İzolasyon ve murin lenfositlerin aktivasyonu

Lenfositler, adaptif immün yanıtlarda ana oyunculardır. Burada, in vitro ve in vivo lenfosit aktivasyonunda istenen moleküllerin fizyolojik fonksiyonlarını belirlemek için bir lenfosit saflaştırma protokolü sunuyoruz. Açıklanan deneysel prosedürler, kontrol ve genetik olarak değiştirilmiş lenfositler arasındaki fonksiyonel kapasiteleri karşılaştırmak için uygundur.

Bu deneyin genel amacı, çeşitli in vitro ad in-vivo fonksiyonel testler kullanarak saflaştırılmış murin lenfositlerinin fonksiyonel kapasitelerini incelemektir. Bu yöntem, İmmünoloji ve Moleküler Biyoloji alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Gen eksikliği olan lenfositlerde ilgilenilen bir proteinin işlevinin araştırılması gibi.

Bu tekniğin temel avantajı, lenfositleri minimum manipülasyon ve çevresel stres ile hızlı bir şekilde saflaştırma yeteneğidir. B hücrelerini saflaştırmak için, 300 mikrolitre dengeli tuz çözeltisi veya FBS ile desteklenmiş BSS içinde sekizinci kırmızı kan hücresi bitlenmiş tüm dalak hücrelerini on kere kadar yeniden süspanse edin. Ardından 50 mikrolitre anti-CD43 manyetik mikro boncuk ekleyin.

Ölü hücreleri çıkarmak için, dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 30 mikrolitre Annexin beş manyetik boncuk ekleyin. Hücrelerin eşit şekilde etiketlenmesini sağlamak için hücre süspansiyonunu 15 dakikalık aralıklarla hafifçe vurun. İnkübasyonun sonunda, FBS ile desteklenmiş 14 mililitre BSS ile B etiketli hücreler vardı.

Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı çıkarın, tüpü hafifçe vurun ve peleti FBS ile desteklenmiş bir ila üç mililitre oda sıcaklığında BSS'de yeniden askıya alın. Santrifüjleme sırasında, manyetik bir rafa bir ayırma sütunu yükleyin ve akış hızını azaltmak için sütunun ucuna steril bir 21 gauge iğne takın. Sütunu iki mililitre oda sıcaklığında BSS ile dengeleyin.

Peleti bir ila üç mililitre oda sıcaklığında BSS'de yeniden süspanse ettikten sonra, toplama tüpünü iğnenin altına yerleştirin ve ardından B etiketli hücreleri dengelenmiş kolona yükleyin. Akışı 15 mililitrelik konik bir tüpte toplayın. Ardından sütunu FBS ile takviye edilmiş bir mililitre taze BSS ile durulayın.

Yıkamanın toplanan hedef hücrelerle havuzlanması: Kolonu aluet içeren hedef hücre ile yeniden yükleyin ve akışı aynı 15 militer tüpte toplayın. Ve sütunu FBS ile takviye edilmiş bir mililitre BSS ile üç kez yıkayın ve yıkamaları bir hedef hücre süspansiyonu ile birleştirmeye devam edin. Üçüncü yıkamadan sonra, sütunu mıknatıstan çıkarın ve FBS ile desteklenmiş beş mililitre BSS ile doldurun.

Manyetik olarak etiketlenmiş hedef olmayan hücreleri yeni bir 15 mililitrelik tüpe akıtmak için sütun pistonunu kullanın. Ardından, ayrılan hücrelerin saflığını akış sitometrisi ile kontrol edin. Bir ayırma kolonunu yeniden kullanmak için, manyetik boncuk etiketli hücreleri yıkadıktan sonra, kolonu üstten üç kez, yıkama başına beş mililitre PBS ile ve yıkama başına beş mililitre damıtılmış su ile üç kez yıkayın.

Daha sonra, sütunu aynı şekilde beş mililitre yüzde 70 etanol ile yıkayın ve saklamadan önce sütunu iyice kurutmak için bir hava musluğu kullanın. Sütunu yeni bir saflaştırma deneyinde yeniden kullanmak için, sütunu aşağıdan yukarıya doğru beş mililitre yüzde 70 etanol ile yeniden yıkayın ve ardından iki beş mililitre PBS yıkaması yapın. Ardından, son bir yıkama için sütunun üst kısmını beş mililitre PBS ile doldurun.

Ve sütunu iki mililitre oda sıcaklığında BSS ile dengeleyin. Sütun daha sonra deneysel hücre popülasyonu ile yüklenebilir. B saflaştırılmış hücreleri CFSE ile etiketlemek için, hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpte taze hazırlanmış etiketleme solüsyonu ile iki kez yıkayın.

İkinci peletin taze 37 santigrat derece etiketleme çözeltisinde mililitre konsantrasyonunda 10 ila yedinci hücre olmak üzere iki kez yeniden süspanse edilmesi. Her seferinde numuneleri santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve tüpleri hafifçe vurun. Daha sonra hücreleri, 37 santigrat derecede karanlıkta 10 dakika boyunca bir kısım hücre süspansiyonunda bir kısım taze hazırlanmış 10 mikromolar CFSE solüsyon oranına etiketleyin.

Boyanın eşit dağılımını sağlamak için tüpü her iki dakikada bir ters çevirin. Hücre peletinin bir etiketleme çözeltisi içinde iyice süspanse edildiğinden emin olmak için dikkatli olunmalıdır. Hücre kümeleri CFSE etiketlemesinin homojenliğini etkileyebilir.

İnkübasyonun sonunda, CFSE'yi söndürmek için RPMI ortamı ekleyin ve hücreleri birkaç hacim buz gibi soğuk tam RPMI ortamında iki kez yıkayın. Hücreler başarılı bir şekilde etiketlendiyse, pelet rengi sarı olacaktır. Daha sonra, uygun uyaranla kaplanmış 96 kuyulu düz tabanlı bir plakayı PBS'de iki kez yıkayın.

CFSE etiketli B hücreleri için, mililitre başına altıncı B hücresini 10 kez üç kez yeniden askıya alın ve RPMI ortamını tamamlayın ve 100 mikrolitre B hücresini 72 saat boyunca üç kopya halinde kaplanmış plakaya tohumlayın. Bu tükenme yöntemi ile boncuk izole edilen OT1-CD8 T hücrelerinin saflığı yüzde 72,8'den yüzde 94,2'ye çıkarılabilir. Hücreler daha sonra gösterildiği gibi CFSE ile etiketlenebilir ve in vivo proliferasyonlarının analizi için alıcı hayvanlara evlat edinilebilir şekilde aktarılabilir.

Ek olarak, anti-CD45.1 antikor etiketlemesi, alıcı farelerin lenfoid organlarında evlat edinilen donör CD-45.1 pozitif OT1-CD8 T hücreleri olarak CFSE eksprese eden hücrelerin kimliğini daha fazla doğrulamak için kullanılabilir. Alternatif olarak, saflaştırılmış T hücreleri in vitro olarak uyarılabilir ve proliferasyonları tritiye Timidin dahil edilmesi ile değerlendirilebilir. Bu yöntemle splenik B hücre saflığında da önemli bir artış sağlanır.

Saflaştırılmış B hücrelerinin aşağı akış fonksiyonel analizi için benzer fırsatların kolaylaştırılması. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik iki saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü gerçekleştirerek, CI süspansiyonunuzu saflaştırma ve CFSE etiketleme dışında her zaman buz üzerinde tutmanız önemlidir.

Saflaştırılmış lenfositler, genetik olarak modifiye edilmiş lenfositlerin terminal sinyal kapasitesine immünoblotlama gibi diğer fonksiyonel testlerde de kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, B ve T hücrelerinin nasıl saflaştırılacağı ve hücrelerin çeşitli in vitro ve in vivo fonksiyonel tahliller için nasıl kullanılacağı hakkında daha iyi bir fikre sahip olmalısınız.