Lipaz ve Fosfolipaz Adayları için substrat özellikleri tanımlama

Bu prosedürün genel amacı, potansiyel lipazlar ve fosofolipaslar için fizyolojik substratların tespitini hızlandırmaktır. Bu yöntem, fosfolipazların biyolojik zarlarda lipid yeniden şekillenmesine nasıl katkıda bulunduğu gibi Entomoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, enzimatik aktivitenin optimizasyonunun ve enzim için doğal substrat arayışının bağımsız olarak gerçekleştirilebilmesidir.

Bu yöntem, bakteriyel lipazların ve fosfolipazların substrat özgüllüğü hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer model organizmaların hidrolazlarını incelemek için de değiştirilebilir. Bu yöntem için ilk olarak, içsel membran lipid fosfatidilkolin inorhizobium meliloti'yi parçalayabilecek bir enzim aktivitesi aradığımızda aklımıza geldi. Hücresiz protein özleri hazırlamak için, bakteri hücresi süspansiyonlarının buzunu çözün ve buz üzerinde saklayın.

Daha sonra, hücre süspansiyonlarını inç kare başına 20.000 pound hızla soğuk bir basınç hücresinden üç kez geçirin. Dokunulmuş hücreleri ve hücre kalıntılarını, dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 5.000 kez g'de santrifüjleme ile çıkarın. Santrifüjlemeden sonra, sonraki analizler için süpernatandan 100 ve 500 mikrolitrelik alikotlar hazırlayın.

Metin protokolünde tablo halinde gösterilen pipetleme şemalarını kullanarak önceden optimize edilmiş enzim testini ayarlayın. Farklı enzim aktivitelerinin ilk kapsamı için, para-nitrofenol veya PNP türevleri gibi hidroliz üzerine renkli bir ürün veren yapay substratlar kullanın. Beş dakikalık bir süre boyunca 30 santigrat derecede bir spektrofotometrede PNP oluşumu nedeniyle 405 nanometrede bir absorbans artışı için zaman seyrini takip edin.

Son olarak, metin protokolünde açıklandığı gibi hesaplamaları gerçekleştirin. Lipitlerin radyoyla etiketlenmesi için, istenen kültür ortamının beş mililitresinde ilgilenilen bir organizmanın gece boyunca ön kültürünü hazırlayın ve 30 santigrat derecede büyütün. Ön kültürden, kültür için 620 nanometre 0.3'te bir başlangıç optik yoğunluğu elde etmek için 100 milimetrelik bir kültür şişesinde 20 milimetre taze ortama aşılayın.

Daha sonra, kültürün bir mililitrelik bir alikotunu steril koşullar altında 14 mililitrelik steril polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın. Bir mililitrelik kültüre 114 c asetat içeren bir mikroküri ekleyin. Daha sonra, sıvı kültürü 24 saatlik bir süre boyunca 30 santigrat derecede çalkalama altında inkübe edin.

Kuluçka süresinin sonunda, kültürü 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında 12.000 kez g'de santrifüjleyin. Peleti 100 mikrolitre suda tekrar süspanse edin. Bu noktada, hücre süspansiyonunu eksi 20 santigrat derecede saklayın veya hemen polar lipitlerin ekstraksiyonuna devam edin.

Polar lipitlerin ekstraksiyonunu gerçekleştirmek için, 100 mikrolitre sulu hücre süspansiyonuna kloroform çözeltisine 375 mikrolitre iki ila bir metanol ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakika inkübe etmeden önce numuneyi 30 saniye vorteksleyin. İnkübasyonun ardından, oda sıcaklığında 12.000 kez g'de beş dakika santrifüjleyin.

Ardından, süpernatanı yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra, süpernatana 125 mikrolitre kloroform ve 125 mikrolitre su ekleyin. 30 saniye girdapladıktan sonra, numuneyi oda sıcaklığında 12.000 kez g'de bir dakika santrifüjleyin.

Alt kloroform fazını yeni bir tüpe aktarın. Ardından, çözeltiyi bir nitrojen gazı akışıyla kurutun. Kurutulmuş lipitleri 100 mikrolitre kloroformda metanol çözeltisine çözün.

Nötr polar lipitlerin ince tabaka kromatografisi ile ayrılması için, plakanın kenarlarından iki santimetre uzakta başlayarak yüksek performanslı ince tabaka kromatografisi silika jel alüminyum levha üzerine lipid numunelerinin üç mikrolitrelik alikotunu uygulayın. Tek boyutlu kromatografide birden fazla numune analiz ediliyorsa, farklı numune uygulama noktaları arasında en az 1,5 santimetre mesafe bırakın. Mobil fazı, dahili olarak kromatografi kağıdı ile kaplanmış bir TLC geliştirme odasına aktarın.

Haznenin 30 dakika doygun hale gelmesi için bir cam plaka ile örtün. HPTLC Silika Jel alüminyum levhayı kurutulmuş lipid numuneleri ile hazneye aktarın. Plakayı çıkarmadan önce plakanın kapalı bir odada 30 dakika gelişmesine izin verin.

Ardından, çözücülerin iki saat boyunca bir akış başlığında kurumasını bekleyin. Geliştirilen TLC tabakası kuruduktan sonra, üç gün boyunca kapalı bir kasette ışıkla uyarılabilen bir lüminesans ekranı ile inkübe edin. Ardından, inkübe edilmiş ekranı bir PSL tarayıcıya maruz bırakın ve ayrılmış radyo etiketli lipitlerin sanal bir görüntüsünü elde edin.

Diasilgliserol veya DAG, lipaz aktivitesini belirlemek için, önce 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne 5.000 CPM 14 C etiketli DAG ekleyin. Ayrıca, tüpe bir Triton X-100 çözeltisi ekleyin ve girdap ile karıştırın. Çözeltiyi bir azot akışı altında kurutun.

Son 100 mikrolitrelik bir test için Tris-HCl tamponu, bir sodyum klorür çözeltisi ve bi-damıtılmış su ekleyin. Beş saniye boyunca girdap. Çözeltiye beş mikrolitre enzim ekleyerek reaksiyonu başlatın.

Çözeltiyi dört saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Bu videoda daha önce anlatıldığı gibi lipitleri çıkarmadan önce 250 mikrolitre metanol ve 125 mikrolitre kloroform ekleyerek reaksiyonu durdurun. Daha önce olduğu gibi 1DTLC ve ardından PSL görüntüleme ile nötr polar lipidleri analiz etmeye devam edin.

Tahmin edilen fosofolipaz SMc01003, yapay para-nitrofenol asil esterleri ile aktivite göstermesine rağmen, aktivite, hiçbir yabancı genin eksprese edilmediği Escherichia coli'nin hücresiz ekstraktlarında bulunan arka plan aktivitesinin sadece iki veya üç katıdır. Bu, para-nitrofenil asil esterlerin SMc01003 için iyi substratlar gibi görünmediğini gösterir. E.Coli'nin hücresiz ekstraktları diasilgliserolü parçalayamazken, tahmin edilen fosfolipaz, SMc01003'ün eksprese edildiği suşların ekstraktları, diasilgliserolün bozulmasına neden oldu.

SMc01003'ün bir fosfolipaz olduğu tahmin edilse de, aslında diasilgliserolü monoasilgliserol ve bir yağ asidine indirgeyen bir diasilgliserol lipazdır. Daha sonra monoasilgliserolü daha da gliserol ve başka bir yağ asidine indirger. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa birkaç hafta içinde yapılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, lipazların ve fosfolipazların enzim aktivitelerini nasıl optimize edeceğinizi ve fizyolojik substratlarını aramaya nasıl devam edeceğinizi iyi anlamalısınız. Bu prosedürün önemli bir avantajı, enzim aktivitesinin optimizasyonunun, doğal enzim substratı arayışından ayrılabilmesidir. Organik çözücüler veya radyoaktif maddelerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman gerekli önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.