Name: Lipaz ve Fosfolipaz Adayları için substrat özellikleri tanımlama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Keşfedin lipaz ve fosfolipaz adayları için substrat özellikleri tanımlama yöntemini. Bu teknik, enzimatik aktivite optimizasyonunu doğal substrat aramasından bağımsız olarak gerçekleştirerek lipid metabolizması araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser (Investigación en Fronteras de la Ciencia de Investigación Científica BasicA 82614, 153998, 253549, ve 178359 yanı sıra 118) ve Dirección Genel de Consejo Nacional de Ciencias y Tecnología-México (CONACyT-Meksika) hibe ile desteklenmiştir (DGAPA-UNAM; PAPIIT IN202616, IN203612) asuntos de Kişisel Académico-Universidad Nacional Autonoma de México.

<ol><li>Nelson, D. L., Cox, M. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNelson%2C+DL+%22Lehninger%2C+Principles+of+Biochemistry%22">Lehninger, Principles of Biochemistry</a>. , W. H. Freeman and Company. New York. (2013).</li>
<li>Jaeger, K. E., Eggert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipases+for+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Lipases for biotechnology.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 13 (4), 390-397 (2002).</li>
<li>Dowhan, W., Bogdanov, M., Mileykovskaya, E. Functional roles of lipids in membranes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDowhan%2C+W+%22Biochemistry+of+Lipids%2C+Lipoproteins+and+Membranes%22">Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes</a>. , 5th, Elsevier. Amsterdam, The Netherlands. 1-37 (2008).</li>
<li>Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+membrane+phospholipid+diversity%3A+why+are+there+so+many+lipids%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids?</a> Annu. Rev. Biochem. 66, 199-232 (1997).</li>
<li>De Rudder, K. E. E., Thomas-Oates, J. E., Geiger, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhizobium+meliloti+mutants+deficient+in+phospholipid+N-methyltransferase+still+contain+phosphatidylcholine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Rhizobium meliloti mutants deficient in phospholipid N-methyltransferase still contain phosphatidylcholine.</a> J. Bacteriol. 179, 6921-6928 (1997).</li>
<li>Geiger, O., Röhrs, V., Weissenmayer, B., Finan, T. M., Thomas-Oates, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulator+gene+phoB+mediates+phosphate+stress-controlled+synthesis+of+the+membrane+lipid+diacylglyceryl-N%2CN%2CN-trimethylhomoserine+in+Rhizobium+%28Sinorhizobium%29+meliloti%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The regulator gene phoB mediates phosphate stress-controlled synthesis of the membrane lipid diacylglyceryl-N,N,N-trimethylhomoserine in Rhizobium (Sinorhizobium) meliloti.</a> Mol. Microbiol. 32 (1), 63-73 (1999).</li>
<li>Klug, R. M., Benning, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+enzymes+of+diacylglyceryl-O-4%27-%28N%2CN%2CN%2C-trimethyl%29homoserine+biosynthesis+are+encoded+by+btaA+and+btaB+in+the+purple+bacterium+Rhodobacter+sphaeroides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Two enzymes of diacylglyceryl-O-4'-(N,N,N,-trimethyl)homoserine biosynthesis are encoded by btaA and btaB in the purple bacterium Rhodobacter sphaeroides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (10), 5910-5915 (2001).</li>
<li>Zavaleta-Pastor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sinorhizobium+meliloti+phospholipase+C+required+for+lipid+remodeling+duringphosphorus+limitation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Sinorhizobium meliloti phospholipase C required for lipid remodeling duringphosphorus limitation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (1), 302-307 (2010).</li>
<li>Pech-Canul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FadD+is+required+for+utilization+of+endogenous+fatty+acids+released+from+membrane+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">FadD is required for utilization of endogenous fatty acids released from membrane lipids.</a> J. Bacteriol. 193 (22), 6295-6304 (2011).</li>
<li>Banerji, S., Flieger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patatin-like+proteins%3A+a+new+family+of+lipolytic+enzymes+present+in+bacteria%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Patatin-like proteins: a new family of lipolytic enzymes present in bacteria?</a> Microbiology. 150 (Pt 3), 522-525 (2004).</li>
<li>Sahonero-Canavesi, D. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid-releasing+activities+in+Sinorhizobium+meliloti+include+unusual+diacylglycerol+lipase%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fatty acid-releasing activities in Sinorhizobium meliloti include unusual diacylglycerol lipase.</a> Environ. Microbiol. 17 (9), 3391-3406 (2015).</li>
<li>Fischer, M., Pleiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lipase+Engineering+Database%3A+a+navigation+and+analysis+tool+for+protein+families%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acid.+Res%22%5BJournal%5D)">The Lipase Engineering Database: a navigation and analysis tool for protein families.</a> Nucl. Acid. Res. 31 (1), 319-321 (2003).</li>
<li>Sigrist, C. J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+continuing+developments+at+PROSITE%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">New and continuing developments at PROSITE.</a> Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D344-D347 (2013).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+Chain+Reaction%3A+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> J. Vis. Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3+-+new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Primer3 - new capabilities and interfaces.</a> Nucl. Acids Res. 40 (15), e115(2012).</li>
<li>Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+T7+RNA+polymerase+to+direct+expression+of+cloned+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes.</a> Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990).</li>
<li>Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+JH+%22Experiments+in+Molecular+Genetics%22">Experiments in Molecular Genetics</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY, USA. (1972).</li>
<li>Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvolume+Protein+Concentration+Determination+using+the+NanoDrop+2000c+Spectrophotometer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer.</a> J. Vis. Exp. (33), e1610(2009).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A rapid method for total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37 (8), 911-917 (1959).</li>
<li>Molecular Dynamics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Phosphorimager+SI+User%C2%B4s+Guide%22">Phosphorimager SI User´s Guide</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://www.camd.lsu.edu/SAXS/Files/PIManual.pdf">http://www.camd.lsu.edu/SAXS/Files/PIManual.pdf</a> (1994).</li>
<li>Dixon, M., Webb, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDixon%2C+M+%22Enzymes%3A+Third+Edition%22">Enzymes: Third Edition</a>. , Longman, USA. (1979).</li>
<li>Rudolph, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+characterization%2C+and+mutagenesis+of+the+Yersinia+pestis+murine+toxin%2C+a+phospholipase+D+superfamily+member%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Expression, characterization, and mutagenesis of the Yersinia pestis murine toxin, a phospholipase D superfamily member.</a> J. Biol. Chem. 274 (17), 11824-11831 (1999).</li>
<li>Kato, S., Yoshimura, T., Hemmi, H., Moriyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+analysis+of+a+novel+lipolytic+enzyme+YvdO+from+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.+Biotechnol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Biochemical analysis of a novel lipolytic enzyme YvdO from Bacillus subtilis.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 74 (4), 701-706 (2010).</li>
<li>Peppelenbosch, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Scientifica+%28Cairo%29%22%5BJournal%5D)">Kinome profiling.</a> Scientifica (Cairo). , Article ID 306798 (2012).</li>
<li>Manafi, M., Kneifel, W., Bascomb, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+and+chromogenic+substrates+used+in+bacterial+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic and chromogenic substrates used in bacterial diagnostics.</a> Microbiol. Rev. 55 (3), 335-348 (1991).</li>
<li>Kuznetsova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+genomics%3A+Application+of+general+enzymatic+screens+to+discover+new+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Enzyme genomics: Application of general enzymatic screens to discover new enzymes.</a> FEMS Microbiol. Rev. 29 (2), 263-279 (2005).</li>
<li>Scopes, R. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScopes%2C+RK+%22Protein+Purification%2C+Principles+and+Practice%22">Protein Purification, Principles and Practice</a>. , Springer. New York. (2010).</li>
<li>Geiger, O., Lopez-Lara, I. M., Sohlenkamp, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylcholine+biosynthesis+and+function+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylcholine biosynthesis and function in bacteria.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1831 (3), 503-513 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Son 20 yılda, birçok organizmanın genomu dizilimi edilmiş ve genom dizisi verilerin bir zenginlik üretilen olmasına rağmen, fonksiyonel yorumlama geride ve bu nedenle genom fonksiyonunun anlayışımızı engellemektedir edilir. genomları Gen fonksiyonları genellikle bilinen işlev veya korunmuş motiflerinin oluşum genlerine benzerliğine dayalı atanır. Bununla birlikte, belirli bir genin tam işlevi genellikle bilinmez. Özellikle, enzimler için yapısal genler nedeniyle kolaylıkla en enzimler iki yüzeyler ve iki ürünü içeren ka...

Bu tür triaçilgliserol ve (glisero) fosfolipidler gibi gliserol tabanlı lipidler önemli oluşturmaktadır ve muhtemelen en iyi bilinen lipit sınıfları 1. Triaçilgliseroller (TAG) yağlar ya da genellikle depolama lipidler olarak işlev yağlar, ve bu nedenle potansiyel enerji ve karbon kaynağı olarak bulunmaktadır. TAG&#39;lar sık ​​sık dış TAG sindirmek ve karbon kaynağı olarak kullanılabilir hale getirmek için üreten organizma tarafından salgılanan lipaz tarafından bozulmuş olabilir. Ayrıca, lipazlar yaygın nedeniyle önemli biyo teknolojik uygulamalarda 2 yıl içinde incelenmiştir. Nedeniyle amfifilik doğası ve onların yakın silindirik şekil, (glisero) fosfolipidler sergi zar oluşturan özellikleri ve genellikle iki katmanlı membranın 3 ana lipidik bileşenlerini teşkil edecek. Bu bakteri Escherichia coli, sadece üç ana kafa grubu varyantları, fosfatidilgliserol (PG), kardiyolipin (CL) ve phosphatid basit mikroorganizmalardabunlardan biri, her biri farklı moleküler türler 4 çok sayıda bir sn farklı yağlı asil zincirleri önemli sayıda -1 ya da sn -2 pozisyonu veren artış ile ikame edilebilir bilmelidir, ancak ylethanolamine (PE), karşılaşılan . Diğer bakteriler diğer fosfolipidler ek olarak veya bunun yerine sahip olabilir. Örneğin, Sinorhizobium meliloti, baklagil yonca (Medicago sativa), bir azot bağlayıcı kök nodül simbiyoz oluşturmak için güçlü bir toprak bakterisi, ikinci bir zitteriyonik fosfolipid, fosfatidilkolin (PC), PE ilave olarak ihtiva eden 5 ile. Ayrıca, lipit içermeyen, fosfor veya gliserol, hücre zarının amfifilik ve form parçası olabilir. Örneğin, fosfor sınırlayıcı büyüme koşullarına bağlı olarak, S. meliloti (glisero) Fosfolipidler, büyük ölçüde, yani sulfolipidlerin, ornitin lipidler ve diacylglyceryl trimethylho fosfor içermeyen membran lipidleri ile ikame edilmektedirmoserine (DGTS) 6. Bakterilerde DGTS iki aşamalı yolun 7 diasilgliserole (DAG) teşekkül eden, fakat DAG üretimi için bir kaynak belli değildi edilir. Darbe kovalayıcı deneyler bilgisayar fosfor sınırlayıcı koşullar altında meydana geldiği ve DAG ve fosfokolin haline PC dönüştürmek olan DGTS 8 için bir ön-madde olarak ve bir fosfolipaz C (PLCP, SMc00171) tanımlayabilir Bu yazıda tarif edilen metodoloji kullanılarak düşündürmektedir 8. Ayrı bir çalışmada, biz keşfettik bir açil-KoA sentetaz (fadd) S. -açıklı mutant büyüme 9 sabit faz girerken melılotı veya Escherichia coli serbest yağ asitleri birikmiş. Bu yağlı asitler, membran lipitleri elde edilecek gibi görünse de, serbest yağ asitleri ya da bunların serbest bırakılması enzim (ler) için kesin bir kaynak bilinmemektedir. Yine, bu stratejiyi uygulayan bu yazının ana hatlarıyla, iki patatin gibi 10 (fosfo) lipazlar (S. serbest yağ asitleri oluşmasına katkıda SMc00930 ve SMc01003) meliloti 11 tahmin edildi. Şaşırtıcı bir şekilde, SMc01003 o gliserol ve serbest yağ asitleri 11 nihayet monoaçilgliserol ve dönüştürme substrat olarak DAG kullanıldı. Bu nedenle, SMc01003 DAG lipazı (DGLA) &#39;dir. Algoritmaları bir dizi potansiyel (fosforo) tahmin etmek için mevcut olmakla beraber 12,13, lipazlar onların hassas fonksiyon ve fizyolojik rolü genellikle bilinmemektedir. Burada klonlamak, bir protokol anahat ve tahmin veya potansiyel (fosfo) lipazlar aşın. Bu el yazması enzim tahlilleri geliştirilmiş ve yapay kromojenik maddeleri kullanarak aşırı (fosfo) lipaz için optimize edilebilir açıklar. Bu bulguların mikrobiyal fizyoloji anlayışımızı zenginleştirecek nasıl optimize edilmiş bir enzim testi ile gerçek (fosfo) lipaz substrat karşılaştı olabilir ve nasıl örnekler sağlar.

<table><tbody><tr><td>Kloroform</td><td>JT Baker</td><td>9180-03</td><td>TLC analizi ve Lipid ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>JT Baker</td><td>9070-03</td><td>TLC analizi ve Lipid ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>Asetik Asit</td><td>JT Baker</td><td>9507-05</td><td>TLC analizi ve Lipid ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>Hekzanlar</td><td>JT Baker</td><td>9309-02</td><td>TLC analizi ve Lipid ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>Dietileter</td><td>Sigma</td><td>32203</td><td>Enzimatik tahliller</td></tr><tr><td>bidistile su</td><td>&nbsp; HERHANGİ BİRİ</td><td>&nbsp; NA</td><td>Enzimatik tahliller</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>T-1503</td><td>Enzimatik tahliller</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Baker</td><td>9535-02</td><td>Enzimatik tahliller</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Baker</td><td>3624-01</td><td>Enzimatik tahliller</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td>Enzimatik tahliller</td></tr><tr><td>LB suyu</td><td>HERHANGİ BİR</td><td>NA</td><td>Bakteri üremesi, 10 gr tripton + 5 gr maya özü + başına 10 gr NaCl litre bidistile damıtılmış su</td></tr><tr><td>tripton</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>211705</td><td>Bakteri üreme</td></tr><tr><td>mayası özü</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>212750</td><td>Bakteri büyümesi</td></tr><tr><td>TY et suyu</td><td>HERHANGİ</td><td>BİR NA</td><td>Bakteri büyümesi, 8 g tripton + 3 g maya özü + 66 mg CaCl2&#183; Bidistilled su litresi başına 2H2O</td></tr><tr><td>CaCl2&#183; 2H2O</td><td>Baker</td><td>1332-01</td><td>Enzimatik tahliller</td></tr><tr><td>izopropil-&beta;-D-tiyogalaktozit (IPTG)</td><td>İnvitrojen</td><td>15529-019</td><td>Bakteri üremesi</td></tr><tr><td>Dietanolamin</td><td>Sigma</td><td>D-8885</td><td>Enzimatik tahliller</td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Sigma</td><td></td><td>221279 Enzimatik tahliller</td></tr><tr><td>Fosfolipaz A2 yılan zehir</td><td>Sigma</td><td>P0790</td><td>Enzimatik tahliller</td></tr><tr><td>Fosfolipaz C Clostridium perfringens</td><td>Sigma</td><td>P7633</td><td>Enzimatik tahliller</td></tr><tr><td>Bis-p-nitrofenil fosfat</td><td>Sigma</td><td>07422AH</td><td>Enzimatik tahliller</td></tr><tr><td>p-nitrofenil stearat</td><td>Sigma</td><td>N3627</td><td>Enzimatik tahliller</td></tr><tr><td>p-nitrofenil dodekanoat</td><td>Sigma</td><td>61716</td><td>Enzimatik tahliller</td></tr><tr><td>p-nitrofenil dekanoat</td><td>Sigma</td><td>N0252</td><td>Enzimatik tahliller</td></tr><tr><td>p-nitrofenil palmitat</td><td>Sigma</td><td>N2752</td><td>Enzimatik tahliller</td></tr><tr><td>p-nitrofenil bütirat</td><td>Sigma</td><td>N9876</td><td>Enzimatik tahliller</td></tr><tr><td>p-nitrofenil oktanoat</td><td>Sigma</td><td>21742</td><td>Enzimatik tahliller</td></tr><tr><td>Asetik Asit, sodyum tuzu [1-14C]</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEC084</td><td>Bakteri büyümesi</td></tr><tr><td>dimetilsülfoksit (DMSO)</td><td>JT Baker</td><td>9224-01</td><td>Enzimatik tahliller</td></tr><tr><td>Alüminyum HPTLC silika jel 60 plaka. Silika jel HPTLC plakalar boyutu 20 x 20 cm, 25 yaprak.</td><td>Merck</td><td>105547</td><td>TLC analizi & Lipid ekstraksiyon</td></tr><tr><td>Spektrometresi UV/VIS Lambda 35</td><td>Perkin Elmer</td><td>NA</td><td>Enzimatik tahliller</td></tr><tr><td>Storm 820 Fosforgörüntüleyici</td><td>Moleküler Dinamik</td><td>NA</td><td>Fotostimülan Lüminesans tarayıcı&nbsp;</td></tr><tr><td>Çok Amaçlı Sintilasyon Sayacı</td><td>Beckman Coulter</td><td>NA</td><td>Radyoaktivite Miktar Tayini</td></tr><tr><td>Fransız Basınç Hücresi</td><td>ThermoSpectronic</td><td>NA&nbsp;</td><td>Hücrelerin kırılması</td></tr><tr><td>kromatografi kağıdı 3MM Chr</td><td>Whatman</td><td>3030917</td><td>TLC analizi</td></tr><tr><td>Sinorhizobium meliloti 1021referansımız</td><td>11</td><td></td><td>incelenen suş</td></tr><tr><td>Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Yetkili hücreler</td><td>Novagen</td><td>69451</td><td>protein ekspresyon suşu</td></tr><tr><td>pET9a vektörü</td><td>Novagen</td><td>69431</td><td>protein ekspresyon vektörü</td></tr><tr><td>pET17b vektör</td><td>Novagen</td><td>69663</td><td>protein ekspresyon vektörü</td></tr><tr><td>steril polistiren yuvarlak tabanlı tüp (14 ml) Falcon</td><td>Becton Dickinson</td><td>352057</td><td>bakteri kültürlerinin radyo-işaretlemesi</td></tr><tr><td>polipropilen mikrosantrifüj tüpleri (1.5 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>30125.15</td><td>Enzimatik deneyler</td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoil-sn-gliserol</td><td>Sigma</td><td>D9135</td><td>lipid standardı</td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatidilkolin, dipalmitoil</td><td>Sigma</td><td>P6267</td><td>lipid standardı</td></tr><tr><td>DL-&alfa;-monopalmitin</td><td>Sigma</td><td>M1640</td><td>lipid standardı</td></tr><tr><td>palmitik asit</td><td>Sigma</td><td>P0500</td><td>lipid standardı</td></tr></tbody></table>

lipaz ve fosfolipaz adayları için substrat özellikleri tanımlama

Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates

Mikroorganizmalar organizma için dış yüzeyler kullanılabilir hale getirmek için salgılanan (fosfo) lipaz çok geniş bir yelpaze oluşturur. Alternatif olarak, diğer (fosfo) lipazlar fiziksel üreten organizma iç lipidlerin ciro sebep olması ve sıklıkla, hücre membranlarının bir biçimlenme sebebiyet veren ile ilişkili olabilir. potansiyeli (fosfor) lipazlar gen / protein dizisi mevcuttur algoritmaları bir dizi ile tahmin edilebilir, ancak, enzim aktiviteleri, alt-tabaka özgüllükleri ve potansiyel fizyolojik fonksiyonları deneysel kanıtı sıklıkla elde edilmemiştir. Bu yazıda bilinmiyor alt-tabaka özgüllükleri ve nasıl bir ilgili (fosfo) lipaz doğal alt-tabaka için arama, bu optimum koşulların kullanılması ile potansiyel (fosfo) lipazlar için Tayin koşullarının optimize edilmesi açıklanmaktadır. Küçük tespit etmek için yardımcı, p-nitrofenil türevleri gibi yapay kromojenik substratlar, olabilir kullanmaStandart koşullar altında bir tahmin (fosfo) lipaz için enzimatik aktivite. Böyle küçük bir enzimatik aktivite karşılaşmıştır, bir enzim tahlili ayrı parametre ile yapay alt tabaka daha verimli bir hidrolizi elde etmek için değiştiirlebilir. bir enzim çalışır koşulları tespit ettikten sonra, potansiyel, doğal substratlar, çeşitli tenzillerinden tat kromatografik yöntemler kullanılarak takip edilebilir bir işlem test edilmelidir. Yeni enzimler için alt-tabaka özgüllükleri tanımı, genellikle daha sonra deneysel olarak test edilebilir, bu enzimlerin, potansiyel bir fizyolojik rolü için hipotez içerir. Bu yönergeleri izleyerek, biz büyüme fosfor sınırlayıcı koşullara bağlı bakteri Sinorhizobium meliloti membranların remodeling için önemli bir adım olarak, fosfokoline ve diaçilgliserol için fosfatidilkolin bozan bir fosfolipaz C (SMc00171) tespit başardık. İki patatin- tahmin içinAynı organizmanın fosfolipaz (SMc00930 ve SMc01003) gibi, biz onların alt tabaka özgüllükleri yeniden tanımlamak ve SMc01003 bir diaçilgliserol lipaz olduğunu açıklamak olabilir.

Bis p-nitrofenil Fosfat PC özgü Fosfolipaz C SMc00171 Faaliyet E. elde edilen hücre içermeyen özütler E. coli BL21 (DE3) &#39;smc00171 oluşan s -np ölçme bir spektrofotometrik enzimatik analiz kullanılarak, bis- p-nitrofenil fosfat esterleri hidrolize etme kabiliyetleri açısından incelendi ifade vardı pLysS...

Tahmin edilen birçok (fosfo)lipaz, substrat özgüllükleri ve fizyolojik fonksiyonları açısından zayıf bir şekilde karakterize edilir. Burada enzim aktivitelerini optimize etmek, doğal substratları aramak ve bu enzimler için fizyolojik işlevler önermek için bir protokol sunuyoruz.

Lipaz ve Fosfolipaz Adayları için substrat özellikleri tanımlama

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. ...

Bu prosedürün genel amacı, potansiyel lipazlar ve fosfolipazlar için fizyolojik substratların tespitini hızlandırmaktır. Bu yöntem, fosfolipazların biyolojik membranlardaki lipid yeniden şekillenmesine nasıl katkıda bulunduğu gibi Entomoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, enzimatik aktivitenin optimizasyonunun ve enzim için doğal substrat arayışının birbirinden bağımsız olarak gerçekleştirilebilmesidir.Bu yöntem, bakteriyel lipazların ve fosfolipazların substrat özgüllüğü hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer herhangi bir model organizmanın hidrolazlarını incelemek için de modifiye edilebilir. Bu yöntemle ilgili ilk fikrimiz, rhizobium meliloti'de intrinsik membran lipidi fosfatidilkolini degrade edebilecek bir enzim aktivitesi ararken ortaya çıktı. Hücreden arındırılmış protein ekstraktları hazırlamak için, bakteriyel hücre süspansiyonlarını çözdürün ve buz üzerinde saklayın.Ardından, hücre süspansiyonlarını 20.000 pounds per square inch basınçtaki soğuk bir basınç hücresinden üç kez geçirin. Bozulmamış hücreleri ve hücre kalıntılarını, dört santigrat derecede, 5.000 ×g'de 30 dakika santrifüj ederek uzaklaştırın. Santrifüjden sonra, sonraki analizler için süpernatandan 100 ve 500 µL'lik alikotlar hazırlayın.Metin protokolünde tablolaştırılmış pipetleme şemalarını kullanarak daha önce optimize edilmiş enzim analizini kurun. Farklı enzim aktivitelerinin başlangıç kapsamı için, hidroliz sonucu renkli bir ürün veren para-nitrofenol veya PNP türevleri gibi yapay substratlar kullanın. 30 °C'deki bir spektrofotometrede, beş dakikalık süre boyunca PNP oluşumuna bağlı olarak 405 nanometrede meydana gelen absorbans artışının zaman seyrini takip edin.Son olarak, metin protokolünde açıklanan hesaplamaları gerçekleştirin. Lipidlerin radyoaktif olarak işaretlenmesi için, ilgi duyulan organizmanın beş mililitre istenen kültür ortamında bir gece ön kültürü hazırlayın ve 30 °C'de büyütün. Kültür için 620 nm'de başlangıç optik yoğunluğun 0,3 olması için, ön kültürden 100 mm'lik bir kültür balonundaki 20 mm taze ortama inokülasyon yapın.Ardından, kültürden bir mililitrelik bir alikotu, steril koşullar altında 14 mililitrelik steril polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın. Bir mililitrelik kültüre bir mikrokuri 114 c asetat ekleyin. Daha sonra, sıvı kültürü 30 °C'de, ajitasyon altında 24 saat boyunca inkübe edin.İnkubasyon süresinin sonunda, kültürü 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında, 12.000 ×g hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin. Peleti 100 µL su içerisinde yeniden süspande edin. Bu noktada, hücre süspansiyonunu -20 °C'de saklayın veya hemen polar lipid ekstraksiyonuna geçin.Polar lipidlerin ekstraksiyonunu gerçekleştirmek için, 100 µL sulu hücre süspansiyonuna, ikiye bir oranında metanol ve kloroform çözeltisinden 375 µL ekleyin. Örneği, oda sıcaklığında beş dakika inkübe etmeden önce 30 saniye boyunca vorteksleyin. İnkübasyonun ardından, oda sıcaklığında 12,000 ×g hızda beş dakika santrifüj edin.Ardından, süpernatantı yeni bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Sonra, süpernatanta 125 µL kloroform ve 125 µL su ekleyin. 30 saniye boyunca vortekslendikten sonra, örneği oda sıcaklığında 12.000 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin.Alt kloroform fazını yeni bir tüpe aktarın. Ardından, çözeltiyi bir nitrojen gazı akımı ile kurutun. Kurutulmuş lipidleri 100 microliters kloroform-metanol çözeltisinde çözün.Nötr polar lipidlerin ince tabaka kromatografisi ile ayrıştırılması için, yüksek performanslı ince tabaka kromatografisi silika jel alüminyum levhanın kenarlarından iki santimetre içeriden başlayarak, lipid örneklerinden üç mikrolitrelik alikotlar uygulayın. Tek boyutlu kromatografide birden fazla örnek analiz edilecekse, farklı örnek uygulama noktaları arasında en az 1,5 santimetre mesafe bırakın. Mobil fazı, iç yüzeyi kromatografi kağıdı ile kaplanmış bir TLC geliştirme haznesine aktarın.Kamberin 30 dakika boyunca doyurulması için üzerine bir cam plaka kapatın. Kurutulmuş lipid örneklerini içeren HPTLC Silika Jel alüminyum levhayı kambere aktarın. Levhayı çıkarmadan önce, kapalı kamberde 30 dakika boyunca gelişmesine izin verin.Ardından, çözücülerin bir hava akımlı kabinde iki saat boyunca kurumasına izin verin. Geliştirilen TLC plakası kuruduğunda, plakayı kapalı bir kaset içinde fotostimüle edilebilir lüminesans ekranı ile üç gün boyunca inkübe edin. Daha sonra, inkübe edilen ekranı bir PSL tarayıcıya maruz bırakın ve ayrıştırılmış radyo etiketli lipidlerin sanal görüntüsünü elde edin.Diasilgliserol veya DAG lipaz aktivitesini belirlemek için, önce 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne 5.000 CPM 14 C-işaretli DAG ekleyin. Ayrıca, tüpe bir Triton X-100 çözeltisi ekleyin ve vorteksle karıştırın. Çözeltiyi bir azot akımı altında kurutun.Nihai 100 µL'lik analiz için Tris-HCl tamponu, sodyum klorür çözeltisi ve çift distile su ekleyin. Beş saniye boyunca vorteksleyin. Çözeltiye beş µL enzim ekleyerek reaksiyonu başlatın.Çözeltiyi 30 °C'de dört saat boyunca inkübe edin. Bu videonun önceki kısımlarında açıklandığı gibi lipidleri ekstre etmeden önce, 250 µL metanol ve 125 µL kloroform ekleyerek reaksiyonu durdurun. Daha önce olduğu gibi, nötral polar lipidleri 1DTLC ve ardından PSL görüntüleme ile analiz etme aşamasına geçin.Öngörülen fosfolipaz SMc01003, yapay para-nitrofenol açil esterleri ile aktivite gösterse de, bu aktivite, herhangi bir yabancı genin eksprese edilmediği Escherichia coli hücreden arındırılmış ekstraktlarda mevcut olan arka plan aktivitesinin yalnızca iki veya üç katıdır. Bu durum, para-nitrofenil açil esterlerinin SMc01003 için uygun substratlar olmadığını göstermektedir. E.Coli hücreden arındırılmış ekstraktlar diasilgliserolü degrade edemezken, öngörülen fosfolipaz SMc01003'ün eksprese edildiği suşların ekstraktları diasilgliserolün degre dasyonuna neden olmuştur.SMc01003'ün bir fosfolipaz olduğu öngörülmüş olsa da, aslında diasilgliserolü monoasilgliserole ve bir yağ asidine parçalayan bir diasilgliserol lipazdır. Ardından monoasilgliserolü gliserole ve başka bir yağ asidine daha parçalar. Bu teknik bir kez kavrandıktan sonra, uygun şekilde uygulandığında birkaç hafta içinde tamamlanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, lipazların ve fosfolipazların enzim aktivitelerinin nasıl optimize edileceği ve fizyolojik substratlarının aranmasına nasıl devam edileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Bu prosedürün kritik bir avantajı, enzim aktivitesinin optimizasyonunun doğal enzim substratı arama sürecinden ayrılabilmesidir. Organik çözücülerle veya radyoaktif maddelerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken gerekli önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

defining-substrate-specificities-for-lipase-phospholipase

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Protein fosforilasyonu, hücrelerin hücre dışı ortamlarındaki bilgileri nasıl yorumladığının ve ona nasıl yanıt verdiğinin merkezi bir özelliğidir. Burada, ilgilenilen bir substratı (substratları) fosforile eden kinazları hızlı bir şekilde tanımlamak için memeli hücrelerinden saflaştırılmış kinazları kullanan yüksek verimli bir tarama protokolü sunuyoruz.

Yüksek Verimli Tarama kullanma Kinaz-substrat Çiftlerinin Kimlik

Opsin ile sulandırılmış büyük unilameller lipozomlarda fosfolipid karıştırmayı ölçmek için floresan bazlı bir test tarif ediyoruz.

Fosfolipid Scramblase Aktivitesinin bir floresan bazlı analiz

Burada, pH modülasyonuna dayalı etiketsiz bir yöntem kullanarak protein-fosfoinositid etkileşimlerini incelemek için bir mikroakışkan platform bağlamında desteklenen bir lipid çift katmanı sunmaktayız.

PIP-on-a-chip: Protein-fosfoinositid Etkileşimlerinin Etiketsiz Bir Çalışması

Burada, proteaz özgüllük ham fare doku belirlemek için bir protokol MALDI-TOF spektrometresi kullanılarak özleri mevcut.

Proteaz özgüllük fare doku belirlenmesi MALDI-TOF Kütle spektrometresi tarafından ayıklar: PH özgüllük değişiklikler neden manipüle

Burada, diyasilgliseril peptid ve alkin-fosfolipitleri klik-kimyası ile substrat olarak kullanarak apolipoprotein N-asiltransferaz aktivitesini izlemek için hassas bir floresan testi sunulmaktadır.

Enzim Karakterizasyonundan Yüksek Verimli Taramaya Kadar Apolipoprotein N-asiltransferaz için Click-Kimya Tabanlı Florometrik Analiz

Burada, bir proteinin fosfatidiylserine veya fosfatidiliinositol 4-fosfat in vitro'yuayıklayıp taşımadığını belirlemek için floresan lipid sensörleri ve lipozomlar kullanarak protokolleri açıklıyoruz.

Membranlar Arasında Fosfataylserine/Fosfatidiylinositol 4-Fosfat Değişiminin Floresan Bazlı Ölçümleri

Bu protokol, farmakolojik olarak önemli G proteini bağlantılı reseptör sınıflarından biri olan insan 1A serotonin reseptör proteininin (5-HT1AR) yeniden uzlaştırılması için burada açıklandığı gibi, integral membran proteinlerini (IMP'ler) dev unilamellar lipid veziküllerine (GUVs) dahil etmek için güçlü ve genelleştirilebilir bir teknik olarak agarose şişmesini kullanır.

G-protein Bağlantılı Reseptörleri (GPCR) içeren Model Lipid Membranlarının yapımı

OCTOPUS olarak adlandırılan çok fazlı bir değişim ile uygulanan bir kolye damlası yüzey film dengesi, orijinal toplu çözeltinin simüle edilmiş gastrointestinal sıvılarla sıralı alt faz değişimi ile sindirim koşullarının taklit edilmesine izin verir. Simüle edilen in vitro sindirim, sindirilen ara yüz tabakasının ara yüz gerginliği in situ olarak kaydedilerek izlenir.

İn vitro Simüle Edilmiş Gastrointestinal Sıvıların Çok Alt Fazlı Değişimi Yoluyla Emülsiyonların Tek Bir Damlacıkta Sindirimi

Bu yöntem, glukan fosfataz ve amilopektinin bağlanma afinitesini ölçmek için lektin bazlı in vitro sedimantasyon testini tanımlar. Bu ko-sedimantasyon testi, glukan fosfataz substrat bağlanmasını ölçmek için güvenilirdir ve çeşitli çözünür glukan substratlarına uygulanabilir.

Glukan Fosfatazların Substrat Bağlanmasını Ölçmek için Konkanavalin A Bazlı Sedimantasyon Testi

Lipozomal membran geçirgenliğini değerlendirmek için geleneksel tekniklere göre üstün hassasiyet ve çözünürlükle uygun maliyetli bir yöntem sunuyoruz. Yeni bir kapsüllenmiş ligand ikame reaksiyonu kullanan bu teknik, model membranlarda fosfolipaz A2 ile indüklenen değişiklikleri tespit eder. Standart analizlerle kolayca entegre edilen bu erişilebilir yaklaşım, membran biyofiziği ve toksin etkileşimlerini incelemek için çözünürlüğü artırır.

Fosfatidilinositol Fosfat Gruplarının Venom PLA2'nin Membranotropik Etkisi Üzerindeki Etkilerini Araştırmak için Bir Lipozom Membran Geçirgenlik Testi

Keşfedin lipaz ve fosfolipaz adayları için substrat özellikleri tanımlama yöntemini. Bu teknik, enzimatik aktivite optimizasyonunu doğal substrat aramasından bağımsız olarak gerçekleştirerek lipid metabolizması araştırmalarına katkı sağlar.

Lipaz ve Fosfolipaz Adayları için substrat özellikleri tanımlama

Daha fazla video keşfet