Name: Aday Faktörü Soaked Boncuk ile birlikte Geçirimsiz Engelleri Uygulama Chick Endüktif Sinyalleri Eğitim için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Öğrenin, geçirimsiz bariyerler ve aday faktör boncukları kullanarak civciv embriyosunda uzuv tomurcuğu başlatma mekanizmalarını nasıl araştırılacağını. Bu yöntem gelişimsel biyolojide sinyal iletimini izole etmeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma MRC hibe MC.PC_13052 tarafından finanse edilmiştir.

<ol><li>Murillo-Ferrol, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causal+study+of+the+earliest+differentiation+of+the+morphological+rudiments+of+the+extremities.+Experimental+analysis+on+bird+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Anat+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Causal study of the earliest differentiation of the morphological rudiments of the extremities. Experimental analysis on bird embryos.</a> Acta Anat (Basel). 62 (1), 80-103 (1965).</li>
<li>Sweeney, R. M., Watterson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rib+development+in+chick+embryos+analyzed+by+means+of+tantalum+foil+blocks%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">Rib development in chick embryos analyzed by means of tantalum foil blocks).</a> Am J Anat. 126 (2), 127-149 (1969).</li>
<li>Kieny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+relations+between+somatic+and+somatopleural+mesoderm+before+and+during+primary+induction+of+chick+embryo+limbs%5BTitle%5D)+AND+%22C+R+Acad+Sci+Hebd+Seances+Acad+Sci+D%22%5BJournal%5D)">On the relations between somatic and somatopleural mesoderm before and during primary induction of chick embryo limbs.</a> C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 268 (26), 3183-3186 (1969).</li>
<li>Pinot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+somitic+mesoderm+in+the+early+morphogenesis+of+the+limbs+in+the+fowl+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">The role of the somitic mesoderm in the early morphogenesis of the limbs in the fowl embryo.</a> J Embryol Exp Morphol. 23 (1), 109-151 (1970).</li>
<li>Eichele, G., Tickle, C., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontrolled+release+of+biologically+active+compounds+in+chick+embryos%3A+beads+of+200-microns+diameter+for+the+local+release+of+retinoids%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Microcontrolled release of biologically active compounds in chick embryos: beads of 200-microns diameter for the local release of retinoids.</a> Anal Biochem. 142 (2), 542-555 (1984).</li>
<li>Cohn, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factors+induce+additional+limb+development+from+the+flank+of+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factors induce additional limb development from the flank of chick embryos.</a> Cell. 80 (5), 739-746 (1995).</li>
<li>Nishimoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RA+Acts+in+a+Coherent+Feed-Forward+Mechanism+with+Tbx5+to+Control+Limb+Bud+Induction+and+Initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">RA Acts in a Coherent Feed-Forward Mechanism with Tbx5 to Control Limb Bud Induction and Initiation.</a> Cell Rep. 12 (5), 879-891 (2015).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).</li>
<li>Stephens, T. D., McNulty, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+metameric+pattern+in+the+development+of+the+chick+humerus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Evidence for a metameric pattern in the development of the chick humerus.</a> J Embryol Exp Morphol. 61, 191-205 (1981).</li>
<li>Strecker, T. R., Stephens, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerves+do+not+play+a+trophic+role+in+limb+skeletal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Teratology%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerves do not play a trophic role in limb skeletal morphogenesis.</a> Teratology. 27 (2), 159-167 (1983).</li>
<li>Riddle, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+mediates+the+polarizing+activity+of+the+ZPA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA.</a> Cell. 75 (7), 1401-1416 (1993).</li>
<li>Ng, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+limb+identity+gene+Tbx5+promotes+limb+initiation+by+interacting+with+Wnt2b+and+Fgf10%5BTitle%5D)+AND+%22Devel%22%5BJournal%5D)">The limb identity gene Tbx5 promotes limb initiation by interacting with Wnt2b and Fgf10.</a> Devel. 129 (22), 5161-5170 (2002).</li>
<li>Takeuchi, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tbx5+and+Tbx4+trigger+limb+initiation+through+activation+of+the+Wnt%2FFgf+signaling+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Devel%22%5BJournal%5D)">Tbx5 and Tbx4 trigger limb initiation through activation of the Wnt/Fgf signaling cascade.</a> Devel. 130 (12), 2729-2739 (2003).</li>
<li>Lee, J., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+and+pattern+formation+in+the+developing+chick+wing%3A+SEM+and+quantitative+studies+of+early+effects+on+the+apical+ectodermal+ridge+and+bud+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid and pattern formation in the developing chick wing: SEM and quantitative studies of early effects on the apical ectodermal ridge and bud outgrowth.</a> J Embryol Exp Morphol. 90, 139-169 (1985).</li>
<li>Tickle, C., Crawley, A., Farrar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+application+to+chick+wing+buds+leads+to+a+dose-dependent+reorganization+of+the+apical+ectodermal+ridge+that+is+mediated+by+the+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Devel%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid application to chick wing buds leads to a dose-dependent reorganization of the apical ectodermal ridge that is mediated by the mesenchyme.</a> Devel. 106 (4), 691-705 (1989).</li>
<li>MacCabe, J. A., Parker, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+gradient+of+a+morphogenetic+substance+in+the+developing+limb%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence for a gradient of a morphogenetic substance in the developing limb.</a> Dev Biol. 54 (2), 297-303 (1976).</li>
<li>Summerbell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zone+of+polarizing+activity%3A+evidence+for+a+role+in+normal+chick+limb+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">The zone of polarizing activity: evidence for a role in normal chick limb morphogenesis.</a> J Embryol Exp Morphol. 50, 217-233 (1979).</li>
<li>Wilde, S. M., Wedden, S. E., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoids+reprogramme+pre-bud+mesenchyme+to+give+changes+in+limb+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Devel%22%5BJournal%5D)">Retinoids reprogramme pre-bud mesenchyme to give changes in limb pattern.</a> Devel. 100 (4), 723-733 (1987).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Biz civciv embriyo ekstremite tomurcuğu oluşumunu önlemek için geçirimsiz engellerin kullanımını tanımlamak. Bu teknik, kritik adımlar bir numarası vardır. Ön deneyler ardından, 9 kullanılan menteşe şeklinde bariyerler, 10 düz engelleri çok daha iyi embriyo yerinde olduğunu ortaya koydu. Bariyerin uzak düz tarafı vitellin membran yapışır ve yeri (Şekil 2C &#39;)&#39; de bariyer tutar. protokolün adım 1.6 de tarif edildiği gibi alüminyum folyo menteşe şeklinde engeller dikkatli hazırlanması işleminin başarısı için çok önemlidir. İkinci önemli adım yumurta çok uzun pencereleme takip ve embriyo üzerinde faaliyet öncesinde evreleme için inkübatör dışına bırakılmış değil emin olmaktır. Bizim tecrübelerimize göre, embriyolar operasyon gerçekleştirildiği zaman onlar veya inkübasyon sıcaklığında yakınında ise bir operasyon daha iyi hayatta. Operasyon bu nedenle mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır ve yumurta istemi resealedly iyi sağkalım oranlarını sağlamak. Birçok araştırmacı inkübatör yumurta dönmeden önce mikrocerrahi aşağıdaki embriyoya antibiyotik bir damla ekleyin. sıvının mevcudiyeti pozisyonda de yapışmasını engeller engelledi. antibiyotik eklenmesi de yerleştirilmesinden sonra boncuk yerinden olabilir. Bu nedenle antibiyotik, hızlı operasyonlar ve aletleri ile iyi temizlik kullanmayan enfeksiyonu önlemek için tavsiye edilir. Bir işlemin her aşamasında, aşağıdaki% 70 etanol ile aletleri silme (protokol adım 3.1.2.2 bakınız) engeller veya boncuklar iki forseps bağlı neden olabilir Vitellin membran ile temas yapışkan hale gelen araçlar bilmek esastır. kullanılan boncuk Her iki çeşit operasyondan sonra yersiz düşebilir. bariyer pozisyonu ertesi gün kontrol edildi zaman boncuk yerinde ya da değil kalan olup olmadığını tespit etmek için bariyerini görmek mümkün değildi. boncuk düşmüştü durumlarda kanat tomurcuk akıbet kurtarıldı değildi ( <stRong&gt; Tablo 1). Onları implantasyonu sırasında boncuk ile sıvı transfer kaçınmak boncuk (protokol 2.3.2.3 bakınız) LPM kesilmiş yüzüne daha kolay sopa anlamına gelir. Sonunda embriyolar hasat iyi takip eden gen ekspresyon analizi için kritik hemen sonra sabit olmasını sağlamak (protokol adım 4.2). Bu protokol, uzuv tomurcuk başlamasını önlemek için engelleri kullanılan daha önce yayınlanan deneyleri değiştirir bariyerleri özel optimum genişlikleri tanımlar ve gen ekspresyon analizi takiben birleştirerek bariyer ve boncuk yerleştirme tanıttı. Biz ucuz ve tüm laboratuvarlarda hazır olan klasik alüminyum folyo kullanarak bulundu, daha önce tantal folyo kullanılan olanlar eşit sonuçlar üretir. Folyo in situ hibridizasyon (Şekil 2C &#39;)&#39; de yerine getirirken embriyoda yaptı ama birden fazla embriyo embriyolar zarar folyo keskin kenarları önlemek için işleniyor eğer biz genellikle kaldırmak olabilir. Pilot çalışmalar, bacak bölgesi engellerin genişliği özellikle önemli olduğunu göstermiştir. Başlangıçta trialed bariyerler çok kısa ve bacak tomurcuk akıbet engelledi değildi. 1.2-1.3 mm tamamen bacak tomurcuk akıbet engellemek için bir bariyer için optimum genişlik olduğunu. bir doğru yerleştirebilirsiniz dar kanat engelleri tomurcuk akıbet iyi sağkalım oranlarını vermek önlemek için. Bu 0.5-0.7 mm kadar dar olabilir. Ancak, biraz daha geniş olan engelleri (biz 0,7-1 mm kullanılır) onlar yerleştirme küçük bir yanlışlık izin çünkü kanat tomurcuk akıbet tam engellenmesine yol açar olasılığı daha yüksektir. kan damarlarının kaçınma zaman kesi yaparak kanat tomurcuk seviyesi engelleri için kritik öneme sahiptir. Yarı geçirgen bariyerler önce civciv bacak tomurcuk iki eşit parçaya böler için kullanılmıştır. MacCabe ve Parker, 1976 ve Summerbell, 1979 hem kullanılan filtreler sırasıyla 0.45 mikron ve 0,8 mikron gözenek boyutu, 16, 17. Onlar yayılabilir sinyaller filtreleri ve gözenekler yoluyla geçebileceği bildirildiSonuçlar yarı geçirgen bariyerler geçirimsiz bir tantal folyo bariyer ile hiçbir mevcut bariyer ve biriyle bacak tomurcuk arasındaki orta idi kullanılarak kazandı. Bu protokol, boyutu veya sinyal yayılma dinamiklerini değiştirme göre aday sinyalleri ayırt etmek için farklı gözenek büyüklüğü yarı geçirgen bariyerler kullanmak üzere adapte edilebilir. Bu protokol esas model organizma kendisi ile ilişkili çeşitli sınırlamalar vardır. Bu tür teknikler uzuv gelişiminde başka sorular ve aynı zamanda omurgalı embriyogenez diğer soruları araştırmak için kullanılabilir. Bir şartı civciv embriyo müdahale için erişilebilir olduğu zaman, söz konusu organı / alan geliştirme gerektiğidir. Bir bariyer yerleştirilmesi gereken bölgede büyük kan damarlarının varlığı bariyer yerleştirme sonraki aşamada 13 veya teknik açıdan zorlayıcı 14 daha yapar. büyük kan damarları bariyer yerleştirme sırasında kesilir ise bu embriyo mortaliteye neden olabilir. Transkripsiyon T faktörleri zaman bizim soruşturmaBX5 ve Tbx4 ilk LPM indüklenen daha sonra sırasıyla karşıt ya kanat veya bacak tomurcuk sona ereceğini bir bariyer koyabilirsiniz en erken aşamada sınırlı kalmıştır. Gastrulasyon yakın daha erken aşamaları ile TBX gen indüksiyonunu bloke girişimi aydınlatıcı olabilir. erken bir engel olası kanat bölgesinde yer olabilir başarıyla sahne 8 ve daha sonraki hızlı büyüme bariyer ve sonuçları yerinden çünkü bacak bölgesi aşamasında 10&#39;da Bu protokol muhtemelen bacak tomurcuk aşamalarında ötesinde gen ifadesinin çalışma için uygun değildir sadece bir engel oluşturma başlangıç ​​konumuna geçirilmesi ile ilgilidir. Bu bağlamda civciv embriyo sınırlamaları ile ilgili olması, diğer omurgalı model organizmalar üzerinde avantajları çoktur. civciv embriyo omurgalı bir embriyo fiziksel müdahale bu tür için çok uygun bir hayvan modeli. Embriyolar, nispeten büyük ve Throu kolayca erişilebiliryumurta kabuğu gh. Bir başka deney için embriyo dönebilirsiniz (örneğin, bir boncuk 18 ya da bir bariyer çıkarılması) veya basitçe bant pencere kaldırarak gidişatını kontrol etmek için. Canlı görüntüleme veya zaman atlamalı görüntüleme dahil etmek mümkün kapsamı vardır. Biz özellikle erken evre embriyolar üzerinde çalışan için uygundur tavuk yumurtası Pencereleme bir yöntem açıklanmaktadır. ekstremite çalışmaları durumda her bir biyolojik deney için ideal bir iç kontrol olarak hizmet vermektedir her deney için bir kontralateral kontrol uzuv olduğunu çok önemli ve yararlı olduğunu. sinyal moleküllerinin batırılmış uzuv akıbet ve boncuk önlemek için geçirimsiz bariyerler kullanarak kombinasyonu daha önce rapor edilmemiştir. Bu tür müdahaleleri aşağıdaki mRNA Bizim analizi de romandır. Bu teknikler uzuv özel transkripsiyon Tbx5 ve Tbx4 de LPM uyarılan ve olan faktörleri ne zaman zor bir problemi incelemek için etkinDaha sonra, önceden tomurcuğu başlatılması uzuv olduğunu göstermek için, LPM bu tbx genlerin varlığı FGF10 transkripsiyon aktivasyonu ve bacak tomurcuk büyümesinin başlaması için yeterli değildir. 2G, 2D ve 2E iyi bu bulguları olarak göstermektedir. Şekil 2G aşamasında 10 bir bariyer sokulması şu Tbx4 ifade olmaması Tbx4 indüksiyonundan sonra, aşama 15 bariyer yerleştirilmesi, aşağıdaki 2D ve 2E varlığını taban tabana zıttır. RA batırılmış boncuklar implantasyon bariyer yerleştirilmesi ve bacak tomurcuk akıbet başlamadan önce LPM gerekli olan Somitlerin gelen RA kadar puan aşağıdaki ekstremite tomurcuğu başlatılması kurtarılmasını kolaylaştırdı. Bu tür teknikler uzuv gelişiminde başka sorular değil, aynı zamanda omurgalı embriyogenez diğer soruları çözmek için kullanılabilir. beyin, göz ve gövde alanları uygun olması muhtemeldir.

Klasik embriyolog geleneksel embriyonik gelişimini kontrol mekanizmaları sorgulamak için fiziksel teknikler kullandı. 1960&#39;lar ve 1970&#39;lerde araştırmacılar embriyogenez sırasında endüktif sinyallerin önemini göstermek için gelişen embriyonun dokularında arasına eklenen geçirimsiz bariyerler kullanılan teknikleri geliştirdi. Bizim ilgi bacak tomurcuk akıbet önce hangi etkinliklerin omurgalı ekstremite gelişimi ve özellikle olduğunu. Örneğin, bir bariyer yerleştirilmesi bu karşı, ameliyat edilmemiş tarafta normal olarak devam etmesine izin verirken, civciv embriyo bir tarafında meydana gelen bacak tomurcuk büyümesini engelleyebilir. Bu engeller değişik yapmak için kullanılan maddeler; Örneğin, mika plakaları 1 ve tantal folyo 2. Bu engeller etkin bir Somitlerin gelen ekstremite tomurcuğu formları, paraxial mezodermden oluşan hangi yanal plaka mezoderm (LPM), ayrı. Cerrahi aşılama teknikleri bu yakın ilişki zekâ göstermekbacak tomurcuğu başlatılması LPM 3 4 meydana ise H Somitlerin gereklidir. 80&#39;li ve 90&#39;lı yıllarda gelişimsel biyologlar gelişimsel süreçleri kontrol altına alınmasında gerekli olan sinyal molekülleri yayılabilir keşfetti. Bu sinyal molekülleri ile ıslatılmış Boncuk embriyonun belirli bölgelerde implante ve embriyonik gelişim değişiklikler üretmek olabilir. Bir civciv embriyo içine implante ve rakamlardan 5 ayna görüntüsü çoğaltılması üretebilir Örneğin, iyon değişimi boncuklar tarafından alınan retinoik asit (RA) 24 saatlik bir süre içinde serbest bırakılır. FGF protein içeren heparin akrilik boncuk interlimb LPM 6 uzuv tomurcuk büyümesini başlatabilir. Daha yakın zamanlarda, fare ve balık genetiği (7 gözden) yeni bir dönemin içine omurgalı bacak başlama çalışma almış. bacak tomurcuk başlamadan önce Somitlerin RA mevcut LP tarafından gerekli olan temel yayılabilir sinyal olduğunu iyi kanıtlar bulunmaktadırM bacak tomurcuklanmayı başlatmak için. Biz ekstremite tomurcuğu başlama sefer LPM gen ifadesi üzerinde bariyer implantasyon etkisini incelemek için civciv embriyo erişilebilirliğini ve deneysel sağlamlık istismar etmek istedim. Bizim yöntemin bir roman uyarlaması bir engel birleştirmek olduğunu bariyer tarafından bloke edilmiş dışsal olarak tedarik aday endojen faktörler bariyer boncuk yerleştirme yanal ile eksenel dokulardan blok sinyaller. Aşağıdaki protokoller ekstremite tomurcuk indüksiyon ve inisiyasyon mekanizmalarını didiklemek için geliştirilmiş olanlardır. bacak tomurcuk başlatılması incelenmesi erken evre embriyolar kullanarak anlamına gelir. ilk derialtı iğne ile hava kesesi yoluyla albumin bazı kaldırarak birçok araştırmacı pencere tavuk yumurtası. sarısı üstüne yatıyor embriyo, daha sonra yumurta düşük yalan olur. Bu, elektroporasyon gibi teknikler, bir avantaj, ancak embriyo cerrahi manipülasyon isteniyorsa bir dezavantaj olabilir.Mümkün bir avantaj olarak biz yumurta açılışına yakın embriyoya sahip bulmak. Sorular omurgalı bacak tomurcuk indüksiyon ve başlatılmasını kontrol sinyalleri ile ilgili kalır ve aşağıdaki protokoller onlara hitap etmek uygundur. Biz daha erken bir aşamada 12 8 daha aşamada civciv bacak tomurcuk akıbet önlemek için engellerin yerleştirilmesi için bir protokol geliştirmek için ilk bulunmaktadır. Bu protokollerin değiştirilmiş versiyonları da primordium kaynaklı olmak için erişilebilir bir indükleyici doku bitişik yatıyor kökeni ve endüktif ipuçlarının zamanlaması diğer soruları kullanılabilir. embriyo bölgesi, ilgili bir gelişim aşamasında erişilebilir sunulmuştur, daha sonra bir engel çalışılan iki doku ve gelişme sonucu değişiklikler arasında yerleştirilebilir. Örnekler, karaciğer ya da böbrek indüksiyon beyin gelişimi eksen uzantısı ve muhtemelen organ gelişmesinde bulunabilir.

<table><tbody><tr><td>Dumont No. 5 saatçi forseps, x2</td><td>Güzel Bilim Aletleri&nbsp; www.finescience.de</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont No. 4 saatçi forseps, x2</td><td>Güzel Bilim Aletleri&nbsp; www.finescience.de</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont güçlü forseps, AA tipi</td><td>Güzel Bilim Aletleri&nbsp; www.finescience.de</td><td>11210-10</td><td></td></tr><tr><td>2,5 cm uzunluğunda</td> <td>bıçaklı kavisli makasGüzel Bilim Araçları&nbsp; www.finescience.de</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Künt uçlu kavisli forseps, uçlar yaklaşık 0.5&nbsp; cm uzunluğunda</td><td>Güzel Bilim Aletleri www.finescience.de</td><td>11065-07</td><td></td></tr><tr><td>Çelik pim, 0,2 mm genişliğinde</td><td>Güzel Bilim Aletleri&nbsp; www.finescience.de</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Bileme taşı, kare</td><td>Güzel Bilim Aletleri&nbsp; www.finescience.de</td><td>29008-01</td><td></td></tr><tr><td>Mineral yağ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>İğne tutucu</td><td>Güzel Bilim Aletleri&nbsp; www.finescience.de</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Şeffaf bant, 50 mm x 66&nbsp; m</td><td>www.5staroffice.com</td><td>295985</td><td></td></tr><tr><td>FGF4 proteini</td><td></td><td></td><td>Cliff Tabin'den bir hediye.</td></tr><tr><td>all-trans-retinoik asit</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>R2625-50MG</td><td>Işıktan korumayı unutmayın.</td></tr><tr><td>BMS 493</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>B6688-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Neşter bıçağı No. 15</td><td>www.swann-morton.com</td><td>kedi no. 0105</td><td></td></tr><tr><td>Affi-Gel Mavi, afinite kromatografi jeli</td><td>Bio-Rad www.bio-rad.com</td><td>153-7301</td><td>Protein vermek için boncuklar.</td></tr><tr><td>AG1-X2 İyon değiştirici reçine</td><td>Bio-Rad www.bio-rad.com</td><td>140-1251</td><td>RA veya BMS 493 vermek için boncuklar.</td></tr><tr><td>Yumurtalar için kuluçka makinesi</td><td>Memmert www.hce-uk.com</td><td>LAB128</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA)</td> <td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>P6148-1KG</td><td>Zararlı, tahriş edici, aşındırıcı. Tozu tam koruyucu giysiyle çeker ocakta tutun.</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>32221-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, yüksek glikozlu</td><td>Gibco www.thermofisher.com</td><td>41965-039</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td><td>Fisher Scientific webshop.fishersci.com</td><td>D/4121/PB08</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Binoküler Mikroskop&nbsp;</td><td>Leica www.leica-microsystems.com</td><td>MZ6</td>, <td>M60 Tavuk</td></tr><tr><td>yumurtası</td><td>ile değiştirildi Henry Stewart & Co Ltd sales@medeggs.com</td><td></td><td>Kahverengi Yumurtalar</td></tr></tbody></table>

aday faktörü soaked boncuk ile birlikte geçirimsiz engelleri uygulama chick endüktif sinyalleri eğitim için

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

civciv embriyo doğrudan bir şekilde gelişim soruları incelemek için kullanılabilecek mükemmel bir omurgalı bir model sağlar. cerrahi girişim sonrasında erişilebilirlik ve sağlamlık önemli deneysel güçlü vardır. Mika levhalar civciv bacak tomurcuk başlamasını 1 önlemek için kullanılan ilk engelleri vardı. kanat tomurcuk veya bacak tomurcuk indüksiyon ve ya başlatılması için geçirimsiz bir bariyer olarak alüminyum folyo kullanmak Protokoller tarif edilmektedir. Biz bariyer tarafından engellendi arz aday endojen faktörlerin dışsal olarak bariyere boncuk yerleştirme yanal ile bu tekniği birleştirir. Sonuçlar daha sonra gen ekspresyonu, in situ hibridizasyon ile analiz edilmiştir. Ana odak indüksiyon retinoik asit sinyalizasyon ve civciv embriyo ön ve hindlimb sonraki başlatılması rolüdür. Bu BMS 493 kullanımı (retinoik asit reseptörleri bir ters agonist (RAR)) yan levha mezoderm (LPM) implante batırılmış boncuklar bir bar etkisini taklit etmek içinrier Somitlerin (retinoik asit kaynağıyla (RA)) ve ekstremite tomurcukları büyümesi olan LPM arasına yerleştirilir. Bu protokollerin değiştirilmiş versiyonları da endüktif ipuçları kökeni ve zamanlaması konusunda diğer soruları kullanılabilir. civciv embriyo bölgesi, ilgili bir gelişim aşamasında erişilebilir sunulmuştur, bir engel çalışılan iki doku ve gelişme sonucu değişiklikler arasında yerleştirilebilir. Örnekler, karaciğer ya da böbrek indüksiyon gibi gelişmekte olan beyin, ekseni uzantısında ve organ gelişiminde bulunabilir.

Yukarıda detaylı bir protokol Nishimoto ve arkadaşları kullanılan yöntemleri tarif eder. 2015 kağıt ön ve civciv embriyo hindlimb hem de bacak tomurcuk indüksiyon ve başlatılması inceler. Ön ayakları tomurcuk akıbet önlemek için geçirimsiz engellerin yerleştirilmesi aşağıdaki sonuçlar önceden 1, 2, 9 yayınlanmış ancak bacak tomurcuk başlatılması 1 önlenmesi sadece bir çalışma açıklayan engeller olmuştur. Nishimoto ve ark arka bacak verileri. 2015 bariyer yerleştirme aşağıdaki mRNA ifadesinin çalışmanın temsilcisi sonuçları burada sunulmuştur. LPM içinde Tbx4 İfade Arka ayağın akıbet başlatın için yeterli değildir: Şekiller 2B ve C (Tablo 2) aşama 15 (Şekil 2A) o bariyer yerleştirilmesini gösteren iki FGF10 yol açar (protokol 3.2)ve FGF8 ifade işletilen sağ tarafta (braket ile gösterilen) bacak tomurcuk bölgede yok olma. Opere sol tarafı ile karşılaştırın. Ancak, Tbx4 ifade işletilen tarafında (Şekil 2B ve E) hem sahnede 19 ve evre 23&#39;te görülmektedir. Biz yalnız Tbx4 ifade LPM hindlimb akıbet başlatmak için yeterli değildir sonucuna varıldı. Civciv diğer çalışmalar TBX gen ön ayakları tomurcuk oluşumu 12, 13 başlatmak için yeterli olduğunu ileri sürmüşlerdir. Şekil 2C &#39;bir engel embriyo sonrası fiksasyon bacak bölgesinde ankastre görünüyor nasıl göstermek için dahil edilmiştir. Vakalar engellerin çoğunda önceden in situ hibridizasyon (protokol 4.3) &#39;de çıkarıldı. Somitlerin RA FGF10 İndükler Ekstremite Bud O önce LPM içinde Essentialutgrowth: Şekil 3A, 15 sahne (protokol 3.2.1.3) eklenen bir bariyere RA batırılmış kordon distal eklenmesini temsil eden bir şemadır. (Bir yıldız işareti ile belirtilmiştir) bu işlem bacak tomurcuk büyümesinin da kontrol sol tarafında olduğu gibi tomurcuk olarak ifade edilmiştir ameliyat sağ tarafta Tbx4, FGF10 ve FGF8 gözlenmektedir takiben (Şekil 3B, C ve D, Tablo 2) . Böylece LPM için RA eklenmesi bariyer ve bacak tomurcuğu başlatılması ilerledikçe etkisini ortadan kaldırır. Biz ekstremite tomurcuk akıbet başlatılabilir önce Somitlerin normal gelişim RA&#39;da LPM gerekli olduğu sonucuna varıldı. Ortaya çıkan hindlimb tomurcukları kontrol tarafında olanlar genellikle daha küçüktür. Bu LPM yabani tip duruma denk olmama RA dozuna bağlı olabilir. RA dozu çok yüksek ise Apikal Ektodermal Ridge (AER) kısaltılabilir ve küçük tomurcukları neden olur14, 15. LPM içinde (Somitlerin itibaren) o RA doğrulamak için normal bir uzuv tomurcuk başlatılması RAR, BMS 493 ters agonist için gereklidir, kullanılmıştır. Boncuk aşamada 15 bacak bölge LPM implante edilir (Şekil 3E) (protokol 3.2.1.4 bakınız). FGF10 ifade kontrol tarafı (; Tablo 3 Şekil 3F) ile karşılaştırıldığında daha küçük hindlimb tomurcukları sonuçlanan 493 boncuk LPM içinde BMS aşağıdaki uygulama downregüle olmaktadır. Kontrol DMSO boncuklar bu hataları (; Tablo 3 Şekil 3G ve 3H) neden olmaz. BMS 493 Uygulamayı takip eden gözlenen kusurlar bir engel operasyonu ile uyarılan daha hafif olan; yani FGF10 hala ifade edilir ve bacak tomurcukları oluşur. BMS 493 etkileri boncuk etrafında yerel sınırlıdır ve axi tarafından üretilen tüm RA antagonize mümkün olmayabilir, çünkü bu olması muhtemeldirark dokular. Erken Eksenel Sinyaller sonra Tbx4 Express LPM Hücreleri belirtin: LPM muhtemel bacak oluşturan bölgede Tbx4 ifade kabiliyetini kazanır Biz test ettik. bir engel daha sonra bacak tomurcuk akıbet bloke edeceği eklenebilir en erken evre, sahnede daha erken aşamalarında paraxial mezoderm ve olası bacak arasına yerleştirilen 12. Engelleri engelleri eklemek için bir protokol geliştirmek için ilk olan aşama 10&#39;dur aşama 10&#39;da LPM aşamasında 10 eksenel dokulardan gelen bir sinyal daha sonra ekspresyon için gerekli olduğunu göstermektedir, blok bacak tomurcuk oluşumu ve bacak oluşturucu LPM bölgesindeki Tbx4 ekspresyonunu (Şekiller 2F ve 2G, Tablo 2) (protokol 3.4) hindlimb LPM içinde Tbx4. Daha sonra bariyer yerleştirme Tbx4 ifade veriyor Şekil 2D ve E bu sonuç karşılaştırkurulacak. Ayrıca, biz bu eksen sinyali RAR ters agonist Tbx4 ifadesini azaltır olmadığını gözlemleyerek RA olup olamayacağını test ettik. Evre 10 (protokol 3.4.1.3 bakınız) hindlimb LPM yerleştirilen bir BMS 493 boncuk DMSO batırılmış kontrol boncuklar Tbx4 ifade (Şekil 2J ve 2K) etkilemez oysa, Tbx4 ifadesini (Şekil 2H ve 2I) downregüle. Birlikte, bu sonuçlar eksenel dokulardan RA sinyali olumlu hindlimb LPM 7 Tbx4 düzenleyerek uzuv indüksiyon düzenleyen bir model destekler. Post-operatif Ölüm: Tablo 1, 2 ve 3 ameliyat sonrası ve hasat önce ölen civciv embriyo sayısı da dahil olmak üzere deneysel sonuçların ayrıntılı bilgi veriniz. Bazı ölümler bu tür mikrocerrahi sonra beklenemez. sayılar ölen tutulabilir<html> araçlar temiz olduğundan emin yaparak asgariye, yumurta delik embriyolar bu son nokta operasyonu ile birlikte, asgari süre için yapışkan bant mühür koruması olmadan sol ve olduğunu, minimum boyutu gerekli olan mümkün olduğu kadar hızlı bir şekilde gerçekleştirilir. Bu operasyonların hiçbiri çok zaman alıcı ama boncuk ve engellerin ilgili işlemler biraz daha zaman alabilir vardır. Bu önlemlere rağmen, operasyon erken bir evrede de gerçekleştirilebilir ve kanat bölgesinde, bu ölümüne neden olması muhtemeldir. ölüm nedeniyle kan kaybına yol açabilir bacak oluşturan bölgeler ve bu gemilerin kazayla rüptürü etrafında büyük kan damarları vardır. Biz yumurta olan embriyolar ameliyat değil, sık sık ertesi gün ölecek evre 8 ya da 9, açılan bulabilirsiniz. Bu nedenle, bu sorunlar tek çözüm deneyler yüksek dizi deneyi gerçekleştirmek üzere olan. d / 54618 / 54618fig2.jpg &quot;/&gt; Muhtemel Bacak Düzeyde Bariyer veya Boncuk Ekleme aşağıdaki Şekil 2. Marker Gen İfadesi değişiklikler. (A) aşama 15 embriyoda olası bacak seviyesi (Somitlerin 26-32) de şematik gösteren bariyer pozisyonu (yeşil hat). (B - E ve G) işletilen embriyolar üzerinde DİLERİZ analizi. Bacak bölgesi (parantez) belirtilmiştir. (B) FGF10 ifade işletilen LPM eksik olan, fakat sağlam bir sentezleme sol tomurcuk tespit edilir. (C) FGF8 ifadesi hiçbir AER olduğunu düşündüren, ameliyat tarafı yoktur. (C &#39;) bir bariyer çıkarılmadan önce, aynı embriyosu. (D) Tbx4 kontrol tomurcuk aynı Rostro-kaudal düzeyde LPM olarak ifade edilir. (E) Tbx4 ifade ekstremite büyüme olmamasına rağmen sağ bacak bölgesinde tutulur. (F) bir sahnenin şematik<html> varsayımsal bacak seviyesinde bariyer pozisyonu (yeşil hat) gösteren 10 civciv embriyosu. (G) Tbx4 ifade işletilen sağ LPM (braket) &#39;de yoktur. (H) olası bacak seviyesinde BMS 493 boncuk pozisyonu (mor daire) gösteren bir sahne 10 civciv embriyo şematik diyagramı. (I) Tbx4 ifade BMS 493. (J) kontrol DMSO boncuk pozisyonu (gri daire) gösteren bir sahne 10 civciv embriyo şematik diyagram ile tedaviyi takiben ameliyat sağ tarafında downregüle olmaktadır. (K) Tbx4, tek başına DMSO ile işleme tabi kontrolü sol tarafının edilene benzer bir düzeyde çalışan yandaki ifade edilir. Bu şekil 7 ile modifiye edilmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> d / 54618 / 54618fig3.jpg &quot;/&gt; Şekil 3. RA kurtarır Ekstremite Bud&#39;un Devamsızlık Bariyer Ekleme Yarattığı ve Bacak Bud kıbet öncesinde LPM Essential olduğunu. (A) olası bacak seviyesinde (Somitlerin 26-32) ve RA-batırılmış boncuk (kırmızı daire) bariyer konumunu (yeşil hat) gösteren şematik diyagram. (B - D) (bir yıldızla gösterilir) RA kurtarır bacak tomurcuk sonucudur. (B) Tbx4 ifade un çalışan tarafına benzer kurtarıldı bacak tomurcuk halinde mevcuttur. (C) FGF10 kurtarıldı bacak un çalışan tarafına benzer tomurcuğun ifade edilir. (D) FGF8 kurtarıldı sağ bacak tomurcuk AER olarak ifade edilir. BMS 493 boncuk (mor halkalar) evre 15 embriyo olası bacak LPM yerleştirildi nerede (E) şematik göstermektedir. (F) FGF10 ifade çalışan sağ tarafta downregüle ve bacak tomurcuk küçük aşağıdaki BMS 49 mesafesindedir3 tedavi. Boncuk üst yıldızlı vardır. Kontrol DMSO boncuklar (gri daireler) konumunu gösteren (E) ila (G) &#39;dekine benzer şematik. (Yıldız ile gösterilen) (H) DMSO boncuk FGF10 ifade ya da bacak tomurcuk büyüklüğü etkilemedi. Bu şekil 7 ile modifiye edilmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Sahne bariyer yerleştirilmiş (+ boncuk) * </td><td> sayı işletilen </td><td> Kanat eksik ** </td><td> Kanat mevcut ** </td><td> sayı ölü </td></tr><tr><td> Aşama 12-14 </td><td> 40 </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> Aşama 8/9 </td><td> 65 </td><td> 23 </td><td> 0 </td><td> 42 </td></tr><tr><td> Aşama 12-13 (FGF4 boncuk) </td><td> 41 </td><td> 7 (boncuk eksik) </td><td> 17 </td><td> 17 </td></tr><tr><td> Aşama 12-13 (RA boncuk) </td><td> 75 </td><td> 9 (boncuk eksik) </td><td> 32 </td><td> 34 </td></tr><tr><td> Aşama 13 (kontrol boncuk) </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="5"> * Somitlerin 15-20 ve yan plaka mezoderm arasına yerleştirilen 0,7-1 mm folyo engelleri. 0.35 mg / ml FGF4 kordon. 0.05-0.1 mg / ml RA kordon. </td></tr><tr><td colspan="5"> DMSO kontrolü kordon. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** Chick embriyolar sabit aşamaları 21-23 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Kanat Seviye Bariyer ve Boncuk Deney Sonuçları. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Sahne bariyer yerleştirilmiş (+ boncuk) * </td&gt; <td> sayı işletilen </td><td> Bacak eksik ** </td><td> Bacak mevcut ** </td><td> sayı ölü </td></tr><tr><td> Aşama 12-15 </td><td> 43 </td><td> 39 </td><td> 0 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Aşama 10/11 </td><td> 23 </td><td> 16 </td><td> 0 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Aşama 15 (FGF4 boncuk) </td><td> 8 </td><td> 0 </td><td> 5 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Aşama 15 (RA boncuk) </td><td> 18 </td><td> 0 </td><td> 18 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="5"> * Somitlerin 26-32 ve yan plaka mezoderm arasına yerleştirilen 0,7-1,3 mm folyo engelleri. 0.35 mg / ml FGF4 kordon. 0.05-0.1 mg / ml RA kordon. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** Chick embriyolar sabit aşamaları 18-24 </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Bacak Seviye Bariyer ve Boncuk Deney Sonuçları. <table border = &quot;1&quot; fo: keep-together.within sayfa = &quot;1&quot; fo: keep-ile-next.within sayfa = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> sayı işletilen </td><td> Bacak küçük tomurcuk </td><td> Bacak biraz küçük tomurcuk </td><td> Bacak tomurcuk normal boyut </td><td> sayı ölü </td></tr><tr><td> BMS 493 boncuk * </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15 </td><td> 12 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> DMSO boncuklar ** </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 12 </td><td> 0 </td><td> 3 </td><td> 9 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="5"> * 5 mg batırılmış 2-3 boncuk / ml BMS 493 bacak seviyesinde doğru aşama 14-15 LPM yerleştirilir. </td></tr><tr><td colspan="5"> DMSO batırılmış ** 2-3 boncuk yalnız bacak seviyesinde doğru aşama 15 LPM yerleştirilir. </td></tr><tr><td colspan="5"> Civciv embriyolar aşamalarında sabit 17-19. </td></tr></tbody></table> Tablo 3. Ayak Seviye BMS 493 Boncuk Deney Sonuçları.

Ekstremite oluşumu için gerekli olan civciv embriyosunda ana gövde ekseni ve yan dokuları arasındaki indüksiyon olaylarını engellemek için geçirimsiz bariyerler kullanan protokoller anlatılmaktadır. Aday indüktif sinyallere batırılmış boncuklar, bariyer yerleşiminin etkisinin üstesinden gelmek için kullanılır ve gen ekspresyonunun analizi bunu doğrular.

Aday Faktörü Soaked Boncuk ile birlikte Geçirimsiz Engelleri Uygulama Chick Endüktif Sinyalleri Eğitim için

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

Bu cerrahi müdahalenin amacı, sinyal moleküllerinin medial dokulardan lateral plak mezodermindeki hücrelere yayılmasını önleyerek ve bunun gen ekspresyonu üzerindeki etkisini inceleyerek, civciv embriyosundaki ekstremite indüksiyon mekanizmalarını aydınlatmaktır. Bu yöntem, ekstremite tomurcuğu başlangıcını kontrol eden indüktif sinyallerin neler olduğu gibi gelişimsel biyolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin avantajı, civciv embriyosunun cerrahi manipülasyona açık ve oldukça dayanıklı olmasıdır; ayrıca, operasyon yapılmamış karşı taraf kontrol ekstremite tomurcuğu çok kullanışlı bir iç kontrol görevi görür.Prosedürü Susan Wilde gösterecektir. Başlamak için, 0,013 mm kalınlığında alüminyum folyodan 1 cm'lik kare bir parça kesin ve %70 etanol ile silerek sterilize edin. Ardından, kare parçayı 6 cm'lik steril plastik bir petri kabına yerleştirin.Statik yapışmayı önlemek için kapağı atın ve aynı folyodan kap için yeni bir kapak yapın. Ardından, petri kabını binoküler bir mikroskobun altında, 1,6x büyütmeye ayarlanmış bir sahne gratikülünün üzerine yerleştirin. Folyodan 2 mm uzunluğunda ve 1,3 mm genişliğinde şeritler kesmek için 15 numara bıçaklı küçük bir skalpel kullanın.Folyo şeritleri, iki çift dört numara saatçi pensi kullanarak ayırın. Ardından, folyo bariyerin merkezinde, bir menteşeye benzeyecek şekilde dik açılı bir bükme yapın. Bariyerleri petri kabının merkezinde, bir tarafı kaba düz şekilde yapışık ve diğer tarafı kaptan dışarıya doğru yukarı bakacak şekilde hizalayın; operasyon gününden önce 20 veya daha fazla bariyer hazırlayın.Folyo kapağı kabın üzerine yerleştirin ve bariyerleri rahatsız edilmeyecekleri bir yerde saklayın. Yumurta yan yatmış haldeyken, bir çift tip AA güçlü forsepsi sıkıca kavrayın ve yumurtayı boş elinizle tutarken, hava kesesini içeren küt ucu kontrollü bir saplama hareketiyle delin. İç kabuk zarının yırtıldığından emin olun.Ardından, yumurtayı iki elinizle tutun ve yatay ekseni boyunca 180 derece döndürün. Sonra, yaklaşık 5 cm kare şeklinde şeffaf bir bant parçası alın ve yumurta açıldığında yumurta kabuğunun embriyonun üzerine dökülmesini önlemek için bunu yumurtanın en üst yüzeyine sıkıca yapıştırın. Yumurtanın en üst kısmının merkezindeki kabuğu ve buna bağlı iç hücre zarlarını nazikçe kırmak için kavisli bir makas kullanın.Havanın embriyonun üzerindeki yumurtaya girebilmesi için makasın tek bir ucuyla çok küçük bir delik açın. Yumurta kabuğundaki deliği, makas kullanarak yaklaşık 1 cm çapında bir daireye kadar genişletin. Yumurtanın üzerinden bu parça boyutundaki kabuğu çıkarın.Yumurtadaki deliği yaklaşık 5 cm kare boyutunda şeffaf bir bant parçasıyla kapatın. Bandı, geri kalan kısmı serbest bırakacak şekilde sadece deliğin kenarına yapışacak şekilde bastırın. Serbest kalan bant parçası, yumurtanın mühürünü kolayca açmak için tutulabilir.İnkübatörden 15. evre bir embriyo alın ve yumurtayı, 3,2x veya daha yüksek büyütme oranına ayarlanmış bir binoküler mikroskop altındaki yumurta tutucuya yerleştirin. Ardından, üstteki şeffaf bant katmanını çıkarın. Çelik bir mikro bıçak kullanarak, embriyonun sağ tarafındaki 26-32 numaralı somitlerin bitişiğindeki vitellin membran ve lateral yer mezodermi üzerinden bir insizyon yapın.Bariyeri bir ucundan 5 numara mikro pens ile tutun ve boşta kalan ucunu kesi içerisine yerleştirmek için bariyeri döndürün. En kısa sürede yumurtayı şeffaf bantla mühürleyin ve inkübatöre geri koyun. Bariyerle birlikte bir boncuk yerleştirilecekse, öncelikle ekteki metin protokolünde açıklandığı şekilde retinoik asit emdirilmiş boncuklar hazırlayın.Ardından, boncuğu ve 5 numara mikro pensi alın ve bunları insizyonun distal tarafındaki lateral plak mezoderminin kesik yüzeyine yerleştirin. Daha sonra, bariyeri boncuğun proksimalindeki insizyona yerleştirin. Yumurtayı mühürleyin ve vakit kaybetmeden inkübatöre geri koyun.Eğer bir boncuk veya birden fazla boncuk bariyer olmadan yerleştirilecekse, uzun insizyon yapmayın. Bunun yerine, vitelline membran boyunca ve boncuğun yerleştirileceği konumdaki lateral plak mezodermine küçük bir insizyon yapın. Ardından, boncuğu ve 5 numara mikro penseti alarak lateral plak mezodermindeki deliğe yerleştirin.Pensetin kapalı uçlarıyla biraz daha içeri itin. İnkübatörden pencereli bir evre on embriyosu alın ve yumurtayı, tercih edilirse 3,2x veya daha yüksek büyütmeye ayarlanmış binoküler mikroskop altındaki bir yumurta desteğine yerleştirin. Ardından, çelik bir mikro bıçak kullanarak, embriyonun kaudal ucunda, somitlerle aynı hizada, primitif çizginin lateralinden vitellin membran ve lateral plak mezodermi boyunca yaklaşık altı somit uzunluğunda bir insizyon yapın.Ardından, bariyeri petri kabından dışarı uzanan ucundan 5 numara mikro pensle tutun ve bariyerin boşta kalan ucunu kesi içerisine yerleştirmek için elinizi döndürün. En kısa sürede yumurtayı şeffaf bantla mühürleyin ve inkübatöre geri yerleştirin. Bariyersiz bir boncuk yerleştirilecekse, vitellin membran üzerinden ve boncuğun yerleştirileceği konumdaki lateral plaka mezodermine doğru küçük bir kesi yapın.Ardından, boncuğu ve 5 numara mikro penseti alarak yan plaka mezodermündeki deliğe yerleştirin. Son olarak, pensetin kapalı uçlarıyla boncuğu biraz daha içeri itin. Burada, evre 15 bir embriyoda, 26-32. somitlerin varsayılan bacak seviyesindeki bariyer pozisyonu gösterilmektedir.Bu bariyer, opere edilen tarafta bacak tomurcuğu bölgesinde hem Fhf10 hem de Fhf8 ekspresyonunun yok olmasına, opere edilmeyen sol tarafta ise mevcut olmasına yol açar. Ancak, opere edilen tarafta hem 19. evrede hem de 23. evrede Tbx4 ekspresyonu gözlemlenir. Bu durum, Tbx4 ekspresyonunun tek başına lpm'den arka ekstremite büyümesini başlatmak için yeterli olmadığını göstermektedir.Retinoik asit emdirilmiş boncuklar 15. evrede bariyerin distal kısmına yerleştirildiğinde, Tbx4, Fgf10 ve Fgf8'in tamamı, sol kontrol tarafında olduğu gibi opere edilen tarafta da eksprese edilir. Dolayısıyla, normal gelişimde, uzuv tomurcuğu büyümesi başlatılmadan önce somitlerden gelen retinoik asit temel bir gerekliliktir. Bu videoyu izledikten sonra, tavuk embriyosunda indüktif sinyallerin uzuv tomurcuğu başlatılmasını nasıl düzenlediğini incelemek için geçirimsiz bariyerlerin ve aday faktör emdirilmiş boncukların nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

application-impermeable-barriers-combined-with-candidate-factor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Çeşitli büyüme faktörleri ve proteinler, hücre gelişimi sırasında farklı hücre kaderi almaya ikna etmek için etkileşim. Burada E2.5 civciv embriyolarının boncuk koyarak gelişimin farklı proteinler arasındaki etkileşimleri adresine ovo hazırlanmasında kullanımı göstermektedir.

Erken Evre Tavuk Embriyolar Büyüme Faktörü-Kaplı Boncuk yerleştirme

Sinir indüksiyon beyin oluşumunda ilk adımdır. Hensen düğüm (düzenleyen), sinir kaderi kabul komşu doku talimatını hangi bir mekanizma, yani sinir sistemi yol açmaları. Bu video civciv embriyo sinir indüksiyonu için bir test göstermektedir.

Civciv Embriyo Sinir İndüksiyon için Testi

Bu makale, kraniyofasiyal gelişimi sırasında sinyalizasyon ve yüzey sefalik ektoderm desenlendirme özellikleri test etmek için tasarlanmış bir doku nakli tekniği açıklar.

Kraniofasial Geliştirme sırasında Ektodermal Epiteli Sinyal Özellikleri değerlendirilmesi

Erken Civciv Embriyo morfogenetik Doku deformasyonlar Takibi

Gelişim sırasında tavuk embriyosunu görüntülemek ve ona erişmek zor olabilir. Basit, uygun maliyetli ve bir sınıfta veya araştırma ortamında kolayca kullanılabilecek bir ex ovo yöntemi geliştirdik. Bu yöntem, embriyonik gelişimin geç aşamalarına kadar embriyoya erişim sağlar (HH 40).

Optimize Ex-ovo Kalkınma Gelişmiş Aşamaları Chick Embriyolar ekimi

Büyüme faktörlerine veya sinyal yollarının spesifik inhibitörlerine batırılmış boncukları gelişmekte olan embriyolara aşılayarak, etkilerini in vivo olarak doğrudan test etmek mümkündür. Bu protokolde, bu moleküllerin gen ekspresyonu ve sinyal iletimi üzerindeki etkilerini belirlemek için boncuklar uzuv tomurcuğuna aşılanır.

Gen İfade Etkileyen Sinyal İletimi Pathways tanımak Tavuk Embriyo uzuvlar Geliştirme içine Boncuk eklenme

Burada, iletilen ışık ve floresan mikroskobu kullanarak hızlandırılmış görüntüleme için civciv embriyolarını ex ovo kültürlemek için yeni bir teknik sunuyoruz. Batık filtre kağıdı sandviçi, sıvı bir kültür ortamına tamamen batırılmış civciv embriyolarının kültürlenmesine izin veren, iyi bilinen filtre kağıdı taşıyıcı tekniğinin1 bir çeşididir.

Uzun vadede bir Batık Filtre Kağıdı Sandviç Ex Ovo Time-lapse Görüntüleme

Biz floresan etiketlemeyi yüzeysel geçirme yöntemleri tarif Hücre çoğalmasıyla tarafından ve geçiş görselleştirmek için bir düz-mount kültür etiketli hücre hareketinin hızlandırılmış görüntüleme için hücre gelişmekte olan piliç optik tectum davranış .

Görselleştirme teğet hücre göç gelişmekte olan piliç optik Tectum içinde

Islatılmış boncuk testi, hücre farklılaşmasının ve morfogenezinin düzenlenmesini incelemek için herhangi bir gelişimsel zaman noktasında test reaktifinin hedeflenmiş olarak verilmesini içerir. Üç farklı tipte ıslatılmış boncuk hazırlamak ve bunları bir tavuk embriyosunun ara rakamlarına implante etmek için herhangi bir deneysel hayvan modeline uygulanabilir ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.

Islatılmış Boncuk Tahlili Kullanılarak Tavuk Embriyogenezi Sırasında Hücre Farklılaşması, Morfogenez ve Desenleme Analizi

Civciv, çeşitli çalışmalar için uygun maliyetli, erişilebilir ve yaygın olarak bulunan bir model organizmadır. Burada, kuş iç kulağı gelişimi ve yenilenmesinin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için bir dizi protokol detaylandırılmıştır.

Ovo ve Ex Ovo'da Kuş İç Kulak Gelişimini İnceleme Yöntemleri

Öğrenin, geçirimsiz bariyerler ve aday faktör boncukları kullanarak civciv embriyosunda uzuv tomurcuğu başlatma mekanizmalarını nasıl araştırılacağını. Bu yöntem gelişimsel biyolojide sinyal iletimini izole etmeye olanak tanır.

Aday Faktörü Soaked Boncuk ile birlikte Geçirimsiz Engelleri Uygulama Chick Endüktif Sinyalleri Eğitim için

Daha fazla video keşfet