Name: Tedavi Kan Retina Bariyer ihlali ve Potansiyel İlaçlar değerlendirilmesi için bir Akut Retina Modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Keşfedin, histamin kaynaklı kan retina bariyeri ihlalleri için lipoksin A4 ile hasar değerlendirmesi yapılan düşük maliyetli ekz vivo domuz retina modelini. Bu yöntem nörodejeneratif hastalıklarda ilaç taraması için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bringhurst Meats (Berlin, NJ), domuz gözbebeklerini sağlamadaki gerçek yardımları için kabul edilmektedir.

Tüm protokoller geçerli nereye Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi politikalarına uygun yürütülmüştür. 1. Hazırlık <ol><li> % 75 ile sabitleme ortamı hazırlamak Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM),% 25 Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS). kullanılana kadar -20 ° C&#39;de, iyi kısım ve mağaza karıştırın. </li><li> Fosfat tamponlu tuz (PBS) hazırlanması ve otoklavda sterilize edilir. Oda sıcaklığında çözüm saklayın. Deney (oyuk başına 5 mi) daha önce 37 ° C&#39;ye kadar PBS ısıtın. </li><li> % 10,% 20 ve PBS içinde% 30 sukroz hazırlayın. ayrı sterilizasyon için ayrı 0.22 mikron filtre üzerinden tüm çözümleri filtre. 4 ° C&#39;de çözüm kaydedin. </li><li> 90 mM&#39;lik bir konsantrasyona kadar PBS içinde histamin stok çözelti hazırlayın. 0.22 uM filtre üzerinde filtre edilerek çözelti sterilize edin. Kısım ve -80 ° C&#39;da, çözelti kaydedin. Birden fazla donma-ve-çözülme döngüleri kaçının. </li><li> deneyden önce PBS içinde taze% 4 paraformaldehid (PFA) yapın. Buz üzerine yerleştirin. Dikkat: Davlumbaz PFA tutun ve uygun koruyucu ekipman giyin. </li><li> stabilizasyon orta (retinanın başına 20 ml) çözülme. 100 U / ml bir son konsantrasyona kadar Penisilin-Streptomisin ekleyin. Deney öncesi bir inkübatörde 37 ° C&#39;ye kadar ortam (retinanın başına 15 mi) sıcak bölümü. buz üzerinde orta kalanı bırakın. </li><li> buz üzerinde HBSS (retinanın başına 10 ml) koyun. </li></ol> 2. Retina Organotipik Kültür <ol><li> Bir doku kültürü kaputu örnekleri aktarın. lensin etrafında keserek Göz yuvası açın. Bir fırça yardımıyla hafifçe retina üzerine çekerek olmadan vitreus mizah kaldırın. Yavaşça optik diski ortaya çıkarmak için bir fırça ile kesilmiş kenarından retina ayırın. optik bir ustura ile sinir ve retina serbest ağır. </li><li> Petri kabı içine retina aktarın ve dikkatle soğuk HBSS kullanarak bir kez retina durulayın. i üzerinde HBSS örnek yerleştirince. Adım 2.1 ve bu adımı tekrarlayarak gerektiği kadar retina parçalara ayır. </li><li> simetrik bir jilet ile ikiye retina kesti. Yavaşça sabitleme ortamının 3 ml 6 yuvalı bir plaka örnekleri transferi ile sabitleştirilir. % 5 CO2 içeren bir atmosfer ile bir inkübatör içinde 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca dengede izin verin. </li><li> Adım 2.3 de inkübasyon sırasında aşağıdaki reaktifler hazırlayın: sıcak ortamda istenen konsantrasyona (450 uM) histamin stok solüsyonu sulandırınız. 250 ng / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar bir ortamda (argon altında saklanan) LXA4 çözülür. Not: LXA4 etkisini ölçerken, diğer yarısı LXA4 ile histamin kullanılır ise, tek bir retina yarısı tek başına histamin kullanılır. </li><li> dikkatli bir şekilde sabitleme ortamı aspire ve her bir (oyuk başına 3 mi) hazırlanan orta ekleyin. % 5 CO2 içeren bir atmosfer ile bir kuluçka makinesi içinde, 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> durulamabir zamanlar sıcak, steril PBS örnekler. </li></ol> 3. immün için Örnekleri hazırlayın <ol><li> plakalardan aspire PBS. % 4 PFA (oyuk başına 3 mi) ilave edilir ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. </li><li> Çabuk PFA aspire. bir zamanlar PBS kullanarak örnekleri durulayın. % 10 sakaroza örnekleri (oyuk başına 5 mi) aktarın ve 4 ° C&#39;de 2 saat ila 4 inkübe edilir. </li><li> % 30 sukroz (oyuk başına 5 mi) örnekleri aktarın ve 4 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edilir. Çalışma donma orta yapmak için% 20 sukroz, iki parça ticari dondurma orta bir bölümünü karıştırın. kabarcıklar kaybolur hava kadar 4 ° C gecede veya daha uzun bırakın. </li><li> Çalışma dondurma ortamı örnekleri aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika için dengeleme sağlar. dikdörtgenler içine her retina (5 mm kabaca 3 mm) Trim. </li><li> Dikkatle silindirik bir kap (yaklaşık 1 cm çapında x 2 cm yükseklik) dev içerdiği çalışan dondurma ortama örnekleri aktarmakAlüminyum folyodan ised. retina dilimleri ve sıvı nitrojen içinde bunları dondurmak (Kesit üzerine retinanın bir kesitini sağlamaya yönelik) dik olduğundan emin olun. kullanılana kadar -80 ° C &#39;de bloklar kaydedin. </li><li> Bölüm her 14 mikron kalınlığında dilimler halinde bir kriyostat blok ve cam slaytlar bölümleri monte edin. kullanılana kadar -80 ° C &#39;de slaytlar saklayın. </li></ol> 4. immün <ol><li> bir kez% 5 sakaroz fosfat tamponu (SPB, PBS içinde% 5 sukroz, pH 7.4) ile bölümleri yıkayın. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca (% 10 normal keçi serumu ve% 0.5 Triton X-100 ile% 5 SPB) blokaj tamponunda bölümleri inkübe edilerek spesifik olmayan bağlanma yerlerini bloke. </li><li> Uygun primer antikor ile (slaytlar üzerinde) bölümleri inkübe (1&#39;de seyreltilmiş GFAP ya MAP2&#39;nin: 500 bloklama tamponu içinde) 1 saat boyunca. çözüm aspire. % 5 SPB içinde üç kez yıkayın. endojen IgG boyama için, bu adımı atlayın. </li><li> İlgili secon ile bölümleri inkübe1 saat: dary antikorlar (bloke edici tampon içinde 800 Cyanine3 / FITC konjüge edilmiş eşek anti-fare / anti-tavşan IgG, 1 seyreltilmiş). </li><li> iyice% 5 SPB üç kez bölümleri yıkayın. orta montaj DAPI içeren ve lamelleri ile kaplama onları monte edilerek mikroskopi için örnekler hazırlayın. </li><li> Gruplar arasında, vb kalma süresi, lazer yoğunluğu, kazanç değeri olarak aynı parametreleri altında 20X merceğinden bir lazer konfokal mikroskop, yakalama görüntüleri kullanma. 488/525 nm olarak 561/785 nm olarak (Cyanine3 algılamak için) kırmızı kanal için, 408/447 nm olarak (DAPI tespit etmek) ve yeşil kanal için (FITC algılamak için) mavi kanal için uyarma / emisyon dalga boylarını ayarlamak . </li></ol> 5. Görüntü Analizi <ol><li> Aşağıdaki kriterlere 12&#39;ye göre sızdıran kan damarlarının yüzdesini ölçmek: sayısında bölümün düzlemi içinde endotel hücre çekirdekleri ile sadece kan damarları dahil; o ag gösterirse bir kan damarı sızan düşününkabı çevreleyen immün radient. </li><li> ifade seviyesini belirlemek için, ilgi alanları seçmek ve görüntü analizi yazılımı kullanılarak ortalama gri değeri ölçmek. </li><li> sürecin genişliğini ölçmek için, süreçler (örneğin dış çekirdek katmanı, onl) farklı olan bölümün bir alanı seçin. Sonra bu süreçler görünür ve sürekli olan bir optik alanı seçin. Mikroskobik ayarına göre ölçek çıtayı süreci boyunca bir çizgi çizin ve ölçümü yapmak. </li><li> sürecin devamlılığını analiz etmek için, ilgi seçkin bölgeleri, komşuluk varyans ile her pikseli değiştirerek Görüntüdeki kenarları artırır varyans denilen filtre uygulamak, otomatik olarak, kontrast ve parlaklık ayarı satırları saymak tarafından sayımı normale Konum. </li><li> İki kuyruklu Student t-testi kullanılarak istatistiksel anlamlara hesaplayın. * P &lt;0.05; ** P &lt;0.01; *** P &lt;0.001. Plot Mean olarak sonuç SEM ±. </li></ol>

<ol><li>Cunha-Vaz, J., Bernardes, R., Lobo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-retinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Blood-retinal barrier.</a> J Ophthalmol. 21, 3(2011).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-neural+barrier%3A+intercellular+communication+at+glio-vascular+interface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Molec+Biol%22%5BJournal%5D)">Blood-neural barrier: intercellular communication at glio-vascular interface.</a> J Biochem Molec Biol. 39, 339-345 (2006).</li>
<li>Kumagai, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+transport+in+brain+and+retina%3A+implications+in+the+management+and+complications+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes.</a> Diabetes Metab Res Rev. 15, 261-273 (1999).</li>
<li>Runkle, E. A., Antonetti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-retinal+barrier%3A+structure+and+functional+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molec+Biol%22%5BJournal%5D)">The blood-retinal barrier: structure and functional significance.</a> Methods Molec Biol. 686, Clifton, N.J. 133-148 (2011).</li>
<li>Takata, K., Hirano, H., Kasahara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+glucose+across+the+blood-tissue+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Transport of glucose across the blood-tissue barriers.</a> Int Rev Cytol. 172, 1-53 (1997).</li>
<li>Goncalves, A., Ambrosio, A. F., Fernandes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+claudins+in+blood-tissue+barriers+under+physiological+and+pathological+states%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Regulation of claudins in blood-tissue barriers under physiological and pathological states.</a> Tissue Barriers. 1, 24782(2013).</li>
<li>Patton, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+image+analysis%3A+concepts%2C+applications+and+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Ret+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal image analysis: concepts, applications and potential.</a> Prog Ret Eye Res. 25, 99-127 (2006).</li>
<li>Di Marco, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+dysfunction+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer%27s+disease--A+review+of+endothelium-mediated+mechanisms+and+ensuing+vicious+circles%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Vascular dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease--A review of endothelium-mediated mechanisms and ensuing vicious circles.</a> Neurobiol Dis. 82, 593-606 (2015).</li>
<li>Nagele, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-reactive+autoantibodies+prevalent+in+human+sera+increase+intraneuronal+amyloid-beta%281-42%29+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimer%27s+Dis%3A+JAD%22%5BJournal%5D)">Brain-reactive autoantibodies prevalent in human sera increase intraneuronal amyloid-beta(1-42) deposition.</a> J Alzheimer's Dis: JAD. 25, 605-622 (2011).</li>
<li>Goldwaser, E., Acharya, N., Nagele, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrovascular+and+blood-brain+barrier+compromise%3A+A+mechanistic+link+between+vascular+disease+and+Alzheimer%27s+disease+subtypes+of+neurocognitive+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parkinsons+Dis+Alzheimer%27s+Dis%22%5BJournal%5D)">Cerebrovascular and blood-brain barrier compromise: A mechanistic link between vascular disease and Alzheimer's disease subtypes of neurocognitive disorders.</a> J Parkinsons Dis Alzheimer's Dis. 2, 10(2015).</li>
<li>Horton, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+three-photon+microscopy+of+subcortical+structures+within+an+intact+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Photonics%22%5BJournal%5D)">In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain.</a> Nat Photonics. 7, (2013).</li>
<li>Sedeyn, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+Induces+Alzheimer%27s+Disease-Like+Blood+Brain+Barrier+Breach+and+Local+Cellular+Responses+in+Mouse+Brain+Organotypic+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Histamine Induces Alzheimer's Disease-Like Blood Brain Barrier Breach and Local Cellular Responses in Mouse Brain Organotypic Cultures.</a> Biomed Res Int. 2015, 937148(2015).</li>
<li>Avdeef, A., Deli, M. A., Neuhaus, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAvdeef%2C+A+%22Blood-Brain+Barrier+in+Drug+Discovery%3A+Optimizing+Brain+Exposure+of+CNS+Drugs+and+Minimizing+Brain+Side+Effects+for+Peripheral+Drugs%22">Blood-Brain Barrier in Drug Discovery: Optimizing Brain Exposure of CNS Drugs and Minimizing Brain Side Effects for Peripheral Drugs</a>. Di, L., Kerns, E. H. , John Wiley & Sons, Inc. Ch. 10 188(2014).</li>
<li>Eigenmann, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+four+immortalized+human+brain+capillary+endothelial+cell+lines%2C+hCMEC%2FD3%2C+hBMEC%2C+TY10%2C+and+BB19%2C+and+optimization+of+culture+conditions%2C+for+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+permeability+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies.</a> Fluids Barriers CNS. 10, 33(2013).</li>
<li>Takeshita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+blood-brain+barrier+model+combining+shear+stress+and+endothelial+cell%2Fastrocyte+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture.</a> J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).</li>
<li>Alberghina, M., Lupo, G., Anfuso, C. D., Moro, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitate+transport+through+the+blood-retina+and+blood-brain+barrier+of+rat+visual+system+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Palmitate transport through the blood-retina and blood-brain barrier of rat visual system during aging.</a> Neurosci Lett. 150, 17-20 (1993).</li>
<li>Hosoya, K., Yamamoto, A., Akanuma, S., Tachikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipophilicity+and+transporter+influence+on+blood-retinal+barrier+permeability%3A+a+comparison+with+blood-brain+barrier+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Lipophilicity and transporter influence on blood-retinal barrier permeability: a comparison with blood-brain barrier permeability.</a> Pharm Res. 27, 2715-2724 (2010).</li>
<li>Minamizono, A., Tomi, M., Hosoya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+dehydroascorbic+acid+transport+across+the+rat+blood-retinal+and+-brain+barriers+in+experimental+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Pharm+Bull%22%5BJournal%5D)">Inhibition of dehydroascorbic acid transport across the rat blood-retinal and -brain barriers in experimental diabetes.</a> Biol Pharm Bull. 29, 2148-2150 (2006).</li>
<li>Serlin, Y., Levy, J., Shalev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+pathology+and+blood-brain+barrier+disruption+in+cognitive+and+psychiatric+complications+of+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Psychiatry+Neurol%22%5BJournal%5D)">Vascular pathology and blood-brain barrier disruption in cognitive and psychiatric complications of type 2 diabetes mellitus.</a> Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2011, 609202(2011).</li>
<li>Kolb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+retina+works+-+Much+of+the+construction+of+an+image+takes+place+in+the+retina+itself+through+the+use+of+specialized+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Sci%22%5BJournal%5D)">How the retina works - Much of the construction of an image takes place in the retina itself through the use of specialized neural circuits.</a> Am Sci. 91, 28-35 (2003).</li>
<li>Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+pathology+as+biomarker+for+cognitive+impairment+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurgery+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease.</a> J Neurol Neurosurgery Psychiatry. 83, 917-922 (2012).</li>
<li>Tan, Z., Ge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta%2C+the+retina%2C+and+mouse+models+of+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta, the retina, and mouse models of Alzheimer disease.</a> Am J Pathol. 176, 2055(2010).</li>
<li>Serhan, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-resolving+lipid+mediators+are+leads+for+resolution+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pro-resolving lipid mediators are leads for resolution physiology.</a> Nature. 510, 92-101 (2014).</li>
<li>Bucolo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+topical+indomethacin%2C+bromfenac+and+nepafenac+on+lipopolysaccharide-induced+ocular+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effects of topical indomethacin, bromfenac and nepafenac on lipopolysaccharide-induced ocular inflammation.</a> J Pharm Pharmacol. 66, 954-960 (2014).</li>
<li>Edelman, J. L., Lutz, D., Castro, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticosteroids+inhibit+VEGF-induced+vascular+leakage+in+a+rabbit+model+of+blood-retinal+and+blood-aqueous+barrier+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Corticosteroids inhibit VEGF-induced vascular leakage in a rabbit model of blood-retinal and blood-aqueous barrier breakdown.</a> Exp Eye Res. 80, 249-258 (2005).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu yazıda, domuz retinası kullanılarak BRB disfonksiyonunun güçlü bir ex vivo akut retina modelini sunuyoruz. Bu model sistem özel aletler gerektirmez ve çoğu laboratuvar ortamına kolayca uyarlanabilir. Ancak başarılı bir sonuç elde etmek için birkaç adım yakından takip gerektirir. Gözbebekleri kaynağından alındıktan sonra 4 °C'de veya buz üzerinde tutulmalı ve mümkün olan en kısa sürede işlenmelidir. Bir tedavinin etkisi analiz edilirken, aynı retinanın iki yarısı kullanılmalıdır - bir yarısı yalnızca deneysel ...

Artan miktarda kanıt vücut kan retina bariyerinin (BRB) 1-5 ve kan beyin bariyeri (KBB) 6,7 olan benzerliği varlığını destekler. BBB Uzlaşma sıkıca böyle deliryum 10 olarak nedensel ya da Alzheimer hastalığı (AH) gibi kronik nörodejeneratif hastalıklar tanısal belirteç olarak 8,9 ve akut koşulları ile bağlantılı olmuştur. potansiyel ilaç hedefleri için bu patolojilerin ve keşifler içine mekanistik anlayışlar genellikle beynin sınırlı erişilebilirlik ve ağ karışıklık tarafından engellenmektedir. Bu, in vivo görüntüleme 11, beyin Organotipik kültürü 12, birincil hücre kültürleri 13,14 ve ko-kültür sistemleri 15 gibi alternatifler oluşturulmuştur. Ancak bu modellerin çoğu hücreleri tanımlamak için özel araçlar, uzun deneysel dönemleri veya birden fazla belirteçler gerektirir. Fonksiyonel ve yapısal BBB ile BRB arasındaki benzerlikler yanı sıra dy arasında bir korelasyoniki sfunctions 16-19 iddia edilmiştir. Buna ek olarak, daha kolay erişim, iyi tanımlanmış hücre tipleri ve tabakalı yapı beyne bir pencere olarak iyi karakterize edilmiş retina izin vermiştir. BBB ve BRB yapısal ve işlevsel kimlikler detaylı karşılaştırılması gerekmektedir. Bununla birlikte, retina hastalıkları, özellikle de BRB ihlali da sıkı bir şekilde diyabet 18-19 ve AD 21,22 dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların ilerlemesinin ile ilişkilendirilmiştir. Bu durumda, bir BRB disfonksiyon sistemi mekanizmasını tanımlamak için değil, aynı zamanda, potansiyel ilaç taranması için sadece kurmak ilgi çekicidir. Bu raporda, basit bir akut retinal kültürünü kullanarak bir protokol sağlayan BRB disfonksiyonu gelişti ve sunulmuştur. Artmış BBB geçirgenliği ve AD-benzeri patolojik değişiklikler histamin, bir pro-inflamatuar arabulucu 12 ile inkübe bir beyin Organotipik kültürü kurulmuştur. Bu nedenle, sunulan sistemde, histamin İçi olduBRB disfonksiyonu ikna etmek için ex vivo retina kültürüne ied. Böyle Mus musculus ve Bos Boğa gibi çeşitli türlerden gelen retinaları, test edilmiştir. Nedeniyle ticari kullanılabilirliği ve insan dokusuna benzediği için, taze domuz gözbebekleri burada bildirilen veri sağlamak için kullanılmıştır. Histamin ve / veya diğer ilaçlar ile inkübe edildikten sonra, retinalar immünoglobülin G (IgG), kan ana bileşenden biri olarak bir kaç protein 12 için immün değerlendirme için işleme alınmıştır; Glial fibriller asidik protein (GFAP), glial aktivasyon için iyi bilinen bir işaretleyici; ve mikrotübül-ilişkili protein 2 (MAP2), mikrotübül montaj için gerekli bir nörona özgü sitoskeletal proteini. Bundan başka, retinanın tabakalı yapı gibi genişliği ve süreklilik değişiklikler olarak Müller hücrelerinin ve gangliyon hücreleri proseslerinin ayrıntılı bir analizini sağlar. Böylece birkaç ek parametreler sonuçlarını değerlendirmek için kullanılabilirBRB ihlali erken bir aşamada ve aynı zamanda potansiyel tedavilerin ters etkilerini değerlendirmek için. kan damarlarının sızıntı (KZ), glial hücrelerin aktivasyonu ve nöronal hücrelerin hasar tepki: Bu protokol, ekranlı ilaçların potansiyel ters etkileri üç açıdan değerlendirilir. Çeşitli ölçümü yöntemleri, örneğin, ifade seviyesi immün bir süreç ve bir donanım filtresi tarafından gösterilen nöronal süreçlerin sürekliliği genişliği ölçüm yoğunluğu ile gösterilen, kullanılmaktadır. Daha iyi yöntemi göstermek için ve sonuçları yorumlamaya yardımcı olmak için, Lipoksin A4 (LXA4), endojen inflamatuar hasarına yanıt ve endotel disfonksiyonu 23 hafifletici sentezlenen bir bileşik, gösteri amaçlı seçilmiştir.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Yaşam Teknolojileri&nbsp;</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Yaşam Teknolojileri&nbsp;</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td>, <td>J.T.Baker</td>, <td>4072-05</td><td></td></tr>, <tr><td>Histamin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H7125-1G</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Donma Ortamı&nbsp;</td><td>Üçgen Biyomedikal Bilimler</td><td>TFM-5</td><td></td></tr><tr><td>Normal Keçi Serumu&nbsp;</td><td>Rockland</td><td>D104-00-0050</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>GFAP Antikoru</td><td>Millipore</td><td>AB5804</td><td></td></tr><tr><td>MAP2 Antikoru</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB3418</td><td></td></tr><tr><td>FITC konjuge Eşek anti-tavşan IgG Jackson</td><td>ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>711-095-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 konjuge Eşek anti-fare IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>715-165-150</td><td></td></tr><tr>DAPI <td>Vector Laboratories, Inc.</td> <td>içeren montaj ortamı</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Lazer Konfokal Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti mikroskobu</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Ulusal Sağlık Enstitüleri</td><td>1.45s</td><td></td></tr></tbody></table>

tedavi kan retina bariyer ihlali ve potansiyel İlaçlar değerlendirilmesi için bir akut retina modeli

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

Kan retina bariyeri ihlalini iyileştirebilecek potansiyel tedavileri değerlendirmek için düşük maliyetli, kullanımı kolay ve güçlü bir model sistem kurulmuştur. Enflamatuar bir faktör olan histaminin, kan damarlarının dışında IgG'nin pozitif boyanması yoluyla kültürlenmiş retinadaki damar bütünlüğünü tehlikeye attığı gösterilmiştir. Histaminin kendisinin ve lipoksin A4 gibi potansiyel tedaviler için aday ilaçların etkileri üç parametre kullanılarak değerlendirilir: IgG immün boyama yoluyla kan damarı sızıntısı, GFAP boyama yoluyla Müller hücrelerinin aktivasyonu ve MAP2 boyama yoluyla nöronal dendritlerde değişiklik. Ayrıca, retinanın katmanlı organizasyonu, genişlik ve süreklilikteki değişiklikler gibi Müller ve ganglion hücrelerinin süreçlerinin ayrıntılı bir analizine izin verir. Sunulan veriler domuz retina kültürü ile ilgili olsa da, sistem birden fazla türe uygulanabilir. Bu nedenle, model, bozulmuş retina damar bütünlüğünün farklı hücre tipleri üzerindeki erken etkilerini araştırmak ve ayrıca tedavi için potansiyel ilaç adaylarını değerlendirmek için güvenilir bir araç sağlar.

Biz histamin tarafından uyarılan BRB ihlal karşı koruyabilecek potansiyel tedaviler değerlendirmek için düşük maliyetli, zaman verimli ve kolay kullanımlı bir sistem sunuyoruz. IgG kontrol retina (Şekil 1A) damarlar içinde kısıtlı, ancak modelin başarıyla kuruldu doğrulayan histamin maruz (Şekil 1B) üzerine kan damarlarının, dışarı sızdırıyor. LXA4 sunulan sistemde BRB ihlal karşı ilaçlar için...

Düşük maliyetli, kullanımı kolay ve güçlü bir sistem histamin tarafından uyarılan kan retina bariyer ihlali iyileştirecek potansiyel tedaviler değerlendirmek için kurulmuştur. Kan damarı sızıntı, Müller hücre aktivasyonu ve nöron sürekliliği bir potansiyel ilaç, Lipoksin A4 hasarı yanıtını ve ters değerlendirmek için kullanılır.

Tedavi Kan Retina Bariyer ihlali ve Potansiyel İlaçlar değerlendirilmesi için bir Akut Retina Modeli

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Bu ex vivo retinal model sisteminin genel amacı, kan-sinir bariyeri sızıntısını iyileştiren ilaçları taramaktır. Bu yöntem, nörodejeneratif hastalıklar alanında, erken evre olayların neler olduğu ve bu hastaların tedavisinde yardımcı olabilecek ilaçların nasıl taranabileceği gibi birkaç temel soruyu yanıtlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı; düşük maliyetli, kullanımı kolay, hızlı ve uyarlanabilir olmasıdır.Genellikle bu yöntemde yeni olan kişiler, güvenilir ve tekrarlanabilir veriler elde etmenin iyi numuneler üretme konusundaki teknik becerilere bağlı olması nedeniyle zorluk yaşayacaklardır. İlk olarak, burada ticari bir kaynaktan temin edilen domuz retinaları kullanılmıştır. Kaynaktan temin edildikten sonra göz küreleri 4 °C'de veya buz üzerinde saklanmalı ve mümkün olan en kısa sürede işleme alınmalıdır.Diseksiyona, göz kapağını açmak için lensin çevresini keserek bir doku kültürü kabininde başlayın. Ardından bir fırça kullanarak, retinayı çekmeden vitreus hümörü nazikçe uzaklaştırın. Optik diski açığa çıkarmak için retinayı kesilen kenardan nazikçe ayırmak üzere bir fırça kullanın.Optik siniri bir jiletle kesin ve retinayı serbest bırakın. Retinayı bir petri kabına aktarın ve soğuk HBSS kullanarak dikkatlice bir kez durulayın. Örneği buz üzerinde HBSS içine yerleştirin.Ardından, retinayı simetrik olarak ikiye bölmek için bir jilet kullanın. Uygulamalar gerektiğinde, retinanın bir yarısına işlem uygulanırken, aynı retinanın diğer yarısı baz çizgisi oluşturmak ve hayvanlar arası varyasyonları düzeltmek için işlenmelidir. Örnekleri, her kuyucuğunda üç mililitre stabilizasyon medyumu içeren altı kuyucuklu bir plakaya nazikçe aktarın.Retinaları, %5 karbondioksit içeren atmosferli bir inkübatörde 37 °C'de 30 dakika boyunca dengeye getirin. İnkübasyon sonrası, stabilizasyon ortamını dikkatlice aspire edin ve her kuyucuğa histamin ve LXA4 içeren üç mililitre ortam ekleyin. Örnekleri bir saat daha inkübe edin.Sıcak steril PBS ile duruladıktan sonra, her kuyucuğa üç mililitre %4 PFA ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. İnkübasyon süresi dolduğunda, PFA'yı hızla aspire edin ve örnekleri bir kez PBS ile durulayın. Kuyucuklara %10 sükroz ekleyin ve dört derece santigrat sıcaklıkta iki ila dört saat inkübe edin.Ardından, %10 sükrozu %30 sükroz ile değiştirin ve dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Sonra, çalışma dondurma ortamını hazırlamak için bir birim ticari dondurma ortamını iki birim %20 sükroz ile karıştırın. Hava kabarcıkları kaybolana kadar dört derece Celsius'ta gece boyunca veya daha uzun süre bekletin.Ertesi gün, %30 sükrozu çalışma dondurma medyumu ile değiştirin ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca dengelenmeye bırakın. Dengelenmeden sonra, her bir retinayı üç milimetreye beş milimetrelik dikdörtgenler şeklinde kesin, ardından retina dilimlerini alüminyum folyodan yapılmış bir silindir içindeki dondurma medyumuna yerleştirerek dondurun. Kesit alma işleminde retinanın bir enine kesiti elde etmek için retinal dilimlerin dikey olduğundan emin olun ve bunları sıvı azot içinde dondurun.Her bir bloğu kriyostat üzerinde 14 mikron kalınlığında dilimler halinde kesin ve kesitleri cam lamlara monte edin. Lamları kullanana kadar -80 °C'de saklayın. Kesitleri %5 sükroz fosfat tamponu (SPB) ile yıkayarak immünboyama işlemine başlayın.Ardından, kesitleri ve bloklama tamponunu oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe ederek spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke edin. Daha sonra, kesitleri uygun primer antikor ile bir saat boyunca inkübe edin. Bir saatlik süre dolduğunda, solüsyonu aspire edin ve kesitleri %5 SPB ile üç kez yıkayın.Ardından, kesitleri ışıktan koruyarak uygun sekonder antikorlarla bir saat boyunca inkübe edin. Kesitleri %5 SPB ile üç kez yıkadıktan sonra, örnekleri DAPI içeren bir montaj ortamında sabitleyerek ve lamellerle kapatarak mikroskopiye hazırlayın. Son olarak, konfokal mikroskop kullanarak görüntüleri yakalayın.Uzantıların genişliğini ölçmek için, büyüteç aracını kullanarak uzantıların bulunduğu kesit bölgesini, örneğin dış nükleer tabakayı seçin. Ardından, bu uzantıların görünür ve sürekli olduğu bir optik alan seçin. Ana menüdeki analiz aracına tıklayın ve ardından mikroskobik ayara göre ölçek çubuğunu ayarlamak için alt menüden ölçeği ayarla seçeneğine tıklayın.Ana menüden çizgi işlevini seçin ve süreç boyunca bir çizgi çizin. Ölçümü gerçekleştirmek için ana menüden analiz seçeneğine, ardından alt menüden ölç seçeneğine tıklayın. Sürecin sürekliliğini analiz etmek için ana menüye dönün ve ilgi alanı olarak iç pleksiform tabakasını seçmek için poligon işlevini kullanın.Analyze ve ardından measure seçeneklerine tıklayarak alanı ölçün. Görüntüdeki kenarları, her pikseli komşuluk varyantıyla değiştirerek belirginleştirmek için process, filter ve ardından variants seçeneklerine tıklayın. Daha sonra image, adjust, brightness and contrast adımlarını takip ederek alt menüdeki auto seçeneğine tıklayıp kontrast ve parlaklığı otomatik olarak ayarlayın.Ardından çizgileri sayın. Bu görüntülerde, IGG immünoreaktivitesi kırmızı renkte görülmektedir. Kontrol gruplarında IGG, kan damarlarıyla sınırlıdır.Histamin grubunda, IGG damarların dışında tespit edilir ve burada noktalı dairelerle belirtilen sızıntı bulutları oluşturur. LXA4 ile tedavi edilen gruplarda, IGG tekrar kan damarlarının içine sınırlanmıştır. LXA4'ün eklenmesi, histamin tarafından indüklenen damar fonksiyonunu geri kazandırır.Bu histogram, test edilen gruplar genelinde sızdıran kan damarlarının yüzdesini göstermektedir. Bu görüntülerde, Müller hücrelerini boyayan GFAP için immün boyama sunulmuştur. Pozitif boyama, retina boyunca Müller hücrelerinin uzantılarında ve kan damarlarının çevresinde elde edilmiştir.Tüm gruplardaki Müller hücresi uzantılarının genişlikleri sunulmuştur. Tek başına histamin veya LXA4 ile tedavi, uzantı genişliğini azaltmıştır. Ancak her iki reaktif birlikte uygulandığında, uzantı genişliği eski haline dönmüştür.Bu görüntülerde, MAP2 için immünboyama sunulmuştur. Ganglion hücrelerinin uzantılarında ve hücre gövdelerinde pozitif boyama gözlenmektedir. Tüm gruplardaki sürekli MAP2 pozitif ganglion hücresi uzantılarının yoğunluğu sunulmuştur.Histamin ile tedavi dendritik çıkıntıların sürekliliğini azaltırken, LXA4'ün anlamlı bir etkisi yoktur. Bu deney, uygun şekilde yürütüldüğünde; retina başına beş dakika diseksiyon, altı dakika tedavi ve ardından kesit alma, immün boyama ve analiz aşamalarıyla üç ila beş günde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, taze doku ve uygun kontrollerin kullanılması önemlidir.Bu prosedürün ardından, kalsiyum seviyelerindeki ve mitokondriyal özelliklerdeki gerçek zamanlı değişimleri takip etmek için canlı görüntüleme gibi diğer yöntemler eklenebilir. Bu videoyu izledikten sonra, BRB disfonksiyonu oluşturmak, hasarı değerlendirmek ve potansiyel ilaçları taramak için bu ex vivo akut retina kültür modelinin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmanız gerekir. İzlediğiniz için çok teşekkür ederiz, deneylerinizde başarılar dileriz.

an-acute-retinal-model-for-evaluating-blood-retinal-barrier-breach

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

, Dekolmanı bir tekrarlanabilir ve sürekli yüksekliği ile deneysel retina dekolmanı oluşturma ve subretinal kanama olmadan retina hastalığında fotoreseptör hücre kaybı patofizyolojisi okuyan ve potansiyel terapötik müdahalelerin değerlendirilmesi için önemlidir. Burada ayrıntılı olarak, böyle bir yöntem sunulmaktadır.

Sodyum Hyaluronat subretinal Enjeksiyon Kemirgenler Retina Dekolmanı Modeli

Bu makalede, farelerde yüksek göz tansiyonu retinal iskemi-reperfüzyon hasarı uyarılması için bir yöntem tarif eder. yüksek göz içi basıncı ile retinal iskemi-reperfüzyon hasarı, retina nörovasküler biriminin, insan hastalıkları için, potansiyel hücresel mekanizmaları ve tedavi incelemelerine sağlayan retinada tehlikeye oksijen ve besin teslimat karakterize olan insan patolojilerinin model vermektedir.

Göz İçi Basıncı Yükselmesi ile Retina İskemi-Reperfüzyon Hasarı Fare Modeli

Oksijen kaynaklı retinopati (OIR), prematürite retinopatisi ve proliferatif diyabetik retinopati gibi iskemik retina hastalıklarını modellemek ve neovasküler hastalıklar için antianjiyojenik ilaçların değerlendirilmesinde kavram kanıtı çalışmaları için bir model görevi görmek için kullanılabilir. OIR, retinada ölçülebilen sağlam ve tekrarlanabilir neovaskülarizasyona neden olur.

Kemirgenlerde İskemik Retina Hastalıkları için Oksijen Kaynaklı Retinopati Modeli

Diyabetik retinopati körlüğün önde gelen nedenlerinden biridir. Histoloji, kan-retinal bariyer parçalanma testi ve floresan anjiyografi, retinanın patofizyolojisini anlamak için değerli tekniklerdir ve bu da diyabetik retinopatiye karşı etkili ilaç taramasını daha da artırabilir.

Sıçan Modelinde Retinal Patofizyolojik Değerlendirme

Bu protokol, insan retinal mikrovasküler endotel hücrelerinin kaveola aracılı transsellüler taşıma süreçlerinde yaban turpu peroksidazını hücreler arasında taşıma yeteneğini ölçerek iç kan-retinal bariyer geçirgenliğini değerlendirmek için bir model olarak in vitro endotel hücre transsitozu testini göstermektedir.

İç Kan-Retinal Bariyer Geçirgenliğini Değerlendirmek için In Vitro Model Olarak Endotel Hücre Transsitozu Testi

Gözün retina pigment epitel tabakasını etkileyen dejeneratif göz hastalıkları monogenik ve poligenik kökenlidir. Çeşitli hastalık modelleri ve bir yazılım uygulaması olan LipidUNet, hastalık mekanizmalarını ve potansiyel terapötik müdahaleleri incelemek için geliştirilmiştir.

LipidUNet-Machine Learning Tabanlı iPSC Kaynaklı Retinal Pigment Epiteli Kullanılarak Lipid Birikintilerinin Karakterizasyonu ve Nicelleştirilmesi Yöntemi

Xenopus laevis kurbağa yavrularında retina hasarını veya retina dejenerasyonunu indüklemek için çeşitli protokoller geliştirdik. Bu modeller retinal rejenerasyon mekanizmalarını inceleme imkanı sunar.

Xenopus Kurbağa Yavrularında Retina Yaralanma Modellerinin Oluşturulması

Retina damar sisteminin oksidatif stres ve sitokinler gibi diyabet/diyabetik retinopati ile ilişkili hakaretlerden ölüme karşı direncini izlemek için bir koruma testi geliştirilmiştir.

Farelerde Retina Damar Sisteminin Diyabete Bağlı Ölümden Korunmasını Saptamak İçin Bir Test

Bu protokol, ön kamara kanülasyonu ve göz içi basınç yükselmesi yoluyla retina iskemiyi indükleyerek ve ardından reperfüzyonu başlatmak için göz içi basıncı normalizasyonu ile bir fare gözünde retinal iskemi-reperfüzyon hasarını modeller.

Bir Fare Gözü Modelinde Retinal İskemi-Reperfüzyon Hasarının İndüksiyonu

Bu çalışma, terapötiklerin yetişkin sıçanın retina ve optik sinirlerine verilmesi için bir metodoloji sunmaktadır. Ek olarak, yetişkin bir sıçanda optik sinir ve retinanın yukarıdan aşağıya blok koleksiyonu için benzersiz bir doku elde etme yöntemi tanıtılmıştır.

Erişkin Sıçanlarda Oküler Terapötik Uygulama ve İleri Doku Alımı

Keşfedin, histamin kaynaklı kan retina bariyeri ihlalleri için lipoksin A4 ile hasar değerlendirmesi yapılan düşük maliyetli ekz vivo domuz retina modelini. Bu yöntem nörodejeneratif hastalıklarda ilaç taraması için değerlidir.

Tedavi Kan Retina Bariyer ihlali ve Potansiyel İlaçlar değerlendirilmesi için bir Akut Retina Modeli

Daha fazla video keşfet