Name: İzolasyon ve murin lenfositlerin aktivasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Öğrenin manyetik mikroboncuklarla fare lenfositlerinin izolasyonunu ve aktivasyonunu. Bu yöntem genetik olarak modifiye lenfositlerin fonksiyonel kapasitelerini karşılaştırmak için hızlı ve minimal stres sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Çalışma Eğitim, Singapur Bakanlığı (AcRF Tier1-RG40 / 13 ve Tier2-MOE2013-T2-2-038) tarafından desteklenmektedir. el yazması Obrizus Communications Amy Sullivan tarafından düzenlendi.

Tüm fareler yetiştirilen ve özel patojen içermeyen koşullar altında korunur ve tüm fare protokolleri Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi kurallarına uygun olarak yürütülmektedir vardır. Tamponlar ve Reaktiflerin hazırlanması 1. <ol><li> 55 uM 2-merkaptoetanol tamamlandı Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ortamında (% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS), 2 mM L-glutamin, penisilin (100 lU / ml) / streptomisin (100 ug / ml) hazırlayın ). </li><li> Ayrı, 20x Dengeli Tuz Çözeltisi (BSS) Stok 1 ve Stok 2 hazırlayın. <ol><li> 20x BSS stok 1 (1 L steril su içinde 111 mM dekstroz, 8.8 mM potasyum fosfat, 26.7 mM sodyum fosfat dibazik) hazırlanması ve son hacim ayarlamasından önce, 20x BSS stoklar 1-40 ml% 0.5 Fenol Kırmızısı ekleyin. 4 ° C&#39;de depolamadan önce 0.2 mikron filtre kullanılarak steril filtre. </li><li> 20x BSS stok 2 (25.8 mM kalsiyum klorür dihidrat, 107 mM potasyum klorür, 2.73 M sodyum ch hazırlayınloride, 19.6 mM magnezyum klorür hekzahidrat, 1 L&#39;lik steril su içinde 16.6 mM magnezyum sülfat). 4 ° C&#39;de depolamadan önce 0.2 mikron filtre kullanılarak steril filtre. </li><li> 400 ml steril su her ayrı 50 ml BSS stok 1 ve 50 ml BSS stok 2 sulandırmak, deneysel kullanım için 1x BSS hazırlamak. , Seyreltilmiş çözüm birleştirin pH 7&#39;ye ayarlamak ve 20 ml FBS (% 2) ilave edilir. 0.2 um filtre kullanılarak steril su ve steril filtre kullanılarak 1 L doldurun. NOT: Konsantre BSS stoklarının karıştırılması doğrudan yağış neden olabilir çünkü BSS stok çözeltileri ayrı ayrı hazırlanmalıdır. </li></ol></li><li> Kırmızı kan hücresi (RBC) Liziz Tamponu <ol><li> RBC liziz tamponu kullanımdan önce 1 parçası hazır Tris-baz (steril su içinde 130 mM Tris (hidroksimetil) aminometan, pH 7.65) 9 parça hazır amonyum klorür (steril su içinde 155 mM amonyum klorür) karıştırın. Not: 4 ° C&#39;de amonyum klorür ve Tris-bazın mağazası steril stok çözeltileri. lizis b hazırlayınRBCs verimli parçalama sağlamak için taze Uffer. </li></ol></li></ol> Dalak veya lenf nodu gelen Lenfosit Süspansiyon 2. Nesil NOT: fare ötanazi önce deney için gerekli tüm reaktifler ve ekipman hazırlamak ve yüksek hücre canlılığı korumak için mümkün olduğunca çabuk lenfositlerin tek hücre süspansiyonları üretmek için önemlidir. <ol><li> Servikal dislokasyon veya CO 2 boğulma tarafından deneysel fare Euthanize. Not: itibaren Bu adımdan tüm deneysel işlemler aseptik olarak yapılmalıdır. </li><li> Herhangi bir kesiler yapmadan önce% 70 etanol içine tüm fare batırın. Dalak ve lenf düğümleri aseptik 8 çıkarın ve ya (aşama 1.2.3 den) BSS / FBS (% 2 FBS ile RPMI) 5 ml buz gibi soğuk RPMI / FBS ihtiva eden ayrı ayrı 15 ml tüpler yerleştirin. Not: BSS etkin RBC parçalama engellediğinden, dalak hücre süspansiyonu hazırlamak için RPMI kullanmak afte BSS geçmekr RBC parçalama. </li><li> 2 ml buz gibi soğuk RPMI / FBS BSS / FBS içeren bir petri steril 100 um hücre filtresi örgü iki adet arasında organ (lar) yer, dalak ve lenf düğümleri, tek bir hücre süspansiyonu üretmek için. Çok ince parçalar halinde yırtılmış kadar 1 ml şırınga pistonu kullanarak, organı (ler) ezin. </li><li> 15 ml tüp hücre süspansiyonu aktarın ve hücre süzgecinden buz soğukluğunda olarak RPMI / FBS BSS / FBS ile örgü yıkayın. Kalan hücre süspansiyonu toplayın aynı 15 ml tüp ekleyin ve 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 453 xg&#39;de aşağı doğru döndürün. süpernatantı. NOT: Sonraki adımda RBC parçalama tamponu veya orta eklemeden önce parmaklarıyla tüp hafifçe vurarak pelet hücreleri askıya Re. </li><li> Hücre süspansiyonu santrifüje esnasında oda sıcaklığında (RT) RBC liziz tamponu (adım 1.3 bkz.). Süpernatant hücrelerin peletleme ve çıkardıktan sonra, her 10 8 hücreleri için 1 ml RBC parçalama tamponu ile hücrelerin yeniden askıya. incukesmek 3-4 dakika boyunca oda sıcaklığında lizis reaksiyonu. </li><li> 14 ml buz gibi soğuk BSS / FBS ile RBC lizis durdurun ve 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 453 xg&#39;de aşağı doğru döndürün. </li></ol> B ve T hücrelerinin 3. saflaştırılması <ol><li> B hücrelerinin saflaştırılması <ol><li> Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. 300 ul BSS / FBS kadar 10 8 dalak hücreleri yeniden askıya ve 50 ul anti-CD43 manyetik mikroboncukları 9,10 ekleyin. , Ölü hücreleri çıkarmak 30 ul Annexin V manyetik boncuklar ekleyin. 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de buzdolabında hücre süspansiyonu inkübe edin. </li></ol></li><li> T hücreleri ile saflaştırılması <ol><li> Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Olmayan T hücre tükenmesi antikor kokteyli 10 8 hücreleri (CD19, B220, Gr-1 karşı biotinlenmiş antikorlar kadar yeniden askıya TCR-γδ, CD49b, CD11c, CD11b, Ter119 ve CD4 veya CD8 hedef hücre popülasyonuna bağlı olarak / FBS 4,5 200 ul BSS 200:) arındırılmalıdır, 1 seyreltilmiş. Bir hücre süspansiyonu inkübe15 dakika boyunca 4 ° C&#39;de bir buzdolabı. </li><li> İnkübasyondan sonra, hücreler yıkama ve 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 453 x g&#39;de döndürülür ve 10 mi BSS / FBS ekleyin. Süpernatantı ve 30 ul streptavidin mikro boncuklar ve 15 ul Annexin V manyetik boncuklar ile 165 ul BSS / FBS hücreleri yeniden askıya. 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de buzdolabında hücre süspansiyonu inkübe edin. NOT: bile manyetik mikro-ile etiketleme sağlamak 15 dakika boyunca mikro-hücreleri inkübe sonra 15 ml tüp dokunarak yavaşça hücre süspansiyonu karıştırın ve adım 3.1.1 sırasında başka bir 15 dakika inkübe etmek. ya da 3.2.2. </li></ol></li><li> Hücre Arıtma için Ayırma Sütunu hazırlanması <ol><li> Hücrelerin microbead etiketleme sırasında kullanılmayan bir ayırma kolonu hazırlayın (adım 3.1.1. ya da 3.2.2.). RT&#39;ye (FBS olmadan) Pre-sıcak BSS ve yıkama ve aseptik sütun dengelenmeye 2 ml kullanın. BSS ile dengelendikten sonra, yıkanmış, kolon kurumasına izin verilmemelidir. NOT: LS c kullanınolumn yerine tavsiye edilen LD sütun nedeniyle yeniden kullanılabilirlik (adım 3.4.). </li><li> Manyetik boncuklar ile etiketleme işleminden sonra, hücreler yıkama ve 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 453 x g&#39;de döndürülür ve 14 ml BSS / FBS ekleyin. Süpernatantı ve 1-3 ml RT BSS hücreleri yeniden askıya. </li><li> saflaştırma işlemi sırasında akış oranını azaltmak için sütunun ucuna steril 21 G iğne takın. dengelenmiş kolona hücre süspansiyonu yükleyin ve saflaştırılmış hedef hücreleri ihtiva eden akışı toplamak. NOT: sütuna yükleme sırasında içine kabarcıkları tanıtan kaçının. </li><li> 1 mi BSS / FBS ile bir kez kolon yıkaması ve saflaştırılmış hedef hücreleri ihtiva eden akışı toplamak. bir kez daha içinden akışı ile sütun yeniden yükleyin. Aynı 15 ml tüp ikinci yüklemeden sonra akışı toplayın. </li><li> 1 ml BSS / FBS ile sütun 3 kere yıkayın ve saflaştırılmış hedef hücreleri ihtiva eden akışı toplamak. Bundan sonra, th 5 ml BSS / FBS ekleyinBir dalgıç ile e kolon ve yeni bir 15 ml tüp içine sütun dışında manyetik etiketli hücreleri yıkayın. </li><li> Saflaştırılmış B veya T hücrelerinin 4,5 antijenlerini yüzey bağlanan antikorlar kullanılarak akış sitometrisi ile toplanan hücreler saflığını kontrol edin. </li></ol></li><li> Yeniden kullanılması ayırma kolonunun NOT: LS sütun arıtma verimini etkilemeden 4 kata kadar tekrar edilebilir. <ol><li> 5 ml fosfat tamponlu tuz (PBS) ve pistonu kullanan üstten damıtılmış su, 5 ml 3 kez sütun 3 kez yıkayın. </li><li> 5 ml% 70 etanol ile sütun yıkayın ve yoğun sütunda pas oluşumunu önlemek için bir hava musluğunu kullanarak sütun kurutun. </li><li> ayn bir saflaştırma deneyi için el LS kolonu hazırlamak için, şırınga adaptörü kullanarak 5 mi,% 70 etanol ile aşağıdan yukarıya doğru sütun yıkayın. Daha sonra, sütun üst bir kez 5 ml PBS ve ardından, 5 ml steril PBS ile iki kez aşağıdan yukarıya doğru sütun yıkayın. 2 ekleml RT BSS sütun dengelenmesi ve ardından etiketli hücreleri ile kolon yükleme devam etmek. </li></ol></li></ol> 4. KAKE Etiketleme ve Uyarım Not: Saflaştırılmış hücreleri, in vitro çeşitli ve in vivo fonksiyonel deneylerde tabi tutulabilmektedir. Burada, APC &#39;5 T hücresi uyarılması yeteneğini belirlemek için, saflaştırılmış T hücreleri kullanır. <ol><li> 37 ° C öncesinde CFSE yüklenmesi Pre-sıcak etiketleme çözümü (PBS içinde% 0.1 FBS). Not: PBS içinde FBS düşük bir yüzde kullanarak CFSE yükleme esnasında hücre ölümünü azaltır ve santrifüj sırasında hücre kaybını en aza indirir. Ancak, çok fazla FBS KAKE yükleme engelleyebilir. </li><li> Etiketleme çözeltisi ile iki kez saflaştırıldı hücreler yıkanır, daha sonra 15 ml&#39;lik bir tüp içinde önceden ısıtılmış markalama çözeltisi içinde 2 x 10 7 hücre / ml&#39;de yeniden süspanse edilir. </li><li> 10 uM KAKE çözeltisi hazırlayın (1: 500 seyreltme 5 mM KAKE stok solüsyon) önceden ısıtılmış etiketleme çözeltisi içinde. KAKE çözümü gerekirtaze optimum etiketleme elde etmek için her zaman hazır olun. </li><li> CFSE ile hücrelerin yüklemek için, 37 ° C &#39;de 10 dakika süre ile karanlıkta, 15 ml&#39;lik bir tüp içinde 1 kısım 10 uM CFSE çözeltisine 1 kısım hücre süspansiyonu ekleyin ve inkübe edilir. 5 uM CFSE bir son konsantrasyon elde 1 x 10 7 hücre / ml etiketlemek için kullanılır. </li><li> CFSE yükleme esnasında hücre, homojen bir karışım sağlamak için tüpü her 2 dakikada ters çevirin. </li><li> , Reaksiyonu durdurmak buz soğukluğunda tam RPMI ortamında bir çok sayıda ekleme ve 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 453 x g&#39;de döndürülür ve. Başarılı KAKE yükleme üzerine, hücre pelet sarımsı görünecektir. </li><li> Yıkama CFSE buz soğukluğundaki tam RPMI ortamı ile hücreler bir kez daha yüklenir ve in vitro kültür için ya da in vivo uyarılması kullanılmadan önce, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 453 x g&#39;de aşağı doğru döndürün. </li></ol> 5. İn vitro uyarma <ol><li> kullanımdan hemen önce uyaranların 2x stok solüsyonu (2x uyaranlara stok çözelti) hazırlayın 10 ve böylece2x uyaranlara stok çözeltisi 0 ul, 96 oyuklu bir plaka içerisinde, oyuk başına 200 ul nihai bir hacme 100 ul hücre ilave edilebilir. </li><li> (B hücreleri ve T hücreleri için, CD3 ve CD28 için IgM veya CD40) uyaranlara ile kaplanmış bir tabak gerekli ise, bir gece boyunca 4 ° C&#39;de PBS içinde uyaranlara ve ön-kaplama kültürü plakası seyreltin. Seçenek olarak ise, kültür plakası Deney gününde 1 saat boyunca 37 ° C &#39;de kaplanabilir. PBS (plaka, herhangi bir zamanda kurumasına izin vermeyin) ile iki kez kaplanmış plaka yıkayın. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> B hücreleri için </td><td></td></tr><tr><td> uyaranlar </td><td> Nihai konsantrasyon </td></tr><tr><td> F (ab &#39;) 2 keçi anti-fare IgM </td><td> 0,6-2,4 ug / ml </td></tr><tr><td> Fare karşıtı CD40 mAb </td><td> 0.5-2 ug / ml </td></tr><tr><td> rekombinantfare IL-4 </td><td> 25 U / ml </td></tr><tr><td> lipopolisakkarit </td><td rowspan="2"> 0,1-10 ug / ml </td></tr><tr><td> E. (LPS) E. coli serotipi 055: B5 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> T hücreleri için, </td><td></td></tr><tr><td> uyaranlar </td><td> Nihai konsantrasyon </td></tr><tr><td> Anti-CD3 (plaka kaplı) </td><td> 2-10 ug / ml </td></tr><tr><td> (50 ul / oyuk kaplama) </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD28 (plaka kaplı) </td><td> 2 ug / ml </td></tr><tr><td> Rekombinant IL-2 </td><td> 40 U / ml </td></tr><tr><td> PDBu (forbol ester) </td><td> 5-50 ng / ml </td></tr><tr><td> A23187 (Kalsiyum İyonofor) </td><td> 250 ng / ml </td></tr></tbody></table> Tablo 1: in vitro kültür içinde lenfositleri uyarmak için kullanılan uyarıcı konsantrasyonu.<ol start="3"><li> CFSE, etiketli B hücreleri için, 3 x 10 5 hücre ile üç nüsha tam RPMI ortamı ve kültürde 6 ila 10 x 3 hücre / ml yeniden askıya / kuyuda 72 saat için 96-gözlü düz tabanlı plakalar. </li><li> CFSE-etiketli T hücreleri için, 0.5-3 x 10 5 hücre ile üç nüsha tam RPMI ortamı ve kültür 0,5-3 x 10 6 hücre / ml&#39;de yeniden askıya / kuyuda 48 ya da 72 saat süre ile, 96-gözenekli yuvarlak tabanlı plakalar . </li></ol> 6. in vivo uyarılmasına <ol><li> In vivo uyarılmasına, adoptif transferi için fare başına 4 x 10 6 KAKE etiketli T hücreleri (intravenöz (iv) 200 ul PBS) her MHC-uyumlu alıcı fare içine. NOT: Bu protokol, KAKE etiketli T hücreleri adoptively ev gibi dalak ve lenf düğümleri olarak lenfoid organlara olacak bu hücrelerin olarak kuyruk ven ya da retro-orbital enjeksiyonu kullanılarak transfer edilebilir. </li><li> Bir gün sonra antijen ile alıcı fareler meydan. NOT:OVA-spesıfik T hücresi reseptörü (TCR) -transgenic T hücrelerinin adoptif alıcı farelere aktarıldı, bu örnekte, antijen olarak ovalbumin (OVA proteini, 50 ug / fare) kullanın. Her alıcı farenin 5 içine, deri altı enjeksiyon (si) üzerinden, steril PBS OVA proteini hazırlayın ve OVA protein / PBS veya PBS kontrol 100 ul enjekte edilir. </li><li> Hasat ve 3 gün OVA proteini veya PBS ile immünizasyondan sonra alıcı farelerin bir lenfoid organlara hücre süspansiyonları (lenf düğümleri ve dalak) oluşturur. proksimal lenf nodlarının mezenterik, popliteal, inguinal, lomber ve kuyruklu lenf düğümleri içeren aksiller, brakial ve yüzeysel servikal lenf düğümleri) ve distal lenf nodları (DLN) içerir (PLN), içine ayrı lenf nodları. Uygun FACS antikorları kullanarak leke hücreler, T hücre çoğalması kontrol etmek için. NOT: Bu KAKE hücre izleme deneyinde olmayan di için bir temel floresan kurmak PBS enjekte edilmiş kontrol farelerinden T hücrelerinin KAKE etiketliHücreleri sa¤layan. Çoğalan hücre bölünmeleri, antijen ile uyarılmış, KAKE etiketli hücreler floresan zirveleri 12,13 ölçülerek tarafından görüntülenmiştir. PBS kontrolü ile, çoğalan hücre bölünmeleri sayısı KAKE etiketli T hücreleri 12,13 belirlenebilir. </li><li> Örnekler arasında, hücre bölümleri veya tepe sayısını karşılaştırarak CFSE etiketli hücre proliferasyon verileri analiz (Şekil 1 ve 2). Not: Örneğin, CFSE etiketli, adoptif OVA antijen alıcı alıcı farelere aktarıldı OVA spesifik T hücreleri, PBS enjekte edilmiş kontrol farelerine kıyasla 5,12 aktif proliferasyonunu uğrayacaktır. Ayrıca, Hawkins ve arkadaşları 14 tarafından gösterildiği gibi KAKE hücre çoğalma verileri analiz etmenin birçok yolu vardır işaret etmek çekicidir. </li></ol>

<ol><li>Nikolich-Žugich, J., Slifka, M. K., Messaoudi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+important+facets+of+T-cell+repertoire+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The many important facets of T-cell repertoire diversity.</a> Nat. Rev. Immunol. 4 (2), 123-132 (2004).</li>
<li>LeBien, T. W., Tedder, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes%3A+how+they+develop+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes: how they develop and function.</a> Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).</li>
<li>Brownlie, R., Zamoyska, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+signaling+networks%3A+branched%2C+diversified+and+bound%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell receptor signaling networks: branched, diversified and bound.</a> Nat. Rev. Immunol. 13 (4), 257-269 (2013).</li>
<li>Neo, W. H., Lim, J. F., Grumont, R., Gerondakis, S., Su, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-rel+regulates+ezh2+expression+in+activated+lymphocytes+and+malignant+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">C-rel regulates ezh2 expression in activated lymphocytes and malignant lymphoid cells.</a> J. Biol. Chem. 289 (46), 31693-31707 (2014).</li>
<li>Gunawan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methyltransferase+Ezh2+controls+cell+adhesion+and+migration+through+direct+methylation+of+the+extranuclear+regulatory+protein+talin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin.</a> Nat Immunol. 16 (5), 505-516 (2015).</li>
<li>Lyons, A. B., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+lymphocyte+division+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of lymphocyte division by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 171 (1), 131-137 (1994).</li>
<li>Cabatingan, M. S., Schmidt, M. R., Sen, R., Woodland, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%C3%AFve+B+lymphocytes+undergo+homeostatic+proliferation+in+response+to+B+cell+deficit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Naïve B lymphocytes undergo homeostatic proliferation in response to B cell deficit.</a> J. Immunol. 169 (12), 6795-6805 (2002).</li>
<li>Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Th17+differentiation+of+na%C3%AFve+CD4+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Th17 differentiation of naïve CD4 lymphocytes.</a> J. Vis. Exp. (79), e50765(2013).</li>
<li>Su, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ezh2+controls+B+cell+development+through+histone+h3+methylation+and+Igh+rearrangement%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ezh2 controls B cell development through histone h3 methylation and Igh rearrangement.</a> Nat. Immunol. 4 (2), 124-131 (2003).</li>
<li>Mecklenbräuker, I., Saijo, K., Zheng, N., Leitges, M., Tarakhovsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C%CE%B4+controls+self-antigen-induced+B-cell+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein kinase Cδ controls self-antigen-induced B-cell tolerance.</a> Nature. 416 (6883), 860-865 (2002).</li>
<li>Rush, J. S., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+activated+via+CD40+and+IL-4+undergo+a+division+burst+but+require+continued+stimulation+to+maintain+division%2C+survival+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">B cells activated via CD40 and IL-4 undergo a division burst but require continued stimulation to maintain division, survival and differentiation.</a> Eur. J. Immunol. 31 (4), 1150-1159 (2001).</li>
<li>Quah, B. J. C., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat. Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).</li>
<li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+methods+for+measuring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+using+CFSE-like+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes.</a> J. Immunol. Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).</li>
<li>Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+lymphocyte+proliferation%2C+survival+and+differentiation+using+CFSE+time-series+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data.</a> Nat. Protoc. 2 (9), 2057-2067 (2007).</li>
<li>Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+separation%3A+Terminology+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Cell separation: Terminology and practical considerations.</a> J. Tissue Eng. 4 (1), 1-14 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu protokol, lenfoid organların lenfositlerin saflaştırılması için bir prosedürü göstermektedir. manyetik boncuk sıralama kullanılarak hücre arıtma canlı, yüksek düzeyde saflaştırılmış hedef hücreleri verimleri hızlı ve basit bir yöntemdir. Protokol çerçevesinde kritik adımlar Hücre canlılığı, ve hücre verimi In vitro olarak hematopoietik kökenli hücrelerin canlılığını muhafaza başarılı ve tekrarlanabilir deney...

Olgun lenfositler, bireyde önceden var olan bir enfeksiyon veya iltihap yoksa genellikle dinlenme durumunda bulunur. Bu nedenle, in vitro veya in vivo fonksiyonel testler yapmadan önce izolasyon işlemi sırasında lenfositlerin naif durumunu korumak önemlidir. Tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmenin anahtarı, hücrelerin gereksiz manipülasyonunu sınırlamaktır. 
Manyetik hücre sıralaması, ilgilenilen hücre popülasyonunu zenginleştirmek için hücreleri etiketlemek için antikorlar ve mikro boncuklar kullanır. Bu yaklaşımla, iki saflaştırma stratejisi vardır: pozitif zenginleştirme ve negatif tükenme. Pozitif zenginleştirme, hedef hücrelere bağlanan bir antikor kullanarak ilgilenilen hücre popülasyonunu zenginleştirir. Negatif tükenme ise hedef olmayan hücreleri tüketir ve hücre popülasyonunu ilgilenilen şekilde bırakır. Laboratuvarımızda, negatif tükenmeyi pozitif zenginleştirmeye tercih ediyoruz çünkü antikorların hedef hücrelere bağlanması hücre özelliklerini ve davranışını potansiyel olarak değiştirebilir. Aslında, belirli bir hücre popülasyonunun izolasyonu için uygun olan birçok yerleşik hücre yüzeyi markörü aynı zamanda fonksiyonel reseptörlerdir. 
Manyetik hücre ayıklama, yalnızca canlı hedef hücrelerin yüksek saflıkta popülasyonlarını vermekle kalmaz, aynı zamanda daha az zaman alıcıdır ve floresanla aktive edilen hücre sıralamasında (FACS) kullanılan yüksek basınçlı akışın neden olduğu hücresel stresi önler. İstenmeyen hücre popülasyonlarını etiketleyerek ve manyetik bir ayırma sütunu kullanarak tüketerek, hedef hücre popülasyonunun canlılığından ödün vermeden hızlı hücre izolasyonu gerçekleştirebiliyoruz. Bu protokolde, saf B hücrelerini veya T hücrelerini saflaştırmak için negatif tükenme stratejilerinin kullanımını gösteriyoruz.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Malzemeler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 (L-Glutamin olmadan)</td> <td>Gibco</td><td>31870025</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu Isı</td><td></td><td></td><td>inaktive edildi ve nbsp;</td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140114</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD43 manyetik mikro boncuklar</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-801</td><td>İyice karıştırın önceki kullanım</td></tr><tr><td>Streptavidin mikro boncukları</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td>Kullanmadan</td></tr> <tr>önce iyice karıştırın<td>Anti-Annexin V manyetik boncuklar</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-201</td><td>İyice karıştırın, önceki kullanım</td></tr><tr><td>MACS LD&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu U-dipli steril kültür plakası</td><td>Greiner Bio-one</td><td>650180</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu F-dipli steril kültür plakası</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>100 & mu; m hücre süzgeç ağı</td><td></td><td></td><td>UV radyasyonu kullanarak sterilize etmek için önceden</td></tr><tr><td>0.2 & mu kullanın; m&nbsp; steril tek kullanımlık filtre üniteleri</td><td>Nalgene</td><td>567-0020</td><td>Herhangi bir steril filtre cihazı ile ikame edilebilir</td></tr><tr><td>Kısaca CellTrace Violet</td><td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td>CTV; kısaca CFSE</td></tr><tr><td>CellTrace Yellow</td><td>Invitrogen</td><td>C34567</td><td>CTY'ye alternatif; kısaca CFSE</td></tr><tr><td>CellTrace Far Red</td><td>Invitrogen</td><td>C34564</td><td>CTFR'ye alternatif; CFSE'ye alternatif</td></tr><tr><td>Hücre Proliferasyon Boyası eFluor 670</td><td>eBioscience</td><td>65-0840</td><td>kısaca CPD670; CFSE</td></tr><tr><td>PKH26</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PKH26GL</td><td>alternatifi, PKH26, CFSE'ye alternatif</td></tr><<tr><td>strong>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Chemicals </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dekstroz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>Fenol Kırmızı</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür dihidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Merck Millipore</td><td>S7653</td><td>Diğer kaynaklardan kullanılabilir</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür hekzahidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Tris-baz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>D8418</td><td></td></tr> <tr><td>(5- (ve 6-) karboksifloresein diasetat süksinimidil ester (CFSE)</td> <td>Moleküler Problar</td><td>C-1157</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>Phorbol 12,13-dibutirat (PBDU, Phorbol ester)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>P1269</td><td></td></tr><tr><td>A23187 (Kalsiyum iyonofor)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>C7522</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Adı < / güçlü ></td> <td>< güçlü > Şirket< / güçlü> </td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</td></tr><tr><td>Antikorlar ve rekombinant protein</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b biotin (klon m1/70)</td><td>Biolegend</td><td>101204</td><td>T hücresi tükenme kokteyli</td></tr><tr><td>CD11c biotin (klon N418)</td><td>Biolegend</td><td>117304</td><td>T hücresi tükenme kokteyli</td></tr><tr><td>Gr-1 biotin (klon RB6-8C5)</td><td>Biolegend</td><td>108404</td><td>T hücresi tükenme kokteyli</td></tr><tr><td>Ter119 biyotin (klon Ter119)</td><td>Biolegend</td><td>116204</td><td>T hücresi tükenme kokteyli</td></tr><tr><td>TCR-&gama; &delta; biotin (klon GL-3)</td><td>Biolegend</td><td>118103</td><td>T hücresi tükenme kokteyli</td></tr><tr><td>CD19 biotin (klon 6D5)</td><td>Biolegend</td><td>115504</td><td>T hücresi tükenme kokteyli</td></tr><tr><td>B220 biotin (klon RA3-6B2)</td><td>Biolegend</td><td>103204</td><td>T hücresi tükenme kokteyli</td></tr><tr><td>CD49b biotin (klon DX5)</td><td>Biolegend</td><td>108904</td><td>T hücresi tükenme kokteyli</td></tr><tr><td>CD4 biotin (klon GK1.5)</td><td>Biolegend</td><td>100404</td><td>T hücresi tükenme kokteyli</td></tr><tr><td>CD8 biyotin (klon 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100704</td><td>T hücresi tükenme kokteyli</td></tr><tr><td>F(ab')2 keçi anti-fare IgM (plaka kaplı)</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>115-006-075</td><td>50 & l/kaplama için kuyu (96 kuyulu)</td></tr><tr><td>Anti-fare CD40 mAb (plaka kaplı)</td><td>Pharmingen&nbsp;</td><td>553722</td><td>50 ve mikro; kaplama için l/kuyucuk (96 kuyucuklu)</td></tr><tr><td>Rekombinant IL-4</td><td>ProSpec&nbsp;</td><td>Cyt-282</td><td></td></tr><tr><td>LPS E. coli Serotip 055:B5</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L-4005</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3 (klon klon OKT3) (plaka kaplı)</td><td>eBioscience&nbsp;</td><td>16-0037-85</td><td>50 & kaplama için l/kuyu (96 kuyulu)</td></tr><tr><td>Anti-CD28 (klon klon 37.51) (plaka kaplı)</td><td>eBioscience&nbsp;</td><td>16-0281-85</td><td>50 & kaplama için l/kuyu (96 oyuklu)</td></tr><tr><td>Rekombinant IL-2</td><td>ProSpec</td><td>Cyt-370</td><td></td></tr><tr><td>Tavuk yumurtası akından elde edilen albümin, Ovalbumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7641</td><td></td></tr></tbody></table>

İzolasyon ve murin lenfositlerin aktivasyonu

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B ve T hücreleri, son derece çeşitli antijen-reseptör repertuarlarıyla, hemen hemen her istilacı patojene karşı spesifik bağışıklık tepkileri oluşturma yeteneğine sahiptir1,2. Anlaşılır bir şekilde, bu tür karmaşık yetenekler, zamanında ve mekansal olarak düzenlenmiş bağışıklık tepkilerini sağlamak için çeşitli hücresel süreçlerde yer alan çok sayıda molekül tarafından kontrol edilir3. Burada, manyetik hücre sıralama teknolojisi kullanılarak yüksek oranda saflaştırılmış murin lenfositlerinin hızlı izolasyonuna izin veren deneysel prosedürleri açıklıyoruz. Elde edilen saflaştırılmış lenfositler daha sonra çeşitli in vitro veya in vivo fonksiyonel testlere tabi tutulabilir, örneğin immünoblotlama4 ile stimülasyon üzerine lenfosit sinyal kapasitesinin belirlenmesi ve 3H-timidin dahil edilmesi veya karboksifloresein diasetat süksinimidil ester (CFSE)etiketleme 5-7 ile proliferatif yeteneklerin araştırılması gibi. Kontrol ve genetik olarak modifiye edilmiş lenfositlerin fonksiyonel kapasitelerini karşılaştırmanın yanı sıra, nakledilen CFSE etiketli OT-I T hücrelerini kullanarak temsili sonuçlarımızda gösterildiği gibi, antijen sunan hücrelerin (APC'ler) T hücresi stimülatör kapasitesini in vivo olarak da belirleyebiliriz.

lenfositlerin manyetik hücre saflaştırma kullanıcılara zaman nispeten kısa bir miktarda bir hedef hücre popülasyonu arındırmak için izin verir. Bizim tükenmesi protokolü kullanarak, arıtıldıktan sonra 94.2% (için 72,8% (önceki arıtma) den (rekombinasyon aktive gen 1 (RAG-1) -açıklı farelerde OT-I) CD8 T hücrelerinin yüzdesini artırmak başardık; Şekil 1A) 4,5. Bu arıtılmış, lenfositler, daha sonra olan limfosit proliferasyon ve sinyal transdüksiyonunu 4,5<...

Lenfositler, adaptif immün yanıtlarda ana oyunculardır. Burada, in vitro ve in vivo lenfosit aktivasyonunda istenen moleküllerin fizyolojik fonksiyonlarını belirlemek için bir lenfosit saflaştırma protokolü sunuyoruz. Açıklanan deneysel prosedürler, kontrol ve genetik olarak değiştirilmiş lenfositler arasındaki fonksiyonel kapasiteleri karşılaştırmak için uygundur.

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Bu deneyin genel amacı, saflaştırılmış fare lenfositlerinin fonksiyonel kapasitelerini çeşitli in vitro ve in-vivo fonksiyonel analizler kullanarak incelemektir. Bu yöntem, İmmünoloji ve Moleküler Biyoloji alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, gen eksikliği olan lenfositlerde ilgilenilen bir proteinin fonksiyonunun araştırılması gibi.Bu tekniğin temel avantajı, minimum manipülasyon ve çevresel stresle lenfositleri hızlı bir şekilde saflaştırabilme yeteneğidir. B hücrelerini saflaştırmak için, eritrositleri lize edilmiş 10⁸'e kadar tüm dalak hücrelerini, FBS ile desteklenmiş 300 µL dengeli tuz çözeltisi veya BSS içinde yeniden süspande edin. Ardından 50 µL anti-CD43 manyetik mikro boncuk ekleyin.Ölü hücreleri uzaklaştırmak için, 4 °C'de 30 dakika boyunca 30 µL Annexin five manyetik boncuğu ekleyin. Hücrelerin eşit şekilde etiketlenmesini sağlamak için hücre süspansiyonunu 15 dakikalık aralıklarla hafifçe çalkalayın. İnkübasyonun sonunda, etiketlenmiş hücreleri FBS ile desteklenmiş 14 mL BSS ile yıkayın.Santrifüj sonrası süpernatantı uzaklaştırın, tüpü hafifçe vurarak çökeltiyi oda sıcaklığında FBS ile desteklenmiş bir ila üç mililitre BSS içerisind

isolation-and-activation-of-murine-lymphocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Miltenyi MAC kiti kullanılarak lenfositlerin İzolasyon tüm lenfoid doku homojenatlarında hücreleri arındırmak için güvenilir bir yol. Miltenyi sistemini kullanarak saflaştırılmış Hücreler genellikle ≥% 96 saf. Burada, CD4 + T hücreleri, Miltenyi tarafından sunulan birçok kitleri biri izole etmek için atılan adımları göstermektedir.

CD4 İzolasyon Miltenyi MACS Arıtma Fare lenf düğümleri + T hücreleri

Bu video, CD40 aktivasyonu ve dokunulmazlık indüksiyonu eğitim için bir model antijen sunan hücre (APC) olarak da kullanılabilir C57BL / 6 farelerin dalak, fare B hücreleri genişleme prosedürü göstermektedir.

Murin Model B hücreleri CD40 aktivasyonu

Biz retroviral transdüksiyon kullanarak fare antijen spesifik T-hücrelerinin üretmek için bir protokol...

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

Fare genital lenfosit yalıtmak için verimli bir şekilde tarif edilmiştir. Bu yöntem verimli izolasyonu sağlamak için enzim sindirim ve Percoll degrade ayrılık yararlanır. Bu teknik, diğer tür kullanım için de...

Fare Genital Sistemlerinin Mukozanin gelen Lenfosit İzolasyonu

Peyer plaklarında hücrelerin belirli altgrupları (PPs), gut-ilişkili lenfoid dokuların primer endüktif sitelerin immünolojik işlevlerini anlamak giderek artan bir ilgi var. Burada akım sitometri analizi ve immun için PP cryosections için tek hücre hazırlıkları PP hazırlamak için paralel protokolleri anahat.

Lenfositler ve mürin Peyer en Yamalar itibaren Dendritik Hücreler İzolasyon Ve immün

Burada izolasyonu, tanımlanması ve fare timik epitelial hücreler üzerinde (Tecs) saflaştırılması için etkili bir yöntem tarif eder. Bu protokol, normal T-hücresi gelişimi, timus disfonksiyon ve T hücresi sulandırılacak timus fonksiyonunun çalışmaları için kullanılabilir.

İzolasyon, tanımlama ve Murin Thymic Epitel Hücreleri saflaştırılması

Lenf nodu stromal hücrelerinin izolasyonu, fibroblastik retiküler hücreler, lenfatik ve kan endotel hücreleri elde etmek için enzimatik sindirim ve mekanik ayrıştırmayı içeren çok aşamalı bir prosedürdür. Tarif edilen prosedürde, canlı lenf nodu stromal hücrelerinin yüzey işaretleyici bozulmasını en aza indirmek için kısa bir sindirim otomatik mekanik ayrıştırma ile birleştirilir.

Kemirgen Lenf Düğümü Stromal Hücrelerinin İzolasyonu

Monosit kaynaklı DC (MoDC) tehlike ilişkili molekülleri küçük miktarlarda hissi olabilir ve bu nedenle kolayca astarlanmalıdır. MoDC yalıtım kan ve tümörleri ve onların harekete geçirmek bağışıklık kompleksleri ile onların erken harekete geçirmek önlemek için düşünülmesi gereken önemli önlemler vurgulayarak süre için detaylı bir protokol sağlar.

Yalıtım Protokolü fare monosit kaynaklı dendritik hücreler ve onların sonraki Vitro harekete geçirmek ile tümör bağışıklık kompleksleri

Burada biz lenfositler gut ilişkili lenfoid doku Peyer's yamalar ve boşaltma Mezenterik lenf düğümleri de dahil olmak üzere İndüktif sitelerinden ve lamina propria dahil efektör mekanları ekran koruyucu yalıtım için detaylı bir protokol tanımlamak ve bağırsak epitel küçük bağırsak bağışıklık sisteminin.

Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

Bu makale, murin endotel hücrelerinin dermal lenfatik kılcal damarlardan manyetik boncuk bazlı izolasyonu için bir yöntemi açıklamaktadır. İzole edilmiş lenfatik endotel hücreleri, aşağı akış in vitro deneyler ve protein ekspresyon analizi için kullanılabilir.

Murin Dermal Lenfatik Endotel Hücre İzolasyonu

Mevcut çalışma, virüse özgü TFH hücrelerinin erken kader bağlılığını değerlendirmek ve bu hücrelerde gen ekspresyonunu manipüle etmek için protokoller göstermektedir.

Akut LCMV ile Enfekte Farelerde Virüse Özgü Foliküler Yardımcı CD4+ T Hücresinin Erken Farklılaşmasına Erişim

Öğrenin manyetik mikroboncuklarla fare lenfositlerinin izolasyonunu ve aktivasyonunu. Bu yöntem genetik olarak modifiye lenfositlerin fonksiyonel kapasitelerini karşılaştırmak için hızlı ve minimal stres sağlar.

İzolasyon ve murin lenfositlerin aktivasyonu

Daha fazla video keşfet