Budding Maya endositozun kantitatif, kinetik ve Yüksek verim Analizi pHluorin Uygulamaları

Bu prosedürün genel amacı, canlı hücrelerin endositik yolundaki veziküler kaçakçılık olaylarını ölçmektir. Bu yöntem, protein ekspresyonundaki mutasyon veya değişikliklerin insan ticareti olaylarının oranlarını ve verimliliğini nasıl etkilediği gibi veziküler kaçakçılık alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, floresan etiketli kargo proteinlerinin yoğunluğunu ölçerek endositik kaçakçılık ve canlı hücrelerin doğrudan ölçülmesine izin vermesidir.

Metin protokolüne göre çözeltiler ve ortamlar hazırladıktan sonra, plazmit seçimini sürdürmek için ek besinlerden yoksun olan beş mililitre YNB ortamında iki ila üç maya hücresi kolonisini aşılayın. Kültürleri 16 ila 24 saat çalkalayarak 30 santigrat derecede büyütün. Görüntülemeden yaklaşık üç saat önce, her gece boyunca kültürün OD 600'ünü ölçün.

Daha sonra, plazmid bakımı için ek besin maddelerinden yoksun olan YNB ortamında 0.35 ila 0.4 arasında bir OD 600'de beş mililitre seyreltme hazırlayın ve üç saat çalkalayarak 30 santigrat derecede büyütün. İnkübasyon sırasında, mikroskopların çevre odasını veya ısıtılmış aşamayı 30 santigrat dereceye kadar önceden dengeleyin. Metin protokolüne göre görüntüleme için sekiz kuyulu bir kutu ile muamele edilmiş cam kap ve hazne lamı hazırladıktan sonra, her bir oyuğa plazma seçimi için ek besin içermeyen 200 mikrolitre YNB ortamı ekleyin.

Kültürler hazır olduğunda, bir mililitreyi bir mikro buzdolabı tüpüne aktarın ve hücreleri iki dakika boyunca 8.000 RPM'de peletleyin. Ardından süpernatanın 975 mikrolitresini çıkarın. Kalan süpernatantta hücre peletini yeniden süspanse edin.

Daha sonra, sekiz oyuklu plakanın her bir oyuğunun ortasına 2,5 mikrolitre hücre süspansiyonu bırakın. Hücreleri dağıtmak için yukarı ve aşağı pipetleyin ve hücrelerin beş ila 10 dakika oturmasına izin verin. Hazne sürgüsünü 30 santigrat dereceye dengelenmiş, ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu üzerine yerleştirin.

Ardından, bir hücre alanını bulmak için parlak alan aydınlatması kullanın. Mililitre başına 20 mikrogramlık bir nihai metiyonin konsantrasyonu elde etmek için kuyudaki 200 mikrolitre ortama mililitre metiyonin başına 100 mikrogram içeren 50 mikrolitre önceden ısıtılmış YNB ortamı ekleyin. Görüntülemeye başlamadan önce hücrelerin iki dakika dengelenmesine izin verin.

Daha sonra görüntülemeden hemen önce mikroskobu istenen odak düzlemine ayarlayın. 45 ila 60 dakika boyunca 5 dakikalık aralıklarla parlak alan veya DIC görüntülerinde GFP elde edin. Bir zaman serisindeki tüm görüntüler için aynı edinme parametrelerini kullanma.

Daha fazla ayrıntı için metin protokolüne bakın. Her bir zaman noktasındaki tek tek hücrelerin floresan yoğunluğunu ölçün ve değerleri ilk görüntünün başlangıç yoğunluğunun yüzdesi olarak ifade edin. Görüntüleri resim j'deki metin protokolüne göre dışa aktardıktan sonra, Aç seçeneğini kullanarak dosya menüsündeki dosyaları açın.

Niceleme için floresan görüntüsünü ve hücrelerin konumunu belirlemek için referans olarak parlak alanı veya DIC görüntüsünü kullanın. DIC tarafından görüntülendiğinde canlı hücrelerden daha koyu görünen mevcut ölü hücreleri hariç tutun ve GFP kanalı altında otofloresan hale getirin. İşlem menüsünde düzensiz bir arka plana sahip görüntüler için arka plan çıkarma algoritmasını seçin ve varsayılan ayarı seçin.

Görüntüler elde edildikten sonra, niceleme prosedürüne devam etmeden önce arka plan çıkarma işlemini gerçekleştirmek önemlidir. Bu adım özellikle önemlidir, çünkü aksi takdirde arka plan sinyali numuneler arasındaki farkları maskeleyebilir veya azaltabilir. Serbest seçim aracını kullanarak, tüm hücreyi dahil ettiğinizden emin olarak, ancak hücrenin dışında mümkün olduğunca az alan içerdiğinden emin olarak bir hücrenin ana hatlarını çizin.

Ardından Analiz menüsü altında, alanı, entegre yoğunluğu ve ortalama gri değeri ölçmek için ayarlanan ölçümler işlevini kullanın. Analiz Et'e ve ardından Araçlar'a tıklayarak ROI Yöneticisi'ni açın. ROI Manager penceresinde, vurgulanan bölgeyi yeni bir ROI olarak girmek için Ekle düğmesine tıklayın.

Görüntüdeki diğer hücreler için, ölü hücreleri veya görüntünün kenarına dokunan hücreleri hariç tutarak, anahat oluşturma ve ölçüm işlemini tekrarlayın. Ölçülen değerleri yeni bir pencerede görüntüleyecek olan ölçüm düğmesine tıklayarak seçilen ROI'leri zip dosyası olarak kaydedin. Ardından daha fazla düğmesini tıklayın ve tüm ölçümleri bir elektronik tabloya veya istatistiksel analiz yazılımına aktarın.

Plazmit seçimini sürdürmek için ek besinlerden yoksun olan iki ila üç koloni maya hücresi ve 0.5 mililitre YNB ortamı aşılayın. Hücreleri 16 ila 24 saat boyunca 30 santigrat derecede bir silindir tamburunda büyütün. Plazmid bakımı için ek besin içermeyen bir mililitre YNB ortamı ekleyin ve üç saat daha büyütün.

Daha sonra, iki adet beş mililitrelik yuvarlak tabanlı tüpün her birine bir mililitre hücre aktarın. Daha sonra, mililitre başına 20 mikrogramlık bir nihai konsantrasyon için ilk tüpe 0.25 mililitre YNB Met ortamı ve mililitre başına 100 mikrogram metiyonin içeren 0.25 mililitre YNB ortamı ekleyin. Çok sayıda numune için, gerçeklerin analizine zaman ayırmak için metiyonin ilavesini kademelendirin.

Akış sitometremiz çalışma başına 40 örneğe kadar ölçüm yapabilir. Gruplar halinde metiyonin ekliyoruz. Her beş dakikada bir sekiz örnek.

Bu, tüm numunelerin metiyonin ilavesinden 45 ila 50 dakika sonra ölçülmesini sağlar. Hücreleri 45 dakika inkübe edin. Daha sonra hücreleri akış sitometrisi ile analiz edin, hücre boyutunun bir ölçüsü olarak ileri saçılma veya FS'yi seçin ve kargo içselleştirmesinin bir ölçüsü olarak bir FITC filtresinden akan bir floresan yoğunluğunu eşleyin.

45 dakikalık inkübasyon sırasında, kullanılan maya hücrelerinin boyut aralığı ve floresan yoğunluğu için algılamayı optimize etmek üzere FS ve FITC kanallarının voltajını ayarlamak için kaydırma düğmelerini kullanın. Her koşuldan 10.000 hücre için FS ve floresan yoğunluğunu ölçün. Yüksek akış hızı ayarını kullanarak, grafik ekle'ye tıklayarak floresan yoğunluğuna karşı FS'nin bir dağılım grafiğini oluşturun.

Ardından x ekseni için FITC'yi ve y ekseni için FS'yi seçin ve 1000 noktanın grafiğini çizin. Kapı işlevini ve vahşi tip Met koşulunu kullanarak, en parlak hücrelerin yaklaşık %5'i kapının sağına düşecek şekilde dikey bir kapı atayın. Deneydeki diğer tüm koşullar için bu geçiti kullanın.

Burada gösterildiği gibi, hücrelerin hızlandırılmış görüntülemesi, GFP veya flor etiketli Mup1 içselleştirmesini ve floresanstaki değişiklikleri izlemek için metiyonin yokluğunda veya varlığında beş dakikalık aralıklarla gerçekleştirildi. Beklendiği gibi, GFP ve flor etiketli Mup1, metiyonin yokluğunda plazma zarında kaldı. Buna karşılık, metiyonin varlığında görüntülenen hücreler, kargo içselleştirmesi ile tutarlı olarak hücre yüzeyinden floresan sinyalinin ilerleyici olarak tükendiğini gösterdi.

Bununla birlikte, metiyonin varlığında kaybedilen floresan kinetiği, pHlourin Mup1 hücrelerine kıyasla Mup1 GFP hücrelerinde gecikmiştir. Bu saçılma grafikleri, dikey bir geçit uygulandıktan sonra metiyonin varlığında veya yokluğunda vahşi tip veya dört delta ENTH1 hücresinin floresan yoğunluğunu karşılaştırır. Yabani tip Met hücrelerinin% 4'ü, popülasyondaki en parlak hücrelere karşılık gelen kapının sağ tarafında bulunurken, tedavi edilmemiş vahşi tip hücrelerin% 65'i kapıda bulunuyordu.

Buna karşılık, dört delta ENTH1 hücresi, endositozdaki bir kusurla tutarlı olarak, parlak ve loş hücrelerin dağılımında hiçbir fark göstermedi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa üç ila dört saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, son nokta verilerinin tüm numuneler için aynı tedavi süresinden sonra toplanabilmesi için, eşzamanlı deneyler yapmaktan başlangıç zamanlarını kademelendirmeyi unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, veziküler kaçakçılığa hangi yeni faktörlerin katkıda bulunduğu gibi ek soruları yanıtlamak için çiçek genetik taramaları gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, veziküler kaçakçılık alanındaki araştırmacıların, endozom yıpranmasının yanı sıra tomurcuklanan mayada yeni keşfedilen klatrinden bağımsız ve asidik bir yolun yönlerini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, canlı hücrelerdeki endositik olayları ölçmek için florent tipi kargoların nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.