Name: Antikor parçalarının bir kütüphanenin taranması için bakteriyel iç zar görüntü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Keşfedin, bakteriyel iç zar görüntüleme yöntemiyle antikor parçalarını bağlanma ve çözünürlük için eş zamanlı taramayı. Escherichia coli twin-arginine translokasyon yolunu kullanarak sitoplazmik katlanma kalitesini kontrol edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tomer Zohar'a scFv taraması ve karakterizasyon testleri üzerindeki çalışmaları için teşekkür ederiz. Bu çalışmanın bir kısmı, Ulusal Kanser Enstitüsü'nden (AJK'ya) F32CA150622 numaralı ödülle desteklendi. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Kanser Enstitüsü veya Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

<ol><li>Biocca, S., Pierandrei-Amaldi, P., Campioni, N., Cattaneo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+immunization+with+cytosolic+recombinant+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Intracellular immunization with cytosolic recombinant antibodies.</a> Biotechnology (NY). 12 (4), 396-399 (1994).</li>
<li>Chen, S. Y., Bagley, J., Marasco, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+antibodies+as+a+new+class+of+therapeutic+molecules+for+gene-therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Intracellular antibodies as a new class of therapeutic molecules for gene-therapy.</a> Hum. Gene Ther. 5 (5), 595-601 (2008).</li>
<li>Gargano, N., Biocca, S., Bradbury, A., Cattaneo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+recombinant+antibody+fragments+neutralizing+human+immunodeficiency+virus+type+1+reverse+transcriptase+provide+an+experimental+basis+for+the+structural+classification+of+the+DNA+polymerase+family%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human recombinant antibody fragments neutralizing human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase provide an experimental basis for the structural classification of the DNA polymerase family.</a> J Virol. 70 (11), 7706-7712 (1996).</li>
<li>Mhashilkar, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+HIV-1+Tat-mediated+LTR+transactivation+and+HIV-1+infection+by+anti-Tat+single+chain+intrabodies%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Inhibition of HIV-1 Tat-mediated LTR transactivation and HIV-1 infection by anti-Tat single chain intrabodies.</a> Embo J. 14 (7), 1542-1551 (1995).</li>
<li>Strube, R. W., Chen, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+anti-cyclin+E+single-chain+Fv+antibodies+and+intrabodies+in+breast+cancer+cells%3A+enhanced+intracellular+stability+of+novel+sFv-F-c+intrabodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Characterization of anti-cyclin E single-chain Fv antibodies and intrabodies in breast cancer cells: enhanced intracellular stability of novel sFv-F-c intrabodies.</a> J. Immunol. Meth. 263 (1-2), 149-197 (2002).</li>
<li>Mössner, E., Koch, H., Plückthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+selection+of+antibodies+without+antigen+purification%3A+adaptation+of+the+protein+fragment+complementation+assay+to+select+antigen-antibody+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fast selection of antibodies without antigen purification: adaptation of the protein fragment complementation assay to select antigen-antibody pairs.</a> J. Mol. Biol. 308 (2), 115-122 (2001).</li>
<li>Wörn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+in+vitro+stability+and+in+vivo+performance+of+anti-GCN4+intrabodies+as+cytoplasmic+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Correlation between in vitro stability and in vivo performance of anti-GCN4 intrabodies as cytoplasmic inhibitors.</a> J Biol Chem. 275 (4), 2795-2803 (2000).</li>
<li>Knappik, A., Plückthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+turns+of+a+recombinant+antibody+improve+its+in+vivo+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineered turns of a recombinant antibody improve its in vivo folding.</a> Protein Eng. 8 (1), 81-89 (1995).</li>
<li>Martineau, P., Jones, P., Winter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+an+antibody+fragment+at+high+levels+in+the+bacterial+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of an antibody fragment at high levels in the bacterial cytoplasm.</a> J Mol Biol. 280 (1), 117-127 (1998).</li>
<li>Steipe, B., Schiller, B., Plückthun, A., Steinbacher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+statistics+reliably+predict+stabilizing+mutations+in+a+protein+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequence statistics reliably predict stabilizing mutations in a protein domain.</a> J. Mol. Biol. 240 (3), 188-192 (1994).</li>
<li>Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+engineering+with+bacterial+display%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein engineering with bacterial display.</a> Curr Opin Struct Biol. 17 (4), 474-480 (2007).</li>
<li>Lener, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverting+a+protein+from+its+cellular+location+by+intracellular+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Diverting a protein from its cellular location by intracellular antibodies.</a> Eur. J. Biochem. 267 (4), 1196-1205 (2000).</li>
<li>Lynch, S. M., Zhou, C., Messer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+scFv+intrabody+against+the+nonamyloid+component+of+%CE%B1-synuclein+reduces+intracellular+aggregation+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An scFv intrabody against the nonamyloid component of α-synuclein reduces intracellular aggregation and toxicity.</a> J. Mol. Biol. 377 (1), 136-147 (2008).</li>
<li>Gai, S. A., Wittrup, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+surface+display+for+protein+engineering+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Yeast surface display for protein engineering and characterization.</a> Curr. Opin. Struc. Biol. 17 (4), 467-473 (2007).</li>
<li>Kieke, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+functional+T+cell+receptor+mutants+from+a+yeast+surface-display+library%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Selection of functional T cell receptor mutants from a yeast surface-display library.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 (10), 5651-5656 (1999).</li>
<li>Steiner, D., Forrer, P., Stumpp, M. T., Pluckthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+sequences+directing+cotranslational+translocation+expand+the+range+of+proteins+amenable+to+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Signal sequences directing cotranslational translocation expand the range of proteins amenable to phage display.</a> Nat. Biotechnol. 24, 823-831 (2006).</li>
<li>Pugsley, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+general+secretory+pathway+in+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The complete general secretory pathway in gram-negative bacteria.</a> Microbiol. Rev. 57 (1), 50-108 (1993).</li>
<li>Rapoza, M. P., Webster, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+filamentous+bacteriophage+assembly+proteins+require+the+bacterial+SecA+protein+for+correct+localization+to+the+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The filamentous bacteriophage assembly proteins require the bacterial SecA protein for correct localization to the membrane.</a> J. Bacteriol. 175 (6), 1856-1859 (1993).</li>
<li>Karlsson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+antibody+fitness+and+function+using+membrane-anchored+display+of+correctly+folded+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Molec.+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineering antibody fitness and function using membrane-anchored display of correctly folded proteins.</a> J. Molec. Biol. 416 (1), 94-107 (2012).</li>
<li>DeLisa, M. P., Tullman, D., Georgiou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+quality+control+in+the+export+of+proteins+by+the+bacterial+twin-arginine+translocation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Folding quality control in the export of proteins by the bacterial twin-arginine translocation pathway.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 6115-6120 (2003).</li>
<li>Fisher, A. C., Kim, W., DeLisa, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+selection+for+protein+solubility+enabled+by+the+folding+quality+control+feature+of+the+twin-arginine+translocation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Genetic selection for protein solubility enabled by the folding quality control feature of the twin-arginine translocation pathway.</a> Protein Sci. 15 (3), 449-458 (2006).</li>
<li>Maynard, J., Georgiou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Antibody engineering.</a> Annu Rev Biomed Eng. 2, 339-376 (2000).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. 1, Fourth, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).</li>
<li>Milo, R., Jorgensen, P., Moran, U., Weber, G., Springer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioNumbers--the+database+of+key+numbers+in+molecular+and+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">BioNumbers--the database of key numbers in molecular and cell biology.</a> Nucleic Acids Res. 38, D750-D753 (2010).</li>
<li>Hermanson, G. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermanson%2C+GT+%22Bioconjugate+Techniques%22">Bioconjugate Techniques</a>. , Third, Elsevier/Academic Press. (2013).</li>
<li>Tayapiwatana, C., Chotpadiwetkul, R., Kasinrerk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+using+streptavidin+magnetic+bead-sorted+in+vivo+biotinylated+survivin+for+monoclonal+antibody+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel approach using streptavidin magnetic bead-sorted in vivo biotinylated survivin for monoclonal antibody production.</a> J Immunol Methods. 317 (1-2), 1-11 (2006).</li>
<li>Zhu, G., Song, L., Lippard, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+inhibition+of+nucleosome+mobility+and+transcription+by+cisplatin-DNA+interstrand+crosslinks+in+live+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Visualizing inhibition of nucleosome mobility and transcription by cisplatin-DNA interstrand crosslinks in live mammalian cells.</a> Cancer Res. 73 (14), 4451-4460 (2013).</li>
<li>Bogsch, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+component+of+a+novel+bacterial+protein+export+system+with+homologues+in+plastids+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An essential component of a novel bacterial protein export system with homologues in plastids and mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 273, 18003-18006 (1998).</li>
<li>Julian, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-evolution+of+affinity+and+stability+of+grafted+amyloid-motif+domain+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng.+Des.+Sel%22%5BJournal%5D)">Co-evolution of affinity and stability of grafted amyloid-motif domain antibodies.</a> Protein Eng. Des. Sel. 28 (10), 339-350 (2015).</li>
<li>Garber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bispecific+antibodies+rise+again%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug.+Discov%22%5BJournal%5D)">Bispecific antibodies rise again.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 13 (11), 799-801 (2014).</li>
<li>Marschall, A. L., Dübel, S., Böldicke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+in+vivo+knockdown+of+protein+function+by+intrabodies%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Specific in vivo knockdown of protein function by intrabodies.</a> MAbs. 7 (6), 1010-1035 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Sitoplazmik aktivite için antikorların mühendislik nedeniyle disülfid bağlarını 6,7 stabilize oluşumunu engellemektedir sitoplazmasında, azaltılması ortamda bir zor bir iştir. Bu, bağlanma afinitesi için tasarlanmış olan ek olarak, sitoplazma içinde kararlılıklannın ve çözülebilirliklerinin için tasarlanmıştır sürece sitoplazmik inaktif olarak en antikorları neden olur. Faj gösterimi, bakteriyel yüzey ekranında ve maya yüzey görüntüleme yöntemleri, mevcut yöntemler, tüm antikorların görüntülenmesi için salgılama yoluna 14-16 kullanır, ancak bu yöntemler, hücre içi katlama mühendislik için bir araç vardır. Tat yolunun katlama kalite kontrolü kötü katlanmış ve sitoplazmada kararsız olan antikorların translokasyonu önler, çünkü iç zarı ekranı kullanarak işlenmiş antikorlar sitoplazmik istikrar ve gelişmiş çözünürlüğe sahip. Bu yöntem afinite a mühendislik içi antikorların tekrarlı sürecini kolaylaştırırnd çözünürlük, iki özellik tek adımda mühendislik gibidir. bu yöntem indirgeyici hücre içi çevrede çözünürlüğe sahip antikorların mühendislik için tasarlanmış olsa da, aynı zamanda, proteinler, bu yöntem, periplazma oksitleyici ortamda katlama muhafaza kullanılarak tasarlanır, çünkü, indirgeyici olmayan koşullar işlev mühendislik antikorlara uygulanabilir. Bu teknik, yüksek afinite ve yüksek sitoplazmik çözünürlüğe sahip antikorlar mühendislik sürecini kolaylaştırır rağmen, çeşitli sınırlamalar bu protokolü kullanarak göz önünde bulundurulacak önemlidir. İkincil ekran ELISA sinyallerini analiz ederken scFv varyantları umut tanımlamak için yeterli antijen bağlama sergilemek olmayabilir potansiyel olarak ilginç varyantları ve bu arasındaki seçici eşiği birkaç klon daha karakterize edilmiştir sonrasına kadar belirgin olması muhtemel değildir. Ana antikor üzerinde bağlayıcı geliştirilmiş bakmak için önemlidir; ancak,anormal yüksek sinyal avidite 29 veya toplama etkileri 30, iç-zar ekran tarama yaklaşımı özgü olmayan bir meydan okuma işaret olabilir. Bu protokolü kullanarak kaydırma sonra spheroplastlar kurtarmak için yetersizlik olduğunda onlar cansız (yayınlanmamış veri) olarak önemli bir sınırlaması, hatırlamak. Bu antikor kodlayan plazmidler kurtarmak için DNA amplifikasyonu ve dönüşüm adımlarını gerektirir. protokolün birkaç kritik adımlar katlama ve antikorların bağlanma eşzamanlı mühendislik sağlar. Tarama başarılı olması için, taranan scFv kitaplığı ssTorA sinyal peptidine bir füzyon olarak ifade edilmelidir. Bu sekans olmadan, antikorlar, Tat yoluna yönlendirilecektir garanti eder ve periplasmasında 19 transloke edilmez. Buna ek olarak, bir C-terminal epitop etiketi kutusu görüntülenen antikorların saptanmasına olanak tanınması için antikorlara kaynaşık şarttırDing tahlilleri. Açıktır ki, E. coli suşu da gerekli Tat yolu makine olması gerekir scFv&#39;leri ifade etmek için kullanılan, ancak bu yaygın olarak kullanılan E. doğrudur coli suşları. Bu protokole değişiklikler arzu edilen özelliklere sahip antikorların izole edilmesi için potansiyelini geliştirmek mümkündür. Bir çıkarımsal kaydırma adım önce olmayan, istenen bileşenlerin scFv kütüphanesini tüketmek için hedef antijene karşı kaydırma tamamlanmış olabilir. Kütüphane sferoplastlar olmayan bir istenen proteini, tek başına veya kaplanmış BCCP kaplanmış manyetik boncuklarla inkübe edilebilir ve bu boncuklara bağlanan sferoplastlar istenen hedefe bağlanma için geri kalan bağlanmamış spheroplastlar taramadan önceki atılabilir. Örnek Sonuçlar de belirtildiği gibi, bir yöntem olup, izole edilmiş bir scFv afinite spheroplastlar görüntülenen scFv&#39;den ile rekabet kaydırma reaksiyonunda çözünebilir rakip eklemektir geliştirmek. çözünür comp Çünküetitor hiç DNA spheroplastlar görüntülenen scFv&#39;lerin yani sadece sekanslar PCR reaksiyonunda geri kazanılan olacak, amplifiye edilir, saflaştırılmış bir proteindir. Buna ek olarak, bu yöntem, antikor ya da olmayan bir antikor bağlama proteinlerinin diğer türleri mühendisliğine genişletilebilir. E.coli iç zarı ekran yüksek afinite ve hücre içi çözünürlüğü yüksek olan mühendislik antikorları için güçlü bir platformdur. Bu yöntem, hücre içi çevrede meydana gelecek şekilde tasarlanmıştır antikorların etkin ürünler için özellikle uygundur. Bu hücre içi antikorlar, nörodejeneratif hastalıklar, kanser ve viral enfeksiyonların 31 gibi alanlarda bir dizi potansiyel terapötikler olarak araştırılmaktadır. Bu teknik, araştırma ve tıp bu alanlarda ve in situ bir protein hedefi istenen incelenmesi her bir diğer alan için bir araç olarak hücre içi antikorlar daha yaygın kullanımı sağlayacak.

katlanması ve hücre içi ortamı fonksiyon görme yeteneğine sahip antikorlar, araştırma ve terapötik uygulamaları için umut vaat eden araçlar. Bunlar protein-protein etkileşimlerini önlemek protein, nükleik asit etkileşimleri bozmak ya da enzimler 1-5&#39;e alt-tabaka erişimi engellemek için hücre içinde bir hedef proteine bağlanarak protein aktivitesini modüle etme kabiliyetine sahiptir. antikorlar, hücre içi uygulamalar için büyük bir potansiyele sahip olmalarına rağmen, bir hedef antijene bağlanma yeteneğine korurken, hücre içi çevrede düzgün katlanmasını ve çözünürlüğünü bunları mühendislik zordur. Indirgeme sitoplazmik ortamı, normal olarak, tam-uzunlukta antikorlar ve tek zincirli değişken fragmanı (scFv) 6,7 antikorlar dahil olmak üzere antikor fragmanları, sabit katlama için gerekli disülfit bağlarının oluşumunu engeller. yönlendirilmiş evrim bir kısım yaklaşımlar, h antikor mühendislikten geçirilmesi için kullanılmıştırhedef IGH afiniteleri 8-10 antijenleri. Bu yaklaşımlar genellikle antikor 11-13 büyük kütüphanelerinin taranması için faj gösterimi, maya yüzey görüntüsünü veya bakteriyel yüzey görüntüsünü kullanın. Bu yöntemler, hedeflere bağlanan antikorların belirlenmesi için güçlü ve etkili, henüz 14-16 görüntülenir proteinlerin taşınması için salgı yoluna bağlıdır. salgı yolu maya veya bakteri içinde periplazmaya endoplazmik retikulum lümenine azaltarak sitoplazmadan katlanmamış proteinleri translocates. Daha sonra proteinler oksitleyici şartlar altında kat ve hücre yüzeyinde gösterilen ya da afinite 17,18 bağlanma taranması için faj parçacıkları halinde paketlenir. Bunun bir sonucu olarak, bu teknikler kullanılarak izole antikorlar zorunlu olarak sitoplazmada de katı olmayacak ve antikorlar, hücre içi uygulamalarda kullanılacaksa, hücre içi içindeki çözünürlüğü çoğu zaman ayrı ayrı işlenmiş olması gerekir. Geliştirmekde sitoplazmada katlanmaktadır mühendisliği antikorların etkinliği, daha önce MAD-TRAP (ilişkilendirilmesi proteinleri Tat bazlı tanınması için, zara-sabitlenmiş ekran) başarısını Escherichia coli inner- kullanarak bir scFv antikoru kütüphanesinin taranması için bir yöntem rapor membran ekran 19. Bakteriyel bir iç zar görüntüleme salgılama yoluna kullanan diğer yaygın görüntü yöntemlerin aksine olarak, görüntülenen antikorların taşınması için çift arginin translokasyon (TAT) yolu kullanır. Tat yolu, sadece çözünür, doğru biçimde katlanmış proteinler, E. taşınacak sağlayan bir kalite kontrol mekanizması içerir iç zarından ve periplasmasında 20,21 içine coli sitoplazma. De sitoplazmada katlanmaktadır (bir TAT sinyal peptidi ssTorA bir N-terminal füzyon Tat yoluna hedeflenmiş yani., Proteinler) aşırı eksprese Tat substratlar bir N terminaline sahip bir ara madde, uzun ömürlü bir translokasyon Form Isitoplazma ve periplasmasında 19 C-terminali n. Bu E. periplazmik yüzünde, antikor fragmanları da dahil olmak üzere doğru katlanmış Tat yüzeyler, görüntülenmesini sağlar E. coli iç zarı. Spheroplastlar oluşturmak için enzimatik sindirme ile dış membran ayrılmasından sonra, antikorlar, hücre dışı alan (Şekil 1) maruz kalmaktadır. Bu, iç zar üzerinde görüntülenen Tat substratlar belirli bir hedefe bağlanması açısından taranabilir sağlar. Önemli olarak, hücre-yüzeyi ekran Tat yolu sokmak de sitoplazmada katlanmaktadır Kütüphanede yalnızca antikorlar afinite ve hücre içi katlanmayı bağlama eşzamanlı mühendisliği sağlayan bağlanma için sorguya garanti eder. Bu protokol, biz E. üzerinde bir scFv kitaplığı nasıl görüntüleneceğini açıklar coli iç zarı, bir hedef antijene karşı kütüphane pan ve kütüphaneden en umut verici bileşenleri tanımlamak için ikincil bir ekran gerçekleştirin. biz odak iken<html> scFvs&#39;ye üzerinde protokol, yöntem başvurusu bağlayıcı ve hücre içi katlanmayı gerektiren herhangi bir proteini mühendislik tatbik edilebilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54583/54583fig1.jpg" /> Şekil 1. Tat iç zar ekran. E. ise E. coli, ssTorA sinyal sekansına bir füzyon olarak ifade edilir ve doğru şekilde sitoplazmada katlanır scFv antikor iç zarı boyunca taşınmaktadır. scFv sitoplazma içinde N-terminalinde ve periplazmada C-terminali ile bir iç zar içinde tutturulmuş Translokasyon ara form. E. coli dış zar enzimatik ve böylece hücre-dışı alana bağımlı antikorların açığa görüntülenen antikorun C-terminalli füzyonu yapılmış epitop takısına bağlanan bir antikor kullanılarak tespit edilmesi için kullanılabilir hale, spheroplastlar oluşturmak için sindirilmiştir.yük / 54583 / 54583fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

<table><tbody><tr><td>scFv kütüphanesi</td><td>Değişir</td><td></td><td>Uygun bir scFv kütüphanesi ticari veya akademik bir kaynaktan edinilmelidir.</td></tr><tr><td>MC4100 E. coli hücreleri</td><td>Coli Genetik Stok Merkezi</td><td>6152</td><td>Hücrelerin, seçilen transformasyon yöntemine bağlı olarak kimyasal olarak yetkin veya elektro-yetkin olması gerekir.</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>Difco kurutulmuş kültür ortamı LB Et suyu, Miller (Luria-Bertani)</td><td>BD</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>Kloramfenikol (cm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP904-100</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat, dibazik (Na2HPO<>sub4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat, monobazik (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9706-100</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris tabanı</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 0.5 M</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür (MgCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Lizozim</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3790-10X1ML</td><td></td></tr><tr><td>Vorteks karıştırıcı</td><td>VWR</td><td>97043-564</td><td></td></tr><tr><td>Bicine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2646100</td><td></td></tr><tr><td>D-Biotin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP232-1</td><td></td></tr><tr><td>İzopropil ve beta;-D-1-tiyokalaktopiranosit</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-1</td><td></td></tr><tr><td>BugBuster Master Mix (hücre lizis deterjanı)</td> <td>EMD Millipore</td><td>71456</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 2 MWCO, 3.000&nbsp; daltons</td><td>GE Sağlık Bilimleri</td><td>28932240</td><td></td></tr><tr><td>Hedef antijen</td><td>Değişir</td><td>N/A</td><td>Saflaştırılmış hedef antijen satın alınabilir veya üretilebilir/saflaştırılabilir.</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Invitrogen</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>Dynamag-2 mıknatıs</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Tüp döndürücü</td><td>VWR</td><td>13916-822</td><td></td></tr><tr><td>PCR primerleri</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>Primer dizileri protokolde tarif edildiği gibidir.</td></tr><tr><td>10x T4 DNA ligaz reaksiyon tamponu</td><td>New England BioLabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polinüselotid kinaz (PNK)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0201S</td><td>Primer fosforilasyon reaksiyonunda kullanılan T4 ligaz tamponunun 1 mM ATP içerdiğinden emin olun.</td></tr><tr><td>5x Phusion HF tampon paketi</td><td>New England BioLabs</td><td>B0518S</td><td></td></tr><tr><td>Deoksinükleotid (dNTP) çözelti karışımı, her biri 10 mM dNTP</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA polimeraz</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530S</td><td>Alternatif olarak diğer yüksek kaliteli polimerazlar kullanılabilir, ancak <güçlü>Tablo 3</güçlü> tavlama sıcaklığı ayarlanmalıdır.</td></tr><tr><td>Çift 48/48 hızlı reaksiyon modüllü C1000 Touch termal döngüleyici</td><td>Bio-Rad</td><td>185-1148</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Promega</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Güvenli DNA jel lekesi</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV jel ve PCR temizleme sistemi</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligaz</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodiyaliz membran filtre</td><td>EMD Millipore</td><td>VSWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu polistiren yuvarlak tabanlı hücre kültürü plakaları</td><td>VWR</td><td>10062-902</td><td></td></tr><tr><td>Costar genel polistiren tahlil plakası kapakları</td><td>Corning</td><td>3931</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotitre plaka çalkalayıcı</td><td>VWR</td><td>12620-926</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96 kuyu EIA/RIA Kolay Yıkama şeffaf düz tabanlı polistiren yüksek bağlayıcı mikroplaka</td><td>Corning</td><td>3369</td><td></td></tr><tr><td>Bel-blotter polikarbonat 96 kuyulu çoğaltma aracı</td><td>Bel-Art Ürünleri</td><td>378760002</td><td></td></tr><tr><td>Anında yağsız kuru süt</td><td>Kalite Biyolojik</td><td>A614-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 (polisorbat 20)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>PopCulture reaktifi (konsantre hücre lizis deterjanı)</td><td>EMD Millipore</td><td>71092-3</td><td></td></tr><tr><td>Farede üretilen Monoklonal ANTI-FLAG M2-Peroksidaz (HRP) antikoru</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>SigmaFast OPD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9187-50SET</td><td></td></tr><tr><td>Sülfürik asit (H2SO4), 10 nbsp; N çözümü</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA200-1</td><td></td></tr><tr><td>Reynolds Wrap alüminyum folyo</td><td>VWR</td><td>89079-075</td><td></td></tr><tr><td>BioTek Epoch mikroplaka spektrofotometresi</td><td>Fisher Scientific</td><td>11120570</td><td></td></tr></tbody></table>

antikor parçalarının bir kütüphanenin taranması için bakteriyel iç zar görüntü

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Hücre içi işlev için tasarlanmış antikorlar, yalnızca hedef antijenlerine afiniteye sahip olmamalı, aynı zamanda çözünür olmalı ve sitoplazmada doğru şekilde katlanmalıdır. Rekombinant antikor kütüphanelerinin görüntülenmesi ve taranması için yaygın olarak kullanılan yöntemler, hücre içi protein katlanması kalite kontrolünü içermez ve bu nedenle, bu yöntemler kullanılarak tasarlanan antikorların antijen bağlama kabiliyeti ve sitoplazmik katlanması ve çözünürlüğü genellikle ayrı olarak tasarlanmalıdır. Burada, aynı anda antijen bağlama ve uygun sitoplazmik katlanma için tek zincirli değişken fragman (scFv) antikorlarından oluşan bir rekombinant kütüphaneyi taramak için bir protokol açıklıyoruz. Yöntem, E. coli iç zarı üzerinde bir scFv kütüphanesi görüntülemek için Escherichia coli ikiz arginin translokasyonu (Tat) yolunun içsel hücre içi katlanma kalite kontrol mekanizmasını kullanır. Tat yolu, sadece çözünür, iyi katlanmış proteinlerin sitoplazmadan dışarı taşınmasını ve iç zarda görüntülenmesini sağlar, böylece antijen bağlanması için sorgulamadan önce zayıf katlanmış scFv'leri ortadan kaldırır. Dış zarın çıkarılmasını takiben, iç zarda görüntülenen scFv'ler, hedef antijene bağlanan scFv'leri izole etmek için manyetik boncuklar üzerinde hareketsiz hale getirilmiş bir hedef antijene karşı kaydırılır. Ek karakterizasyon için en umut verici scFv'leri tanımlamak için enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) bazlı bir ikincil ekran kullanılır. Antijen bağlama ve sitoplazmik çözünürlük, hücre içi uygulamalar için yüksek afiniteye ve yüksek sitoplazmik çözünürlüğe sahip antikorlar tasarlamak için sonraki mutajenez ve tarama turları ile geliştirilebilir.

E. Tat yolunun, hücre içi protein katlanması kalite kontrol mekanizması E. coli de indirgeyici sitoplazmik ortamda katlanır proteinlere iç hücre zarından karşıya aktarımı sınırlar. SsTorA sinyal sekansı (doğal Tat yolunun 20 ile taşınır Tora proteini, sinyal sekansı) bir scFv füzyon aşırı ifade ile, translokasyon iç zarı 19 scFv&#39;lerin ekranda sonuçlanan durdu. Dış zar enzimatik bölündükten sonra gösterildi antikorlar antijen bağlanma aktivitesi için tarama için uygun yapılır. ScFv ekran Tat yolunun yararlanmak olanağı Karlsson ve arkadaşları tarafından gösterilmiştir. 19 (Şekil 6). scFv antikor scFv13 ve scFv13.R4 tarafından tanınan arginin-arginin Tortu çifti yoksun nativ ssTorA dizisi ya da modifiye edilmiş bir ssTorA da kaynaştırılmıştırTat yolu. scFv13.R4 yönlendirilmiş evrim dört tur boyunca scFv13 arasında. Martineau ve arkadaşları tarafından işlenmiş ve sitoplazma 9 iyi katlama bilinmektedir. Bu scFv iç zarı görüntülenen, fakat yerli ssTorA sinyal sekansına bir füzyon olarak ifade edilmiştir, sadece (Şekil 6). Bunun aksine, scFv13 de sitoplazmik 9 katlanmamış olduğundan, bu nedenle bağımsız olarak sinyal dizisinin bu da erimiş olduğu, iç zar üzerinde de görüntülenir. Buna ek olarak, eğer scFv&#39;ler görüntülü dahili zar görüntü ve Tat yolu arasında önemli bir bağ gösteren gözlenmemiştir, TatC protein, Tat Makine 20,28 önemli bir bileşeni yoksun hücreler olarak ifade edildi. Bu sonuçlar, hücre içi fol için bir ekran olarak işlev Tat yolu ile taşıma sağlayan bir TAT sinyal peptidi içerir ve sadece bir protein doğru olarak iç zar üzerinde gösterildi sitoplazmada katlanır göstermektedirding. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/54583/54583fig6.jpg" /> Şekil iç zarı görüntülenen scFv&#39;lerin 6. bulunması. Sitometri analizi akışı iç zar üzerinde zayıf katlanmış scFv13 ve de katlanmış scFv13.R4 görüntüsünü tespit etmek için yapılmıştır. scFv ssTorA sırayla Arg-Arg çifti Lys-Lys değiştirildiği doğal ssTorA ya ssTorA (KK), kaynaştırılmıştır. scFv&#39;nin C-terminal FLAG epitop takıları, floresanlı bir izotiyosiyanat (FITC) ile tespit edilmiştir anti-FLAG antikoru ile konjüge edilmiş. FLAG etiketi olmadan TatC protein (ΔtatC) ve ssTorA-scFv13 olmayan hücreler kontrol olarak test edildi. M medyan floresan değerini gösterir. Izni ile referans 19 den yeniden basılmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54583/54583fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <p class="jove_content" fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; İç-zar ekran başarıyla hedef protein için afinite yüksek düzeyde ve sitoplazmik çözünürlüğü yüksek olan scFv antikorları izole edebilir. Buna ek olarak, iç-zar ekranı kullanarak yönlendirilmiş evrim sonraki mermi antikor özelliklerini 19 artırmak. Bunu göstermek için, β-galaktosidaz için bağlanma afinitesi düşük bir seviyede yer alır scFv13 dayanan bir hata eğilimli PCR kütüphanesi, protokolde tarif edilen yöntemi ekran kullanılarak ve panning hedef antigen β-galaktosidaz karşı pişirilmiştir. scFv 1-4 mutajenez ve kaydırma bir turdan sonra izole edilir ve scFv13 (Şekil 7A) az ve sitoplazmik çözünürlüğünün daha yüksek bir seviyede (Şekil 7B)-galaktosidaz olan B için yüksek bir bağlanma afinitesine sergilendi. scFv 1-4 dayalı yeni bir kütüphane, hata eğilimli PCR kullanılarak yapılan ve karşı bu ikinci nesil kütüphane kaydırma olduβ-galaktosidaz tarif edilen protokolün bir modifikasyonu kullanılarak yapıldı. evrim ikinci turu için β-galaktosidaz karşı kaydırma scFv 1-4 daha yüksek afinite ile klonların izole edilmesi olasılığını arttırmak için bir rakip olarak saflaştınlmış, çözülebilir scFv 14 varlığında yapıldı. mutagenez ve kaydırma bu ikinci turundan sonra, scFv 2-1 ve scFv 2-3 ELISA tabanlı ikincil tarama kullanılarak izole edilmiştir. Bu scFv&#39;ler sadece scFv13 daha β-galaktosidaz için daha yüksek bağlanma afinitesi sergiledi, fakat aynı zamanda ilk turda klonu scFv 1-4 daha iyi bağlama sergiledi değil. scFv 2-1 scFv13.R4 (Şekil 7A) ile karşılaştırılabilir bağlanma β-galaktosidaz sergiledi. scFv 2-3, aynı zamanda çözünebilirlik ve antijen bağlayıcı eşzamanlı mühendisliği vurgulama, scFv 14 göre sitoplazmik çözünürlük daha fazla bir artış görülmektedir. scFv&#39;lerin afinite ve çözünür sentezleme aynı zamanda açısından taranır için, seçilmiş bir scFv mod olması mümkündürerate çözünürlük ancak yüksek bağlanma ya da tam tersi. Örneğin, scFv 2-1 scFv 2-3 daha düşük eriyebilir bir ifade vardır, ancak P-galaktosidaz için daha yüksek bir bağlanma eğilimi gösterir. <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/54583/54583fig7.jpg" /> Şekil 7. Hedef bağlayıcı ve scFv sitoplazmik ifade iç zarı ekran kullanılarak izole varyantları. (A) scFv&#39;ler E. sitoplazmasında ifade edildi coli Heksahistidin (6 × His) etiketi ile (ssTorA sinyal dizisi olmaksızın örneğin.,) hücreleri ve nikel-nitrilotriasetik asit spin-sütunları kullanılarak saflaştırılmış. -Galaktosidaz olan B için saflaştınlmış scFv&#39;lerin bağlayıcı bir ELISA ile ölçüldü. Saflaştırılmış scFv&#39;ler β-galaktosidaz ile kaplanmış ELISA plakaları üzerine yüklendi, ve bağlanmış scFv&#39;ler bir anti-6 x -His antikor ile tespit edilmiştir. Veri altı tekrarların ortalamasıdır, ve buradaki hata çubuğu, ortalamanın standart hatasını gösterir.(B) sitoplazmik bir anti-6 x -His antikoru ile problanmış bir Batı lekesi ile analiz edilmiştir scFv&#39;leri eksprese eden hücrelerden elde edilen hücre lizatları çözünen ve çözünmeyen fraksiyonlar. Toplam protein konsantrasyonu numune yükleme normalize etmek için kullanıldı. (A) yayımlanmaktadır ve izni ile referans 19 (B) uyarladı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54583/54583fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Hücre içi protein katlanması için doğal bir kalite kontrol mekanizmasına sahip olan Escherichia coli ikiz-arginin translokasyon yolunu kullanarak, bağlanma afinitesi ve sitoplazmik çözünürlük için bir antikor fragmanları kitaplığını aynı anda taramak için bir yöntem sunuyoruz, antikor fragmanlarını iç zarda görüntülemek için.

Antikor parçalarının bir kütüphanenin taranması için bakteriyel iç zar görüntü

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Bu prosedürün genel amacı, antikorların hücre içinde işlev görmesini sağlayacak mühendislik çalışmalarında uygulanmak üzere, tek bir adımda antikor fragman bağlanmasını ve hücre içi katlanmasını tasarlamak için ikiz-arginin translokasyon yolağının katlanma kalite kontrol mekanizmasını kullanmaktır. Bu yöntem, antikorların indirgeyen sitoplazmik ortamda düzgün şekilde katlanması ve işlev görmesi için gereken mühendislik zorluklarının aşılması gibi antikor mühendisliği alanındaki temel engellerin üstesinden gelinmesine yardımcı olabilir. Yalnızca sitoplazmada iyi katlanan antikorlar sergilenir ve bağlanma açısından analiz edilir.Ekspresyon için sekresyon yollarına dayanan maya ve faj display yöntemlerine göre bir avantaj sağlamaktadır. Bu tekniğin etkileri; nörodejeneratif hastalıklar, kanser ve viral enfeksiyonların tedavisine kadar uzanmaktadır; çünkü bu hastalıklar, antikorlarla hedeflenebilecek hücre içi patogenez süreçleri içerir. Sferoplastların nasıl üretileceğini ve onlarla nasıl çalışılacağını anlamak zor olduğu için, bu yöntemin görsel gösterimi kritik önem taşımaktadır.scFv kütüphanesini ssTorA sinyal dizisine füzyon ettikten ve 37 °C'de üç saat boyunca çalkalayarak büyüttükten sonra, scFv kütüphanesinin ekspresyonuna 20 °C'de ve 225 rpm'de gece boyunca 15 ila 22 saat izin verin. İnkübasyonu takiben, 600 nm'deki optik yoğunluğu ölçmek için bir spektrofotometre kullanın. Ardından, indüklenmiş kültürün hesaplanan hacmini 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 12.000 ×g'de ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca santrifüjleyin.Süpernatantı uzaklaştırın ve peletleri yeniden süspansiyon haline getirmek için 100 µL buz gibi soğuk fraksiyonlama tamponu veya fB kullanın. Ardından, örnekleri 12,000 ×g'de ve oda sıcaklığında bir dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra, peletleri yeniden süspansiyon haline getirmek için 3,5 µL 10 mg/mL lizozim eklenmiş 350 µL buz gibi soğuk fB kullanın.Ardından, tüpleri yavaşça vortekslerken damla damla 700 µL 1 mM EDTA ekleyin ve örneklerin karışması için tüpleri oda sıcaklığında, bir tüp rotatöründe 20 dakika inkübe edin. Tüpleri rotatörden çıkarın. Her tüpe 50 µL buz gibi soğuk 0,5 M MgCl2 ekleyin ve tüpleri buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.Ardından örnekleri 11,000 ×g'de ve 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Şimdi, bir mikropipet ve 1 mL uç kullanarak pelletin bir kısmını yavaşça çekin. Daha sonra, tüpü tutarken, ağzı yeni bir 1,5 mL tüpün tam üzerinde olacak şekilde bir açıyla tutun, pipet ucunu süpernatanttan yavaşça kaldırın ve pelletin yeni tüpe kaymasını sağlayın.Fazla süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra, sferoplastları yeniden süspand etmek için bir mililitre buz gibi soğuk PBS kullanın. Agregatlar içinde bulunan ve bağlanmayan scFv'ler panning sırasında yalancı pozitif sonuçlara yol açacağından, panning öncesinde sferoplastlar tamamen yeniden süspande edilmelidir. Hedef antijeni metin protokolüne göre biyotinilledikten sonra, streptavidin kaplı manyetik boncukları orijinal flakonlarında yeniden süspande edin.Ardından, 7 ila 10 × 10⁹ boncuğu 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Boncukların tüpün kenarında toplanması için boncuk içeren tüpü iki dakika boyunca manyetik rafa yerleştirin ve süpernatantı dikkatlice uzaklaştırmak için pipetleyin. Tüpü mıknatıstan çıkarın ve hava kabarcığı oluşturmadan boncukları yeniden süspande etmek için PBS kullanın.Ardından tüpü tekrar mıknatısa yerleştirin ve boncukları iki kez daha PBS ile yıkamadan önce tamponu uzaklaştırın. Boncuklara biyotinize antijen içeren bir mililitre lizat ekleyin ve hafifçe döndürerek oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından boncukları beş kez yıkamak için %1 BSA içeren PBS kullanın.Ardından, boncukları yeniden süspande etmek için %1 BSA içeren PBS kullanın. scFv kütüphanesini taramak için, steril bir 15 mililitrelik tüpe 4x10⁹ sferoplast ve 8x10⁸ boncuk ekleyerek başlayın. Toplam hacmi dört mililitreye tamamlamak için 1x %1 BSA içeren PBS ekleyin.Ardından çözeltiyi, her biri bir mililitre olacak şekilde dört adet 1,5 mililitrelik tüpe paylaştırın ve reaksiyonları dört derece Celsius'tale nazikçe döndürerek beş saat boyunca inkübe edin. Boncuklara bağlı sferoplastları PCR için hazırlamak amacıyla, panning reaksiyon tüplerini üç dakika boyunca mıknatısa yerleştirin. Süpernatantı uzaklaştırın ve boncukları daha önce olduğu gibi dört kez %1 BSA içeren bir x PBS ile yıkayın.Ardından, boncukları yeniden süspand etmek için tüp başına 25 µL ddH20 kullanın. Metin protokolünde açıklandığı gibi, boncuklara bağlı scFv'ler için genleri çoğaltmak üzere tüm plazmid PCR'ı gerçekleştirin ve ardından PCR ürününden plazmidi yeniden daireselleştirin. Tüm reaksiyonu, metin protokolüne uygun olarak MC4100 dengelenmiş hücrelerine transforme edin.ELISA kullanarak klonları tanımlamak için, panlenmiş alt kütüphanenin bir tüpünü çözün ve LB agar plaklarına ekin. Yuvarlak tabanlı 96 kuyucuklu bir kültür plağının her kuyucuğuna, mililitre başına 20 mikrogram kloramfenikol içeren 200 mikrolitre LB ekleyin. Bir pipet ucuyla, agar plaktan tek bir koloni seçin.Ardından ucu 96 kuyucuklu plakanın ilk kuyucuğuna yerleştirin ve inokülasyon için nazikçe karıştırın. Her kuyucuğa bir koloni inoküle etmeye devam edin. Bir mikroplaka sallayıcıda 37 °C'de 20 ila 24 saat boyunca inkübe edin.Metin protokolüne uygun olarak bir hedef antijen kaplama çözeltisi hazırladıktan sonra, çözeltinin 50 µL'sini 96 kuyucuklu yüksek bağlanma kapasiteli şeffaf polistiren ELISA plakasının her bir kuyucuğuna ekleyin. Plakaları dört °C'de gece boyunca inkübe edin. Ardından, 96 kuyucuklu kültür plakalarındaki kolonileri metin protokolüne uygun olarak agar plakalara aktarın.Ardından, kaplama solüsyonunu ELISA plaklarından boşaltın ve metin protokolüne göre hazırlanan 100 microliter bloklama solüsyonunu her bir kuyucuğa ekleyin. Oda sıcaklığında en az iki saat veya dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Yuvarlak tabanlı kültür plağının her bir kuyucuğuna 20 microliter konsantre hücre lizis deterjanı ekleyin ve kültür plağını oda sıcaklığında bir mikroplak çalkalayıcıda 15 ila 20 dakika inkübe edin.ELISA plakalarındaki bloklama çözeltisini boşaltın ve kuyucukları, metin protokolüne göre hazırlanan 200 microliters yıkama tamponu ile dört kez yıkayın. Son yıkama işlemini tamamladıktan sonra, hücre liziz plakasının her kuyucuğundan 50 microliters örneği ELISA plakasının karşılık gelen kuyucuğuna aktarın. Plakaları oda sıcaklığında bir ila iki saat inkübe edin.ELISA plakasındaki örnekleri boşaltın ve kuyucukları dört kez yıkayın. Ardından, metin protokolüne uygun olarak scFv'leri tespit etmek için antikor çözeltisini hazırlayın. Her kuyucuğa 50 µL antikor ekleyin ve oda sıcaklığında bir ila iki saat inkübe edin.Üretici protokolüne göre hazırlanan HRP substratının kuyuk başına 200 µL'sini eklemeden önce ELISA plaklarını yıkama tamponu ile dört kez yıkayın. Plakaları oda sıcaklığında, karanlıkta 30 ila 60 dakika inkübe edin. Reaksiyonu durdurmak için her kuyuğa 50 µL üç molar H2SO4 ekleyin ve çözeltiyi karıştırmak için pipetle nazikçe karıştırın.Son olarak, 492 nanometrede plaka okuması yaparak absorbansı ölçün. Bu deneyde, scFv13 ve scFv13. R4 scFv antikorları, ya doğal ssTorA dizisine ya da twin-arginine translokasyon yolu (Tat yolu olarak da adlandırılır) tarafından tanınmayan modifiye edilmiş bir ssTorA'ya füzyonlandı.ScFv.R4 iyi katlanır ve doğal ssTorA'ya infüze edildiğinde iç membran üzerinde eksprese edilir. ScFv13 ise hangi Tat sinyal peptidine füzyonlandığına bakılmaksızın iyi katlanmaz ve iç membran üzerinde sergilenmez. Bu sonuçlar, yalnızca Tat sinyal peptidini içeren ve sitoplazmada doğru şekilde katlanan proteinlerin iç membran üzerinde sergilendiğini, böylece Tat yolağının hücre içi katlanma için bir tarama mekanizması olarak işlev görmesini sağladığını göstermektedir.Bu deneyde, beta-galaktosidaza düşük bağlanma afinitesine sahip olan scFv13 tabanlı, hataya eğilimli bir PCR kütüphanesi beta-gal'e karşı panlanmıştır. İzole edilen scFv 1-4, beta-gal'e karşı scFv13'ten daha yüksek bir bağlanma afinitesinin yanı sıra daha yüksek düzeyde sitoplazmik çözünürlük göstermiştir. İkinci nesil scFv 1-4 kütüphanesine karşı rakip olarak scFv 1-4 kullanılarak, scFv 2-1 ve 2-3 izole edilmiş ve bunlar beta-gal için scFv13 1-4'ten bile daha yüksek bağlanma afiniteleri sergileyerek, çözünürlük ve antijen bağlanmasının eş zamanlı mühendisliğinin altını çizmiştir.Bu prosedürün ardından, antijen özgünlüğünü doğrulamak ve izole edilen klonların bağlanma afinitesini belirlemek amacıyla saflaştırılmış lizat kullanılarak ELISA gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, kütüphaneyi sergilemek için Tat yolunu ve antijen bağlayıcılarını zenginleştirip izole etmek için manyetik boncuk panlama yöntemini kullanarak, bir antikorun ilgilenilen bir antijene bağlanma yeteneği için nasıl taranacağını anlamış olmalısınız. Sülfürik asit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve uygun kişisel koruyucu ekipman kullanmanın gerekliliğini unutmayın.

bacterial-inner-membrane-display-for-screening-library-antibody

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bir yöntem olup, aynı anda antijenlere karşı yüz Faj gösterimli birleştirici sentetik antikor kütüphanelerinden, ölçeklenebilir, yüksek verimli seçimleri yürütmek için görsel eşliğinde tarif edilmektedir. Bu paralel yaklaşımı kullanarak, standart bağışıklık tahlillerinde işlevsel çeşitli antijenler için yüksek bir çekim ve özelliğe gösteren antikor fragmanları izole ettik.

Faj-görüntülenen Sentetik Antikor Kütüphaneler itibaren Ölçeklenebilir Yüksek Verim Seçimi

Burada yazarlar, saflaştırılmış bir monoklonal antikor ve nokta-leke hibridizasyonulama yoluyla peptit taraması kullanarak doğrusal bir antijenik epitop tanımlamak için basit ve verimli bir protokol sunmaktadır. Tanımlanan epitop daha sonra terapötik ve tanısal uygulamalarda kullanılabilir.

Peptid, bir monoklonal antikor tarafından tanınan lineer B-hücresi epitopunun belirlenmesi: Tarama destekli

Biopanning bakteriyel görüntü kitaplıkları peptid benzeşme reaktifler, antikorlar için güçlü bir alternatif keşfi için kanıtlanmış bir tekniktir. Yarı Otomatik sıralama yöntemini burada yanlış pozitif oluşumunu azaltmak için biopanning aerodinamik. Burada düşünce süreci ve adayların değerlendirilmesi ve aşağı akım analizi en aza indirerek uygulanan teknikler gösterilmektedir.

Peptid benzeşme reaktif keşif ve elde edilen yalıtır analizi için bakteriyel ekran kütüphanelerin yarı otomatik Biopanning

Açıklanan protokollere izin ver inşaat, karakterizasyonu ve DNA, herhangi bir kaynaktan yapılan bir "domainome" kitaplığının (karşı seçim hedef) seçimi. Bu farklı teknolojileri bir araya getiren bir araştırma boru hattı tarafından sağlanır: faj ekran, katlama muhabir ve sonraki nesil sıralama veri analizi için bir web aracı ile.

Interactome-Seq: Domainome kitaplığı inşaat, doğrulama ve seçim fajının görüntü ve sonraki nesil sıralama için bir protokol

Burada, içinde yüksek üretilen iş ekran ekstraselüler protein microarrays kimliği roman reseptör-ligand etkileşimleri için bir iletişim kuralına mevcut. Ayrıca protein-microbead kompleksleri kullanarak geçici protein-protein etkileşimlerinin algılama geliştirmek için bir yöntem açıklar.

Hücre dışı Protein Mikroarray teknoloji yüksek işlem hacmi düşük benzeşme reseptör-Ligand etkileşimleri algılanması için

BSelex yöntemi tanımlamak ve insan periferik kan mononükleer hücrelerden bireysel antijen özgü antikorlar kurtarmak için tek hücreli PCR ve klonlama ile akış sitometri birleştirir.

Zenginleştirilmiş İnsan Hafızası B Hücre Popülasyonlarından İstenilen Özgülliklerle Antikorların Seçimi ve Geri Kazanımı İçin Tek Hücreli Tarama Yöntemi

Burada e. coli biotin-protein ligase BirA'nın belirli bir hedef peptidbiyominiyapan yeni varyantları için seçme yöntemi salıyoruz. Protokol, hedef peptidin bakteriyel olarak görüntülenmesi için bir plazmid yapımını, BirA kütüphanesinin neslinin, BirA varyantlarının seçilmesi ve karakterizasyonunun yapılmasını açıklar.

Roman Biyotinilasyon Enzimlerinin Seçimi için Bakteriyel Peptit Gösterimi

Herhangi bir küçük molekül ligand için istenilen yakınlık ve özgüllük ile kimyasal kaynaklı protein dimerizasyon sistemleri oluşturma birçok biyolojik algılama ve harekete uygulama olacaktır. Burada, faj la görüntülenen tek etki alanı antikor kütüphanesinin adım adım seçimi yoluyla kimyasal olarak indüklenen dimerizasyon sistemlerinin de novo mühendisliği için etkili, genelleştirilebilir bir yöntemi tanımlıyoruz.

Bir Kombinatoryal Tek Etki Alanı Antikor Kütüphanesi adım wise Faj Seçimi ile Son Derece Spesifik Kimyasal Kaynaklı Protein Dimerization Sistemleri Oluşturma

Bu protokol, ilgilenilen bir antijene bağlanan protein varyantlarını zenginleştirmek için maya yüzeyi teşhir seçimi kampanyalarının yürütülmesi için temel adımları açıklar.

Maya Yüzey Ekranı ile Protein Mühendisliği

Bu protokol, bir memeli ekspresyon sistemi içinde terapötik bir antikor üretimini tarif eder. Tarif edilen yöntemler, afinite kromatografisi kullanılarak, büyük ölçekli kültür ve saflaştırma ayarlamak vektör DNA, kararlı transfeksiyonu ve bir insan embriyonik böbrek 293 hücre hattı serumsuz adaptasyon hazırlanmasını içerir.

Laboratuar ölçekli üretim ve terapötik bir antikor ile saflaştırılması

Keşfedin, bakteriyel iç zar görüntüleme yöntemiyle antikor parçalarını bağlanma ve çözünürlük için eş zamanlı taramayı. Escherichia coli twin-arginine translokasyon yolunu kullanarak sitoplazmik katlanma kalitesini kontrol edin.

Antikor parçalarının bir kütüphanenin taranması için bakteriyel iç zar görüntü

Daha fazla video keşfet