ile Enfeksiyon sırasında boşaltılması Lenf düğümleri içine Fare Cilt Dendritik Hücre Göç Eğitim Bir KAKE tabanlı Testi

Floresan hücre takipçisine dayalı bu assay'in genel amacı, Bacille Calmette-Guerin veya BCG ile ayak pedi enfeksiyonundan sonra deriden drenaj lenf düğümüne göç eden ilgi çekici spesifik hücre popülasyonlarını izlemek ve karakterize etmektir. Bu tekniği, deri BCG enfeksiyonundan sonra drenaj lenf düğümüne yerleşen dendritik hücre popülasyonunu tanımlamak için kullandık. Bu teknik, tümörlerin tanımlanmış 24 saatlik bir pencere süresince enjekte edilmesiyle hücre göçünün çalışılmasına olanak sağlamıştır.

Ayak tabanı enjeksiyonu ve lenf nodu izolasyon aşamalarının metin üzerinden öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Microbacterium Bovus BCG enjeksiyonu için, ayak parmağı sıkıştırma yöntemiyle uygun sedasyon seviyesi doğrulandıktan sonra, 29 gauge 1/2 inçlik iğne takılmış bir şırınga kullanarak, sekiz ila 12 haftalık bir farenin arka ayak tabanına 30 µL PBS içinde 1×10⁶ koloni oluşturan birim bakteri inoküle edin. Kontrol ayak tabanlarına yalnızca PBS enjekte edin.

Ardından, hayvanları tamamen ayağa kalkana ve enjeksiyon yapılan ayak tabanına ağırlık verebilene kadar izleyin. CFSE enjeksiyonu için, BCG enjeksiyonundan sonraki uygun zaman noktasında, oda sıcaklığındaki beş millimolar CFSE'nin bir flakonunu PBS içinde on kat seyreltin ve çözeltiyi tamamen yeniden süspanse etmeye özen gösterin. Ardından, şırıngayı seyreltilmiş CFSE ile doldurun ve ilk enjeksiyonun yapıldığı aynı arka ayak tabanına 20 microliters uygulayın.

CFSE enjeksiyonundan 24 saat sonra, arka uyluk bölgesine dikkatlice dikey bir insizyon yapın ve kas yağını temizleyin. Ardından, diz çukurundaki yağ kesesinin derinliklerinde yer alan Popliteal Lenf Nodunu açığa çıkarmak ve çıkarmak için makas ve cımbız kullanın. Lenf nodunu buz üzerinde 0,5 milliliters steril PBS'ye aktarın ve altı kuyucuklu bir plakanın beş milliliters PBS içeren bir kuyucuğu içerisinde, üç milliliterslik bir şırınganın arka ucuyla 70 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirerek lenf nodunu homojenize edin.

Süzgeci 5 mL daha tamponla yıkayın ve hücre çözeltisini 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Ardından, hücreleri santrifüjleyin ve peleti yeterli hacimdeki tampon içerisinde yeniden süspande edin. Hücreleri akış sitometrisi için işaretlemek amacıyla, 1x10⁶ ile 10x10⁶ arası hücreyi 5 mL'lik yuvarlak tabanlı polistiren tüplere aktaracağım ve hücreleri taze FACS tamponu ile yıkayacağım.

Pelletleri, FACS tamponu içerisinde, buz üzerinde ve ışıktan korunarak, spesifik olmayan FC aracılı etkileşimleri engellemek için anti-mouse CD16 CD32 içeren uygun antikor kokteylinin 50 ila 100 µL'lik hacminde yeniden süspande edin. 30 ila 45 dakika sonra, hücreleri FACS tamponu ile yıkayın ve pelletleri 50 ila 100 µL taze FACS Tamponu içerisinde yeniden süspande edin. Popliteal lenf düğümündeki CFSE markalamasının çoğunluğu, deri drenajlı lenf düğümlerine göç eden deri dendritik hücreleri ile uyumlu olarak, MHC-II yüksek ve CD11c pozitif düşük hücrelerde gözlemlenir.

PBS enjekte edilen kontrollerle karşılaştırıldığında, BCG enfekte farelerin popliteal lenf düğümlerinde bu işaretli hücrelerin hem sıklığı hem de toplam sayısı artmış görünmektedir; bu durum, BCG'nin bu hücrelerin drenaj lenf düğümüne yeniden yerleşimini artırdığını göstermektedir. Deri dendritik hücreleri, enfeksiyondan sonra beş güne kadar drenaj lenf sistemine girmeye devam ederek, mevcut modeldeki dendritik hücre göçünü, popliteal lenf düğümündeki antijenle spesifik CD4 pozitif T-hücrelerinin başlangıç aktivasyon zaman çizelgesinin çok ötesine taşımaktadır. Ayrıca, göç eden deri dendritik hücreleri yüksek düzeylerde ko-stimülatör moleküller eksprese ederek, bu göç eden dendritik hücrelerin aktive olduğu kavramını desteklemektedir.

Önemli bir nokta olarak, aflerent lenfatikler yoluyla değil, yüksek endotelyal venüller aracılığıyla iltihaplı lenf düğümlerine giren hem lenf düğümü dirençli mono-sitoid hem de plazma-sitoid dendritik hücrelerin CFSE için negatif olması, CFSE etiketlemesinin esas olarak ayak tabanında gerçekleştiğini daha da doğrulamaktadır. Ayrıca, ek akış sitometrik analizler, EpCAM düşük CD11b yüksek hücrelerin bir alt popülasyonunun, BCG enfeksiyonuna yanıt olarak popliteal lenf düğümüne drene olan ana migratuar deri dendritik hücre alt kümesi olduğunu ortaya koymaktadır. Uzmanlaşıldığında, bu teknik düzgün bir şekilde uygulandığı takdirde beş dakika içinde gerçekleştirilebilir.

Bu işlem uygulanırken enjeksiyon bölgesine ve enjeksiyon hacmine dikkat etmek önemlidir; diseksiyon sırasında drenaj lenf düğümüne zarar vermemek için büyük özen gösterilmelidir. Prosedürün ardından, alt kümeye özgü hücre mikro ekspresyonunun daha ileri analizi için akış sitometrisi veya konfokal mikroskopi gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, araştırmacıların enfeksiyon veya aşılama cevaben hücreleri deriden drenaj lenf düğümüne kadar 24 saatlik bir süre içinde takip etmelerinin yolunu açmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, ayak tabanı enjeksiyonlarının nasıl yapılacağını ve ilgilenilen göçmen dendritik hücre popülasyonlarının takibi ve karakterizasyonu için drenaj lenf düğümlerinin nasıl tespit edilip izole edileceğini iyi bir şekilde kavramış olmalısınız.