Antikor parçalarının bir kütüphanenin taranması için bakteriyel iç zar görüntü

Bu prosedürün genel amacı, antikorların hücre içi olarak işlev görmesi için mühendislik antikorlarında uygulamalara sahip olacak tek bir adımda antikor fragmanı bağlanmasını ve hücre içi katlanmayı tasarlamak için ikiz arginin translokasyon yolunun katlanma kalite kontrolünden yararlanmaktır. Bu yöntem, indirgeyici sitoplazmik ortamda antikorların düzgün bir şekilde katlanması ve işlev görmesi için mühendislik zorluğunun üstesinden gelmek gibi antikor mühendisliği alanındaki temel zorlukların üstesinden gelmeye yardımcı olabilir. Sadece sitoplazmada iyi katlanan antikorlar görüntülenir ve bağlanma için test edilir.

Görüntüleme için salgı yollarına dayanan maya ve faj gösterimine göre bir avantaj sağlar. Bu tekniğin etkileri, nörodejeneratif hastalıklar, kanser ve viral enfeksiyonların tedavisine kadar uzanır, çünkü bu hastalıklar antikorlar tarafından hedeflenebilecek hücre içi patogenezi içerir. Bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir, çünkü sferoplastların nasıl üretileceğini ve bunlarla nasıl çalışılacağını anlamak zordur.

ScFv kütüphanesini ssTorA sinyal dizisine kaynaştırdıktan ve üç saat çalkalayarak 37 santigrat derecede büyüttükten sonra, scFv kütüphanesinin 15 ila 22 saat boyunca gece boyunca 20 santigrat derece ve 225 rpm'de ifadesine izin verin. İnkübasyonun ardından, 600 nanometredeki optik yoğunluğu ölçmek için bir spektrofotometre kullanın. Daha sonra, hesaplanan indüklenmiş kültür hacmini 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde 12.000 kez g ve oda sıcaklığında beş dakika santrifüjleyin.

Süpernatanı çıkarın ve peletleri yeniden süspanse etmek için 100 mikrolitre buz gibi soğuk fraksiyonasyon tamponu veya fB kullanın. Daha sonra numuneleri 12.000 kez g ve oda sıcaklığında bir dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkardıktan sonra, peletleri yeniden süspanse etmek için mililitre lizozim başına 3.5 mikrolitre 10 miligram ile desteklenmiş 350 mikrolitre buz gibi soğuk fB kullanın.

Daha sonra, tüpleri yavaşça girdaplarken, damla damla 700 mikrolitre 1 milimolar EDTA ekleyin, ardından numuneleri karıştırmak için tüpleri oda sıcaklığında bir tüp döndürücü üzerinde 20 dakika inkübe edin. Tüpleri döndürücüden çıkarın. Her tüpe 50 mikrolitre buz gibi soğuk nokta beş molar MgCl2 ekleyin ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.

Daha sonra numuneleri 11.000 kez g ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Şimdi, bir mikropipet ve bir mililitrelik bir uçla, peletin bir kısmını yavaşça yukarı çekin. Ardından, tüpü tutarken, açıklık doğrudan yeni bir 1,5 mililitrelik tüpün üzerinde olacak bir açıda, pipet ucunu yavaşça süpernatanttan kaldırın ve peleti yeni tüpe kaydırın.

Fazla süpernatanı çıkardıktan sonra, sferoplastları yeniden süspanse etmek için bir mililitre buz gibi soğuk PBS kullanın. Agregalarda bulunan bağlayıcı olmayan scFv'ler, kaydırmadan kaynaklanan yanlış pozitiflere yol açacağından, sferoplastlar kaydırmadan önce tamamen yeniden askıya alınmalıdır. Hedef antijeni metin protokolüne göre biyotinilasyondan sonra, streptavidin kaplı manyetik boncukları orijinal şişelerinde yeniden süspanse edin.

Daha sonra yedi ila 10 kez 10 ila 9. boncukları 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpün yan tarafındaki boncukları toplamak için boncuk tüpünü iki dakika boyunca manyetik rafa yerleştirin ve süpernatanı dikkatlice çıkarmak için pipetleyin. Tüpü mıknatıstan çıkarın ve kabarcık oluşturmadan boncukları yeniden askıya almak için PBS'yi kullanın.

Ardından tüpü mıknatısa geri koyun ve boncukları PBS ile iki kez daha yıkamadan önce tamponu çıkarın. Boncuklara biyotinile antijen içeren bir mililitre lizat ekleyin ve hafifçe döndürürken oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, boncukları beş kez yıkamak için% 1 BSA ile PBS kullanın.

Ardından, boncukları yeniden askıya almak için %1 BSA ile PBS kullanın. scFv kütüphanesini taramak için, steril 15 mililitrelik bir tüpe 9. sferoplastlara dört kez 10 ve 8. boncuklara sekiz kez 10 ekleyerek başlayın. Toplam hacmi dört mililitreye çıkarmak için %1 BSA ile bir x PBS ekleyin.

Daha sonra çözeltiyi, her biri bir mililitrelik dört adet 1.5 mililitrelik tüpe ayırın ve reaksiyonları beş saat boyunca hafifçe döndürerek dört santigrat derecede inkübe edin. Boncuk bağlı sferoplastları PCR için hazırlamak için, kaydırma reaksiyon tüplerini üç dakika boyunca mıknatısın üzerine yerleştirin. Süpernatanı çıkarın ve boncukları daha önce olduğu gibi dört kez% 1 BSA ile bir x PBS ile yıkayın.

Daha sonra boncukları yeniden süspanse etmek için tüp başına 25 mikrolitre ddH20 kullanın. Metin protokolünde açıklandığı gibi, boncuk bağlı scFv'ler için genleri amplifiye etmek için tam plazmit PCR gerçekleştirin ve ardından plazmiti PCR ürününden rekrikülerize edin. Tüm reaksiyonu metin protokolüne göre MC4100 eşitlenmiş hücrelere dönüştürün.

ELISA kullanarak klonları tanımlamak için, kaydırılmış alt kitaplığın bir tüpünü ve plakayı LB agar plakaları üzerinde çözün. Yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir kültür plakasının her bir oyuğuna mililitre başına 20 mikrogram kloramfenikol ile 200 mikrolitre LB ekleyin. Bir pipet ucu ile agar plakasından tek bir koloni seçin.

Daha sonra ucu 96 oyuklu plakanın ilk kuyusuna yerleştirin ve aşılamak için hafifçe karıştırın. Her kuyucuğa bir kolon aşılamaya devam edin. Bir mikroplaka çalkalayıcı üzerinde 20 ila 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Metin protokolüne göre bir hedef antijen kaplama çözeltisi hazırladıktan sonra, 96 kuyulu yüksek bağlayıcı şeffaf polistiren ELISA plakasının her bir oyuğuna 50 mikrolitre çözelti ekleyin. Plakaları gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, 96 kuyulu kültür plakasından kolonileri metin protokolüne göre agar plakalarına çoğaltın.

Daha sonra, kaplama solüsyonunu ELISA plakalarından boşaltın ve metin protokolüne göre hazırlanmış 100 mikrolitre blokaj solüsyonunu her bir oyuğa ekleyin. Oda sıcaklığında en az iki saat veya gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Yuvarlak tabanlı kültür plakasının her bir oyuğuna 20 mikrolitre konsantre hücre lizis deterjanı ekleyin ve kültür plakasını oda sıcaklığında bir mikroplaka çalkalayıcı üzerinde 15 ila 20 dakika inkübe edin.

Blokaj solüsyonunu ELISA plakalarından boşaltın ve metin protokolüne göre hazırlanmış 200 mikrolitre yıkama tamponu ile kuyuları dört kez yıkayın. Son yıkamayı çıkardıktan sonra, hücre lizis plakasının her bir oyuğundan 50 mikrolitreyi ELISA plakasının ilgili kuyucuğuna aktarın. Plakaları oda sıcaklığında bir ila iki saat inkübe edin.

Numuneleri ELISA plakasından boşaltmaya devam edin ve kuyucukları dört kez yıkayın. Daha sonra, metin protokolüne göre scFv'leri tespit etmek için antikor solüsyonunu hazırlayın. Her oyuğa 50 mikrolitre antikor ekleyin ve oda sıcaklığında bir ila iki saat inkübe edin.

Üreticinin protokolüne göre hazırlanan HRP substratının kuyusu başına 200 mikrolitre eklemeden önce ELISA plakalarını yıkama tamponu ile dört kez yıkayın. Plakaları karanlıkta oda sıcaklığında 30 ila 60 dakika inkübe edin. Reaksiyonu söndürmek için, her bir oyuğa 50 mikrolitre üç molar H2SO4 ekleyin ve çözeltiyi karıştırmak için hafifçe pipetleyin.

Son olarak, 492 nanometrede bir plaka okuması kullanarak absorbansı ölçün. Bu deneyde, scFv antikorları scFv13 ve scFv13. R4, ya doğal ssTorA dizisine ya da Tat yolu olarak da adlandırılan ikiz arginin translokasyon yolu tarafından tanınmayan modifiye edilmiş bir ssTorA'ya kaynaştırıldı.

R4 iyi katlanır ve doğal ssTorA'ya infüze edildiğinde iç zarda eksprese edilir. ScFv13 iyi katlanmaz ve hangi Tat sinyal peptidine kaynaştığına bakılmaksızın iç zarda görüntülenmez. Bu sonuçlar, yalnızca Tat sinyal peptidini içeren ve sitoplazmada doğru şekilde katlanmış proteinlerin iç zarda görüntülendiğini ve Tat yolunun hücre içi katlanma için bir ekran olarak işlev görmesine izin verdiğini göstermektedir.

Bu deneyde, beta-galaktosidaz için düşük bir bağlanma afinitesine sahip olan scFv13'e dayalı hataya açık bir PCR kütüphanesi, beta-gal'e karşı kaydırıldı. ScFv 1-4 izole edildi ve scFv13'ten daha yüksek bir beta-gal bağlanma afinitesi ve daha yüksek bir sitoplazmik çözünürlük seviyesi sergiledi. İkinci nesil scFv 1-4 kütüphanesine karşı bir rakip olarak scFv 1-4 kullanılarak, scFv 2-1 ve 2-3 izole edildi ve beta-gal için scFv13 1-4'ten daha yüksek bağlanma afiniteleri gösterdi, bu da aynı anda çözünürlük ve antijen bağlanma mühendisliğini vurguladı.

Bu prosedürü takiben, antijen özgüllüğünü doğrulamak ve izole klonların bağlanma afinitesini belirlemek için saflaştırılmış lizat kullanan ELISA'lar gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, antijen bağlayıcılarını zenginleştirmek ve izole etmek için bu kitaplığı ve manyetik boncuk kaydırmayı görüntülemek için Tat yolunu kullanarak ilgilenilen bir antijene bağlanmak üzere bir antikorun nasıl taranacağını anlamalısınız. Sülfürik asitle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve uygun bir kişisel koruyucu ekipman giymenin gerekli olduğunu unutmayın.