Nükleik Asitlerin bir Polyaniline tabanlı sensör

Bu prosedürün genel amacı, nükleik asitleri etiketsiz bir şekilde tespit etmek için kullanılabilecek suda dağılmış polianilini sentezlemektir. Bu teknik, nükleik asitleri tespit etmek için uygun maliyetli bir yöntemdir. Bunu benimseyen laboratuvarlar onu kolay, sağlam ve hassas bulacaktır.

Tekniğin temel avantajı, etiketsiz olması ve enzimatik manipülasyona ihtiyaç duymadan RNA'ları ve DNA'ları doğrudan tespit etmek için kullanılabilmesidir. Bu teknik, yeni teşhis teknolojileri için potansiyele sahiptir ve bir etiket kullanmadığından, hasta örneklerini çok az manipülasyonla işlemek için kullanılabilir. Görsel gösteri, sensörün gizemini çözmeye yardımcı olacaktır.

Bu platform, çok egzotik görünen ancak aslında uygulanması olağanüstü derecede kolay olan polimer bilimi ve biyolojisini içerir. Anilini 250 ml'lik yuvarlak tabanlı bir şişede 60 ml kloroform içinde tamamen çözün. 600 RPM'de beş dakika karıştırdıktan sonra, buzla sıfır ila beş santigrat dereceye kadar soğutun.

Bu genellikle 15 ila 20 dakika sürer. Daha sonra, 600 RPM'de karıştırırken yuvarlak tabanlı bir şişede anilin çözeltisine sodyum dodesilbenzensülfonat ekleyin. Amonyum persülfatı 20 ml suda çözün ve reaksiyonun aşırı ısınmasını önlemek için 30 dakika boyunca damla damla ekleyin.

Reaksiyonu 24 saat boyunca sıfır ila beş santigrat derece arasında gerçekleştirin. Reaksiyon karışımının başlangıçta 15 dakika sonra süt beyazına, iki saat sonra koyu kahverengiye ve son olarak 24 saat sonra koyu yeşile döndüğünü gözlemleyin. Ardından 24 saat daha oda sıcaklığına ulaşmasına izin verin.

PANI sodyum dodesilbenzensülfonat çözeltisini bir buchner hunisi ile süzün. Süzüntüyü bir ayırma hunisinde 80 ml kloroform ve 120 ml su ile karıştırın. Çözeltiyi oda sıcaklığında 24 saat inkübe edin, ardından koyu yeşil PANI'yi ayırma hunisinden toplayın ve sulu süpernatantta reaksiyona girmemiş sodyum dodesilbenzensülfonat ve APS bırakın.

PANI çözeltisini 10 X kloroform su ile seyreltin, ardından 200 mikrolitre seyreltilmiş PANI'yi 6.4 mikromol prob DNA oligonükleotidi ile bir mikrofüj tüpünde 15 dakika hafifçe sallayarak karıştırın. PANI DNA çözeltisini bir çapraz bağlayıcıda iki dakika boyunca UV santimetre kare başına 1200 mikrojul ile ışınlayın. UV maruziyetinin belirtilen miktarla sınırlı olması çok önemlidir.

UV'ye uzun süre maruz kalmak, muhtemelen PANI ve DNA'nın kovalent çapraz sızması nedeniyle PANI'deki floresan değişimini tehlikeye atar. Altı dakika boyunca 17.000 x g'da santrifüjleme ile pelet kompleksleri ve fosfat tamponlu salin veya PBS ile yıkayın. İkinci kez peletledikten sonra, PBS'de yeniden askıya alın.

200 mikrolitre PANI prob kompleksine sekiz mikrolitre 100 mikromoler tamamlayıcı DNA oligonükleotidi veya hedef nükleik asit ekleyin. Çözelti karışımını 40 santigrat derecede 15 dakika sallayarak hibridizasyon gerçekleştirin. PANI komplekslerini altı dakika boyunca 17.000 x g'da santrifüjleme ile peletledikten sonra, PBS ile yıkayın ve su içinde tekrar süspanse edin.

Farklı işlemlerden PANI'yi 96 oyuklu bir mikroplakaya ekleyin ve 250 nanometrede uyarma ile 270 ila 850 nanometre aralığında emisyon floresansını ölçün. PANI için 500 nanometre civarında bir emisyon zirvesi gözlemlenmelidir. Hiberdize dubleksin floresan mikroskobu ölçümünü yapmak için, PANI'yi bir borosilikat cam örtü kızağı üzerine bırakın ve 48 saat boyunca 40 santigrat derecede kurutun.

Kurutulmuş bir PANI filmine sekiz mikrolitre 100 mikromoler probu ekleyin, ardından iki dakika boyunca UV ışığı ile ışınlayın. Radyasyonu takiben, PANI prob filmini PBS ile yıkayın ve 48 saat boyunca 40 santigrat derecede kurutun. Hedef nükleik asitleri ekleyerek 15 dakika boyunca hibridizasyon gerçekleştirin.

Bu biyolojik bir numune veya kontrollü bir hedef oligonükleotid olabilir. Bir PBS yıkama ile takip edin. 500 nanometre uzun geçiren filtre ile 40 x büyütmede floresan görüntüler elde edin.

Burada, UV ışınlaması ile geliştirilmiş PANI ve DNA problarının elektrostatik etkileşimi gösterilmektedir. Hedef nükleik asidin hibridizasyonu, dubleks oluşumu tetikler, yapısal doğrulamayı değiştirir, bu da prob hedefinin PANI yüzeyinden ayrılmasına neden olur. Bu şekil, hem çözelti hem de katı kaplama ortamında probun yokluğunda veya varlığında PANI floresansındaki değişikliği göstermektedir.

Floresanstaki artış, negatif yüklü DNA'dan gelen elektron akısına ve polimer elektron yoğunluğunun artmasına bağlıdır. Ücretsiz hedef oligonükleotidlerin hibridizasyonundan sonra, problar ayrılır ve fesleğen floresansının restorasyonuna yol açar. Tersine, tek uyumsuz hedef oligonükleotidlerle hibridizasyon, fesleğen floresansının bu restorasyonu ile sonuçlanmaz.

Bu tekniğin ana yeniliği, kesin bir etkileşim için hafif UV kullanması ve aslında spesifik olmayan ve ışık etkileşimini ayırt etmesine yardımcı olmasıdır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, kaplamaların duyu süresi ve kuruma süresi hariç olmak üzere iki saate kadar sürebilir. Bu prosedürü denerken, DNA'nın suda çözündüğünü ve asidik çayın aslında PANI'nin elektronik özelliğini değiştirdiğini hatırlamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, izleyiciler suda dağılmış polianilinin nasıl sentezleneceğini ve nükleik asitleri tespit etmek için floresan özelliklerini nasıl kullanacaklarını iyi anlamalıdır. Prob DNA'larını hareketsiz hale getirebilecek ve hedefleri tespit etmek için hibridizasyon gerçekleştirebilecekler. Monomer ile çalışırken, bu sentezin tehlikeli olduğunu ve koruyucu gözlük, eldiven ve laboratuvar önlüğü gibi koruyucu ekipmanlarla birlikte bir başlık içinde yapılması gerektiğini hatırlamak önemlidir.