Tedavi Kan Retina Bariyer ihlali ve Potansiyel İlaçlar değerlendirilmesi için bir Akut Retina Modeli

Düşük maliyetli, kullanımı kolay ve güçlü bir sistem histamin tarafından uyarılan kan retina bariyer ihlali iyileştirecek potansiyel tedaviler değerlendirmek için kurulmuştur. Kan damarı sızıntı, Müller hücre aktivasyonu ve nöron sürekliliği bir potansiyel ilaç, Lipoksin A4 hasarı yanıtını ve ters değerlendirmek için kullanılır.

Bu ex vivo retinal model sistemin genel amacı, kan nöral bariyer ihlalini iyileştiren ilaçları taramaktır. Bu yöntem, nöral dejeneratif hastalıklar alanında, erken olayların neler olduğu ve bu hastaların tedavisine yardımcı olabilecek ilaçları nasıl tarayabileceğimiz gibi birkaç önemli soruyu cevaplayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, düşük maliyetli, kullanımı kolay, hızlı ve uyarlanabilir olmasıdır.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir çünkü güvenilir ve tekrarlanabilir veriler elde etmek, iyi örnekler oluşturmak için teknik becerilere bağlıdır. Ticari bir kaynaktan elde edilen ilk domuz retinaları burada kullanılmaktadır. Kaynaktan temin edildikten sonra, gözbebekleri dört derecede veya buz üzerinde tutulmalı ve mümkün olan en kısa sürede işlenmelidir.

Göz kapağını açmak için lensin etrafını keserek bir doku kültürü başlığında diseksiyona başlayın. Sonra bir fırça kullanarak, retinayı çekmeden vitröz mizahı nazikçe çıkarın. Optik diski ortaya çıkarmak için retinayı kesik kenardan nazikçe ayırmak için bir fırça kullanın.

Optik siniri bir ustura ile kesin ve retinayı serbest bırakın. Retinayı bir petri kabına aktarın ve soğuk HBSS kullanarak retinayı bir kez dikkatlice durulayın. Numuneyi HBSS'ye buz üzerine yerleştirin.

Ardından, retinayı simetrik olarak ikiye kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın. Tedaviler gerektiğinde, retinanın bir yarısı tedavi edilirken, aynı retinanın diğer yarısı, taban çizgisini belirlemek ve hayvan varyasyonlarını düzeltmek için işlenmelidir. Numuneleri, oyuk başına üç mililitre stabilizasyon ortamı içeren altı oyuklu bir plakaya nazikçe aktarın.

Retinaları% 5 karbondioksit içeren atmosfere sahip bir inkübatörde 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca dengeleyin. İnkübasyondan sonra, stabilizasyon ortamını dikkatlice aspire edin ve her oyuğa histamin ve LXA4 içeren üç mililitre ortam ekleyin. Numuneleri bir saat daha inkübe edin.

Ilık steril PBS ile duruladıktan sonra, her bir oyuğa üç mililitre% 4 PFA ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. İnkübasyon süresi geçtikten sonra, PFA'yı hızlı bir şekilde aspire edin ve numuneleri PBS ile bir kez durulayın. Kuyucuklara% 10 sükroz ekleyin ve dört santigrat derecede iki ila dört saat inkübe edin.

Ardından, %10 sakarozu% 30 sükroz ile değiştirin ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, çalışma dondurma ortamı yapmak için bir kısım ticari dondurma ortamını iki kısım% 20 sükroz ile karıştırın. Hava kabarcıkları kaybolana kadar gece boyunca veya daha uzun süre dört santigrat derecede bırakın.

Ertesi gün,% 30 sakaroz'u çalışan dondurma ortamı ile değiştirin ve oda sıcaklığında beş dakika dengelenmesine izin verin. Dengelemeden sonra, her retinayı üç milimetreye beş milimetre dikdörtgen şeklinde kesin, ardından retina dilimlerini bir alüminyum folyo silindirinde bulunan dondurma ortamına yerleştirerek dondurun. Kesit üzerine retinanın bir kesitini sağlamak için retina dilimlerinin dikey olduğundan emin olun ve bunları sıvı nitrojen içinde dondurun.

Bir kriyostat üzerindeki her bloğu 14 mikronluk dilimler halinde bölümlere ayırın ve bölümleri cam slaytlara monte edin. Slaytları kullanana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Bölümleri %5 sükroz fosfat tamponu veya SPB ile yıkayarak immün boyamaya başlayın.

Daha sonra, bölümleri inkübe ederek ve oda sıcaklığında bir saat boyunca tamponu bloke ederek spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke edin. Daha sonra, bölümleri uygun primer antikor ile bir saat inkübe edin. Bir saat geçtikten sonra, solüsyonu aspire edin ve bölümleri %5 SPB'de üç kez yıkayın.

Daha sonra, ışıktan korunurken bölümleri karşılık gelen ikincil antikorlarla bir saat boyunca inkübe edin. Bölümleri %5 SPB ile üç kez yıkadıktan sonra, numuneleri DAPI içeren ortama monte ederek ve lameller ile kaplayarak mikroskopi için hazırlayın. Son olarak, konfokal bir mikroskop kullanarak görüntüleri yakalayın.

İşlemin genişliğini ölçmek için, dış nükleer katman gibi işlemlerin gerçekleştirildiği bölümün bir alanını seçmek için büyüteç aracını kullanın. Ardından, bu tür işlemlerin görünür ve sürekli olduğu bir optik alan seçin. Ölçek çubuğunu mikroskobik ayara göre ayarlamak için ana menüdeki analiz aracına tıklayın ve ardından alt menüde ölçeği ayarla'ya tıklayın.

Ana menüde çizgi işlevini seçin ve süreç boyunca bir çizgi çizin. Ölçümü gerçekleştirmek için ana menüde çözümle'ye tıklayın ve ardından alt menüde ölç'e tıklayın. Sürecin sürekliliğini analiz etmek için ana menüye dönün ve ilgilenilen bölge olarak iç pleksiform katmanı seçmek için çokgen işlevini kullanın.

Analiz et'e tıklayarak alanı ölçün ve ardından ölç'ü tıklayın. Her pikseli komşu varyantıyla değiştirerek görüntüdeki kenarları geliştirmek için işlemi, filtreyi ve ardından varyantları tıklayın. Ardından, görüntü, ayar, parlaklık ve kontrast ve ardından otomatik seçeneğine tıklayarak kontrastı ve parlaklığı otomatik olarak ayarlayın.

Sonra çizgileri sayın. Bu görüntülerde IGG immünoreaktivitesi kırmızı renkte görülmektedir. Kontrol gruplarında, IGG kan damarları içinde sınırlıdır.

Histamin grubunda, IGG kan damarlarından tespit edilir ve burada noktalı dairelerle gösterilen sızıntı bulutları oluşturur. LXA4 ile tedavi edilen gruplarda, IGG yine kan damarları içinde kısıtlanır. LXA4'ün daha fazla eklenmesi, histamin tarafından indüklenen damarların işlevini kurtarır.

Bu histogram, test edilen gruplar arasında sızdıran kan damarlarının yüzdesini gösterir. Bu görüntülerde, Muller hücrelerini boyayan GFAP için immün boyama sunulmaktadır. Muller hücrelerinin işlemlerinde, retina boyunca ve kan damarlarının çevresinde pozitif boyama elde edilir.

Tüm gruplardan Muller hücre süreçlerinin genişliği sunulmaktadır. Histamin veya tek başına LXA4 ile tedavi, işlem genişliğini azalttı. Ancak her iki reaktif birlikte uygulandığında, işlem genişliği kurtarıldı.

Bu görüntülerde, MAP2 için immün boyama sunulmaktadır. Ganglion hücrelerinin işlemlerinden ve hücre gövdelerinden pozitif lekelenme gözlenir. Tüm gruplardan sürekli MAP2 pozitif ganglion hücre süreçlerinin yoğunluğu sunulmuştur.

Histamin ile tedavi, dendritik süreçlerin sürekliliğini azaltırken, LXA4'ün önemli bir etkisi yoktur. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu deney, uygun şekilde yapılırsa, diseksiyon için retina başına beş dakika, tedavi için altı dakika, ardından kesit alma, immün boyama ve analiz ile üç ila beş gün içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, taze doku kullanmak ve uygun kontroller yapmak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, kalsiyum ve mitokondriyal özellik seviyelerindeki gerçek zamanlı değişiklikleri izlemek için canlı görüntüleme gibi diğer yöntemler eklenebilir. Bu videoyu izledikten sonra, bu ex vivo akut retina kültürü modelini, bir BRB disfonksiyonu oluşturmak, hasarı değerlendirmek ve potansiyel ilaçları taramak için nasıl kullanacağınızı iyi anlamış olmalısınız. İzlediğiniz için çok teşekkür ederim ve deneylerinizde en iyi dileklerimle.