Starlet Deniz Anemone Aboral physa Tam Polip Regeneration uyaran Nematostella vectensis

Bu prosedürün genel amacı, nematostella vectensis'in aboral ucundan çıkarılan küçük bir doku bölümünden tam bir polipin rejenerasyonu sırasında meydana gelen öngörülebilir morfolojik değişiklikler serisini göstermektir. İlk olarak bu yöntem için fikir aklıma geldi çünkü nispeten karmaşık polipin en az miktarda morfolojik bilgiyle başlayarak kendini nasıl bir araya getirebileceğini görmek istedim. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir, çünkü ilk yaralamadan sonraki aşama ilerlemesi bazen bir mukoza zarı tarafından gizlenir.

Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, polipin yumuşak, yapışkan, jelatinimsi doğası nedeniyle yara bölgesindeki dokunun tamamen ayrılmasını sağlamak için mücadele edeceklerdir. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi nematostella vectensis koşullandırması ile başlayın. Bu tekniği kullanırken, seçilen hayvanların aynı boyutta olması ve aynı beslenme ve diğer durum parametreleri gibi aynı kültür geçmişine sahip olması özellikle önemlidir.

Amputasyondan en az bir saat önce seçilen hayvanların tabağını kuluçka makinesinden oda ışığına çıkarın. Beş hayvanı, kesilmek üzere havuzdan binde 12 parça tuzluluk oranında yapay deniz suyu içeren 100 milimetre çapında steril bir cam kesme kabının dibine aktarmak için geniş delikli bir plastik pipet kullanın. Çanağı, 10 ila 40x arasında değişken büyütme oranına sahip bir stereo mikroskop sahnesine yerleştirin.

Yaklaşık olarak aynı uzunlukta boyuta uygun polipleri seçin ve amputasyondan üç gün önce koloniden ayrılmış bir kaseye yerleştirin. Steril bir neşter kullanarak, fizin yaklaşık olarak geniş olduğu ve mezenter içermeyen bir bölümünü elde etmek için her polipten aboral fizayı ampute edin. Bunu başarmak için, neşter bıçağını istenen amputasyon bölgesinde hayvanla temas edecek şekilde yerleştirin.

Bunu ya yardımsız ya da hayvanın vücudunu beş numaralı forseps ile nazikçe kavrayarak yapın. Neşterin kavisli bıçağını vücut boyunca sallanma hareketiyle kullanarak dokuyu kesin. Her bir ampute donör polipini tabaktan çıkarın ve havuzlanmış ampute olarak etiketlenmiş ayrı bir kaseye geri koyun.

Kaseyi çıkardıktan sonra, stok kültürüne geri koyun. Kesme kabında kalan eksize edilmiş fİZİ yapay deniz suyunda 1.000'de 12 parça tuzlulukta durulayın. Daha sonra, her bir fizayı, her bir kuyucukta 1.000 başına 12 parça tuzlulukta 10 mililitre yapay deniz suyu içeren çok kuyulu bir hücre kültürü plakasında ayrı bir steril kuyuya aktarın.

Her deneysel tedavi için ayrılacak her kuyucukta en az beş fizik toplamak için bu adımları tekrarlayın. Folayı içeren plakayı, istenen rejenerasyon hızı ile belirlenen sabit bir sıcaklıkta sıcaklık ayarlı bir inkübatöre yerleştirin. Değişken büyütmeli bir stereo bileşik mikroskop kullanarak fiziği puanlayın.

Taze kesilmiş nematostella physa'yı sıfır aşama olarak puanlayın ve NRSS'yi kullanarak amputasyondan veya DPA'dan sonra her gün aynı saatte puanlamaya devam edin. Taze kesilmiş bir fiz, muhtemelen görülebilen açık bir yara bölgesi olan sarkık bir balona benzeyen fincan şeklinde bir kütle olarak görünüyorsa, fizayı evre sıfır olarak puanlayın. Amputasyon yarası kapalı görünüyorsa, birinci aşama olarak bir fizik puanlayın.

İşitsel direğin yüzeyi şişirilmiş görünüyorsa, radyal olarak simetrik bir düzende düzenlenmiş ve oluklarla ayrılmış sekiz yükseltilmiş kemeri ortaya çıkarsa, ikinci aşama olarak bir physa puanlayın. İkinci aşamada, kemerlerin tepesinde, yaklaşık olarak geniş, muhtemelen geçici ve başlangıçta tek bir ektodermal hücre tabakasından oluşan küçük yarım küre kabarcıklarını gözlemleyin. Fizik tedavi yaşlandıkça, forseps ile dikkatlice çıkarılması gereken mukus ile kaplanabilir.

Endodermal ve ektodermal doku katmanlarını içeren dokunaçların tomurcukları, en azından bazı radyal kemerlerin işitsel ucunda stabil bir şekilde oluşturulmuşsa, üçüncü aşama olarak bir physa puanlayın. Fisa, vücut duvarındaki girişlerden bir koelenteron içinde uzanan sekiz farklı görünür mezenter içeriyorsa, aural aboral uzunlukları, aboral ucundaki farinkse veya enterostoma bağlanıyor gibi göründükleri yerden ölçülen radyal genişliklerinin iki katından fazla olan sekiz farklı görünür mezenter içeriyorsa, dördüncü aşama olarak bir physa'yı puanlayın. Son olarak, flisenin kıvrımlı dörtten fazla mezenteri varsa ve kıvrım dördüncü aşamadakinden daha dolgun ve kıvrımlıysa, beşinci aşama olarak bir fiziğe puan verin.

Beşinci aşamada, hayvan neredeyse normal bir yetişkin görünümüne sahiptir, ancak görünür gonadal hücreler yoktur. Yüzde 0.1 DMSO ile tedavi edilen bu kontrol nematostella physa grubu, beşinci aşamaya tamamen yenilenmiştir. Bununla birlikte, klorokin ile tedavi edilen physa, tamamlanmış mezenterleri tamamen oluşturamadı.

Yakın çekim, klorokin içinde inkübe edilmiş bir fizakta mezenterlerde kıvrımın hem varlığını hem de eksikliğini gösterir. Bu grafik, klorokin tedavisinin toplam sonuçlarını göstermektedir. 10 ila 50 mikromolar arasındaki herhangi bir tedavi, benzer kusurlara neden oldu, çoğunlukla mezenterlerin kıvrım olmaması nedeniyle mezenterlerin tam olarak yeniden şekillenmemesi.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, 30 kesilmiş physa içeren her altı oyuklu plaka için bir saatten daha kısa sürede yapılabilir. Puanlama hızlıdır, belki de her çoğaltma plakası için yarım saat gerektirir. Bu videoyu izledikten sonra, aboral dokunun küçük bir bölümünden tam bir polipin rejenerasyonu sırasında meydana gelen morfolojik değişiklikleri görselleştirmek için fiziğin nasıl ampute edileceğini iyi anlamalısınız.

Bu tekniğin temel avantajı, görsel olarak düzgün bir dokudan tam bir polipin rejenerasyonunun altında yatan moleküler olayların sabitleneceği morfolojik aşamalar sağlamasıdır. Bu prosedürü denerken, hayvanları beslenme geçmişine göre önceden koşullandırmayı, yetişkin mezenterini dışlamak için ikiye bölmeyi ve tedavilerdeki çeşitliliği azaltmak için rejenere fizin boyutunu standartlaştırmayı hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, örneğin küçük moleküllerle genetik mutasyonların veya sinyal yolu bozulmalarının etkileri değerlendirilebilir.

Veya morfogenetik değişiklikler, kendi kendine çoğalmanın mikroskobik analizi, soy takibi veya ikinci bölge gen ekspresyonu ile ilişkilendirilebilir. Bu teknik, rejenerasyon biyolojisi alanındaki araştırmacıların, bu model organizmanın olağanüstü rejeneratif kapasitesinin altında yatan hücre biyolojisini, sinyal yollarını ve morfogenetik süreçleri keşfetmelerinin yolunu açacaktır.