sertliği ölçme Ex Vivo Fare aorta

Bu protokolün genel amacı, fare aortlarının Ex Vivo elastik modülünü ölçmek için Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanma prosedürlerini tanımlamaktır. Bu yöntem, kardiyovasküler biyomekanik ve kardiyovasküler hastalık ve yaşlanma gibi hastalık alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olur. Bu tekniğin ana avantajı, arterler ve hücreler gibi yumuşak biyolojik numunelerin Danoscale seviyelerinde büyük bir doğruluk derecesine sahip AFM ile karakterize edilmiş biyomekanik özellikleridir.

AFM prosedürlerini sunacağım ve laboratuvarımızdan bir araştırmacı olan Doktor Shu-lin Liu, fare aortlarının nasıl izole edileceğini gösterecek. Başlamak için, bir fareyi ötenazi yapın ve ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi aort kısmına kadar inceleyin. Bir çift küçük forseps kullanarak, aortu çevreleyen yağı kavrayın ve aort çevresindeki yağı dikkatlice kesmek için küçük bir makas kullanın.

Daha sonra, aortu forseps ile nazikçe tutun ve çıkan aortun başlangıcındaki damardan bir kesik ve inen aortun sonunda, abdominal aortun hemen üzerinde başka bir kesik yapın. Diseke edilmiş aortu kalsiyum veya magnezyum içermeyen PBS içeren 60 milimetrelik bir tabağa aktarın. Tabakta, aorttan kalan yağ dokusunu incelemeye devam edin ve ardından aortu uzunlamasına açın.

Daha sonra, Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak analiz için inen aorttan 2 milimetreye 4 milimetrelik bir parça ve aort kemerinden aynı boyutta bir parça kesin. Bu doku parçalarını 60 milimetrelik yeni bir plastik tabağa koyun ve bir damla PBS ile nemli tutun. Aort tabakasına dokunmadan bir laboratuvar mendili kullanarak PBS'yi dokunun etrafından dikkatlice çıkarın.

Dokunun lümen tarafının yukarı baktığından emin olun ve açılan aortun her iki ucunu plakaya nazikçe yapıştırmak için beş ila 10 mikrolitre siyanoakrilat yapıştırıcı kullanın. Bu işlem sırasında aort damarının gerilmemesi çok önemlidir. Bittiğinde, yapıştırılmış aortun katlanmadığını veya yüzmediğini kontrol edin.

Yapıştırıcıyı aort üzerinde 30 ila 60 saniye havayla kuruttuktan sonra, yavaşça PBS ekleyin ve numuneyi daldırın. Cımbız kullanarak, küresel uçlu bir silikon nitrat AFM probunu prob tutucusuna kaydırın. Ardından, prob tutucuyu AFM kafasının ZScanner yuvasına sıkıca sabitleyin.

Ardından, AFM yazılımını açın. Deney Kategorisi'ne gidip İletişim Modu'nu seçerek deneme türünü seçin. Ardından, Deney Grubu'na gidin ve Fluid'de Temas Modu'nu seçin ve son olarak Deney'e gidin ve Fluid'de Temas Modu'nu seçin.

Bunlar seçildikten sonra, Denemeyi Yükle'ye tıklayın. Bu lazeri açacaktır. Ardından, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi lazeri hizalamak için kullanılan bir örnek hazırlayın.

Numuneyi AFM'ye yerleştirin. Lazer konumlandırma düğmelerini ayarlayarak lazer noktasını AFM probunun ucuna yerleştirin. Ardından, Dikey Sapma değerleri sıfır ile negatif bir volt arasında olana ve Yatay Sapma sıfır volta yakın olana kadar foto diyotun konumunu ayarlamak için dedektör konumlandırma düğmelerini kullanın.

Ardından, lazer Toplam Sinyalinin maksimize edilip edilmediğini kontrol edin. Gerekirse, maksimum toplam sinyali elde etmek için lazer ışınının AFM ucundaki konumunu ve foto diyotun konumunu yeniden ayarlayın. Kalibrasyona başlamak için parametreleri kontrol et'i seçin ve Tarama Boyutu parametresini sıfıra ayarlayın.

Tarama Hızını bir hertz olarak ayarlayın. Örnek/Çizgiyi 256'ya ve Sapma Ayar Noktasını 20 nanometreye ayarlayın. Ardından Etkileşim'i seçin.

Prob plakanın yüzeyi ile temas ettiğinde, Ramp'a tıklayın. Ardından, tarama araç çubuğu menüsünde genişletilmiş modu seçin ve parametreleri burada gösterildiği gibi ayarlayın. Rampa araç çubuğunda, rampa sürekliliğini seçin ve plaka üzerinde bir kuvvet eğrisi elde edin.

Bu kuvvet eğrisinde, yazılımın sonuçları Z konumuna karşı dikey sapma olarak grafiklendirmesine izin vermek için Kanal 1'i Sapma Hatası olarak ayarlayın. Kuvvet eğrisinin sol veya sağ uçlarına tıklayın ve imleci, kuvvet eğrisinin düz çizgiye sığacak doğrusal bir bölgesini kapsayacak şekilde sürükleyin. Ardından, araç çubuğunda Ramp'ı seçin ve Güncelleme Hassasiyeti'ne tıklayın.

Geçerli değeri kaydedin. Ardından, Kalibre Et'i seçin ve Dedektör'e tıklayın. Sapma Hassasiyeti kutusundaki beş ölçümden giriş ve ortalama değer.

Termal ayar işlemi sırasında AFM kafasını kaldırmak ve AFM ucu ile plaka arasındaki etkileşimi önlemek için İki ila üç kez Geri Çek'e tıklayın. Ardından, araç çubuğundaki Thermal Tune'a tıklayın. Termal Ayar aralığını bir ile 100 kilohertz arasında ayarlayın ve Sapma Hassasiyeti Düzeltmesini V şeklindeki konsollar için 1.144 ve dikdörtgen konsollar için 1.166 olarak ayarlayın.

Termal Ayar menüsünde, bir termal ayar eğrisi elde etmek için Veri Al'a tıklayın. Ardından, eğrinin her iki tarafındaki çizgilere kırmızı çizgi yerleştirin ve hangisinin verilere daha iyi uyduğuna bağlı olarak Lorentzian veya basit harmonik osilatör modelini seçin. Ardından, Verileri Sığdır'a tıklayın ve bu değeri kaydetmek için K Yayınını Hesapla'yı seçin.

Aort dokusunu içeren 60 milimetrelik bir kültür kabını mikroskop tablasına yerleştirin ve plakayı manyetik plaka tutucu ile sabitleyin. Aort konsol ile etkileşime girdiğinde, piezo merkezinin sabit olduğundan emin olun ve Ramp'a tıklayın. Rampa boyutunu üç mikrometreye, Tetikleme modunu Göreli olarak ve Tetikleme eşiğini 100 nanometreye ayarlayın.

Ardından rampa sürekli'yi seçin. Prob ve numune arasındaki temas noktasının, Z rampa döngüsünün yaklaşık olarak merkezinden alt dörtte üçüne kadar gerçekleştiğini gözlemleyin. Bu gözlenmezse, numuneden ayırın, rampa boyutunu gerektiği gibi ayarlayın ve numuneyi yeniden takın.

Ardından, menü çubuğunda Mikroskop'a tıklayın ve Ayarları Etkinleştir'i seçin. SPM para çekme miktarını 30 mikrometre olarak değiştirin ve ardından Tamam'a tıklayın. Kuvvet eğrisini gözlemledikten sonra, menü çubuğunda Yakala'ya tıklayın ve Dosya Adını Yakala'yı seçin. OOO ile biten istediğiniz bir dosya adını girin, belirlenmiş bir klasörü seçin ve verileri kaydedin.

Analize başlamak için, kuvvet eğrisi analiz yazılımını açın, analiz edilecek dosyayı yükleyin ve verileri beraberindeki metin protokolünde açıklandığı gibi değiştirin ve düzeltin. Ardından, menü çubuğunda Temel Düzeltme'yi seçin ve girişleri burada gösterildiği gibi ayarlayın. Ardından, grafikteki dikey noktalı mavi çizgiyi kuvvet eğrisinin düz kısmını kapsayacak şekilde ayarlayın ve Yürüt'e tıklayın.

Ardından, araç çubuğu menüsünde Girinti'ye tıklayın ve girişleri burada gösterildiği gibi ayarlayın. Bu değerleri kaydedin ve birbirinden küçük bir mesafe içinde alınan alan başına beş kuvvet eğrisini ölçerek ilgilenilen alanların her birinin Young modülünü analiz edin. Doku örneğinin genel sertliğini belirlemek için, doku içindeki örnek alanının beş farklı bölgesi üzerinde 25'e kadar ölçüm yapılmalıdır.

Bu alanlar, aort arkı ve inen aort gibi farklı konumlardaki dokuları karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu grafiklerde, inen aort ve aort arkının temsili kuvvet eğrileri aynı fare aortu örneğinden gösterilmiştir. Bu verilere dayanarak, elastik modül her grup için hesaplanabilir ve farklı bölgeler veya koşullar arasında karşılaştırma yapmak için kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, fare aortunun nasıl düzgün bir şekilde izole edileceğini ve Atomik Kuvvet Mikroskobu ile elastik modülün nasıl ölçüleceğini iyi anlayacaksınız. Bu prosedürü denedikten sonra, doku izolasyonundan hemen sonra AFM ölçümünü yapmayı unutmamak önemlidir. Bir kez ustalaştıktan sonra, aortların izolasyonu fare başına yaklaşık 45 dakika içinde tamamlanabilir ve AFM ölçümü ve analizi, uygun şekilde yapılırsa bir buçuk saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü takiben, vasküler yeniden şekillenme veya vasküler düz kas hücrelerinin çoğalması ile ilgili ek soruları yanıtlamak için immünofloresan veya proliferasyon testleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir.