Etkin Sporlanma Saccharomyces cerevisiae 96 çukurlu Formatında

Bu protokolün genel amacı, tomurcuklanan mayayı 96 oyuklu bir formatta verimli bir şekilde sporlamaktır. Tomurcuklanan maya üzerinde birçok büyük ölçekli tarama yapılmış olmasına rağmen, mayoz ve sporülasyona bakan yüksek verimli çalışmalar sınırlı kalmıştır. Bu videoda açıklanan teknik, yüksek verimli tarama ile uyumlu 96 oyuklu bir formatta mayayı uygun maliyetli bir şekilde verimli bir şekilde sporlama avantajına sahiptir.

Bu yöntem için ilk olarak fikrim vardı çünkü refraktil sporlar oluşturamayan bir mutantın yüksek kopya baskılayıcılarını taramak için kiremitli iki mikronlu bir plazmit kütüphanesi kullanmak istedim. Başlangıçta, sporülasyon verimlerim 96 kuyulu formatta zayıftı. Bunun yetersiz havalandırmadan kaynaklandığını öğrendim.

SK1 maya suşunu bir maya özütü, pepton, gliserol veya YPG plakası üzerine çözerek bu işleme başlayın. Gliserol stoğunu içeren dondurucu şişesinden az miktarda hücreyi kazımak için steril bir çubuk kullanın ve bir YPG plakasına yayın. Mayayı 30 santigrat derecede 12 ila 16 saat büyütün.

Daha sonra, mayayı YPG plakasından tek kolonlar için bir maya özü pepton dekstrozu veya YPD plakasına çizin. Mayayı YPD plakasında 30 santigrat derecede 24 ila 48 saat büyütün. YPD katı ortamında 24 ila 48 saatlik büyümeden sonra, YPD plakasından tek bir koloni kullanarak 25 mililitrelik bir YPD kültürüne başlayın.

Bu kültürü, hücreler 4.0 ila 7.0 arasında bir OD600'e ulaşana kadar 220 RPM'de 30 derece sallayan bir inkübatörde gece boyunca büyütün. Ertesi gün, maya özütü pepton asetat veya YPA'da 0.1 OD600 ile 125 mililitrelik bir kültür başlatmak için YPD kültüründen uygun miktarda hücre kullanın. OD600 1,3 ile 1,5 arasında olana kadar kültürü 30 derece Santigrat derece çalkalama inkübatörde 220 RPM'de büyütün.

Kültürü santrifüj tüplerine aktarın ve hücreleri peletlemek için bir masa üstü santrifüjde beş dakika boyunca 1800X G'de döndürün. Hücreleri bir kez 0.5 hacim steril otoklavlanmış deiyonize su ile yıkayın. Tekrar döndürün ve suyu atın.

Hücreleri 1X hacimde bir sporülasyon ortamında yeniden süspanse edin. Farklı genotiplere sahip hücreleri hazırlamak için, 96 çok kuyulu bir plakada çözülmüş donmuş stoklardan alınan hücreler önce YPG katı ortamına aktarılır. 96 uçlu bir kurbağayı alevlendirin ve ardından maya kolonilerine değdirmeden önce bir katı ortam tabağı üzerinde anlık olarak soğutun.

Mayayı gece boyunca 30 santigrat derecede büyütün. Ertesi gün, suşun genotipine bağlı olarak, hücreleri YPG katı ortamından YPD'ye veya seçici katı ortama aktarın. Bu gösteride YPD kullanılıyor.

Her suş için koloniler oluşana kadar mayayı 30 santigrat derecede büyütün. 96 derin kuyu plakasının her bir oyuğuna 1,2 mililitre YPD sıvı ortamı ekleyin. Hücreleri katı ortamdan sıvı ortama aktarın.

Plakayı dikdörtgen bir petri plakasından plastik bir kapakla kapatın ve hava sirkülasyonunu en aza indirmek için bir parça bant kullanarak kapağı yerinde tutun. Hücreleri gece boyunca 220 RPM'de 30 santigrat derece çalkalayıcıda büyütün. Ertesi gün, beş dakika boyunca 1800X G'de santrifüjleyin.

Ortamı dökün ve her kuyucuğa 500 mikrolitre YPA ekleyin. Ve peletlenmiş hücreleri yeniden askıya alın. Plakayı bantla yerinde tutulan plastik bir kapakla örtün.

Hücreleri 220 RPM'de 30 derece santigrat derece çalkalama inkübatörde 15 saat büyütün. Verimli sporülasyon için uygun havalandırmayı sağlamak için, 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna üç milimetre steril katı cam boncuk veya steril beş milimetre x iki milimetre manyetik karıştırma çubuğu ekleyin. Tüm hücreler aynı genotipe sahipse, 96 çok kuyulu plakanın her bir oyuğuna 500 mikrolitre hücre artı ortamı aliquat edin.

Plakayı bantla yerinde tutulan plastik bir kapakla örtün. Hücreler farklı genotiplere sahipse, YPA'daki hücreleri 1800X G'de beş dakika döndürün ve ortamı boşaltın. Her oyuğa 500 mikrolitre sporülasyon ortamı ekleyin.

Ve peletlenmiş hücreleri sporülasyon ortamında yeniden süspanse edin. Plakayı bantla yerinde tutulan plastik bir kapakla örtün. Cam boncuklar kullanıyorsanız, numuneleri 30 santigrat derecede çalkalanan bir inkübatöre yerleştirin ve sporülasyon için 220 RPM'de çalkalayın.

Manyetik karıştırma çubukları kullanıyorsanız, numuneleri sporülasyon için 30 santigrat derecelik bir inkübatörün içindeki bir karıştırma plakasına yerleştirin. Manyetik çubuklar için tam karıştırma hızı, tüm çubuklar enerjik bir şekilde hareket ettiği ve kültür havalandırıldığı sürece çok önemli değildir. 36 saat sonra, sporülasyon yoluyla ilerlemeyi izlemek için numuneleri alın.

Her sporlama kültüründen altı mikrolitre hücre çekin ve 96 oyuklu bir lamel plakasında 24 mikrolitre sporasyon ortamına ekleyin. Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak incelemeden önce hücreleri beş dakika dinlenmeye bırakın. Ters çevrilmiş bir mikroskopta 63X objektif kullanılarak görselleştirilen hücrelerin bu görüntülerinde iki farklı suşun temsili bir sporülasyonu gösterilmektedir.

Ok uçları ile gösterilen refraktil tetradlar, vahşi tip kültürde görülebilir. Ancak sporülasyon eksikliği olan smk1 silme hücrelerini içeren kültürde değil. Çok kuyucuklu plakalarda sporlanmış hücrelerden elde edilen sporülasyon verimlilikleri ile şişelerde daha büyük hacimler kullanılarak sporlanmış hücreler arasında karşılaştırmalar yapıldı.

Çok kuyulu plakaların kullanımı, şişelerde daha tipik sporlama protokolü kullanılırken rutin olarak görülen yüksek verimliliği elde etmedi. Uygun havalandırma ile çok kuyulu plakalarda sporlama, beş milimetrelik bir karıştırma çubuğu kullanılarak elde edilen en iyi sonuçlarla% 50'den daha yüksek yeterli sporülasyon verimliliği sağlayabilir. Bununla birlikte, küçük karıştırma çubuklarının yüksek maliyeti göz önüne alındığında, cam boncuklar kullanılarak elde edilen verimler karşılaştırılabilir.

Hem beş milimetre hem de yedi milimetre karıştırma çubukları 96 çok kuyulu bir plakanın kuyusuna sığmasına rağmen, yedi milimetrelik bir karıştırma çubuğunun kullanılması düşük sporülasyon verimliliğine neden oldu. Bir kuyucuktaki yedi milimetrelik karıştırma çubuğu, bitişik bir kuyucuktaki bir karıştırma çubuğu ile etkileşime girme eğilimindedir. Çubukların düzgün bir şekilde karışmasını önlemek ve kültüre yeterli havalandırma sağlamak.

Bu videoyu izledikten sonra, maya hücrelerinin 96 oyuklu formatta sıvı kültürde nasıl verimli bir şekilde sporlandırılacağını iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, uygun şekilde yapılırsa bu işlem altı gün içinde tamamlanabilir. Bu prosedür, mayoz bölünme ve sporülasyon üzerindeki etkileri açısından farklı mutant suşları, plazmitleri veya küçük molekül inhibitörlerini taramak için kullanılabilir.

Geliştirildikten sonra, bu teknik, mayotik hücre döngüsünün düzenlenmesini ve Saccharomyces cerevisiae'de sporülasyonda sitokinez ve mayozun nasıl bağlandığını incelemek için kullanıldı.