Aday Faktörü Soaked Boncuk ile birlikte Geçirimsiz Engelleri Uygulama Chick Endüktif Sinyalleri Eğitim için

Bu cerrahi müdahalenin amacı, sinyal moleküllerinin medial dokulardan lateral plaka mezodermindeki hücrelere yayılmasını önleyerek ve gen ekspresyonu üzerindeki etkisini inceleyerek civciv embriyosunda ekstremite indüksiyon mekanizmalarını aydınlatmaktır. Bu yöntem, uzuv tomurcuğu başlangıcını kontrol etmek için tümevarım sinyalleri nelerdir gibi gelişimsel biyolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin avantajı, civciv embriyosunun cerrahi manipülasyona açık olması ve çok sağlam olmasıdır, ayrıca ameliyat edilmemiş kontralateral kontrol uzuv tomurcuğu çok yararlı bir iç kontrol görevi görür.

Susan Wilde prosedürü gösterecek. Başlamak için 0,013 mm kalınlığında 1 cm kare alüminyum folyo parçası kesin ve %70 etanol ile silerek sterilize edin. Ardından kareyi 6 cm'lik steril plastik bir petri kabına yerleştirin.

Statik yapışmayı önlemek için kapağı atın ve aynı folyodan tabak için yeni bir tane yapın. Ardından, petri kabını 1,6x büyütmeye ayarlanmış bir dürbün mikroskobu altında bir sahne gratikülünün üzerine yerleştirin. Folyonun 2 mm uzunluğundaki 1,3 mm genişliğindeki şeritlerini kesmek için 15 numaralı küçük bir neşter kullanın.

İki çift dört numara saat yapımcısı forseps kullanarak folyo şeritleri ayırın. Ardından, folyo bariyerin ortasında bir menteşeye benzeyecek şekilde dik açılı bir kıvrım yapın. Petri kabının ortasındaki bariyerleri, bir tarafı tabağa karşı düz ve diğer tarafı tabağın dışına bakacak şekilde hizalayın, çalışma gününden önce 20 veya daha fazla bariyer hazırlayın.

Folyo kapağı tabağın üzerine yerleştirin ve bariyerleri rahatsız edilmeyecekleri bir yerde saklayın. Yumurta yan yatarken, bir çift AA tipi güçlü forseps sıkıca kavrayın ve yumurtayı serbest elinizle tutarken hava kesesini içeren yumurtanın künt ucunu delmek için kontrollü bir bıçaklama hareketi kullanın. İç kabuk zarının kırıldığından emin olun.

Daha sonra yumurtayı iki elinize alın ve yatay ekseni boyunca 180 derece çevirin. Daha sonra, yaklaşık 5 cm karelik bir parça şeffaf bant alın ve yumurta açıldığında yumurta kabuğunun embriyo üzerine parçalanmasını önlemek için bunu yumurtanın en üst yüzeyine sıkıca yapıştırın. Yumurtanın en üst kısmının ortasındaki kabuğu ve ilişkili iç hücre zarlarını nazikçe kırmak için bir çift kavisli makas kullanın.

Makasın bir bıçağıyla çok küçük bir delik açın, böylece embriyo üzerindeki yumurtaya hava girebilir. Kabuktaki deliği yaklaşık 1 cm çapında bir daireye büyütmek için makası kullanın. Yumurta büyüklüğündeki bu kabuk parçasını yumurtadan çıkarın.

Yumurtanın üzerindeki deliği yaklaşık 5 cm karelik şeffaf bir bantla kapatın. Bandı sadece deliğin ağzına yapıştırmak için bastırın ve kalan bandı serbest bırakın. Serbest bant daha sonra yumurtayı kolayca açmak için kavranabilir.

Kuluçka makinesinden bir evre 15 embriyosu alın ve yumurtayı 3.2x veya daha yüksek bir büyütmeye ayarlanmış bir binoküler mikroskop altında bir yumurta dayanağına yerleştirin. Ardından, şeffaf bandın üst katmanını çıkarın. Çelik bir mikro bıçak kullanarak, vitellin zarından bir kesi yapın ve embriyonun sağ tarafındaki somit 26-32'nin yanına mezodermi lateral yerleştirin.

Bir ucunda 5 numaralı mikro forseps bulunan bariyeri kaldırın ve serbest ucu kesiye sokmak için bariyeri bükün. Mümkün olan en kısa sürede, yumurtayı şeffaf bantla kapatın ve kuluçka makinesine geri koyun. Bir boncuk bir bariyer ile birlikte yerleştirilecekse, öncelikle retinoik aside batırılmış boncukları ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın.

Daha sonra, boncuğu ve bir çift 5 numaralı mikro forseps alın ve insizyonun distal tarafındaki lateral yer mezoderminin kesik yüzüne yerleştirin. Ardından, bariyeri boncuğun proksimalindeki kesiye yerleştirin. Yumurtayı kapatın ve derhal kuluçka makinesine geri koyun.

Bariyer olmadan boncuk veya boncuk takılacaksa uzun kesi yapmayın. Bunun yerine, vitellin zarından ve boncuğun yerleştirileceği pozisyonda yan plaka mezodermine küçük bir kesi yapın. Ardından, boncuğu ve 5 numaralı mikro forsepsleri alın ve yanal plaka mezodermindeki deliğe yerleştirin.

Forsepsin kapalı uçları ile biraz daha içeri itin. Kuluçka makinesinden pencereli bir onuncu aşama embriyo alın ve yumurtayı, tercih edilirse 3.2x veya daha yüksek büyütmeye ayarlanmış binoküler mikroskop altında bir yumurta dayanağına yerleştirin. Daha sonra, çelik bir mikro bıçak kullanarak, embriyonun kaudal ucundaki ilkel çizginin yanında, somitlerle aynı hizada, yaklaşık altı somit uzunluğu uzunluğunda, vitellin zarı ve lateral plaka mezodermi boyunca bir kesi yapın.

Daha sonra, bariyeri, petri kabından çıkıntı yapan bir çift 5 numaralı mikro forseps ile alın ve bariyerin serbest ucunu insizyona sokmak için elinizi çevirin. Mümkün olan en kısa sürede, yumurtayı şeffaf bantla kapatın ve kuluçka makinesine geri koyun. Bariyersiz bir boncuk yerleştirilecekse, boncuğun yerleştirileceği pozisyonda vitellin zarından ve yan plaka mezodermine küçük bir kesi yapın.

Ardından, boncuğu ve bir çift 5 numaralı mikro forseps alın ve yanal plaka mezodermindeki deliğe yerleştirin. Son olarak, forsepsin kapalı uçları ile biraz daha içeri itin. Burada gösterilen, evre 15 embriyosunda somit 26-32'nin varsayımsal bacak seviyesindeki bariyer pozisyonudur.

Bu bariyer hem Fhf10 hem de Fhf8 ekspresyonunun ameliyat edilen taraftaki bacak tomurcuk bölgesinde olmamasına ve ameliyat edilmeyen sol tarafta mevcut olmasına yol açar. Bununla birlikte, ameliyat edilen tarafta hem evre 19'da hem de evre 23'te Tbx4 ekspresyonu gözlenir. Bu, Tbx4 ekspresyonunun tek başına lpm'den arka bacak büyümesini başlatmak için yeterli olmadığı anlamına gelir.

Retinoik aside batırılmış boncuklar 15. aşamada bariyerin distaline yerleştirildiğinde, Tbx4, Fgf10 ve Fgf8'in tümü, sol kontrol tarafında oldukları için ameliyat edilen tarafta ifade edilir. Bu nedenle, normal gelişimde, uzuv tomurcuğu büyümesi başlamadan önce somitlerden gelen retinoik asit gereklidir. Bu videoyu izledikten sonra, indüktif sinyallerin civciv embriyosunda uzuv tomurcuğu başlangıcını nasıl düzenlediğini incelemek için geçirimsiz bariyerlerin ve aday ıslatılmış faktörlü boncukların nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.