Nigral Dopamin Nöronlar somatodendritik Domain hücre içi Patch-kelepçe Kayıtlar

Bu yöntem, bireysel voltaj kapılı iyon kanallarının belirli bir nöronun işlevlerine nasıl katkıda bulunduğu gibi nörobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, iyon kanallarının işlevinin nöronlarda hücre altı düzeyde haritalanmasına izin vermesidir. Bu işleme beyni, alt kısmı bir SiliGuard tabakası ile kaplanmış 9 santimetrelik bir petri kabına yerleştirerek başlayın.

Ardından, beyni buz gibi soğuk sükroz-ACSF ile çevreleyin. Koronal dilimler hazırlamak için, beyincik ve beynin rostral kısmını çıkarmak için iki kesim yapın. Daha sonra numune tepsisine siyanoakrilat yapıştırıcı uygulayın ve beyin bloğunu, rostral kısım dilimleme aşamasına bakacak şekilde tepsiye yapıştırın.

Daha sonra, beyne birkaç damla sakaroz-ACSF uygulayın ve tepsiyi yavaşça kesme haznesine daldırın. Daha sonra, tıraş bıçağını yatay düzleme göre 15 derecelik bir açıyla ayarlayın. Substantia nigra'ya ulaşmadan önce cottle burun yönünde yaklaşık 500 mikrometrelik koronal beyin dilimlerini kesin.

Ardından, ilgilenilen bölgeyi içeren 300 mikrometrelik dilimleri kesmek için kalınlığı ayarlayın. Tıraş bıçağının kenarına paralel bir şırıngaya bağlı çok ince bir bol iğne ile dilimleri doku bloğundan ayırın. Bunu takiben, dilimleri bir saat boyunca 34 santigrat derecede yedek odaya aktarın.

Bu prosedürde, bir beyin dilimini kayıt odasına aktarın. Dilimi kayıt odasının altına bir platin halka ile sabitleyin ve dilimin pürüzsüz, düz bir yüzeye sahip olduğundan emin olun. Daha sonra aynı düzlemde uzun bir mesafeye uzanan bir dendrite sahip bir nöron seçin ve ilgilenilen dendritin iyi tanımlanmış bir soma kadar takip edilebildiğinden emin olun.

Ardından, yama pipetini elektrot çözeltisiyle doldurun. Dendriti hücreye bağlı modda yamalamak için, dendritin bir kısmını tanımlayın ve odaklanın. Pipete pozitif basınç uygulayın ve mikro manipülatörü kullanarak pipeti indirin.

Ardından pipeti zara yakın bir yere yerleştirin ve küçük bir çukur oluşturmak için basıncı ayarlayın. Ardından, pipet ucundaki basıncı boşaltın ve pipet direncini kontrol ederken dendriti yamalayın. Hücreye bağlı kayıtlar için bir gigaohm'dan daha büyük, en iyi ihtimalle üç ila on gigaohm arasında bir sızdırmazlık direnci elde etmeye çalışın.

Daha sonra, dendritin deformasyonunu önlemek için pipeti zardan birkaç mikrometre geri çekin. Burada görülen aksiyon akımları, nigral nöronların spontan aksiyon potansiyellerini temsil eder. Aksiyon akımlarını bastırmak için ACSF'ye kalsiyum ve sodyum kanal blokerleri uygulayın.

Ardından, hiperpolarizasyonla aktive olan katyon akımını uyandırmak için sıfır milivoltluk bir tutma potansiyelinden 90 milivoltluk bir voltaj adımı uygulayın. Kaydın sonunda, tüm hücre modunu elde etmek için yamayı yırtın. Bundan sonra, dıştan dışa bir yama elde etmek için dendritik pipeti nöronal zardan yavaşça ve nazikçe çekin.

Tüm hücre modunda karşılık gelen soma'dan kayıt yapmak için, dendritin karşılık gelen soma'sını bulun. Potasyum bazlı hücre içi bir çözelti ile beş ila on megaohm arasında dirençli bir pipeti hücre gövdesine indirin. Ardından, tüm hücre modunu elde etmek için zarı yırtmak için pipet ucuna kısa bir negatif basınç uygulayın.

Uzun hiper ve depolarize edici akım adımları uygulayarak akım kelepçesi modunda nöronun kimliğini kontrol edin ve pipetten biyositinin dendritler boyunca yayılmasına izin verin. 10 dakika sonra, dıştan dışa doğru bir yama elde etmek için pipeti geri çekin. Pipet dilimin üzerine çıktığında, kayıt odasından tamamen çıkmak için hücre zarının düzgün kapanmasını desteklemek için bir dizi kısa yanal yukarı hareket kullanın.

Biyosit ve kaydedilen nöronun dengelenmesine izin vermek için dilimi standart ACSF'de 15 dakika daha kayıt odasında tutun. Daha sonra dilimi yavaşça histoloji için standart ACSF içeren 25 mililitrelik amber cam şişeye aktarın. Bu prosedürde, floresan olarak işaretlenmiş nöronu epifloresan ile dilimde kabaca bulun

Nöronların dendritik çardağını kısaca inceleyin ve 10X'lik bir objektif kullanarak akson ve aksonal bleb'i bulun. Ardından, konfokal mikroskoba geçin ve etiketli nöronu uyarmak için 488 nanometre lazer diyotu seçin. Z eksenindeki akson ve dendritlerin uzantısını takip edin ve tüm hücre için bir Z yığını elde etmek için ardışık görüntüleri kaydedin.

Z ekseninin çözünürlüğünü ayarlayın ve hücrenin konfokal görüntülerini düşük ve yüksek büyütmede toplayın. Sonunda, nöronun görüntü dosyasını bir görüntüleme yazılımı ile açın. Elektrofizyolojik kayıt sırasında yama pipetinin tam konumunu bulmak için Z projeksiyon görüntüsünü bir IR-DGC görüntüsüyle

, bir dopamin nöronunun IR-DGC görüntüsü ve proksimal dendrit üzerindeki bir pipettir. Akım izi, hücreye bağlı konfigürasyonda, beş gigaohm'luk sızdırmazlık direnci ile beş milivoltluk bir voltaj komutuna yanıt olarak EN kaçak akımlarının kapasitesini gösterir. Sıfır milivoltluk bir zar potansiyelinden hiperpolarize voltaj adımı, yavaş yavaş aktive olan hiperpolarizasyonla aktive olan bir katyon akımını indükledi.

Mevcut iz ters çevrildi ve tek bir üstel fonksiyonla donatıldı, bu da 632 milisaniyelik bir zaman sabiti verdi. Burada, hücreye bağlı kayıt sırasında aksiyon potansiyellerini ortadan kaldırmak için voltaj kapılı sodyum ve kalsiyum akım blokerlerinin varlığında bir saniyelik hiper ve depolarize edici akım darbelerine kaydedilen tüm hücrenin voltaj tepkileri verilmiştir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa bir günde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, sağlıklı doku ve stabil kayıt koşulları elde etmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, kaydedilen nöronun kimliği gibi ek soruları yanıtlamak için immünohistokimya gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, nörofizyoloji alanındaki araştırmacıların, uyarılabilir hücrelerde voltaj kapılı iyon kanallarının özelliklerinin işlevini ve rolünü keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, dendritlerde voltaj kapılı iyon kanallarından akan akımların dağılımını nasıl kaydedeceğinizi ve inceleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.