Budding Maya endositozun kantitatif, kinetik ve Yüksek verim Analizi pHluorin Uygulamaları

Bu prosedürün genel amacı, canlı hücrelerin endositik yolaklarındaki veziküler trafik olaylarını miktarlandırmaktır. Bu yöntem, protein ekspresyonundaki değişimlerin veya mutasyonların, trafik olaylarının hızlarını ve verimliliğini nasıl etkilediği gibi veziküler trafik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, floresan işaretli kargo proteinlerinin yoğunluğunu ölçerek, canlı hücrelerdeki endositik trafiğin doğrudan miktarlandırılmasına olanak tanımasıdır.

Metin protokolüne göre çözeltiler ve besiyerleri hazırlandıktan sonra, iki ila üç maya hücresi kolonisini, plazmit seçilimini sürdürmek için ek besin maddeleri içermeyen beş mililitre YNB besiyerine ekleyin. Kültürleri 30 °C'de, çalkalamalı olarak 16 ila 24 saat boyunca büyütün. Görüntülemeden yaklaşık üç saat önce, her bir gece boyu büyütülen kültürün OD 600 değerini ölçün.

Ardından, plazmit idamesi için ek besin maddeleri içermeyen YNB ortamında, 0,35 ila 0,4 OD 600 değerinde beş mililitrelik dilüsyonlar hazırlayın ve 30 °C'de çalkalayarak üç saat boyunca büyütün. İnkübasyon sırasında, mikroskobun çevresel odasını veya ısıtmalı tablasını 30 °C'ye önceden dengeleyin. Metin protokolüne uygun olarak görüntüleme için can işlem görmüş sekiz kuyucuklu cam kap ve oda slaydı hazırladıktan sonra, her kuyucuğa plazma seçimi için ek besin maddeleri içermeyen 200 µL YNB ortamı ekleyin.

Kültürler hazır olduğunda, bir mililitreyi bir mikrofüj tüpüne aktarın ve hücreleri 8,000 RPM'de iki dakika boyunca pelletleyin. Ardından süpernatantın 975 mikrolitresini uzaklaştırın. Hücre pelletini kalan süpernatant içinde yeniden süspanse edin.

Ardından, hücre süspansiyonundan 2,5 µL'yi sekiz kuyuklu plakanın her bir kuyusunun merkezine damlatın. Hücreleri dağıtmak için pipetle yukarı-aşağı hareketler yapın ve hücrelerin çökelmesi için beş ila 10 dakika bekleyin. Hazne lamını, 30 °C'ye dengelenmiş bir ters floresans mikroskobuna yerleştirin.

Ardından, hücrelerin bulunduğu alanı belirlemek için parlak alan aydınlatması kullanın. Kuyucuktaki 200 µL besiyerine, son metiyonin konsantrasyonu 20 µg/mL olacak şekilde, 100 µg/mL metiyonin içeren 50 µL önceden ısıtılmış YNB besiyeri ekleyin. Görüntüleme işlemine başlamadan önce hücrelerin iki dakika boyunca dengelenmesini bekleyin.

Ardından, görüntülemeden hemen önce mikroskobu istenen odak düzlemine ayarlayın. 45 ila 60 dakika boyunca 5 dakikalık aralıklarla parlak alan veya DIC görüntülerinde GFP görüntüleri alın. Bir zaman serisindeki tüm görüntüler için aynı görüntüleme parametrelerini kullanın.

Ek ayrıntılar için metin protokolüne bakınız. Her zaman noktasındaki tekil hücrelerin floresans yoğunluğunu belirleyiniz ve değerleri ilk görüntünün başlangıç yoğunluğunun yüzdesi olarak ifade ediniz. Görüntüleri ImageJ'deki metin protokolüne uygun olarak dışa aktardıktan sonra, Dosya menüsündeki Aç seçeneğini kullanarak dosyaları açınız.

Nicelleştirme için floresan görüntüyü, hücrelerin konumunu belirlemek için ise referans olarak parlak alan veya DIC görüntüsünü kullanın. DIC ile bakıldığında canlı hücrelerden daha koyu görünen ve GFP kanalında otofloresans veren ölü hücreleri hariç tutun. Arka planı düzensiz olan görüntüler için Process menüsünden arka plan çıkarma (background subtraction) algoritmasını seçin ve varsayılan ayarı belirleyin.

Görüntüler elde edildikten sonra, nicelleştirme işlemine geçmeden önce arka plan çıkarma işleminin yapılması önemlidir. Arka plan sinyalinin, örnekler arasındaki farkları maskeleyebilmesi veya azaltabilmesi nedeniyle bu adım özellikle kritik bir öneme sahiptir. Serbest seçim aracını kullanarak, hücrenin tamamını kapsadığınızdan ancak hücre dışındaki alanı mümkün olduğunca az dahil ettiğinizden emin olarak bir hücrenin etrafını çizin.

Ardından Analyze menüsü altında, alanı, entegre yoğunluğu ve ortalama gri değeri ölçmek için set measurements fonksiyonunu kullanın. Analyze ve ardından Tools'a tıklayarak ROI Manager'ı açın. ROI Manager penceresinde, vurgulanan bölgeyi yeni bir ROI olarak eklemek için Add düğmesine tıklayın.

Ölü hücreler veya görüntünün kenarına temas eden hücreler hariç tutularak, görüntüdeki kalan hücreler için ana hatların belirlenmesi ve ölçüm alma işlemi tekrarlanır. Ölçülen değerleri yeni bir pencerede görüntüleyecek olan ölçüm butonuna tıklayarak seçilen ROI'leri zip dosyası olarak kaydedin. Ardından daha fazla butonuna tıklayın ve tüm ölçümleri bir hesap tablosuna veya istatistiksel analiz yazılımına aktarın.

Plazmit seleksiyonunu sürdürmek için ek besin maddeleri içermeyen 0,5 mililitre YNB besiyerine iki ila üç maya hücresi kolonisi ekleyin. Hücreleri bir döner tambur üzerinde 30 °C'de 16 ila 24 saat boyunca büyütün. Plazmit koruması için ek besin maddeleri içermeyen bir mililitre YNB besiyeri ekleyin ve üç saat daha büyütün.

Ardından, her birine bir mililitre hücre transfer ederek iki adet beş mililitrelik yuvarlak tabanlı tüp hazırlayın. Daha sonra ilk tüpe 0,25 mililitre YNB Met medyumunu, ikinci tüpe ise final konsantrasyonu 20 mikrogram per mililitre olacak şekilde, mililitre başına 100 mikrogram metiyonin içeren 0,25 mililitre YNB medyumunu ekleyin. Çok sayıda örnek için, analiz sürelerini ayarlamak amacıyla metiyonin ekleme işlemini kademeli olarak gerçekleştirin.

Akış sitometremiz, çalışma başına 40 örneğe kadar ölçüm yapabilmektedir. Metiyonini gruplar halinde ekliyoruz. Her beş dakikada bir sekiz örnek.

Bu işlem, tüm örneklerin metiyonin eklemesinden sonra 45 ila 50 dakika arasında ölçülmesini sağlar. Hücreleri 45 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, hücre boyutunun bir ölçüsü olarak ileri saçılım veya FS'yi seçerek ve kargo internalizasyonunun bir ölçüsü olarak FITC filtresinden gelen bir akış floresan yoğunluğunu eşleştirerek hücreleri akış sitometrisi ile analiz edin.

45 dakikalık inkübasyon sırasında, kullanılan maya hücrelerinin boyut aralığı ve floresan yoğunluğu için deteksiyonu optimize etmek amacıyla FS ve FITC kanallarının voltajını ayarlamak için sürgü düğmelerini kullanın. Her koşuldan 10.000 hücre için FS ve floresan yoğunluğunu ölçün. Yüksek akış hızı ayarını kullanarak, grafik ekle düğmesine tıklayarak FS'ye karşı floresan yoğunluğunun bir dağılım grafiğini oluşturun.

Ardından x-ekseni için FITC ve y-ekseni için FS seçin ve 1000 noktayı grafiğe dökün. Kapılama (gate) işlevini ve vahşi tip Met koşulunu kullanarak, en parlak hücrelerin yaklaşık %5'i kapının sağında kalacak şekilde dikey bir kapı atayın. Deneydeki diğer tüm koşullar için bu kapılamayı kullanın.

Burada gösterildiği üzere, GFP veya florür etiketli Mup1 internalizasyonunu ve floresan değişimlerini izlemek için metiyonin yokluğunda veya varlığında beş dakikalık aralıklarla hücrelerin zaman aşımı görüntülemesi yapılmıştır. Beklendiği üzere, metiyonin yokluğunda GFP ve florür etiketli Mup1 plazma membranında kalmıştır. Buna karşılık, metiyonin varlığında görüntülenen hücreler, kargo internalizasyonu ile uyumlu olarak hücre yüzeyindeki floresan sinyalinin kademeli olarak azaldığını göstermiştir.

Buna karşın, metiyonin varlığındaki floresans kaybının kinetiği, pHlourin Mup1 hücrelerine kıyasla Mup1 GFP hücrelerinde gecikmeli gerçekleşmiştir. Bu dağılım grafikleri, dikey bir kapı uygulandıktan sonra, yabani tip veya dört delta ENTH1 hücrelerinin metiyonin varlığındaki veya yokluğundaki floresans yoğunluğunu karşılaştırmaktadır. Yabani tip Met hücrelerinin %4'ü, popülasyondaki en parlak hücrelere karşılık gelen kapının sağ tarafında yer alırken, işlem görmemiş yabani tip hücrelerin %65'i kapı içerisinde yer almıştır.

Buna karşılık, dört delta ENTH1 hücresinde parlak ve sönük hücrelerin dağılımında herhangi bir fark görülmemiştir; bu durum endositoz kusuru ile tutarlıdır. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, işlem düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse üç ila dört saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, tüm örnekler için uç nokta verilerinin aynı işlem süresinden sonra toplanabilmesi amacıyla, eş zamanlı yürütülen deneylerin başlangıç sürelerini kademeli olarak ayarlamanız gerektiğini unutmamak önemlidir.

Bu prosedürün ardından, veziküler taşınmaya hangi yeni faktörlerin katkıda bulunduğu gibi ek soruları yanıtlamak için floral genetik taramalar gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirildikten sonra bu teknik, veziküler taşınma alanındaki araştırmacıların, tomurcuklanan mayada endozom kaybı yönlerinin yanı sıra yeni keşfedilen klatrin bağımsız ve asidik bir yolu keşfetmelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, canlı hücrelerde endositik olayları nicelleştirmek için florent tipi kargoların nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.