Akış Sitometrisi ile Sıçan Böbrek gelen Makrofagların Fenotipik Karakterizasyonu
18 Ekim 2016
Bu yazıda fenotipik ve flow sitometri ile sıçan böbreklerden yerleşik makrofajlar kantitatif analizi için ayrıntılı bir protokol açıklar. Elde edilen lekeli hücreler aynı zamanda, böylece deneysel modelinde elde edilen bilgileri, artan hücre sıralama, gen ekspresyon analizi veya fonksiyonel çalışmalar dahil olmak üzere, başka uygulamalar için de kullanılabilir.
Bu prosedürün genel amacı, sıçan böbreklerinden yerleşik makrofajları akış sitometrisi ile ölçmek ve karakterize etmektir. Bu yöntemin akışkanlığında her bir macraphage tipinin böbrek hasarına katkısı nedir gibi anahtar bir soruya cevap olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, farklı protein belirteçlerinin böbrek kateterizasyonuna izin vermesidir. Bu nedenle, prosedürün hücresel bütünlüğünün sınırlandırılması, Complutense Üniversitesi'nden A.P.A.S.D. öğrencisi Elena Olivares ve Melania Guerrero, A.P.A.S.D. öğrencisi böbrek perfüzyonu ve ekstraksiyonu için, sıçanın uygun sedasyon seviyesine ulaştığını doğrulamak için küçük bir cilt kıvrımını sıkıştırarak başlayın. Ve gözleri Veteriner merhemi ile örtün. Hayvanı sırtüstü pozisyonda bir ameliyat masasına yerleştirin. Ve karnı% 70 etanol ile ıslatın. Daha sonra, plevral ve karın boşluklarını ortaya çıkarmak için karın derisi ve periton boyunca pubisten göğüs kafesine kadar merkezi bir kesi yapın. Böbrekleri yıkamak için abdominal aort içine% 0.9 salin solüsyonu enjekte etmek için perfüzyon sistemini kullanın. Kanın serbest bırakılmasına yardımcı olmak için aortu karın bölgesinden kesmek. Kanın tamamı böbreklerden alındığında, renal hilumu kesin. Daha sonra organları dikkatlice kapsüllemek için her bir böbreğin kenarına bastırın. Ve çıkarılan böbrekleri taze olarak aktarın H.B.S.S.To tek bir böbrek hücresi süspansiyonu oluşturun, bir böbreğin yarısını küçük parçalara ayırmak için makas kullanın. Doku parçalarını 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın ve 37 ° C'de 30 dakikalık bir inkübasyon için tüpe 1 mL taze hazırlanmış kollajenaz ekleyin
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, rat böbreklerindeki yerleşik makrofajların akış sitometrisi ile fenotipik ve kantitatif analizine yönelik ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Boyanan hücreler, deneysel modelden elde edilen bilgileri artıracak şekilde çeşitli uygulamalar için kullanılabilir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- İmmünoloji
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Makrofajlar, böbrek sağlığı ve hastalıklarında kritik bir rol oynar.
- Akış sitometrisi, hücre popülasyonlarının ayrıntılı analizine olanak tanır.
- Makrofaj davranışının anlaşılması, terapötik stratejilere ışık tutabilir.
- Böbrek fonksiyonlarını incelemek için yaygın olarak sıçan modelleri kullanılır.
Çalışmanın Amacı
- Böbrek makrofajlarının izole edilmesi ve analiz edilmesi için bir protokol geliştirmek.
- Renal bağlamlarda makrofaj fonksiyonları üzerine yapılacak ileri araştırmaları kolaylaştırmak.
- İlgili alanlardaki araştırmacılar için bir kaynak sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Hücre analizi için akış sitometrisi.
- Makrofaj tanımlama için boyama teknikleri.
- Hücre ayıklama ve gen ekspresyon analizi protokolleri.
- Makrofaj aktivitesini değerlendirmek için fonksiyonel çalışmalar.
Temel Sonuçlar
- Sıçan böbreklerinden resident makrofajların başarılı izolasyonu.
- Makrofaj fenotiplerinin ayrıntılı karakterizasyonu.
- Gen ekspresyonu ve fonksiyonel çalışmalarda potansiyel uygulamalar.
- Böbrek sağlığında makrofajların rollerine dair geliştirilmiş anlayış.
Sonuçlar
- Protokol, makrofaj analizi için güvenilir bir yöntem sunmaktadır.
- Sonuçlar, böbrek hastalıkları üzerine yapılacak gelecek çalışmaları bilgilendirebilir.
- Araştırmalar, akış sitometrisinin ötesindeki diğer uygulamalara genişletilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörle İlgili Yönetici Özeti
Renal hastalık modellerindeki makrofaj alt kümelerinin doğru fenotipik karakterizasyonu, inflamasyon kaynaklı böbrek patolojisinde hedef doğrulamanın risklerini azaltmak için kritik öneme sahiptir. Bu akış sitometrisi protokolü, sıçan böbreklerindeki pro-inflamatuar (M1) ve immünoregülatör (M2) makrofaj fenotiplerinin kantitatif ayrımını sağlayarak, fibrozis ve immün modülasyona dair mekanistik içgörüleri destekler. Makrofajların renal hasara olan katkısını değerlendirmek için güvenilir bir yöntem sunan bu yaklaşım, preklinik hedef seçimi ve yolak sorgulamasındaki öngörüsel güveni artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Böbrek hasarı modellerinde M1/M2 makrofaj oranlarını nicelleştirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Makrofaj fenotiplerini yüksek özgünlükle tanımlamak için CD86/CD163 yüzey boyamasıyla birlikte çift CD45/CD68 kapılaması kullanır.
- Tahmin Değeri: Makrofaj polarizasyon durumlarını fibrozis ve immünoregülatör yolaklar ile ilişkilendirerek hedef riskini azaltmayı destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Makrofaj frekansı ve belirteç ekspresyonu için standartlaştırılmış, kantitatif akış sitometrisi çıktıları üretir.
- Tekrarlanabilirlik: Düşük hücresel mortalite ve korunmuş bütünlük sergileyerek deneyler arasında tutarlı fenotipik okumalar sağlar.
- Alt Analiz Kullanımı: İzole edilen makrofajlar hücre ayıklama, mRNA ve protein analizleri için canlı kalır ve böylece multi-omik takip çalışmalarını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlişkisi: Makrofaj fenotiplerinin patogenezi yönlendirdiği enflamatuar böbrek hastalığı modelleri için doğrudan uygulanabilirdir.
- Translasyonel Süreklilik: Ayrıştırılmış makrofajlardan elde edilen fenotipik veriler, preklinik çalışmalarda biyobelirteç keşfi ve fonksiyonel doğrulamaya temel oluşturabilir.
- Riskten Arındırılmış Kararlar: İmmünomodülatör bileşiklerin makrofaj polarizasyonu üzerindeki etkilerinin objektif bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef doğrulamadan preklinik değerlendirmeye kadar uzanan keşif sürecine uyum sağlayarak, böbrek hastalığı modellerinde öncü bileşik optimizasyonu ve etki mekanizması çalışmalarına temel teşkil eden immünolojik veriler sunar.
- Keşif Biyolojisi: Fenotipik nicelendirme yoluyla, böbrek hasarındaki makrofaj kaynaklı yolaklar üzerinde hipotez testlerini kolaylaştırır.
- Tarama: Analiz doğrulaması ve bileşik tarama kampanyaları için uygun, tekrarlanabilir ve nicel makrofaj verileri sağlar.
- Analitik: Karşılaştırmalı grup analizine olanak tanıyan çok parametreli akış sitometrisi sonuçları (M1 için CD45+/CD68+/CD86+; M2 için CD45+/CD68+/CD163+) sunar.
- Translasyonel Araştırma: Makrofaj fenotiplemesini, hastalıkla ilgili sistemlerdeki fonksiyonel analizler ve gen ekspresyon profillemeleri ile ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla böbrek hastalığı modeli ve terapötik alanda uygulanabilir, standartlaştırılmış bir immünofenotipleme iş akışı oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hassas fenotipik ayrımı mümkün kılarak makrofaj aracılı böbrek hasarındaki mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Temel akış sitometrisi tesisleriyle uyumlu, standartlaştırılmış ve düşük değişkenliğe sahip makrofaj izolasyonu ve boyama sağlar.
- Stratejik Değer: Hedef modülasyonunu makrofaj polarizasyonundaki ölçülebilir değişimlerle ilişkilendirerek devam/dur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Preklinik modellerdeki makrofaj fenotip modülasyonuna dayanarak, immünomodülatör adayların risk ayarlı önceliklendirmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Akış sitometrisi kompanzasyonu, kapılama (gating) stratejisi ve makrofaj belirteç doğrulaması konularında uzmanlık gerektirir.
- Kollajenaz sindirim ekipmanına ve steril hücre işleme altyapısına erişime bağımlıdır.
- Tekrarlanabilir M1/M2 kantifikasyonu için antikor panellerinin ve floresan kontrollerinin merkezler arasında standardize edilmesini gerektirir.
- Diğer dokulara adaptasyon, disosyasyon enzimlerinin ve belirteç panellerinin optimizasyonunu gerektirebilir.
- Daha kapsamlı fare repertuvarlarına kıyasla, sıçan spesifik makrofaj belirteçlerinin (CD86, CD163) mevcudiyeti ile sınırlıdır.
