeneity of human memory B cells.</a> Semin. Immunol. 20 (1), 67-82 (2008).</li>
<li>Perez-Andres, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+peripheral+blood+B-cell+compartments%3A+A+crossroad+in+B-cell+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+B+Clin.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Human peripheral blood B-cell compartments: A crossroad in B-cell traffic.</a> Cytometry B Clin. Cytom. 78 (Suppl 1), S47-S60 (2010).</li>
<li>Huggins, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpG+DNA+activation+and+plasma-cell+differentiation+of+CD27-+na%C3%AFve+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CpG DNA activation and plasma-cell differentiation of CD27- naïve human B cells.</a> Blood. 109 (4), 1611-1619 (2007).</li>
<li>Wu, Y. C., Kipling, D., Dunn-Walters, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+CD27+negative+and+positive+B+cell+populations+in+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The relationship between CD27 negative and positive B cell populations in human peripheral blood.</a> Front. Immunol. 2, 81(2011).</li>
<li>Maïga, R. I., Bonnaure, G., Rochette, J. T., Néron, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD38hiCD138%E2%81%BA+plasma+cells+can+be+generated+in+vitro+from+CD40-activated+switched-memory+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Res%22%5BJournal%5D)">Human CD38hiCD138⁺ plasma cells can be generated in vitro from CD40-activated switched-memory B lymphocytes.</a> J. Immunol. Res. 2014, 635108(2014).</li>
<li>Wienands, J., Engels, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+memory+function+of+the+B+cell+antigen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The memory function of the B cell antigen receptor.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 393, 107-121 (2016).</li>
<li>Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Memory B cells.</a> Nat. Rev. Immunol. 15 (3), 149-159 (2015).</li>
<li>Tzeng, S. J., Li, W. Y., Wang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc%CE%B3RIIB+mediates+antigen-independent+inhibition+on+human+B+lymphocytes+through+Btk+and+p38+MAPK+%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Sci%22%5BJournal%5D)">FcγRIIB mediates antigen-independent inhibition on human B lymphocytes through Btk and p38 MAPK .</a> J. Biomed. Sci. 22, 87-98 (2015).</li>
<li>Ettinger, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-21+induces+differentiation+of+human+na%C3%AFve+and+memory+B+cells+into+antibody-secreting+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-21 induces differentiation of human naïve and memory B cells into antibody-secreting plasma cells.</a> J. Immunol. 175 (12), 7867-7879 (2005).</li>
<li>Bekeredjian-Ding, I., Foermer, S., Kirschning, C. J., Parcina, M., Heeg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poke+weed+mitogen+requires+Toll-like+receptor+ligands+for+proliferative+activity+in+human+and+murine+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Poke weed mitogen requires Toll-like receptor ligands for proliferative activity in human and murine B lymphocytes.</a> PLoS One. 7 (1), e29806(2012).</li>
<li>Bernasconi, N. L., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+serological+memory+by+polyclonal+activation+of+human+memory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells.</a> Science. 298 (5601), 2199-2202 (2002).</li>
<li>Defrance, T., Vanbervliet, B., Brière, F., Durand, I., Rousset, F., Banchereau, J. Interleukin 10 and transforming growth factor beta cooperate to induce anti-CD40-activated naive human B cells to secrete immunoglobulin A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDefrance%2C+T+%22J.+Exp.+Med%22">J. Exp. Med</a>. 175 (3), 671-682 (1992).</li>
<li>Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., et al. Chapter 2, Unit 2.2, Isotype determination of antibodies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHornbeck%2C+P+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. Coligan, J. E., et al. , (2001).</li>
<li>Tanguay, S., Killion, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparison+of+ELISPOT+and+ELISA-based+assays+for+detection+of+individual+cytokine-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphokine+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Direct comparison of ELISPOT and ELISA-based assays for detection of individual cytokine-secreting cells.</a> Lymphokine Cytokine Res. 13 (4), 259-263 (1994).</li>
<li>Crotty, S., Aubert, R. D., Glidewell, J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+human+antigen-specific+memory+B+cells%3A+a+sensitive+and+generalized+ELISPOT+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tracking human antigen-specific memory B cells: a sensitive and generalized ELISPOT system.</a> J. Immunol. Methods. 286 (1-2), 111-122 (2004).</li>
<li>Zhang, Y., Wang, Y., Zhang, M., Liu, L., Mbawuike, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+retarded+influenza+virus-specific+immunoglobulin+class+switch+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Cell.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Restoration of retarded influenza virus-specific immunoglobulin class switch in aged mice.</a> J. Clin. Cell. Immunol. 7 (2), 403(2016).</li>
<li>Doedée, A. M., Kannegieter, N., Öztürk, K., van Loveren, H., Janssen, R., Buisman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+numbers+of+memory+B-cells+and+Th2-cytokine+skewing+in+high+responders+to+hepatitis+B+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Higher numbers of memory B-cells and Th2-cytokine skewing in high responders to hepatitis B vaccination.</a> Vaccine. 34 (19), 2281-2289 (2016).</li>
<li>Coligan, J. E., et al. Chapter 7, Unit 7.5, Isolation of human B cell populations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeine%2C+G+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. , (2011).</li>
<li>Safarík, I., Safaríková, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+magnetic+techniques+for+the+isolation+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B+Biomed.+Sci.+Appl%22%5BJournal%5D)">Use of magnetic techniques for the isolation of cells.</a> J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 722 (1-2), 33-53 (1999).</li>
<li>Morbach, H., Eichhorn, E. M., Liesem, J. G., Girschickm, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+values+for+B+cell+subpopulations+from+infancy+to+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Reference values for B cell subpopulations from infancy to adulthood.</a> Clin. Exp. Immunol. 162 (2), 271-279 (2010).</li>
<li>Thornton, A. M., et al. Chapter 3, Unit 3.5A, Fractionation of T and B cells using magnetic beads. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThornton%2C+AM+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. Coligan, J. E., et al. , (2003).</li>
<li>Klein, U., Rajewsky, K., Küppers, R. Human immunoglobulin (Ig)M+IgD+ peripheral blood B cells expressing the CD27 cell surface antigen carry somatically mutated variable region genes: CD27 as a general marker for somatically mutated memory)Bcells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKlein%2C+U+%22J.Exp.+Med%22">J.Exp. Med</a>. 188 (9), 1679-1689 (1998).</li>
<li>Bohnhorst, J. Ø, Bjørgan, M. B., Thoen, J. E., Natvig, J. B., Thompson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bm1-Bm5+classification+of+peripheral+blood+B+cells+reveals+circulating+germinal+center+founder+cells+in+healthy+individuals+and+disturbance+in+the+B+cell+subpopulations+in+patients+with+primary+Sj%C3%B6gren%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bm1-Bm5 classification of peripheral blood B cells reveals circulating germinal center founder cells in healthy individuals and disturbance in the B cell subpopulations in patients with primary Sjögren's syndrome.</a> J. Immunol. 167 (7), 3610-3618 (2001).</li>
<li>Bleesing, J. J., et al. Chapter 7, Unit 7.35, Assays for B cell and germinal center development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBleesing%2C+JJ+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. Coligan, J. E., et al. , (2003).</li>
<li>Horvatinovich, J. M., Sparks, S. D., Mann, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+pure+lymphocyte+gate+for+subset+analysis+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Establishing a pure lymphocyte gate for subset analysis by flow cytometry.</a> Cytometry. 26 (2), 172-177 (1996).</li>
<li>Ruprecht, C. R., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+stimulation+as+a+third+signal+required+for+activation+of+human+naive+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor stimulation as a third signal required for activation of human naive B cells.</a> Eur. J. Immunol. 36 (4), 810-816 (2006).</li>
<li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+fully+human+monoclonal+antibodies+specific+to+a+vaccinating+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen.</a> Nat. Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).</li>
<li>Caraux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+human+B+and+plasma+cells.+Age-associated+changes+in+counts+and+detailed+characterization+of+circulating+normal+CD138-+and+CD138%2B+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Circulating human B and plasma cells. Age-associated changes in counts and detailed characterization of circulating normal CD138- and CD138+ plasma cells.</a> Haematologica. 95 (6), 1016-1020 (2010).</li>
<li>Kuchen, S., Robbins, R., Sims, G. P., Sheng, C., Phillips, T. M., Lipsky, P. E., Ettinger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+IL-21+in+B+cell+activation%2C+expansion%2C+and+plasma+cell+generation+during+CD4%2B+T+cell-B+cell+collaboration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Essential role of IL-21 in B cell activation, expansion, and plasma cell generation during CD4+ T cell-B cell collaboration.</a> J. Immunol. 179 (9), 5886-5896 (2007).</li>
<li>Pinna, D., Corti, D., Jarrossay, D., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+dissection+of+the+human+memory+B-cell+repertoire+following+infection+and+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Clonal dissection of the human memory B-cell repertoire following infection and vaccination.</a> Eur. J. Immunol. 39 (5), 1260-1270 (2009).</li>
<li>Jahnmatz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+human+IgG+B-cell+ELISpot+assay+for+the+analysis+of+vaccine-induced+B-cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of a human IgG B-cell ELISpot assay for the analysis of vaccine-induced B-cell responses.</a> J. Immunol. Methods. 391 (1-2), 50-59 (2013).</li>
<li>Weiss, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+human+memory+B+cell+assay+and+its+application+to+studying+Plasmodium+falciparum-specific+memory+B+cells+in+natural+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">High efficiency human memory B cell assay and its application to studying Plasmodium falciparum-specific memory B cells in natural infections.</a> J. Immunol. Methods. 375 (1-2), 68-74 (2012).</li>
<li>Leehan, K. M., Koelsch, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cell+ELISPOT%3A+For+the+identification+of+specific+cytokine-secreting+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">T Cell ELISPOT: For the identification of specific cytokine-secreting T cells.</a> Methods. Mol. Biol. 1312, 427-434 (2015).</li>
<li>Karahan, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+HLA+class+II-specific+memory+B+cells+in+HLA-sensitized+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Quantification of HLA class II-specific memory B cells in HLA-sensitized individuals.</a> Hum. Immunol. 76 (2-3), 129-136 (2015).</li>
<li>Hadjilaou, A., Green, A. M., Coloma, J., Harris, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+B+cell%2Fantibody+cross-reactivity+using+a+novel+multicolor+FluoroSpot+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of B cell/antibody cross-reactivity using a novel multicolor FluoroSpot assay.</a> J. Immunol. 195 (7), 3490-3496 (2015).</li>
<li>Janetzki, S., Rueger, M., Dillenbeck, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepping+up+ELISpot%3A+multi-level+analysis+in+FluoroSpot+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Stepping up ELISpot: multi-level analysis in FluoroSpot assays.</a> Cells. 3 (4), 1102-1115 (2014).</li>
<li>Alatrakchi, N., Graham, C. S., He, Q., Sherman, K. E., Koziel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+cell+responses+to+hepatitis+C+virus+%28HCV%29+in+the+liver+of+persons+with+HCV-HIV+coinfection+versus+HCV+monoinfection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">CD8+ cell responses to hepatitis C virus (HCV) in the liver of persons with HCV-HIV coinfection versus HCV monoinfection.</a> J. Infect. Dis. 191 (5), 702-709 (2005).</li>
<li>Smith, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+major+factors+influencing+ELISpot-based+monitoring+of+cellular+responses+to+antigens+from+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+One%22%5BJournal%5D)">Identification of major factors influencing ELISpot-based monitoring of cellular responses to antigens from Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS. One. 4 (11), e7972(2009).</li>
<li>Sundararaman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+reproducibility+of+ELISPOT+counts+from+nine+different+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">High reproducibility of ELISPOT counts from nine different laboratories.</a> Cells. 4 (1), 21-39 (2015).</li>
<li>Janetzki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+automated+evaluation+of+Elispot+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the automated evaluation of Elispot assays.</a> Nat. Protoc. 10 (7), 1098-1115 (2015).</li>
</ol>

Yazar, rekabet eden herhangi bir mali çıkar beyan etmemektedir.

İzolasyon ve İnsan periferal kan B hücrelerinin saflaştırılması Normalde, RBCs verimli rüptüre ve lizis tamponu (adım 1.2) tarafından silinebilir. hücre canlılığı amonyum klorür ile etkilenebilir gibi, 5 dakika daha uzun RBC parçalama tamponu ile PBMC&#39;ler inkübe önemlidir. Seçenek olarak ise, RBC ve trombositlerin aynı zamanda aşağıdaki protokol ile temizlenebilir. asit dekstroz sitrat (ACD) tamponu taze tam kan karıştırın (39 mM sitrik asit, 75 mM sodyum sitrat...

B hücreleri, humoral bağışıklığın gelişiminde önemli bir rol oynar. Onlar başlangıçta kemik iliğinde gelişir ve daha da geliştirilmesi için naif gibi dalak gibi lenfoid dokularda geçebilecek B hücreleri, lenf düğümleri ve bademcikler, kan akışı girin. Ag karşılaşma üzerine, bazı naif B hücreleri germinal merkez B hücreleri bellek B hücreleri ve plazmablastlar (PB) / plazma hücrelerinin (PC) içine ayırt edebilirsiniz lenfoid follikül içine göç ederler. En PB / PC&#39;ler kan akışına çıkış yaparken, birkaç sonunda uzun ömürlü PC&#39;ler 1 içine terminal farklılaşma geçmesi kemik iliğinde bulunur. Dolaşımdaki B hücreleri heterojen ve kararlı durumda, PB / PC&#39;ler, periferik kanda 2 nadirdir. seri spesifik yüzey markerlerinin durumunu bir sonucu olarak, akış sitometrisi periferik kanda B-hücresi alt kümelerinin tanımlanması ve karakterizasyonu için uygun bir yöntem haline gelmiştir. Akış cytometr bir genişletilmiş uygulamaY, yüksek saflıkta ayrılmasını ve B hücrelerinin tek tek alt kümelerinin izole edilmesine izin veren, bir hücre sıralayıcı fonksiyonu eklenmesidir. İnsan dolaşımdaki B hücreleri, genel olarak üç temel alt popülasyonları sınıflandırılır farklı gelişim aşamalarında spesifik yüzey reseptörlerinin ekspresyonu göre: bellek B hücreleri (CD19 + CD27 + CD38 -) saf B hücreleri - (- CD38 CD19 + CD27) ve PB / PC (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (Şekil 1). doğası gereği Naif B hücreleri Ag&#39;lerini karşılaşmadım. Bununla birlikte, IgM + CD27 + bellek B hücrelerine ayırt edilebilir. Naif B hücreleri B-hücresi antijen reseptörü (BCR) -associated molekülleri (örneğin, CD19, CD20 ve CD22) onların immünoglobulin repertuarı 5 heterojen ifade homojen olmasına rağmen. CD27 + bellek B hücrelerinin büyük bir çoğunluğu CD27 olarak ayırt edilebilir+ / hi CD38 + PB / PC&#39;ler 6. Buna ek olarak, hafıza B hücreleri, ve PBS / PC poliklonal ve gelişimsel ve fonksiyonel heterojenliği 4-7 sergiler. dolaşımda PB / PC&#39;ler normalde kısa ömürlü ve CD138 ifade etmezler, ancak kemik iliğinde yerleşmek için yapılanlar ölümcül farklılaştırmak ve uzun ömürlü olacaktır. Terminal farklılaşmış PC&#39;ler CD138 ifade ve yüzeyleri 8 CD27 molekülleri aşağı-düzenler. PB ve PC&#39;ler hem Abs salgılayan yeteneğine sahip olduğundan, pek çok kez onlar topluca TSK olarak belirtilir. Buna mukabil, naif B hücreleri de bellek B hücreleri de Abs 9-10 kayda değer miktarda üretebilir. Uygun kültür koşulları 6, 11-15 yerleştirildiğinde 10 gün - izole Yine de, hem naif ve bellek B hücreleri 3 TSK içine ayırt edilebilir. Aslında, TSK bu doğrudan izole fr ile CD27 ve CD38 in vitro farklılaştırma payı benzer yüzey ifadeler türetilmişom periferik kan 6. Buna ek olarak, in vitro farklılaşan TSK bu PBS / PC 6 dolaşan benzer yüzey CD20 düşük seviyede eksprese eder. kültür kaynaklı TSK tüm kısa ömürlü olmasına rağmen, onlar işlevsel yetkin ve hümoral bağışıklık katkıda mümkün olduğunu belirten Abs salgılar olabilir. kadar en sık uygulanan yöntemler hümoral immün yanıta fonksiyonel bilgi elde etmek için ELISA ve ELISpot hem de. ELISA 96 gözlü plaka bazlı deney, ve sık sık, serum Ag-spesifik Abs ve diğer analitler (örneğin, sitokinler) titreleri ölçmek için kullanılır. Bu uygun ve ölçeklenebilir. ELISA Sıvı bir numunede 16, ABS veya serum gibi diğer maddelerin varlığını tespit etmek için bir katı-faz enzim tahlili kullanmak üzere tasarlanmıştır. Serum ELISA ile ilgili okumalar yaygın vücudun bağışıklık tepkisini temsil etmek için kullanılmaktadır. yeniden kazanılması için gerekli bir araçELISA tahlilleri ile ilgili adouts bir spektrofotometrik mikroplaka okuyucu. Okuyucu, tipik olarak yaban turbu peroksidazı (HRP) ile birleştirilmiş bayır algılama Abs ve spesifik alt tabakalar 17 reaksiyonundan elde edilen son ürünlerin optik yoğunluk (OD) belirleyebilir. humoral immün tepkisi raporlama ile ilgili olarak, ELISA ile tespit serum antikor düzeyleri vücutta TSK toplu, ancak tek tek değil, performans belirtmektedir. Buna ek olarak, ELISA dikkate Abs salgılar yok bellek B hücreleri tarafından katılımını almak için başarısız olur. ELISA gibi, ELISpot tespit ve periferik kan örnekleri 17-18 bağışıklık yanıtı izlemek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. ELISPOT bir sandviç ELISA ile ilgili bir tekniktir. İçinde hücre polivinilidin diflorin (PVDF) kısa süreli bir kültür 96 çukurlu mikrolevhaların membran destekli kuyu içine yerleştirilir. ELISpot tahlil bir mikroplaka ve developin batı blotting gerçekleştirmeden benzerdirg her kuyuda PVDF zarı üzerinde lekeler. Bir otomatik ELISpot okuyucu sistemi veya elle sayım için bir stereomikroskopta gereklidir. bir bağışıklık tepkisinin tespit bölgesindeki ELISPOT ana avantajı TSK ve sitokin salgılayan hücrelerin miktarının onun süper hassasiyettir. Sırasıyla, humoral ve hücresel bağışıklık işlevsel faaliyetlerini bildirir. Hümoral bağışıklık fonksiyonu ölçümünde, ELISA ve ELISPOT tarafından numaralandırılan TSK sayısına göre belirlenir serum Ab düzeyleri sıklıkla ilişkilidir, ancak bu iki deneyleri veri readouts fonksiyonel etkileri 19-20 bazı farklılıklar var. ELISPOT ana avantajı yönteminin onun hassasiyetidir. Abs uygun izotiplerinin bilinen bir miktarı, referans olarak dahil edildiğinde, ELISA ile belirlendiği şekilde, serum antikor titrelerinin seviyesi konsantrasyon çıktılan olarak, daha çok nicel göre antikor seviyesi gösteren OD çıktılan olarak da yarı-nicel olarak sunulmaktadır, ya da. Bunun aksine, ELISPOT sonuçları presente olanilgi konusu bir hücre havuzu TSK mutlak sayısı D (ör bölünmemiş periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) ve PBMC&#39;lerden Saflaştırılmış B hücreleri) içerir. ELISpot tek ASC algılayabilir, ancak ELISA ölçümden önce optimize tahlil bağımlı konsantrasyonları ulaşmak için TSK dan Ab miktarda gerektirir. Bu nedenle, ELISpot ölçümü duyarlılığı ELISA besbelli üstündür. Ayrıca, ELISPOT, aynı zamanda aktive edilmiş hafıza B hücreleri in vitro farklı TSK ölçülmesi için uygundur. Bellek B hücreleri Abs salgılar yok ama aktivasyon üzerine TSK içine ayırt edebilirsiniz; bu nedenle ELISA ile tespit edilen serum Abs hiçbir katkısı var. Bu nedenle, ELISPOT kültüründe aktif hale bellek B hücrelerinin, dolaşımdaki bağışıklık tepkisinin ölçümü tercih edilen bir yöntemdir. Uzun vadeli humoral bağışıklığın bakım izlenmesi için izin verir.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer K2E</td><td>BD Biosciences</td><td>367525</td><td>10 mL tüp</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>endotoksin içermeyen</td></tr><tr><td>Tripan mavisi %0,5 çözelti</td><td>Biyolojik Endüstriler</td><td>03-102-1B</td><td></td></tr><tr><td>IMag İnsan B lenfosit zenginleştirme seti</td><td>BD Biosciences</td><td>558007</td><td></td></tr><tr><td>Biyotinillenmiş CD27 mAb</td><td>Biolegend</td><td>302804</td><td>klonu O323</td></tr><tr><td>Streptavidin manyetik mikro boncuklar</td><td>BD Biosciences</td><td>9000810</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon tüpleri</td><td>BD Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>Mavi naylon örgü hücre süzgeci, 40 & mu; m</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Anti-insan CD19-APC</td><td>Biolegend</td><td>302212</td><td>klonu HIB19</td></tr><tr><td>Anti-insan CD27-eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0279-42</td><td>klonu O323</td></tr><tr><td>Anti-insan CD38-PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>303516</td><td>klonu HIT2&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-insan CD38-PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>560677</td><td>klonu HIT2&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-insan CD45-FITC</td><td>Biolegend</td><td>304006</td><td>klonu HI30</td></tr><tr><td>Anti-insan CD45-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555482</td><td>klonu HI30</td></tr><tr><td>Anti-fare / sıçan / insan CD27-PerCP Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>124213</td><td>klonu LG.3A10</td></tr><tr><td>Anti-insan CD27-PerCP Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>65429</td><td>klon L128</td></tr><tr><td>Anti-insan CD19-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-064</td><td>klon LT19</td></tr><tr><td>Anti-insan CD19-FITC</td><td>GeneTex</td><td>GTX75599</td><td>klonu LT19</td></tr><tr><td>Anti-insan CD20-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555622</td><td>klonu 2H7</td></tr><tr><td>biyotinile anti-insan CD27</td><td>Biolegend</td><td>302804</td><td>klonu O323</td></tr><tr><td>biyotinile anti-insan CD27</td><td>eBioscience</td><td>13-0279-80</td><td>klonu O323</td></tr><tr><td>7-aminoaktinomisin D (7-AAD)</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>CpG (ODN 2006)&nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-2006</td><td>tip B CpG</td></tr><tr><td>Rekombinant insan IL-2</td><td>PeproTech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan IL-10</td><td>PeproTech</td><td>200-10</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan IL-21</td><td>PeproTech</td><td>200-21</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan sCD40L</td><td>PeproTech</td><td>310-02</td><td></td></tr><tr><td>S. aureus Cowan (SAC)</td> <td>Protein ASigma-Aldrich</td><td>82526</td><td></td></tr><tr><td>Pokeweed mitojen (PWM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9379</td><td></td></tr><tr><td>MultiScreen filtre plakaları, 0.45 ve mikro; m gözenek boyutu</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td>MSIPS4510 steril, şeffaf 96 oyuklu, hidrofobik PVDF membranlı</td></tr><tr><td>filtre plakası BCIP/NBT çözeltisi Sigma-Aldrich</td><td></td><td>B6404</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT tek reaktif, alkalin fosfataz substrat</td><td>Merck Millipore</td><td>ES006</td><td></td></tr><tr><td>İnsan IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>009-000-003</td><td></td></tr><tr><td>İnsan IgG, Fc parçası</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>009-000-008</td><td></td></tr><tr><td>F (ab') 2 keçi anti-insan Ig parçası (IgG + IgM + IgA)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-006-127</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-insan IgG-alkalin fosfataz, Fc & gama; fragmana özgü</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-055-008</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-insan IgM-alkalin fosfataz, Fc & mikro; fragmana özgü</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-055-043</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-insan IgG-peroksidaz, Fc & gama; fragmana spesifik</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-035-008</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-insan IgM-peroksidaz, Fc & mikro; fragmana özgü</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-035-095</td><td></td></tr><tr><td>BD ELISPOT AEC substrat kiti</td><td>BD Biosciences</td><td>551951</td><td></td></tr><tr><td>CTL ImmunoSpot analizörü</td><td>C.T.L.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

İzolasyon, farklılaşma ve niceleme İnsan kanı b hücreleri antikor salgılayan: elispot hümoral bağışıklık bir fonksiyonel göstergesi&#39;nin olarak

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

humoral bağışıklık damgasını sentez ve bir patojen olarak bir antijen (Ag), özel Abs salgılar ve ana savunma için kullanılan fonksiyonel TSK, üretmektir. Bir bireyin hümoral bağışıklık tepkisinin fonksiyonel kantitatif tayini, serum Abs ve dolaşan TSK hem yaygın fonksiyonel çıktılan olarak ölçülür. İnsanlarda, çevresel kan ana B hücreleri tarafından ortaya hümoral bağışıklık tepkisinin saptanması için kullanılabilecek en uygun ve kolayca erişilebilir bir örneğidir. TSK kapsamda, farklı B hücresi alt-gruplar, akış sitometrisi ile sıralama seri spesifik Ab-konjuge mikro-veya hücre aracılığıyla seçim yoluyla periferal kandan doğrudan izole edilebilir. Ayrıca, arıtılmış naif ve bellek B hücreleri, aktive edilmiş ve kültür TSK olarak ayırt edilebilir. Ab salgılama katkıda TSK fonksiyonel aktivitesi, Enzim yakınsar bir deney olan, elispot testi ile tayin edilebilirB-bağlı immunoabsorbance deneyi (ELISA) ve Western lekeleme teknolojileri tek hücre düzeyinde tek tek TSK numaralandırılmasına sağlamaktır. Uygulamada, ELISPOT testi artan için kan örnekleri, çok sayıda kullanım kolaylığı aşı etkinliğini değerlendirmek için kullanılmıştır. Periferik kandan insan B hücrelerini izole edilmesi yöntemleri, in vitro TSK olarak B hücrelerinin farklılaşmasını ve toplam IgM- IgG-TSK miktarının ELISPOT istihdam burada tarif edilecektir.

PBMC&#39;ler eritrosit ve yapışık hücrelere (1.7 1.2 adımlar) tükenmiş bulundu. Hücrelerin bir tümböleni (2 x 10 6) periferal kan (Şekil 1) saf B hücreleri, hafıza B hücreleri, ve PBS / PC popülasyonunu gösteren bir akış sitometrik analizi yapıldı. Bu vericinin PBMC&#39;ler olarak, lenfositler, yaklaşık% 10 CD19 + B hücreleri idi. B-hücresi bölümünde, CD19 + CD27 yüzdesi - naif B hücreleri% 50 civarında idi. Öte yandan, CD19 <s...

İnsan periferik kanı, humoral immün yanıtın değerlendirilmesi için yaygın olarak kullanılır. Burada, insan B hücrelerini periferik kandan izole etme, insan B hücrelerini kültürde antikor (Ab) salgılayan B hücrelerine (ASC'ler) ayırma ve bir ELISpot testi ile toplam IgM ve IgG-ASC'leri numaralandırma yöntemleri açıklanmaktadır.

İzolasyon, Farklılaşma ve Niceleme İnsan Kanı B Hücreleri Antikor salgılayan: ELISPOT Hümoral Bağışıklık bir Fonksiyonel Göstergesi&#39;nin olarak

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Bu ELISpot metodolojisinin genel amacı, kandaki insan antikor salgılayan B hücrelerinin miktarının belirlenmesine olanak sağlamaktır. Bu yöntem, biyomedikal alanda B hücrelerinin immünolojisi ve aşı araştırmaları hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, antikor salgılayan B hücrelerinin tek hücre düzeyinde tespit edilmesine ve ölçülmesine imkan tanımasıdır.Prosedürü, laboratuvarımdan lisansüstü öğrencisi Tsung-Chih Tseng gösterecek. Potasyum takviyeli EDTA içeren 15 ml'lik bir tüpe median kubital venden 10 ml kan örneği aldıktan hemen sonra, pıhtı oluşumunu önlemek için tüpü birkaç kez altüst edin. Ardından, hücrelere 35 ml otoklavlanmış eritrosit lizis tamponu ekleyerek oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.Tüp boyunca ışık gözlemlenebildiğinde, kanı santrifüjleyin ve beyaz bir peletin varlığını doğrulayın. Kalan lizis tamponunu 10 ml otoklavlanmış PBS ile uzaklaştırın ve peleti 10 ml RPMI 1640 besiyerinde yeniden süspande edin. Hücreleri, 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında 30 dakika inkübasyon için 10 cm'lik bir kültür kabına ekin.Ardından kültür kabını birkaç kez hafifçe çalkalayın ve yüzen hücreleri plastik 15 ml'lik konik bir tüpe aktarın. Santrifüj ile iki kez yıkadıktan sonra, peleti 200 µL soğuk PBS tamponunda, ml başına hücre konsantrasyonunun 5 ila 10 katı olacak şekilde yeniden süspande edin ve 10⁶ hücre başına 5 µL kan hücrelerine özgü biyotinize anti-human antikor kokteyli ekleyin. Buz üzerinde 30 dakikalık inkübasyonun ardından, hücreleri 10 kat fazla hacimdeki steril PBS ile yıkayın ve peleti, 10⁶ hücre başına 5 µL streptavidin konjuge mikro boncuk içerisinde, buz üzerinde 30 dakikalık bir inkübasyon için yeniden süspande edin.İnkübasyonun sonunda hücrelere 2 ml PBS tamponu ekleyin ve tüpü oda sıcaklığında sekiz dakika boyunca manyetik bir standa yerleştirin. Mikro boncuklar tüp duvarına yapıştığında, süpernatantı dikkatlice yeni bir konik tüpe aktarın ve hücrelere 2 ml daha PBS tamponu ekleyin. İkinci süpernatant toplama işleminden sonra, birleştirilmiş hücreleri santrifüjle toplayın ve hücreleri 5 ml'lik polistiren bir tüpe, hücre başına ml konsantrasyonunun onda bir oranında taze PBS tamponu ile birlikte aktarın.Spesifik olmayan bloklama işlemini gerçekleştirdikten sonra, hücrelerin on katı hacim başına her bir seçilmiş antikorun bir mikrogramını tüpe ekleyin, nazikçe karıştırın ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun son beş dakikasında hücrelere beş mikrolitre 7-AAD ekleyin. Ardından hücrelere iki mililitre taze PBS ekleyin ve santrifüjlemeden önce vorteksleyin.Pelleti, mL başına 7 x 10⁵ hücre konsantrasyonunun bir ila beş katı kadar taze ayıklama tamponunda yeniden süspande edin ve hücreleri 40 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirerek yeni bir 5 mL polistiren tüpe filtreleyin. Ardından, naif B hücrelerini, bellek B hücrelerini ve plazmablast plazma hücrelerini toplamak için hücreleri akış sitometrisi ile her biri 5 mL taze RPMI medyum içeren üç adet 15 ml tüpe ayıklayın. Tüm hücreler toplandığında, alt grupları taze RPMI medyum içerisinde mL başına 5 x 10⁴ hücre konsantrasyonunun bir ila on katı olacak şekilde 12 kuyucuklu bir hücre kültürü plağının ayrı kuyucuklarına ekin.Ardından, hücre kültürü inkübatöründe beş gün boyunca, kuyuk başına mililitrede on altıncı hücrelerin onda birine beş mikrogram CPG ODN 2006 ekleyerek B hücrelerini aktive edin. Aktivasyonun sonunda, ELISpot plakalarının her bir kuyusuna 30 saniye boyunca 30 µL %35'lik etanol ve distile su ekleyin. Daha sonra, her kuyuktaki etanolü 150 µL otoklavlanmış çift distile su ile değiştirin ve kalıntı etanolü uzaklaştırmak için plakaları oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.PBS ile yıkama yapın ve ardından her bir kuyucuğa 50 µL anti-human IG poliklonal FAB2 fragmanı ekleyin. Plakaları, az önce gösterildiği gibi iki kez PBS ile yıkayın. Her bir kuyucuktaki spesifik olmayan bağlanmayı, 200 µL taze BSA'lı PBS ile oda sıcaklığında iki saat boyunca bloke edin.Başka bir PBS yıkama serisinin ardından, kuyucukları 100 µL taze RPMI 1640 ortamında 37 °C'de inkübe edin. Ardından her bir ELISpot kuyucuğundaki ortamı uygun sayıda aktive edilmiş B hücresi ile değiştirin. Her kuyucuğun nihai hacmini taze RPMI ortamı ile 150 µL'ye tamamlayın ve ardından ELISpot plakasını sekiz ila 14 saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri yerleştirin.İnkübasyon süresinin sonunda, besiyerini boşaltın ve kuyucukları 200 µL PBS plus tween20 ile üçer dakikalık beş yıkama şeklinde yıkayın. Son yıkamadan sonra, uygun deteksiyon antikorlarını ilgili kuyucuklara ekleyin ve plakaları karanlıkta iki saat boyunca inkübe edin. Başka bir PBS yıkama serisinin ardından, her kuyucuğa oda sıcaklığında beş ila 15 dakika boyunca 50 µL BCIPMBT substratı ekleyin.Mor lekeler belirdiğinde, kuyuk başına 100 µL çift distile su ile reaksiyonu durdurun ve plakayı akan musluk suyu ile durulayın. Ardından, ELISpot membranını ışıktan koruyarak havada kurutun. Bu donör PBMC örneğinde, eritrosit lizisi ve yapışkan hücrelerin uzaklaştırılmasının ardından lenfositlerin yaklaşık yüzde 10'u CD19 pozitif B hücreleriydi.B hücresi kompartmanında hücrelerin yaklaşık yüzde 50'si CD27 negatif naif B hücreleri ve yüzde 50'si CD27 eksprese eden bellek B hücreleriydi. Az önce gösterildiği üzere, saflaştırılmış insan B hücrelerinin ve CD19+CD27+ hücrelerin beş gün boyunca CPG ile tedavisi, genellikle 1×10⁴ aktive edilmiş B hücresinden 50 ila 200 IgM ve 10 ila 50 IgG antikor salgılayan hücrenin oluşmasıyla sonuçlanır. Uzmanlaşıldığında, bu ELISpot tekniği düzgün şekilde uygulandığı takdirde üç saat içinde tamamlanabilir.Bu prosedüre başlamadan önce, antikor salgılayan hücreleri saptamak için bölgenin uygun yakalama reaktifleri ile kodlanması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, vaksinoloji alanındaki araştırmacıların geniş ölçekli denemelerde ve boylamsal takiplerde aşı etkinliğini incelemelerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, kandan insan B hücrelerinin nasıl saflaştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Sıralama ve farklılaşmaları için naive ve bellek B hücrelerini ayırın ve antikor salgılayan hücreleri belirlemek için bir ELISpot deneyi gerçekleştirin. İnsan kanı ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü uygularken eldiven takmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

the-isolation-differentiation-quantification-human-antibody-secreting

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Adaptif bağışıklık idiyopatik hastalıklar mikrobik hedeflerin belirlenmesi, enzim bağlı immünospot testinin kullanımı yapılabilir.

Enzim-linked immünospot Testi (ELISPOT): Th-1 Mikrobiyal antijenlere karşı hücresel immün cevaplar Kantitasyonu

Bu videoda, B olmayan hücrelere özgü biyotinile antikorlar ve streptavidin konjuge manyetik mikro boncuklar kullanarak B hücrelerinin insan periferik kanından izolasyonunu gösteriyoruz.

İnsan Periferik Kanından B Hücrelerinin İzolasyonu ve Saflaştırılması

Bu videoda, insan periferik kan B hücrelerinden saf B hücresi, bellek B hücresi ve plazmablast plazma hücresi alt popülasyonlarının akış sitometrisine dayalı sıralaması için bir protokol açıklıyoruz. Farklı B hücresi alt popülasyonları, B hücresi yüzeylerinde eksprese edilen CD19, CD27 ve CD38 reseptörlerine florofor bazlı antikor bağlanmasına ve ardından hücre sıralamasına dayalı olarak ayırt edilebilir.

Farklı Dolaşım B Hücre Popülasyonları için Akış Sitometrisi Tabanlı Hücre Sınıflandırması

Bu video, antikor salgılayan B hücrelerinin, ASC'lerin işlevini değerlendirmek için ELISpot testinin kullanımını göstermektedir. ASC'ler tarafından salgılanan antikorlar, enzim konjuge IgG veya IgM antikorları tarafından tespit edilen zara bağlı poliklonal antikor fragmanları ile etkileşime girer. Her bir oyukta üretilen renkli nokta, B hücrelerinin salgı aktivitesi ile ilişkili olan spesifik antikorun izotipinin varlığını gösterir.

Antikor Salgılayan B Hücrelerinin ELISpot Testi Kullanılarak Fonksiyonel Değerlendirmesi

Bu tür tek hücre düzeyinde sitokin üretimi tespit etmek ve T hücre yanıtlarının hem nicel hem de nitel karakterizasyonu sağlanmıştır interferon gamma (IFN-γ) ELISpot, gibi fonksiyonel deneylerde sahip yeni kuşak varicella zoster karşı hücre aracılı bağışıklık tepkilerini ölçmek için kullanılabilir virüsü (VZV).

Göbek Kordon Kanı Transplantasyonu takiben, IFN-γ değerlendirin ELISpot Tahlili Varisella-Zoster Virüs spesifik hücre-aracılı bağışıklık geliştirilmesi

Fonksiyonel ve fenotipik analizi için antijene reaktif B hücreleri tespit etmek ve ettirecek bir manyetik nano-tanecikleri kullanır basit ama etkili bir yöntem tarif edilmiştir.

Fenotip ve Fonksiyon Analizi için algılama ve Nadir zenginleştirilmesi antijene özgü B hücreleri

Biz insan kanında dolaşan nadir B hücreleri başlayarak insan antikorlar faiz, bir antijen için belirli üretim için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu doğal antikorlar nesil verimli ve hızlı ve elde edilen antikor arasında son derece ilgili antijenleri ayırt edebilirsiniz.

Kanda dolaşan nadir antijen spesifik B hücreleri Discriminative insan monoklonal antikorların üretimi

Bu yazıda, biz T-bağımlı ve T-bağımsız immünglobulin (Ig) izotip yanıt ELISA kullanarak farelerde karakterize için bir protokol tanımlamak. Bu yöntem tek başına veya kullanılabilir akış ile birlikte sitometresi araştırmacılar T-bağımlı ve bağımsız T antijen bağışıklama takip farelerde B hücre-aracılı Ig izotip yanıtlarında farkları belirlemek için izin verir.

Timus bağlı ve timus bağımsız immünglobulin izotip yanıt Immunosorbent Assay enzim bağlı kullanarak farelerde karakterizasyonu

BSelex yöntemi tanımlamak ve insan periferik kan mononükleer hücrelerden bireysel antijen özgü antikorlar kurtarmak için tek hücreli PCR ve klonlama ile akış sitometri birleştirir.

Zenginleştirilmiş İnsan Hafızası B Hücre Popülasyonlarından İstenilen Özgülliklerle Antikorların Seçimi ve Geri Kazanımı İçin Tek Hücreli Tarama Yöntemi

Tam kan bazlı immünolojik testler, tanı ve araştırma amaçları için antijene özgü bağışıklığı analiz etmek için kolay ve kaynak açısından verimli bir araç sağlar. Bu makale, pediatrik hastalar ve küçük hayvanlar için düşük hacimli bir versiyon da dahil olmak üzere, mantar ve viral patojenlere karşı konak bağışıklığının kapsamlı analizi için ikili ko-stimülasyonlu optimize edilmiş bir tam kan bazlı protokol sağlar.

Fungal ve Viral Patojenlere Karşı Konak Bağışıklığının Antijene Özgü Analizi için İkili Ko-stimülasyonlu Tam Kan Testi

Öğrenin, ELISpot yöntemiyle insan kanından antikor salgılayan B hücrelerini izole edin, farklılaştırın ve nicelendirin. Bu teknik, hücresel düzeyde ölçüm yaparak aşı araştırmalarına ve bağışıklık bilimine katkı sağlar.

İzolasyon, Farklılaşma ve Niceleme İnsan Kanı B Hücreleri Antikor salgılayan: ELISPOT Hümoral Bağışıklık bir Fonksiyonel Göstergesinin olarak (Video) | JoVE Journal

İzolasyon, Farklılaşma ve Niceleme İnsan Kanı B Hücreleri Antikor salgılayan: ELISPOT Hümoral Bağışıklık bir Fonksiyonel Göstergesi'nin olarak

Daha fazla video keşfet