Aday Faktörü Soaked Boncuk ile birlikte Geçirimsiz Engelleri Uygulama Chick Endüktif Sinyalleri Eğitim için

Bu cerrahi müdahalenin amacı, sinyal moleküllerinin medial dokulardan lateral plak mezodermindeki hücrelere yayılmasını önleyerek ve bunun gen ekspresyonu üzerindeki etkisini inceleyerek, civciv embriyosundaki ekstremite indüksiyon mekanizmalarını aydınlatmaktır. Bu yöntem, ekstremite tomurcuğu başlangıcını kontrol eden indüktif sinyallerin neler olduğu gibi gelişimsel biyolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin avantajı, civciv embriyosunun cerrahi manipülasyona açık ve oldukça dayanıklı olmasıdır; ayrıca, operasyon yapılmamış karşı taraf kontrol ekstremite tomurcuğu çok kullanışlı bir iç kontrol görevi görür.

Prosedürü Susan Wilde gösterecektir. Başlamak için, 0,013 mm kalınlığında alüminyum folyodan 1 cm'lik kare bir parça kesin ve %70 etanol ile silerek sterilize edin. Ardından, kare parçayı 6 cm'lik steril plastik bir petri kabına yerleştirin.

Statik yapışmayı önlemek için kapağı atın ve aynı folyodan kap için yeni bir kapak yapın. Ardından, petri kabını binoküler bir mikroskobun altında, 1,6x büyütmeye ayarlanmış bir sahne gratikülünün üzerine yerleştirin. Folyodan 2 mm uzunluğunda ve 1,3 mm genişliğinde şeritler kesmek için 15 numara bıçaklı küçük bir skalpel kullanın.

Folyo şeritleri, iki çift dört numara saatçi pensi kullanarak ayırın. Ardından, folyo bariyerin merkezinde, bir menteşeye benzeyecek şekilde dik açılı bir bükme yapın. Bariyerleri petri kabının merkezinde, bir tarafı kaba düz şekilde yapışık ve diğer tarafı kaptan dışarıya doğru yukarı bakacak şekilde hizalayın; operasyon gününden önce 20 veya daha fazla bariyer hazırlayın.

Folyo kapağı kabın üzerine yerleştirin ve bariyerleri rahatsız edilmeyecekleri bir yerde saklayın. Yumurta yan yatmış haldeyken, bir çift tip AA güçlü forsepsi sıkıca kavrayın ve yumurtayı boş elinizle tutarken, hava kesesini içeren küt ucu kontrollü bir saplama hareketiyle delin. İç kabuk zarının yırtıldığından emin olun.

Ardından, yumurtayı iki elinizle tutun ve yatay ekseni boyunca 180 derece döndürün. Sonra, yaklaşık 5 cm kare şeklinde şeffaf bir bant parçası alın ve yumurta açıldığında yumurta kabuğunun embriyonun üzerine dökülmesini önlemek için bunu yumurtanın en üst yüzeyine sıkıca yapıştırın. Yumurtanın en üst kısmının merkezindeki kabuğu ve buna bağlı iç hücre zarlarını nazikçe kırmak için kavisli bir makas kullanın.

Havanın embriyonun üzerindeki yumurtaya girebilmesi için makasın tek bir ucuyla çok küçük bir delik açın. Yumurta kabuğundaki deliği, makas kullanarak yaklaşık 1 cm çapında bir daireye kadar genişletin. Yumurtanın üzerinden bu parça boyutundaki kabuğu çıkarın.

Yumurtadaki deliği yaklaşık 5 cm kare boyutunda şeffaf bir bant parçasıyla kapatın. Bandı, geri kalan kısmı serbest bırakacak şekilde sadece deliğin kenarına yapışacak şekilde bastırın. Serbest kalan bant parçası, yumurtanın mühürünü kolayca açmak için tutulabilir.

İnkübatörden 15. evre bir embriyo alın ve yumurtayı, 3,2x veya daha yüksek büyütme oranına ayarlanmış bir binoküler mikroskop altındaki yumurta tutucuya yerleştirin. Ardından, üstteki şeffaf bant katmanını çıkarın. Çelik bir mikro bıçak kullanarak, embriyonun sağ tarafındaki 26-32 numaralı somitlerin bitişiğindeki vitellin membran ve lateral yer mezodermi üzerinden bir insizyon yapın.

Bariyeri bir ucundan 5 numara mikro pens ile tutun ve boşta kalan ucunu kesi içerisine yerleştirmek için bariyeri döndürün. En kısa sürede yumurtayı şeffaf bantla mühürleyin ve inkübatöre geri koyun. Bariyerle birlikte bir boncuk yerleştirilecekse, öncelikle ekteki metin protokolünde açıklandığı şekilde retinoik asit emdirilmiş boncuklar hazırlayın.

Ardından, boncuğu ve 5 numara mikro pensi alın ve bunları insizyonun distal tarafındaki lateral plak mezoderminin kesik yüzeyine yerleştirin. Daha sonra, bariyeri boncuğun proksimalindeki insizyona yerleştirin. Yumurtayı mühürleyin ve vakit kaybetmeden inkübatöre geri koyun.

Eğer bir boncuk veya birden fazla boncuk bariyer olmadan yerleştirilecekse, uzun insizyon yapmayın. Bunun yerine, vitelline membran boyunca ve boncuğun yerleştirileceği konumdaki lateral plak mezodermine küçük bir insizyon yapın. Ardından, boncuğu ve 5 numara mikro penseti alarak lateral plak mezodermindeki deliğe yerleştirin.

Pensetin kapalı uçlarıyla biraz daha içeri itin. İnkübatörden pencereli bir evre on embriyosu alın ve yumurtayı, tercih edilirse 3,2x veya daha yüksek büyütmeye ayarlanmış binoküler mikroskop altındaki bir yumurta desteğine yerleştirin. Ardından, çelik bir mikro bıçak kullanarak, embriyonun kaudal ucunda, somitlerle aynı hizada, primitif çizginin lateralinden vitellin membran ve lateral plak mezodermi boyunca yaklaşık altı somit uzunluğunda bir insizyon yapın.

Ardından, bariyeri petri kabından dışarı uzanan ucundan 5 numara mikro pensle tutun ve bariyerin boşta kalan ucunu kesi içerisine yerleştirmek için elinizi döndürün. En kısa sürede yumurtayı şeffaf bantla mühürleyin ve inkübatöre geri yerleştirin. Bariyersiz bir boncuk yerleştirilecekse, vitellin membran üzerinden ve boncuğun yerleştirileceği konumdaki lateral plaka mezodermine doğru küçük bir kesi yapın.

Ardından, boncuğu ve 5 numara mikro penseti alarak yan plaka mezodermündeki deliğe yerleştirin. Son olarak, pensetin kapalı uçlarıyla boncuğu biraz daha içeri itin. Burada, evre 15 bir embriyoda, 26-32. somitlerin varsayılan bacak seviyesindeki bariyer pozisyonu gösterilmektedir.

Bu bariyer, opere edilen tarafta bacak tomurcuğu bölgesinde hem Fhf10 hem de Fhf8 ekspresyonunun yok olmasına, opere edilmeyen sol tarafta ise mevcut olmasına yol açar. Ancak, opere edilen tarafta hem 19. evrede hem de 23. evrede Tbx4 ekspresyonu gözlemlenir. Bu durum, Tbx4 ekspresyonunun tek başına lpm'den arka ekstremite büyümesini başlatmak için yeterli olmadığını göstermektedir.

Retinoik asit emdirilmiş boncuklar 15. evrede bariyerin distal kısmına yerleştirildiğinde, Tbx4, Fgf10 ve Fgf8'in tamamı, sol kontrol tarafında olduğu gibi opere edilen tarafta da eksprese edilir. Dolayısıyla, normal gelişimde, uzuv tomurcuğu büyümesi başlatılmadan önce somitlerden gelen retinoik asit temel bir gerekliliktir. Bu videoyu izledikten sonra, tavuk embriyosunda indüktif sinyallerin uzuv tomurcuğu başlatılmasını nasıl düzenlediğini incelemek için geçirimsiz bariyerlerin ve aday faktör emdirilmiş boncukların nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.