Name: Nigral Dopamin Nöronlar somatodendritik Domain hücre içi Patch-kelepçe Kayıtlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Öğrenin dopamin nöronlarının dendritlerinden hücre içi patch-kelepçe kayıtları yapmayı. Bu yöntem, iyon kanallarının alt hücresel düzeyde işlev haritalamasını sağlar ve nörobiyoloji araştırmaları için güvenilir bir temel oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ben konfokal mikroskop, ikinci Axopatch 200B amplifikatör hediye Dr Jacques DESTINE, GIGA-Görüntüleme ile önerileri için yaptığı sürekli destek için Dr. Vincent Seutin, Christelle GILLISSEN ve mükemmel teknik yardım için Laurent Massotte, Dr Jean Defourny ve Sandra Ormenese teşekkür eleştirel yazının okunması için konfokal mikroskop ve Imaris yazılım ve Dr Stephen Freeman paylaşımı için bir platform. Bu çalışma Belçikalı FRS hibe ile desteklenmiştir - FNRS (U.N002.13 ve T.N0015.13) ve Belçikalı Üniversitesi Vakfı&#39;nın desteğiyle (halkla avec le concours de la Fondation Universitaire de Belgique) ile yayınladı.

Yazar o hiçbir rakip mali çıkarlarını sahip olduğunu beyan eder.

Bu rapor ikili somatodendritik tam hücreli kayıtları ve yerel dendritik kayıtları uygulamak için bir adım-adım protokolü açıklanır. Sırasıyla, postsinaptik potansiyeller zamanla iyon kanalları (yani, İH) etkisini belirlemek ve nigral DA nöronların somatodendritik bölgeleri boyunca iyon kanalı (lH) dağılımını haritalama için kullanışlıdır. Elde edilen elektrofizyolojik ölçümler hücre morfolojisi kurtarmak için hoc histokimya göndermek için birleştirilir. Prosedür substantia nigra bulunan DA nöronları araştırmak için kullanıldı, ancak komşu nigral GABA nöronlar, ventral tegmental alan DA nöronları ya da diğer orta beyin nöronları için genelleştirilebilir. Tüm adımlar da önemli değişiklikler olmadan nigral nöronların dendrit ifade diğer iyon kanallarını incelemek için takip edilebilir. Post hoc görselleştirme akson-rulman ile nöronlar için özellikle uygun olduğunuBöyle nigral nöronlar 25,26, hipokampal oriens-alveus internöronlar 21 ya da bazı CA1 piramidal nöronlar 67 olarak dendritler. İlginçtir, bu özelliği paylaşan nöronlar genellikle 67 düşündüğümden daha yaygın olduğu görülüyor. Morfolojik analizi de elektrotlar ve akson kesin konumunu ortaya koymaktadır. Ikinci tespit immünohistokimya 68,69 kullanılarak akson başlangıç çizgi parçasının (voltaj kontrollü, Na + kanal veya Ankirin G) &#39;de ifade edilen proteinlerin etiketlenmesine ile optimize edilebilir. dendritik kayıtları ve sonraki nöronal etiketleme ile toplanan verilerin güvenilirliği her zaman dilim kalitesine bağlıdır. En kusursuz nedenle ihtiyaç doku içindeki hücrelerin canlılığını korumak için uygulanır. Bu dilim hazırlıkları süresince sağlıklı hayvanlardan, yüksek kaliteli araçları ve reaktifler, doku ve buz gibi soğuk sıcaklıklar yeterli oksijenizasyonun nazik işleme ile elde edilir. Kararlı kayıt koşulları sağlıklı nöronların seçimi güveniyor. Bütün hücre modunda, seri direnci, başlangıçta mümkün olduğu kadar düşük olması ve deney boyunca sabit tutulur gerekir. Kayıtların istikrar sürüklenme ve titreşim yoksun yüksek kaliteli manipülatörler hakkında daha fazla bağlıdır. pipet tutucu bağlantısını kontrol ve headstage, mikromanipülatör kabloları gevşek olduğunu kontrol, sıcaklık ya da sahne hareketi ani değişiklikler kaçınarak ve manipülatör mekanizması kontrol: Bu tedirginlikler pipet istikrar optimize ederek azaltılabilir. Çift kayıtlar için, metilsülfat 13,15,21 hücre içi çözelti içinde dahil edilmiştir, ancak glukonat 9,14,25 alternatif olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, temel anyon 70,71 potansiyel membran ve bir voltaja bağımlı akımlar 72 değiştirebilir. Hücre içi çözüm ATP, GTP ve physiolo korumak için phosphocreatine ile takviye edilebilirnöronların jik fonksiyonları. Örneğin, bir basınç uygulama yer için ek olarak, pipet çözeltisi bir floresan boya eklenmesi (örneğin, Alexa 594 veya sülforodamin 101 41) yararlı olabilir somatik kayıt sırasında dendritler görselleştirmek için (Ref Şekil 7. 41) ya da elektrikli bir uyarıcı pipet. Hücre bağlı kayıtları için pipet çözümü büyük bir h kaydetmek için yüksek K + konsantrasyonu ve hiçbir Na + içerir. Kayda Değer Na + / K + konsantrasyon oranı geçerli genliği 10, mevcut 11 ters potansiyeli ve h 73 yolluk etkiler. Alternatif olarak, ben h de dışında-çıkışları 10 kullanılarak kaydedilebilir. Bununla birlikte, bu kayıt yapılandırmada, kanalların yakınında hücre içi ortamı tedirgin olabilir. Sonuç olarak, bir voltaja bağımlı aktivasyonuna farklılıklar &lt;karşılaştıran akımları hücre bağlı yamaları ve dış-çıkışları 10 kullanılarak elde zaman sub&gt; h görülmektedir. Nöronların Şişme bazen yama-kelepçe kayıt sırasında karşılaşılan ve sık sık bu tür çözümlerin bileşiminde çözümler 39 veya hatalar hücre içi ve dışı arasında su kalitesinin düşük, güçlü dengesizlik ozmolarite veya pH gibi farklı nedenlerden kaynaklanan bir. elektrofizyolojik kayıtlar kalitesi iyileşti nöronların morfolojisi kalitesi üzerinde doğrudan bir oranına sahiptir. Hücre içi ortamın 14 seyreltme en aza indirmek için, hücre bağlı kaydından sonra - (sayılı referanslarda 6,11 olarak 10 M?. 6) ve tek bir somatik kayıtlar için yüksek direnç somatik pipetler çift kayıtlar için kullanılır. Hücre bağlı kayıt aşağıdaki bütün hücre somatik kayıt nedenle kısa (&lt;10 dk) tutulur. Somatik ve dendritik iki pipetler-dış plasterlerini c uygun kapama için gerekli olanell membran ve hücre morfolojisi sonraki iyileşme. Hücrenin yapısına ek olarak, nörokimyasal içerik kaydedilir nöronlar 59,74 için tespit edilebilir. Örneğin, hücre içi protein tirosin hidroksilaz DA nöronlarının 13 kesin tanımlanması için immunolabeled edilebilir. DA nöronlar ağırlıklı SN yoğunlaşmıştır SN mevcut çok daha düşük yoğunluğa sahip, pars compactadaki onlar GABA nöronlar 75 daha yüksek bir sayı ile karışmış olan reticulata, pars. DA nöronların hücre gövdesi GABA nöronların genellikle daha büyük olmakla birlikte, kızılötesi-videomikroskopi bu hücrelerin görsel tanımlama belirsiz ve kısmen pars compacta&#39;da opaklık tarafından engellenmektedir. Bu sınırlamaları aşmak için, DA nöronların ön seçim nöronlar (DA nöronlar için TH 65 veya DAT GAD belirli bir popülasyonda bir flüoresan işaretleyici ifade eden transgenik farelerin kullanılması ile kolaylaştırılabilirGABA nöronlar) ve epifloresans aydınlatma. Seçenek olarak ise, bir floresan boya dendritler görselleştirme kolaylaştırmak için somatik elektrot çözelti içinde ilave edilebilir. Floresan hücrenin artan çözünürlük Nipkow dönen disk konfokal 14,22,30 veya IR-DGC 6 kombine iki foton mikroskopi 7 tarafından getirilir. Çeşitli avantajlar DIC göre DGC ile ilgilidir. DIC prizma gerekli değildir Birincisi, IR-DGC görüntü floresan görüntü 49,52,53,76 ile kaplanmış olabilir. İkinci olarak, DGC photostimulation ve 77 optogenetics birleştirilebilir. dilim hazırlık bir dezavantajı, nöronların bütünlüğünü korumaktır. DA nöronlar üç uzamsal düzlemde 78,79 kendi dendrit uzanır ve bu nedenle, dendritik bölmenin kesme tam dilimleri 80 önlenemez. dilim yönelim seçimi (koronal, yatay ya da para) Sagital bir trade-off. innervasyon ve deneysel tasarım kökeni dilimleri doğru yönünü seçmek için dikkate alınmalıdır. Doğrudan dendritik yama hücrelerin farklı bölümlerinde fonksiyonel iyon kanallarının dağılımının haritasının çıkartılması kullanılan bir tekniktir. Buna ek olarak, bu teknik, kanallar 20 işlevsel özelliklerinde değişkenliği belirlemek sunar. Bir tamamlayıcısı olarak iyon kanallarının konumu ve yoğunluğu ışık ve elektronik mikroskopi düzeylerinde 17,23 de immünhistokimya kullanılarak tespit edilebilir. Bu yaklaşım aynı zamanda yama pipetler için erişilemez küçük kalibreli yapılarda kanal yoğunluğunu belirlemek için imkanı sunuyor. Bununla birlikte, bu kanallar patch-clamp tekniği kullanılarak kaydedilen kişilerce kıyasla belirgin bir fonksiyonel durum 24 ya da inaktif olabilir. Her iki teknik konumu ve özellikleri tam bir resmini elde etmek için bu nedenle gereklispesifik hücresel bölgesinin 17 iyon kanalları. Voltaj duyarlı boyaların gelişmesiyle birlikte, gerilim görüntüleme birden çok yerde 81 de AP ve nöronlarda EPSPS yayılmasını incelemek için kullanılır olmuştur. Çift patch-kelepçe kayıtları bir alternatif olarak, bu yaklaşım bile yama pipetler için erişilebilir değildir ama sinyal ve ortalamanın doğru kalibrasyon gerektiren ince dendritler için uygulanabilir. SN ve ventral tegmental alandaki DA nöronlar yaygın fizyolojik ve patofizyolojik bağlamda somatik kayıtları aracılığıyla incelenmiş olmakla birlikte, bunların dendritler fonksiyonel özellikleri her iki durumda da büyük ölçüde bilinmemektedir. Dendritler gelen Yama başarı 13,25,26 ile çeşitli gruplar tarafından nigral dopamin nöronları için uygulanan ve bu güzel hücre içi yapıların 8 heyecanlı özelliklerini incelemek için tercih edilen bir yöntem olmaya devam edilmiştir. Dendritik kayıtları başka bir firsattir sağlamakdilmekte verimliliği ve sinaptik iletim plastisite ve dendritik eksitabiliteye 82,83 plastisite irdelemek.

Nöronlar kendi dendritler ağırlıklı sinaptik bilgi almak. Uyarıcı ve aksiyon potansiyelleri (AP) çıkış sinyali olarak uyarılmış bütünleşme sitesine nesil kendi sitesinden yayılan inhibitör sinaptik sinyalleri. Yolda, sinaptik potansiyeller dendrit yapısı ve pasif ve aktif membran özellikleri arasındaki etkileşim hem etkilenir. Bu son derece değişken parametrelerin kombinasyonu nöronlar 1,2 hesaplama gücünü genişletmektedir. Ancak, dendritler küçük çaplı ancak kendi elektriksel özelliklerinin incelenmesini engellemektedir. 6,7 dendritlerindeki - (3 mikron Ø 0.7) patch-kelepçe tekniği 3 sürekli gelişim, son yıllarda optik 4 ve dilim hazırlama 5 için yöntemler arıtma çok ince kayıtları sağlamıştır. Bu yöntemler vardı ve hala büyük ölçüde çeşitli o içinde dendritler heyecanlanma incelemek için kullanılırf nöronlar 8. Doğrudan dendritik kayıtları fonksiyonel özellikleri farklı nöronal bölümlerinde iyon kanallarının 20-22 dağılım 9-19 ve farklılıkları belirlemek için gereklidir. Bu veriler, ışık ve elektron mikroskobu 23,24 kombine immünhistokimya ile tespit edilen iyon kanal dağılımlarının gerekli bir tamamlayıcıdır. Çift somatodendritik kayıtları detaylı pasif kablo modelleri, aksiyon potansiyeli 9,13-15,21,22,25-27 ve nöronların somatodendritik etki boyunca sinaptik potansiyellerin 13,16,18 yayılması yayılmasını keşfetmek elde etmek için uygulanmaktadır 28- 30 ve nöronal entegrasyon 31 zamansal çözünürlüğe araştırmak. substantia nigra (SN) gibi hareketin kontrolü, ödül ve alışılmış davranışları kodlama gibi çeşitli fonksiyonlar yer alan orta beyinde yer alan bir bölgedir. Belirli nedeniyle dopamin azalmaSN dopaminerjik (DA) nöron kaybı, Parkinson hastalığı 32 mustarip hastalarda gözlenen motor bozuklukları ile bağlantılıdır. dopaminerjik ve GABAerjik nöronlar: nigral devresi iki hücre tipinde oluşmaktadır. İlginçtir, bu nöronlar diğer nöronlardan ayırt birçok özgü özellikleri vardır. DA nöronlar ve bazı GABA nöronların büyük bir bölümünün akson dendritik çardak heterojen (akson taşıyan ve akson-eksik dendritler) 25,26,33 olduğunu belirten bir dendritik sitesinden kaynaklanır. Soma kadar, dendritler başlayarak ve son olarak 34 akson için: bu nöronların morfolojisi bilgi aktarımı dinamik Cajal yaydığı kutuplaşma yasasını takip ettiği nöronların tipik organizasyonu ile bu nedenle tezat. DA nöronlar, aynı zamanda, kendi dendritler 35 dopamin serbest patlama aktivitesi 36 ve NMDA reseptörü plastisite 37 neden olduğu bilinmektedir. dissecBu olayların tion onlar başlatılan sitesinden doğrudan kayıtları olmadan zor olduğunu. hassas konum ve iyon kanallarının fonksiyonel özellikleri ve nigral nöronlar dendritik heyecanlanma ve bilgi transferi rollerine arasındaki ilişki içine anlayışlar kazanmak için, doğrudan dendritik kayıtlar tercih edilen yöntem vardır. Bu rapor nigral nöronların dendrit ve ilgili post hoc biocytin etiketleme tek ve çift yama-kelepçe kayıtları elde etmek için kullanılabilir detaylı yordam açıklanır. somatik ve dendritik membran yama için temel ilkeler çok benzer. Pratikte, ancak dendritik sitelerden kayıtları somatik kayıtları karşılaştırıldığında özel optimizasyon gerektirir. Başarılı dendritik kayıtları dilimleri, optik optimal ayarı, kayıtların yama pipet ve istikrar nazik yaklaşımı kalitesine güveniyor.

<table><tbody><tr><td>Çift damıtılmış su</td><td>Millipore</td><td>Süper Q</td><td>Rezistivite >14 M & Omega; cm, ideal 18.2 M & Omega; 25&nbsp'de cm; &deg; C, filtrelenmiş (0.22 & mikro; m), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760</td></tr><tr><td>Mikrofiltre mumları</td><td>Robu</td><td>Gözeneklilik 3, 6 mm veya 13 mm çap</td><td></td></tr><tr><td>Vibroproblu doku dilimleyici</td><td>Leica</td><td>VT1200</td><td>kesme parametreleri: hız 0.07, genlik 1.40</td></tr><tr><td>Doku dilimleyici</td><td>Dosaka</td><td>DTK-1000</td><td>kesme parametreleri: hız 4, frekans 7</td></tr><tr><td>Tıraş bıçağı</td><td>Gilette</td><td>Süper Gümüş</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon aletleri</td><td>Braun, Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rezerv odası</td><td></td><td></td><td>Ismarlama</td></tr><tr><td>PP beckers</td><td>VWR</td><td>213-1725</td><td>400 ml</td></tr><tr><td>Şırınga filtresi</td><td>Merk Millipore</td><td>Millex - GV 0.22 & m</td><td></td></tr><tr><td>Siyanoakrilat yapıştırıcı&nbsp;</td><td>UHU</td><td>"Sekunden Kleber"</td> <td>sıvı tutkal</td></tr><tr><td>Kayıt odası&nbsp;</td><td>Luigs & Neumann</td><td>Slice mini hazne</td><td></td></tr><tr><td>Yatay pipet çektirme Sutter</td><td>Aletleri</td><td>Kahverengi Alevli P-97</td><td></td></tr><tr><td>Pipetler</td><td>Hilgenberg</td><td>1807524</td><td>2 mm OD/1 mm iç çap cam kılcal damarlar, uçları ateşle parlatılmış, yıkanmış</td></tr><tr><td>Diş mumu</td><td>Colt&egrave; ne/Whaledent</td><td></td><td>ortodontik tepsi balmumu şeritleri</td></tr><tr><td>Kayıt odasında dilimleri sabitlemek için platin ızgara</td><td></td><td></td><td></td>, özel olarak platin disk ile üretilmiştir</tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>pipet uçlarını ateşlemek için</td></tr><tr><td>Potasyum metil sülfat</td><td>MP Biyomedikal 215481</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biyosit</td><td>Moleküler problar</td><td>B1592</td><td></td></tr><tr><td>Manometre</td><td>GREISINGER elektronik</td><td>GDH 13 AN</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>FS</td><td></td></tr><tr><td>Dodt Gradyan Kontrast</td><td>Luigs & Neumann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manipülatörleri</td><td>Luigs & Neumann</td><td>LN Mini 25</td><td></td></tr><tr><td>Çerçeve yakalayıcı</td><td>Görüntüleme Kaynağı</td><td>DFG/USB2pro</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>DAGE-MTI</td><td>NC-70</td><td></td></tr><tr><td>Kondenser</td><td>Zeiss</td><td></td><td>yağ ile çalışan yüksek sayısal açıklıklı kondansatör</td></tr><tr><td>Objektif</td><td>Zeiss</td><td>W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR</td><td>63X büyütme, uzun mesafe, yüksek sayısal diyafram 1.0 suya daldırma </td></tr><tr><td>Objektif Dört kat değiştirici</td><td>Luigs & Neumann</td><td></td><td>kamera ve mikroskop arasında</td></tr><tr><td>Siyah beyaz video monitörü</td><td>Sony</td><td>SSM-175CE</td><td>16 inç, 850 TV satırı, analog</td></tr><tr><td>Numune Şişeleri, Amber Cam, Kapaklı</td><td>VWR</td><td>215-2409</td><td>Dilimleri kurulumdan histoloji odasına aktarmak için</td></tr><tr><td>Akson Kılavuzu</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td>Kitabı</td></tr><tr><td>Stimfit</td><td>https://github.com/neurodroid/stimfit</td><td></td><td>Elektrofizyolojik verilerin analizi</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma</td><td>441244</td> kullanmadan <td>önce GÜVENLİK BİLGİ FORMU ve Tehlikeli Maddeler Direktifine (AB) bakın</td></tr><tr>Sabit <td>dilimlerin boyanması için</td><td>kuyu hücre kültürü plakası</td><td>Greiner-Bio-One</td><td>662160</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merk</td><td>108643</td> kullanmadan <td>önce</td></tr> <tr><td>GÜVENLİK BİLGİ FORMU ve Tehlikeli Maddeler Direktifine (AB) bakınfare anti-TH monoklonal birincil</td><td>Immunostar</td><td>22941</td><td>çalışma konsantrasyonu: 1 / 1.000</td></tr><tr><td>keçi anti-fare ikincil antikoru - Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen - Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11031</td><td>Çalışma konsantrasyonu: 1/500</td></tr><tr><td>Normal keçi serumu</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Elmas Antifade</td><td>Moleküler Problar - Thermo Fisher Scientific</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>Floresein Avidin DCS Vektör</td><td>Laboratuvarı</td><td>A-2011</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>NeuronJ</td><td>http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</td><td></td> <td>ImageJ</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>http://www.bitplane.com</td><td></td> için eklenti <td>Biyosit dolu nöronların rekonstrüksiyonu</td></tr><tr><td>Nöroromantik</td><td>http://www.reading.ac.uk/neuromantic/</td><td></td> <td>Biyosit dolu nöronların rekonstrüksiyonu</td></tr><tr><td>WinWCP</td><td>http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm</td><td></td><td>Elektrofizyolojik verilerin analizi</td></tr></tbody></table>

nigral dopamin nöronlar somatodendritik domain hücre içi patch-kelepçe kayıtlar

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

dopaminerjik nöronların Dendritler almak ve sinaptik girdi, destek aksiyon potansiyeli geri yayılma ve nörotransmitter salınımını iletmek. Bu temel işlevleri anlaşılması bu nöronların bilgi aktarımı ışık tutacaktır. Dendritik patch-kelepçe kayıtları doğrudan dendritler ve altta yatan voltaj kapılı iyon kanallarının elektriksel özelliklerini incelemek imkanı sağlamaktadır. Ancak, bu ince yapılar nedeniyle küçük çaplı yama pipetler kolayca erişilebilir değildir. Bu rapor, akut dilim dopaminerjik nöronların dendrit gelen istikrarlı ve güvenilir kayıtları toplamak için bir adım-adım prosedürü anlatılmaktadır. Elektrofizyolojik ölçümler hücre morfolojisi post hoc geri kazanımı ile bir araya getirilmektedir. Başarılı deneyler dilimleri, çözümleri ve pipetler, kaydedilen yapısı ile temas halinde optik ve pipet istikrar yeterli uyum gelişmiş hazırlık güveniyor. som standart ilkeleriatic yama-kelepçe kayıt dendritler ama pipetle bir yumuşak bir yaklaşım ile uygulanır. Bu çok yönlü teknikler dendritler telaşlı özellikleri hakkında çeşitli soruları için uygulanabilir.

Yukarıda açıklanan protokol dendritik yama-kelepçe kayıtları kullanılarak verilerin toplanmasını kolaylaştırmak niyetinde. Post hoc Histokimyanın ile birlikte bu teknik, köken ya da dendrit içine yayılan birçok elektrik sinyallerine mekanizmaları içgörü kazanmak için yardımcı olur. yama pipetler ile dendritler doğrudan erişim zordur, ama birkaç metodolojik açıdan özel önem kayıtları başarı oranını artıracaktır. yeterince stabil somatik kayıt konusunda deneyimli bir deneyci girişimleri en yüksek direnç (GΩ) mühürler ve tam deneyler elde bekleyebilirsiniz. İki yüksek kaliteli dendritik kayıtlar için bir diseksiyon başına toplanabilir. Sağlıklı somata ve dendritler içeren yüksek kaliteli beyin dilimleri durumu bu ince yapılar (Şekil 1) erişmek için bir ön koşuldur. ölçülereBu nöronlar seçmek için bir bütün hücre ve optimum ayarlanmış optik ile gözlenen düşük kontrastlı bir soma ve dendritler üzerinde pürüzsüz ve homojen bir yüzey vardır (Şekil 1A ve 1B). Seçme nöronlar çok güçlü genel tezat stabil olmayan kayıtlar (Şekil 1C ve 1C) yol açar. Bu nedenle bu tür nöronlar kaçınılmalıdır. diğer nöronlara karşılaştırıldığında, nigral DA nöronlar belirli morfolojik ve elektrofizyolojik özellikler göstermektedir. Genellikle tek bir somatik pipet ile değerlendirilen bu özellikler aynı zamanda çift somatik (Şekil 2) ve somatodendritik kayıtları (Şekil 3) görülebilir. Uzun hiperpolarizan akım enjeksiyonları (Şekil 2B ve 5D) &#39;sarkma&#39; olarak adlandırılan bir membran potansiyeli düzeltme neden olur. tanımlandığı şekilde akson bir dendritik sitede, çoğu durumda, kaynaklanırBu nöronların dendritik bölmesi heterojen olduğunu gösteren, tamamlayıcı kriterleri 13,25,26 ile (Şekil 3A - 3B). 13,25,26 - bir sonucu olarak, AP ilk görülmektedir bölmesi akson (3D Şekil 3C) çıktığı kompartıman karşılık gelir. Akson genellikle 64 dilimleme sırasında akson bir kesme neden bir akson bleb ile sona erer, ancak bu yapı sistemli algılanmaz. Arka arkaya Ih aktivasyonuna nigral DA nöronlarının gözlenen belirgin sarkma HCN alt biriminden oluşan bir yüksek ifade etmektedir. Sinaptik sinyallerin entegrasyonu ben h etkisini belirlemek için, sinaptik benzeri akım (EPSC) dalga şekilleri oluşturulur ve somatodendritik çift kayıtları 55 (&lt;esnasında dendritik kayıt elektrot aracılığıyla enjekte edildistrong&gt; Şekil 4). Bu simüle EPSCs kinetiği gerçek spontan EPSCs yükselişi ve çürüme zaman sabitleri dayanmaktadır. Elde edilen aEPSP somatik elektrot ile kaydedildi. Ih bloke edici ZD 7288 Banyo uygulaması sinaptik sinyallerin (Şekil 4B) zaman seyrine Ih katkısını göstermektedir aEPSP süresini uzatmıştır. ZD 7288 teyit membran potansiyeli düzeltme kaldırması da Ih aktivasyonu (Şekil 4C) için sarkma oluşur. Simüle EPSPS ile elde edilen sonuçlar elektrik uyarılmış EPSPS 65 kullanıldığı deneylerde korele edilebilir. DA nöronların somatodendritik etki kanalın hassas dağılımı eşlemek için, hücreye bağlı kayıtları (Şekil 5) uygulanmıştır. Bir yüksek dirençli mühür (&gt;&gt; 1 GΩ) (Şekil 5B hücre bağlı kayıtlar için mutlak bir zorunluluktur </strong&gt;). DA nöronlarının dendritler, ben h uzun hiperpolarizan gerilim adımlarla yavaş yavaş harekete geçirir ve daha önce 66 gösterildiği gibi mevcut kararlı durum, ms (Şekil 5C) yüzlerce sonra elde edilir. Bu gözlem, DA nöronlarının dendritleri ifade HCN kanalları, piramidal nöronlar ya da diğer hücre tipleri 10,16,66 olanlara kıyasla, farklı alt birimlerine sahip olduğunu gösterir. Kanalın dağılımı dendritik bölmesinde homojen olmayan olabilir ve As dendritik bölmesi kendisi heterojen olduğu gibi, dendrit (akson taşıyan veya nonaxon taşıyan dendrit) kimlik konfokal görüntü ile IR-DGC görüntü karşılaştırarak ortaya biocytin boyama (Şekil 3A ve B) uygulanmasından sonra. hücre morfolojisi geri kazanılması da, çift somatodendritik kayıtlar için ve takip eden somatik bütün hücre kayıtları yoluyla hücre-bağlı kayıtlar için gereklidir. Kızılötesi videomikroskopi kullanarak nigral dopaminerjik nöronlar Soma ve Proksimal dendritler görselleştirme Şekil 1.. Soma ve proksimal dendrit hem somatik ve dendritik pipetler gösteren bir nigral DA nöronun (A) IR-DGC görüntü. Bir çift somatodendritik kayıt başarıyla bu sağlıklı nöron üzerinde gerçekleştirildi. Tüm hücrenin somatodendritik etki üzerinde düşük kontrast ve düzgün bir yüzey gözlemleyin. (B) sağlıklı DA nöron bir başka örneği. (C) DA nöron bir kaba ve pürüzlü yüzey ve daha güçlü bir kontrasta sahip. Çift bir kayıt elde edilmiş olsa da, her iki yüzünden pipetler de erişim direnci, tedrici artışına yol (~ 15 dakika) stabilite suboptimal ve kayıt süresi kısa olmuştur. (D) gösteren bir DA nöron İkinci örnek, yüksek kontrastlı soma ve proksimal dendrit. Bu durumda, erişim direnci güçlü bir artış bütün hücre modunda arası kısa bir süre sonra gözlenmiştir. negatif basınç erişim direncini azaltmak için bir girişimi başarısız oldu. Panel C ve D nöronlar dilimleme işlemi sırasında zarar görmüş olabilir ve deneyler için kaçınılmalıdır. (E) kaydın başında sağlıklı DA nöron Eşzamanlı çift somatik kayıt. (F) panel E aynı nöron ~ 17 dakika sonra bir şişmiş hücre gövdesi. Aksine tam olmadığına dikkat edin, soma top benzeri bir görünüm ve sağlıklı nöronlar açık değildir büyük çekirdeğinin varlığı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig2.jpg" /> Şekil 2. </strong&gt; Eşzamanlı Çift somatik bir DA Neuron kayıt yapılması. DA nöron çift somatik kayıt sırasında (A) IR-DGC görüntü. (B) hiperpolarizan ve 1 s uzun akım enjeksiyonları depolarizan (-160 pA 80, pA 80 artırmak) ve ilgili gerilim değişimleri hem yama pipetler ile eş zamanlı olarak kaydedilir. Depolarize akım darbesi sırasında uzun hiperpolarizan akım adım ve AP sonra sonrası hiperpolarizasyon büyük gerilim izleme sarkma varlığını unutmayın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54601/54601fig3.jpg" /> Şekil 3. DA Neuron Çift S omatodendritic Kaydı. (A) DA nöron IR-DGC görüntü. dendritik ve soma arasındaki mesafetlc pipet flöresin izotiyosiyanat (FITC) ile konjuge avidin ile işaretlenmiş Panel A&#39;daki nöron 29 um. (B) Konfokal z projeksiyon görüntüsü. nöron kayıt sırasında biocytin ile doluydu. Akson okla gösterildiği gibi soma yakın bir yakın dendrit kaynaklandı. Soma (siyah gerilim izleri) ve dendrit kaydedilen paneli A. AP nöron (C) Eşzamanlı çift somatodendritik tüm hücre voltaj kayıt (kırmızı gerilimi siyah akım iz) ve sağ alternatif olarak dendritik pipet (;, somatik (sol üzerinden 1 s uzun akım enjeksiyon aşamasında yanıt izleri) kırmızı akım iz) (D) Somatik ve dendritik AP genişletilmiş zaman ölçeğinde gösterilen.. somatik veya dendritik akım enjeksiyon ile ya somatik AP (siyah) dendritik AP (kırmızı) öncesinde. Bu nöron AP arasındaki gecikme 120 us ve sırasıyla somatik ve dendritik akım enjeksiyonu, 210 us oldu. gecikmelerAP yükselen aşamasında AP yarı-maksimum genlik ölçüldü. AP akson önceki gözlemleri 25,26 teyit ortaya çıktığı yakın bölmeye ilk gözlenmektedir. Bu durumda, dendritik kaydı bir akson-eksik dendrit yapılır. Bir akson taşıyan dendrit Ref olduğu bir kaydın bir örneği. 13 (onların Şekil. 1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54601/54601fig4.jpg" /> DA Nöronlar somatodendritik Eksen boyunca Yapay EPSPS Şekil 4. Yayılım. (A) da nöron IR DGC görüntüsü. dendritik ve somatik pipet arasındaki mesafe 45 mm. Her iki yama pipetler tüm hücre akım kelepçe kayıt modunda bulunmaktadır. (B) Cariakım kelepçe dendritik pipet ile kaydedilir ve yapay EPSP (üst) oluşturmak için kullanılır. Geçerli bir EPSC gibi dalga enjeksiyonu ile elde edilir (; τ çürüme = 3 ms; τ yükselişi = 0.6 ms genlik = 100 Pa) dendritik kayıt pipet 55 üzerinden. (; Kırmızı iz 30 iM) alt kısmında, kontrol koşulları (siyah) olarak soma kaydedildi aEPSPs propagandası ve h bloker ZD7288 ve banyo uygulamasından sonra. Her gerilim iz 40 tek süpürür ortalamasıdır. 30 mcM ZD 7288 uygulanmasından sonra (kontrol koşullarında (siyah) soma kaydedilen izleri Gerilim. (C) EPSPS zaman tabii ben h katkısını gösteren ZD7288 varlığında EPSP süresi büyük bir artış gözlemlemek ve uzun (30 pA yanıt kırmızı); 1 ler) hiperpolarizan mevcut adım. I &lt;tıkanması sonra membran potansiyeli düzeltme (sarkma) olmadığına dikkatsub&gt; h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54601/54601fig5.jpg" /> DA Neuron ve Dendritler ben h Şekil 5. varlığı. Proksimal dendrit bir DA nöron ve pipet (A) IR-DGC görüntü. (B) hücre bağlı konfigürasyonda bir 5 mV gerilim komutu esnasında Kapasitif ve kaçak akımları. Conta direnci bu örnekte 5 GΩ olarak (C), hiperpolarize bir gerilim., MV yavaş aktive Ih neden 0 membran potansiyelinden (90 mV üst). Geçerli iz ters ve τ = 632 ms&#39;lik bir zaman sabitini veren tek üstel fonksiyonu ile donatılmış. (D) Gerilim1 s hiper bütün hücre kaydedilen soma (panel A) yanıtları ve depolarize akım darbeleri (120 pA için -160, 40 pA artış). somatik tam hücreli kayıt hücre bağlı kayıttan sonra yapıldı. Nedeniyle hücre bağlı kayıt sırasında kendiliğinden ateş bastırmak için TTX ve Cd 2+ dışı uygulama AP olmadığına dikkat edin. Bu voltaj kapılı Na + ve Ca2 + mevcut blokerlerinin akımlarını bastırmak ilave edildi. Paneller A - D aynı nöron vardır başka DA nöron ve dendritik pipet (E) IR-DIC görüntü -120 mV bir 50 ms prepulse 0 mV bir test darbesi ile aktive (F) Gerilim-bağımlı akımlar.. Panel E. Holding nöron proksimal dendrit potansiyeli -80 mV eksize bir dış çıkış yama. Akımın zamana bağlı inaktivasyonunu unutmayın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig5large.jpg" target="_blank">Bir büyük görmek için tıklayınız</a>Bu rakamın sürümü. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Madde </td><td> g / mol </td><td> konsantrasyon </td><td> 1 L </td></tr><tr><td> NaCI </td><td> 58,443 </td><td> 125 mM </td><td> 7,305 g </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 84,007 </td><td> 25 mM </td><td> 2.100 gr </td></tr><tr><td> KCI </td><td> 74,551 </td><td> 2.5 mM </td><td> 0.186 g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 137,99 </td><td> 1.25 mM </td><td> 0.172 g </td></tr><tr><td> glikoz </td><td> 198,17 </td><td> 25 mM </td><td> 4.95 g </td></tr><tr><td> MgCI2 </td><td> (1 M çözelti) </td><td> 1 mM </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> (1 M çözelti) </td><td> 2 mM </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolarite: ~ 310 mOsmol / L (optimum aralık: 314-325 mOsmol / L) pH = 7.4 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: yapay serebrospinal akışkan (ACSF). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Madde </td><td> g / mol </td><td> konsantrasyon </td><td> 1 L </td></tr><tr><td> NaCI </td><td> 58,443 </td><td> 87 mM </td><td> 5,084 g </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 84,007 </td><td> 25 mM </td><td> 2,1001 g </td></tr><tr><td> KCI </td><td> 7,551 </td><td> 2.5 mM </td><td> 0,18637 g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 137,99 </td><td> 1.25 mM </td><td> 0,17248 g </td></tr><tr><td> MgCI2 </td><td> (1 M çözelti) </td><td> 7 mM </td><td> 7 ml </td></tr><tr><td> glikoz </td><td> 198,17 </td><td> 10 mM </td><td> 1,9817 g &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> sakaroz </td><td> 342,29 </td><td> 75 mM </td><td> 25,672 g </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> (1 M çözelti) </td><td> 0.5 mM </td><td> 0.5 mL </td></tr><tr><td colspan="4"> Ozmolarite: ~ 326 mOsmol / l, pH = 7.4 </td></tr></tbody></table> Tablo 2: Sakaroz-ACSF dilimleri hazırlamak. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Madde </td><td> g / mol </td><td> konsantrasyon </td><td> 100 mL&#39;lik </td></tr><tr><td> KMeSO 4 </td><td> 150.2 </td><td> 120 mM </td><td> 1,8024 g </td></tr><tr><td> KCI </td><td> 74,56 </td><td> 20 mM </td><td> 0,14912 g </td></tr><tr><td> MgCI2 </td><td> (1 M çözelti) </td><td> 2 mM </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> Na 2 ATP </td><td> 551.1 </td><td> 2 mM </td><td> 0,1102 g </td></tr><tr><td> Na 2 GTP </td><td> 523,2 </td><td> 0.5 mM </td><td> 0,02661 g </td></tr><tr><td> Na 2 -Phosphocreatine </td><td> 255,1 </td><td> 5 mM </td><td> 0,1275 g </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 380,4 </td><td> 0.1 mM </td><td> 3,803 mg </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 238,31 </td><td> 10 mM </td><td> 0,23831 g </td></tr><tr><td> Biocytin </td><td> 1 mg / ml </td><td></td><td> 0.1 gr </td></tr><tr><td colspan="4"> Ozmolarite: ~ 302 mOsmol / l, pH = 7.2, KOH ile ayarlanmış </td></tr></tbody></table> Tablo 3: Çift kayıtlar için hücre içi bir çözüm. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Madde </td><td> g / mol </td><td> konsantrasyon </td><td> 100 içinmL </td></tr><tr><td> KCI </td><td> 74,56 </td><td> 120 mM </td><td> 0,8947 g </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> (1 M çözelti) </td><td> 2 mM </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> MgCI2 </td><td> (1 M çözelti) </td><td> 1 mM </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 238,31 </td><td> 10 mM </td><td> 0,23831 </td></tr><tr><td> TEA-CI </td><td> 165.7 </td><td> 20 mM </td><td> 0,3314 g </td></tr><tr><td> 4-AP </td><td> 94,11 </td><td> 5 mM </td><td> 0,04705 g </td></tr><tr><td> BaCl 2 </td><td> 244,26 </td><td> 1 mM </td><td> 0,02443 g </td></tr><tr><td> CDC 2 </td><td> 183,32 </td><td> 0.02 mM </td><td> 0,3666 mg </td></tr><tr><td> TTX </td><td> 1 mM </td><td> 200 nM </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolarite: ~ 290 mOsmol / L, D-glikoz (Ref 16). Ile ayarlanabilir; pH = 7.4 </td></tr></tbody></table> Tablo 4: Hücre bağlı kayıtları için elektrot çözüm.

Hücre altı yama-klemp kayıtları, dendritlerin fonksiyonel özelliklerini araştırma imkanı sunar. Ancak bu ince yapılara küçük çapları nedeniyle kolayca erişilememektedir. Burada açıklanan protokol, dopamin nöronlarının dendritlerinden in vitro dilimler halinde kararlı ve güvenilir kayıtların toplanmasını kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.

Nigral Dopamin Nöronlar somatodendritik Domain hücre içi Patch-kelepçe Kayıtlar

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Bu yöntem, tekil voltaj bağımlı iyon kanallarının belirli bir nöronun fonksiyonlarına nasıl katkıda bulunduğu gibi nörobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, iyon kanallarının fonksiyonlarının nöronlarda hücresel alt düzeyde haritalandırılmasına olanak tanımasıdır. Bu prosedüre, beyni alt kısmı bir SiliGuard tabakasıyla kaplanmış 9 santimetrelik bir petri kabına yerleştirerek başlayın.Ardından, beyni buz soğukluğunda sakroz-ACSF ile çevreleyin. Koronal kesitler hazırlamak için, serebellumu ve beynin rostral kısmını çıkarmak amacıyla iki kesi yapın. Daha sonra, numune tepsisine siyanoakrilat yapıştırıcı sürün ve beyin bloğunu, rostral kısmı kesme aşamasına bakacak şekilde tepsiye yapıştırın.Ardından, beynin üzerine birkaç damla sükroz-ACSF uygulayın ve tepsiyi yavaşça kesim haznesine daldırın. Sonrasında, jiletin açısını yatay düzleme göre 15 dereceye ayarlayın. Substantia nigra'ya ulaşmadan önce, cottle nazal yönünde yaklaşık 500 micrometers kalınlığında koronal beyin kesitleri alın.Ardından, ilgi bölgesini içeren 300 mikrometrelik kesitler almak için kalınlığı ayarlayın. Kesitleri, bir şırıngaya bağlı çok ince bir perforasyon iğnesi ile jiletin kenarına paralel olacak şekilde doku bloğundan ayırın. Bunun ardından, kesitleri bir saat boyunca 34 °C'deki rezerv haznesine aktarın.Bu prosedürde, bir beyin kesitini kayıt odasına aktarın. Kesiti, platin bir halka ile kayıt odasının tabanına sabitleyin ve kesitin pürüzsüz, düzgün bir yüzeye sahip kaliteli bir örnek olduğundan emin olun. Ardından, aynı düzlemde uzun bir mesafe boyunca uzanan dendriti olan bir nöron seçin ve ilgili dendritin belirgin bir somaya kadar takip edilebildiğinden emin olun.Ardından, patch pipetini elektrot çözeltisiyle doldurun. Hücre bağlantılı modda (cell-attached mode) dendriti yakalamak için, dendritin bir bölümünü belirleyin ve ona odaklanın. Pipete pozitif basınç uygulayın ve mikro manipülatörü kullanarak pipeti aşağı indirin.Ardından pipeti membrana yaklaştırın ve küçük bir çukur oluşturmak için basıncı ayarlayın. Sonrasında, pipet direncini kontrol ederek pipet ucundaki basıncı serbest bırakın ve dendriti yamayın. Hücreye bağlı (cell-attached) kayıtlar için bir gigaohm'dan büyük, ideal olarak üç ila on gigaohm arasında bir sızdırmazlık direnci elde etmeye çalışın.Ardından, dendritin deformasyonunu önlemek için pipeti membrandan birkaç mikrometre geri çekin. Burada görülen aksiyon akımları, nigral nöronların spontan aksiyon potansiyellerini temsil eder. Aksiyon akımlarını baskılamak için ACSF'ye kalsiyum ve sodyum kanal blokörleri ekleyin.Ardından, hiperpolarizasyonla aktive olan katyon akımını uyandırmak için sıfır milivoltluk bir tutma potansiyelinden 90 milivoltluk bir voltaj basamağı uygulayın. Kaydın sonunda, tüm hücre moduna geçmek için yamayı patlatın. Bundan sonra, dışa-açık (outside-out) bir yama elde etmek için dendritik pipeti nöronal membrandan yavaşça ve nazikçe geri çekin.Whole-cell modunda ilgili somadan kayıt almak için, dendritin karşılık geldiği somayı bulun. Beş ila on megaohm arası dirence sahip ve potasyum bazlı bir hücre içi çözelti içeren pipeti hücre gövdesine indirin. Ardından, whole-cell moduna geçmek için membranı yırtmak amacıyla pipet ucuna kısa süreli bir negatif basınç uygulayın.Uzun hiperpolarize ve depolarize akım basamakları uygulayarak current-clamp modunda nöronun kimliğini kontrol edin ve pipetteki biyositinin dendritler boyunca yayılmasına izin verin. 10 dakika sonra, outside-out patch elde etmek için pipeti geri çekin. Pipet dilimin üzerine çıktığında, kayıt haznesinden tamamen çıkmak için hücrele membranının düzgün şekilde kapanmasını sağlamak amacıyla bir dizi kısa lateral yukarı doğru hareket uygulayın.Biyositin ve kaydedilen nöronun dengelenmesini sağlamak için kesiti standart ACSF içinde kayıt odasında 15 dakika daha tutun. Ardından kesiti, histoloji için standart ACSF içeren 25 mililitrelik kehribar rengi cam bir şişeye nazikçe aktarın. Bu prosedürde, floresan işaretli nöronun kesit içindeki yaklaşık yerini epifloresans ile belirleyin.10X objektif kullanarak nöronların dendritik arborunu kısaca inceleyin; aksonu ve aksonal blebi konumlandırın. Ardından konfokal mikroskoba geçin ve etiketli nöronu uyarmak için 488 nanometre lazer diyodu seçin. Akson ve dendritlerin Z eksenindeki uzanımını takip edin ve tüm hücre için bir Z yığını elde etmek amacıyla ardışık görüntüler kaydedin.Z ekseninin çözünürlüğünü ayarlayın ve hücrenin düşük ve yüksek büyütmedeki konfokal görüntülerini toplayın. Sonunda, nörona ait görüntü dosyasını bir görüntüleme yazılımıyla açın. Elektrofizyolojik kayıt sırasında patch pipetin kesin konumunu belirlemek için Z projeksiyon görüntüsünü bir IR-DGC görüntüsü ile gözle karşılaştırın.Burada, bir dopamin nöronunun IR-DGC görüntüsü ve proksimal dendrit üzerindeki bir pipet gösterilmektedir. Akım izi, hücreye bağlı (cell-attached) konfigürasyonda, beş gigaohm'luk mühür direnciyle, beş milivoltluk bir voltaj komutuna yanıt olarak EN sızıntı akımlarının kapasitesini göstermektedir. Sıfır milivoltlık bir membran potansiyelinden uygulanan hiperpolarize edici voltaj basamağı, yavaş aktive olan hiperpolarizasyonla aktive edilmiş bir katyon akımıyı tetiklemiştir.Mevcut iz tersine çevrildi ve tekli üstel fonksiyonla uyduruldu, bu da 632 milisaniyelik bir zaman sabiti verdi. Burada, hücre yapışık kayıt sırasında aksiyon potansiyellerini ortadan kaldırmak amacıyla voltaj kapılı sodyum ve kalsiyum akım blokörleri varlığında, somadan kaydedilen tüm hücrenin bir saniyelik hiperpolarize ve depolarize akım palslarına verdiği voltaj yanıtları yer almaktadır. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde yürütülürse bir günde tamamlanabilir.Bu prosedürü uygularken, sağlıklı doku elde etmenin ve kararlı kayıt koşullarını sağlamanın önemli olduğunu unutmamak gerekir. Kaydedilen nöronun kimliği gibi ek soruları yanıtlamak için bu prosedürün ardından immünohistokimya gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, geliştirilmesinin ardından, nörofizyoloji alanındaki araştırmacıların uyarılabilir hücrelerdeki voltaj kapılı iyon kanallarının özelliklerinin işlevini ve rolünü keşfetmelerinin yolunu açmıştır.Bu videoyu izledikten sonra, dendritlerdeki voltaj kapılı iyon kanalları üzerinden akan akımların dağılımının nasıl kaydedileceği ve inceleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

subcellular-patch-clamp-recordings-from-somatodendritic-domain-nigral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, sıçan beyin dilim tam hücre yapılandırması kaydedilen bir dopaminerjik nöron içine iletkenliği nasıl uygulanacağını göstermektedir. Bu teknik, dinamik kelepçe denir.

Dinamik Kelepçe Tekniği ile Sıçan orta beyin dopaminerjik nöronlar NMDA Reseptör İletkenlik Uygulama

Amperometrik tekniği spontan dopamin oksitlenmeye tarafından üretilen oksidatif akımı algılayarak tek bir hücreden dopamin salınımını ölçer. Eşzamanlı gerilim kelepçe ve amperometri metodolojisi dopamin taşıyıcısı ve dopamin ters taşıma Bu faaliyetin düzenleyici rolünün genel "faaliyet" arasındaki mekanistik ilişki bulunmaktadır.

Eşzamanlı Gerilim-kelepçe ve Amperometri ile Dopamin Film Tek Hücre Ölçümü

Bu video, dendritik membran yüzeyinden yama kelepçesi kaydı için bir tekniği göstermektedir. Bu, dopaminerjik nöronlardaki dendritlerin ve altta yatan voltaj kapılı iyon kanallarının elektriksel özelliklerini doğrudan incelemeye yardımcı olur.

Bir Beyin Dilimindeki Dopaminerjik Nöronun Dendritinden Yama-Kelepçe Kayıtları

Bu video, nöron ateşleme modellerini analiz etmek için tam hücre yama-klemp tekniklerini kullanarak omurilik dilimlerinin substantia gelatinosa (SG) nöronlarında elektrofizyolojik kayıtlar gerçekleştirme prosedürünü göstermektedir. Bu yöntem, omuriliğin SG nöronlarındaki uyaranlara verilen sinirsel tepkilerin incelenmesine izin verir.

Bir omurilik diliminin substantia jelatinosa nöronunda tam hücre yama kelepçesi kaydı

Bu video, reobaz ve membran potansiyelini ölçmek için yama kelepçesi tekniği kullanılarak dorsal kök gangliyonlarındaki duyusal nöron uyarılabilirliğinin incelenmesini ve nöronların artımlı akım enjeksiyonlarına tepkilerini analiz etmeyi göstermektedir.

Sağlam Sıçan Dorsal Kök Gangliyonlarında Tüm Hücre Yama Kelepçesi Kayıtları

Burada tarif edilen hücre-bağlı patch-clamp tekniği ile, bir iyon kanalının güncel kayıt uzun uzanır elde edilmesi için bir işlemdir. Bu yöntem, gerçek zamanlı olarak, gözlemlemek için izin veren, biyolojik sinyali altında yer open-close kanal konformasyonlarının desen. Bu veriler rahatsız biyolojik membranların kanal özellikleri hakkında bilgilendirmek.

Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt

Bu protokol tüm hücre yama-kelepçe kayıtları gerçekleştirmek için temel usul adımları açıklar. Bu teknik nöronların elektriksel davranışının çalışma sağlar ve beyin dilimleri yapıldığında, hala nispeten iyi korunmuş beyin devreleri entegre edilmiştir nöronlardan farklı nöron işlevlerinin değerlendirilmesine olanak sağlamaktadır.

Beyin Dilimleri tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

Bu el yazması, yama kelepçesi kayıtları için sağlam dorsal kök gangliyonlarının nasıl hazırlanacağını açıklar. Bu hazırlık, nöronlar ve uydu glial hücreler için mikro çevreyi korur, böylece ayrışmış DRG nöronları kullanılarak görülen fenotipik ve fonksiyonel değişikliklerden kaçınır.

Yetişkin Rats gelen bozulmamış Dorsal Kök Ganglia üzerinde Patch Kelepçe Kayıtlar

Bu protokol, düz monte hazırlık retina nöronlar üzerinde tüm hücre yama kelepçe kayıt yapmak gösterilmiştir.

Deafferentated Fare Retina bir düz montaj Hazırlık patlaması amacrine hücreleri Yama Kelepçe Kaydı

Bu iletişim kuralı kritik adımlar ve yama-kelepçe sonra tek hücre multiplex Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirmek için gereken önlemleri açıklar. Bu teknik ifade profil genler tarafından yama-kelepçe kayıtları ile karakterize bir tek hücreden önceden belirlenmiş bir dizi analiz etmek için basit ve etkili bir yöntemdir.

Tek hücre Multiplex Ters transkripsiyon polimeraz zincir tepkimesi sonra yama-kelepçe

Burada, iç kulağın vestibüler ganglion ve spiral ganglion nöronlarından diseksiyon, ayrıştırma, kültürleme ve yama-klemp kaydı için ayrıntılı talimatlar sağlayan yöntemler sunulmaktadır.

Patch-Clamp Kayıtları için Yenidoğan Kemirgenlerinden Vestibüler ve Spiral Ganglion Somata'nın İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi

Öğrenin dopamin nöronlarının dendritlerinden hücre içi patch-kelepçe kayıtları yapmayı. Bu yöntem, iyon kanallarının alt hücresel düzeyde işlev haritalamasını sağlar ve nörobiyoloji araştırmaları için güvenilir bir temel oluşturur.

Nigral Dopamin Nöronlar somatodendritik Domain hücre içi Patch-kelepçe Kayıtlar

Daha fazla video keşfet