Bir Lüminesans Saat Reporter ile Arabidopsis Protoplasts transfekte içinde Sirkadiyen fenotipleri Hızlı Analizi
17 Eylül 2016
sirkadiyen saat Arabidopsis transcriptome yaklaşık üçte düzenler, ancak timekeeping içine geri besleme genlerin yüzdesi bilinmemektedir. Burada hızla geçici protoplastlar ifade bir sirkadiyen muhabiri Işıklı görüntüleme kullanarak Arabidopsis herhangi mutant doğrultusunda sirkadiyen fenotipleri değerlendirmek için bir yöntem görselleştirmek.
Bu testin genel amacı, transfekte edilmiş protoplastlardan yayılan lüminesansı ölçerek Arabidopsis hatlarında Sirkadiyen dönemi belirlemektir. Bu yöntem, Sirkadiyen biyoloji alanında, hangi genlerin zaman işleyiş mekanizmasının kendisine geri beslendiği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kararlı transgenik hatlar oluşturmaya gerek kalmadan herhangi bir Arabidopsis mutantının Sirkadiyen döneminin hızlı bir şekilde analizine izin
vermesidir.Bu işleme başlamak için, bir petri kabını etiketleyin ve üzerine 10 mililitre filtrelenmiş sterilize edilmiş enzim çözeltisi ekleyin. Dört şerit otoklav bandını yapışkan tarafı yukarı bakacak şekilde temiz bir laboratuvar yüzeyine sabitleyin ve petri kabının boyutunu şeritlerin üzerinde işaretleyin. Büyüme odasından planlar toplayın.
Dört haftalık bitkilerin yapraklarını kesin ve üst epidermisi otoklav bandına bastırın, böylece alt epidermal yüzey yukarı bakacak şekilde bastırın. Alt epidermal yüzeye sihirli yapışkan bant şeritleri koyun. 15 mililitrelik konik bir tüp kullanarak, yaprak dokusunu ezmemeye dikkat ederek şeritleri yaprakların üzerine hafifçe bastırın.
Alt epidermisi sıyırmak ve mezofil hücrelerini açığa çıkarmak için bandı dikkatlice çekin. Daha sonra, otoklav bandını petri kabına uyacak şekilde kesin ve bandı petri kabına taşımak için cımbız kullanın ve yapraklar aşağı bakacak şekilde enzim çözeltisi üzerinde yüzdürün. Bir platform çalkalayıcı üzerinde 60 dakika boyunca 60 RPM'de döndürün, bu sırada protoplastlar çözeltiye salınacaktır.
60 dakika sonra, otoklav bandı şeritlerini çıkarmak ve atmak için cımbız kullanın. Geniş delikli bir pipet ucu kullanarak, protoplastları içeren çözeltiyi 15 mililitrelik konik bir tüpe pipetleyin. Protoplastları 100 gee'de dört santigrat derecede üç dakika santrifüjleyin ve pelet çok gevşek olduğu için süpernatanı dikkatlice çıkarın.
Protoplastlara 10 mililitre W5 çözeltisi ekleyin ve tüpü hafifçe döndürerek yeniden süspanse edin. Saymak için bir protoplast alikotunu çıkarın. Protoplastları 30 ila 60 dakika buz üzerinde dinlendirin.
Protoplastlar buz üzerindeyken, bir hemositometredeki protoplastları sayarak verimi değerlendirin. Protoplastları, dört santigrat derecede üç dakika boyunca 100 gee'de santrifüjleme ile toplayın. Pelet çok gevşek olduğu için süpernatanı dikkatli bir şekilde çıkarın.
Son olarak, protoplastları MMg çözeltisi içinde mililitre başına 500.000 protoplast konsantrasyonuna yeniden süspanse edin. 15 mililitrelik konik bir tüpe on mikrolitre raportör plazmid ekleyerek protoplast transfeksiyon prosedürüne başlayın, ardından 400 mikrolitre protoplast uygulayın. Bir hacim polietilen glikol veya PEG çözeltisi ekleyin ve protoplastları kesmek için tüpü 12 kez hafifçe ters çevirerek karıştırın.
Oda sıcaklığında sekiz ila 15 dakika inkübe edin. Protoplastlar, verimli transfeksiyonu sağlamak için yeterince uzun süre inkübe edilmelidir, ancak canlılıklarını azaltacak kadar uzun olmamalıdır. Daha sonra, protoplast DNA PEG karışımını dört hacim W5 çözeltisi ile seyreltin ve altı kez hafifçe ters çevirerek karıştırın.
Kesilen protoplastları oda sıcaklığında iki dakika boyunca 100 gee'de santrifüjleme ile toplayın. Süpernatanı bir pipetle çıkarın, pelet çok gevşek olduğu için yine çok dikkatli olun. Protoplastları 1.250 mikrolitre görüntüleme solüsyonunda tekrar süspanse edin.
Protoplastlar oldukça kolay bir şekilde yeniden süspanse edilmelidir, bu da transfeksiyondan sonra sağlam olduklarını gösterir. Kuyucuk başına 200 mikrolitreyi 96 oyuklu bir plakanın altı kopya kuyusuna ayırın ve boş kuyuları W5 çözeltisi ile doldurun. Plakayı, ışıldayan görüntüleme için uygun yapışkan şeffaf bir kapakla kapatın.
Protoplastları görüntülemek için, 96 oyuklu plakayı bitki görüntülemeye uygun herhangi bir ışıldayan görüntüleme kurulumuna aktarın. Kuyular arasındaki yoğuşma ve basınç farklarını önlemek için aktarımdan 10 ila 15 dakika sonra plaka üzerindeki yapışkan kapağı değiştirin. Görüntülemeye başlayın.
Plakayı oda sıcaklığında beş gün boyunca her 45 dakikada bir okuyun. Daha sonra, Biyolojik Ritim Analizi Yazılım Sistemi gibi herhangi bir analiz yazılımı kullanarak lüminesans sonuçlarını analiz edin. Bu protokol ile izole edilen mezofil protoplastları bu görüntüde 200 kat büyütme ile gösterilmiştir.
Problastlar vahşi tip arabidopsistir ve cca1/lhy mutantı transfekte edildi ve beş gün boyunca bir plaka okuyucuda sabit ışıkta görüntülendi. Beklendiği gibi, bu mutantta saat kontrollü gen ekspresyonunun serbest çalışma süresi kısalır. Buna karşılık, ztl mutantının protoplastlarındaki Sirkadiyen salınımların periyodu uzar.
CCA1'i aşırı eksprese eden protoplastlarda, CCA1'in aşırı ekspresyonu aritmiye yol açtığı için raportör yapı ifadesinde herhangi bir salınım yoktu. Bu çubuk grafik, vahşi tip ve saat mutant protoplastlarındaki lüminesans izlerine dayalı Sirkadiyen dönem tahminlerini gösterir. Bu Sirkadiyen dönemler, zaman alıcı transgenik yaklaşımlar kullanılarak tüm bitkilerden üretilen yayınlanmış verilerle tutarlıdır.
Bu prosedürü denerken, sağlıklı bitkiler kullanmak ve protoplastları kırılgan oldukları için dikkatli bir şekilde kullanmak önemlidir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa üç ila dört saat içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, Arabidopsis protoplastlarının nasıl izole edileceğini, transfekte edileceğini ve görüntüleneceğini iyi anlamış olmalısınız.
Bu teknikler artık herhangi bir mutant hattına uygulanabilir veya hatta diğer bitki türlerinin görüntü protoplastlarına modifiye edilebilir.
Genel Bakış
Bu çalışma, protoplastların ışık yayılımı görüntülemesini kullanarak Arabidopsis'te sirkadiyen fenotiplerin değerlendirilmesi için bir yöntem sunmaktadır. Teknik, çeşitli mutant hatlarında sirkadiyen periyotların hızlı analizini, stabil transgenik hatlara ihtiyaç duymadan sağlar.
Çalışmanın Ana Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sirkadiyen biyoloji
- Bitki fizyolojisi
- Genetik analiz
Arka Plan
- Sirkadiyen saat, Arabidopsis transkriptomunun önemli bir kısmını etkiler.
- Zaman tutmaya katkıda bulunan genlerin anlaşılması, sirkadiyen biyoloji için kritik öneme sahiptir.
- Geleneksel yöntemler, oluşturulması zaman alan stabil transgenik hatlar gerektirir.
- Bu yeni yöntem, geçici olarak eksprese edilen sirkadiyen raporörleri kullanarak süreci hızlandırır.
Çalışmanın Amacı
- Arabidopsis hatlarında sirkadiyen periyodu belirlemek.
- Sirkadiyen zaman tutma mekanizmasına geri bildirim yapan genleri tanımlamak.
- Mutant hatlarda sirkadiyen ritimleri analiz etmek için hızlı ve verimli bir yöntem sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Arabidopsis yapraklarından mezofiller protoplastlarının izolasyonu.
- Protoplastların ışık yayılımlı bir sirkadiyen raporörü ile transfeksiyonu.
- Sirkadiyen ritimleri değerlendirmek için ışık yayılımının ölçümü.
- Luminozan verilerin özel yazılım kullanılarak analizi.
Ana Sonuçlar
- Çeşitli Arabidopsis mutantlarında sirkadiyen periyotları ölçme kabiliyetinin gösterilmesi.
- Cca1/lhy mutantının serbest koşu periyodunun kısalmış olduğunun doğrulanması.
- Ztl mutantının sirkadiyen salınım periyodunun uzamış olduğunun gösterilmesi.
- Yöntemin geleneksel transgenik yaklaşımlara karşı doğrulanması.
Sonuçlar
- Bu yöntem, Arabidopsis'te sirkadiyen ritimlerin hızlı değerlendirilmesini sağlar.
- Herhangi bir mutant hatta uygulanabilir, sirkadiyen biyolojideki araştırmaları geliştirebilir.
- Gelecek uygulamaları diğer bitki türlerine genişletilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Rapid phenotyping of circadian clock function in Arabidopsis protoplasts using luminescent reporters enables accelerated target validation and mechanistic de-risking in plant biology R&D. This approach streamlines the assessment of genetic perturbations on circadian regulation, supporting predictive confidence at early discovery inflection points. The method's flexibility allows broad portfolio screening without the bottleneck of generating stable transgenic lines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of gene function in circadian regulation through transient reporter assays.
- Facilitates rapid biological de-risking by distinguishing mutants with altered clock phenotypes.
- Supports predictive confidence in target selection by providing quantitative period measurements.
- Accelerates portfolio triage by allowing high-throughput mutant screening.
Screening & Assay Development
- Prepares validated protoplast-based systems for downstream functional genomics workflows.
- Delivers standardized, reproducible luminescent readouts for quantitative assay development.
- Enables scalable screening of diverse genetic backgrounds without stable transformation.
- Supports reliable evaluation of gene perturbations in a controlled environment.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by linking gene function to circadian outputs.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation in plant systems.
- Reduces risk in advancing candidates by confirming mechanistic impact on clock function.
- Offers predictive de-risking for traits relevant to agricultural productivity.
Pipeline & Workflow Integration
This luminescent protoplast assay fits at the interface of early discovery and lead identification, enabling rapid hypothesis testing and functional screening before resource-intensive transgenic work.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of gene function in circadian regulation.
- Screening: Provides reproducible, quantitative luminescence data for comparative analysis.
- Analytics: Generates time-series outputs suitable for statistical period estimation and phenotype classification.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical validation in plant models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse mutant and species backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible phenotyping workflows.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and improves capital efficiency in early R&D.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of genetic targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protoplast isolation, transfection, and luminescent imaging.
- Needs access to plate-based luminescence readers and compatible analysis software.
- Demands careful handling and standardization to ensure protoplast viability and data quality.
- Adaptable to other plant species with protocol optimization.
- Limited by the transient nature of reporter expression and protoplast stability.
