Fare Matrix Jel Plug Test kullanma İnsan endotel-pericyte Etkileşim Vivo Çalışmasında
19 Aralık 2016
Biz matris jel fiş anjiyogenez testinin bir varyasyon kullanarak fare insan endotel-pericyte etkileşimleri incelemek için bir protokol mevcut.
Bu in-vivo matriks jel testinin genel amacı, endotel hücrelerinin parazitlerle etkileşimini araştırmaktır. Bu matrigel testi, araştırmacıların androjenezdeki ana adımları incelemelerine yardımcı olmak için tasarlanmıştır. Ayrıca, kan damarı oluşumundaki önemli adımlardan sorumlu sinyal yollarının yanı sıra, işlev bozukluğu vasküler bozukluklara ve androjenezin diğer sapmalarına yol açabilecek genlerin tanımlanmasına da izin verecektir.
Bu tekniğin temel avantajı, hem endotel hücrelerini hem de destek hücrelerini, perisitlerini içeren in vivo kan damarı oluşumunu incelememize izin vermesidir. Başlamak için, insan endotel ve parazit hücre kültürlerini 10 mililitre uygun ortam ile 100 milimetrelik plakalar üzerinde büyütün. Hücreler% 80 birleşmeye ulaşana kadar ortamı her iki ila üç günde bir değiştirin.
Matris jel çözeltisini hücrelerle karıştırmak üzere hazırlamak için, bir matris jel stoğunu gece boyunca dört santigrat derecede çözün. Ardından, uzun süreli eksi -20 santigrat derecede veya iki haftaya kadar dört santigrat derecede saklamak için 1,5 mililitrelik alikotlar yapın. Her deneysel fiş 200 mikrolitre matris jeli gerektirecektir.
Bu nedenle, stoklanmış bir tüp, %25'lik bir fazlalık ile altı fiş sağlayabilir. 15 mikrolitre çözülmüş 100x beta-FGF stoğu ekleyerek gerekli her alikotu kullanıma hazırlayın. Beta-FGF'yi pipetleme yoluyla çözelti halinde karıştırın, ardından hücreleri eklemeden önce en az 30 dakika buz üzerinde inkübe edin.
Bu noktada, enjeksiyonlar için bazı 28 gauge 1cc insülin şırıngalarını soğutun. Hücreleri kültür plakalarından toplamak için, ortamı çıkarın ve hücreleri bir kez PBS ile yıkayın. PBS'yi çıkardıktan sonra, bir mililitre tripsin çözeltisi ekleyin ve plakaları bir dakika boyunca inkübatöre geri koyun.
Ardından, hücreleri ayırmak ve ortamı 15 mililitrelik bir tüpe toplamak için plakaların üzerine iki mililitre kültür ortamı pipetleyin. Şimdi, bir hemositometre kullanarak koleksiyonların konsantrasyonunu kontrol edin. Daha sonra, 15 mililitrelik tüplerde hücrelerin alikotlarını hazırlayın.
Deney grubu için burada bir milyon endotel hücresi ve 200.000 parazitin bir kombinasyonu kullanılmaktadır. Daha sonra, hücre alikotlarını beş dakika boyunca 400 g'da santrifüjleyin. Ardından, hesaplanan matris jel hacmini hücre peletine ekleyin ve hava kabarcıkları enjekte edilemediğinden köpük oluşmaması için nazik pipetleme ile karıştırın.
Şimdi fareler enjekte etmeye hazır olana kadar hazırlıkları buz üzerinde tutun. Bir fareyi izofluran ile uyuşturduktan ve anestezi durumunu bir ayak parmağı tutamıyla doğruladıktan sonra, fareyi izofluran sağlayan yeniden solumayan sisteme takın ve ventral tarafı aşağı bakacak şekilde ısıtma yastığının üzerine yerleştirin. Şimdi her iki yan arka bölgeden yaklaşık bir santimetre kare saç alın.
Ardından, açıkta kalan cildi %70 alkol kullanarak silerek temizleyin. Daha sonra, hazırlanan hücre çözeltisinin bir mililitresini soğutulmuş bir şırıngaya yükleyin, bu da dört tıkaç için yeterlidir. Enjeksiyon yapmak için, deri altı boşluğunu bulmak için arka cildi kaldırın.
Daha sonra 200 mikrolitreyi göğüs kafesinin arka deri altı boşluğuna eşit şekilde yavaşça enjekte edin ve sızıntıyı önlemek için iğneyi yavaşça çıkarın. Enjeksiyondan sonra, bölgede bir yumru oluşacaktır. Bölgeyi alkolle silin, ardından daha sonra bulunabilmesi için çıkıntıyı kalıcı bir işaretleyici ile ana hatlarıyla belirtin.
Ardından, farenin diğer tarafında enjeksiyon prosedürünü tekrarlayın. Tüm hücreleri üç dakika içinde enjekte ettiğinizden emin olun, aksi takdirde şırıngaya yapışmaya başlarlar. Enjeksiyon adımı, matris jel tıkacının cilt ve kas katmanları arasında oluşmasını sağlamak için iyi bir performans sergilemek için kritik öneme sahiptir, böylece tıkaç iyi bir şekilde korunur ve dağınık hale gelmez.
Bir sonraki fareyi enjekte etmeye devam etmeden önce, matrisin jelleşmesi için zaman vermek için enjekte edilen farenin bir dakika boyunca ısı yastığı üzerinde kalmasına izin verin. Ötenaziden sonra, fareyi ameliyat aşamasına getirin. Enjeksiyon bölgesinden yeniden büyümüş tüyleri çıkardıktan sonra, tıkacın yerini tanımlayan işaret çizgilerini bulun.
Ardından, ince cerrahi makas kullanarak, tapanın işaretli kenarı boyunca, cilde dik ve altındaki kasın içinden geçen bir kesi yapın. İşaretli sınırın çevresini dikkatlice kesin. Ardından fişi çıkarın, cilt ve kas katmanları arasında sıkışmış halde tutun.
Kanı çıkarmak için tapayı hemen küçük bir PBS kabında durulayın. Ardından, tüm fişi 25 mililitre% 4 paraformaldehit içeren 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Herhangi bir çalkalama olmadan 24 saat oda sıcaklığında sabitlenmesine izin verin.
Ertesi gün, tapaları 24 saat boyunca 25 mililitre% 70 etanole aktarın. Ardından, parafin gömme ile devam edin. Sadece endotel hücreleri içeren tıkaçların bölümleri, bazı damarların 14 gün sonra in-vivo olarak konakçının kanı ile perfüze olmadığını göstermektedir.
Buna karşılık, hem endotel hücrelerini hem de parazitleri içeren tıkaçlar, 14 gün sonra in-vivo olarak birçok perfüze damar gösterir. Bu tıkaçlar, kırmızı renkte görülen, CD31 pozitif endotel hücrelerinin hemen yanında, yeşil renkte görülen düz kas aktin boyaması için pozitif hücrelere sahiptir. Bu nedenle, parazitler yeni ortaya çıkan kan damarı oluşumunda önemli bir rol oynayabilir.
Bu videoyu izledikten sonra, birden fazla hücre tipinde kullanılan kan damarı oluşumunu incelemek için bu güçlü in-vivo tekniğin nasıl uygulanacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu teknik, araştırmacıların fare modellerinde vasküler biyolojinin çeşitli konularını keşfetmelerinin yolunu açacaktır. Bu prosedürü takiben, gen ekspresyonu ve proteomikteki değişiklikler gibi ek soruları yanıtlamak için kantitatif PCR ve Western immünoblotlama gibi diğer yöntemler de çalıştırılabilir.
Bu güçlü teknik, araştırmacının kan damarı oluşumu sırasında endotel hücrelerinin ve parazitlerin nasıl etkileşime girdiğini in vivo olarak incelemesine izin verecektir. Bu androjenezde önemli bir adımdır. Bu güçlü teknik, araştırmacının, diğerlerinin yanı sıra pulmoner hipertansiyon gibi vasküler hastalıkları anlamakla ilgili diğer hücre-hücre etkileşimlerini incelemesine de izin verecektir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, matris jel tıkaç anjiyogenez testi kullanarak in vivo insan endotel-perisit etkileşimlerini incelemek için bir yöntem sunmaktadır. Test, kan damarı oluşumunda yer alan sinyal yolaklarını aydınlatmayı ve vasküler bozukluklarla ilişkili genleri tanımlamayı amaçlamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Anjiyogenez
- Hücre etkileşimleri
- Vasküler biyoloji
Arka Plan
- Endotel hücreler ve perisitler arasındaki etkileşim, kan damarı stabilitesi için kritik öneme sahiptir.
- Bu etkileşimlerin anlaşılması, vasküler bozukluklara dair içgörüler sağlayabilir.
- Matris jel tıkaç deneyi, bu süreçlerin in vivo gözlemlenmesine olanak tanır.
- Önceki çalışmalar, anjiyogenezde sinyal yolaklarının önemini vurgulamıştır.
Çalışmanın Amacı
- Endotel-perisit etkileşimlerini incelemek.
- Kan damarı oluşumunda yer alan sinyal yolaklarını belirlemek.
- İşlev bozukluğu durumunda vasküler bozukluklara yol açabilecek genleri araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- In vivo matriks jel deneyi.
- İnsan endotel ve perisit hücrelerinin kültürü.
- Kan damarı oluşumunun gözlemlenmesi.
- Sinyal yollarının ve gen ekspresyonunun analizi.
Ana Sonuçlar
- İn vivo ortamda endotel-perisit etkileşimlerinin başarılı bir şekilde kurulması.
- Anjiyogenezde yer alan temel sinyal yolaklarının belirlenmesi.
- Vasküler bozukluklarla ilişkili genlere dair öngörüler.
- Matriks jel tıkacı deneyinin avantajlarının gösterilmesi.
Sonuçlar
- Matriks jel tıpa deneyi, endotelyal-perisit etkileşimlerini incelemek için etkilidir.
- Bulgular, kan damarı oluşumunun anlaşılmasına katkıda bulunur.
- Vasküler bozuklukları hedefleyen terapötik stratejiler için potansiyel etkiler taşımaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Bu in vivo matriks jel tıkaç deneyi, vasküler hedef doğrulamasındaki risklerin azaltılması ve preklinik modellerdeki öngörü güvenilirliğinin artırılması için temel olan fizyolojik bir mikroortam içinde insan endotel-perisit etkileşimlerinin incelenmesine olanak tanıyarak anjiyogenez araştırmalarındaki kritik bir boşluğu doldurmaktadır. Deney, kan damarı olgunlaşması ve perisit katılımının mekanistik çalışmalarını destekleyerek pulmoner ve sistemik vasküler bozukluklar için translasyonel uygunluk sağlar. Perfüze damar oluşumu ve perisit kapsamı gibi fonksiyonel veriler sunarak mevcut in vitro sistemleri tamamlar; bu veriler, biyofarma Ar-Ge'sindeki hedef doğrulama ve öncü bileşik belirleme iş akışlarına doğrudan uygulanabilir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Vasküler olgunlaşmada endotel-perisit sinyalleşmesine ilişkin terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Hedef etkileşimini ve yolak modülasyonunu in vivo değerlendirmek için hastalıkla ilişkili bir sistem sağlar.
- Bilimsel Değer: Perisitlerin damar stabilitesi ve perfüzyondaki fonksiyonel rolünü açıklığa kavuşturarak mekanistik risk azaltmayı destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Karşılaştırmalı analiz için damar uzunluğu, sayısı, boyutu ve perisit kapsamı dahil olmak üzere histoloji tabanlı kantitatif çıktılar üretir.
- Operasyonel Değer: Analiz doğrulaması ve bileşik tarama kademeleri için uygun, standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir vasküler sonuçlar sağlar.
- Bilimsel Değer: Anjiyojenik veya anti-anjiyojenik adayların sonraki değerlendirmeleri için doğrulanmış biyolojik sistemlerin hazırlanmasına olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değeri: İmmün yetmezliği olan farelerde insan hücre nakli yoluyla, pulmoner hipertansiyon gibi vasküler bozuklukları incelemek için hastalığa özgü bir model sunar.
- Operasyonel Değeri: Perisit örtüsü ve damar olgunlaşmasını fonksiyonel sonuçlarla ilişkilendirerek translasyonel biyobelirteç uyumunu kolaylaştırır.
- Bilimsel Değeri: Vasküler ağ oluşumu üzerindeki genetik veya farmakolojik müdahalelerin değerlendirilmesine olanak tanıyarak preklinik sürekliliği destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu analiz, hedef doğrulamadan öncü bileşik tanımlamaya ve preklinik değerlendirmeye kadar uzanan keşif sürekliliğine uyum sağlar; özellikle anjiyojenik veya damar stabilize edici mekanizmaların fonksiyonel doğrulamasını gerektiren vasküler biyoloji programları için uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Canlı bir mikroçevrede endotel-perisit etkileşiminin gözlemlenmesine olanak tanıyarak hipotez testlerini ve yolak aydınlatmalarını destekler.
- Tarama: Kantitatif histolojik analiz için standartlaştırılmış tıkaç oluşumu, fiksasyon ve kesitleme yoluyla analiz hazırlığı sağlar.
- Analitik: Karşılaştırmalı durum değerlendirmesine imkan veren morfometrik ve perfüzyon tabanlı veriler (damar boyutu, sayısı, perisit kaplaması, RBC içeren lümenler) sunar.
- Translasyonel Araştırma: Pulmoner ve sistemik anjiyogenez ile ilgili insan vasküler etkileşimlerini in vivo modelleyerek preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Vasküler hedefler genelinde genetik çalışmalar, yolak sorgulamaları ve ilaç keşif kampanyaları için yeniden kullanılabilir bir platform olarak işlev görür.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Perisit bağımlı damar olgunlaşmasının doğrudan gözlemlenmesi yoluyla vasküler hedef doğrulamadaki mekanistik belirsizliği azaltarak öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Tanımlanmış hücre oranları, matriks jel hazırlama ve histolojik kantifikasyon protokolleri aracılığıyla tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu geliştirir.
- Stratejik Değer: Keşif sürecinin daha erken aşamalarında fonksiyonel vasküler olgunlaşma verileri sağlayarak go/no-go (devam/dur) kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: İn vivo perisit katılımı ve damar fonksiyonelliğine dayanarak vasküler hedeflerin riske göre ayarlanmış önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Primer insan hücre kültürü, steril cerrahi teknikler ve histolojik işlemleme konularında uzmanlık gerektirir.
- İmmün yetmezliği olan fare modellerine (örneğin, SCID) ve matriks jeline, perfüzyon markörlerine ve immünohistokimyasal reaktiflere erişime bağlıdır.
- Hücre hazırlama, enjeksiyon tutarlılığı ve körleme yöntemiyle yapılan histolojik analiz için ekipler arası standardizasyon gerektirir.
- Adaptasyon hususları arasında türe özgü hücre kaynakları, perisit türleri ve anjiyojenik ile anti-anjiyojenik bileşik testleri yer alır.
- Pratik kısıtlamalar arasında 14 günlük analiz süresi, plug geri kazanımındaki değişkenlik ve gerçek zamanlı görüntüleme yerine son nokta histolojik analizine olan bağımlılık bulunur.
