Fosfolipid Scramblase Aktivitesinin bir floresan bazlı analiz

Opsin ile sulandırılmış büyük unilameller lipozomlarda fosfolipid karıştırmayı ölçmek için floresan bazlı bir test tarif ediyoruz.

Bu prosedürün genel amacı, tipik bir G proteinine bağlı reseptörü büyük unilamellar veziküllere yeniden oluşturmak ve flurorescence bazlı bir test kullanarak bir lipid çift tabakası boyunca fosfolipidlerin 80p bağımsız translokasyonunu gerçekleştirme yeteneğini ölçmektir. Bu yöntem, hücreler arası lipid taşıma alanında, liplipitleri karıştırabilen proteinlerin moleküler kimliğinin ne olduğu ve mekanizmalarının ne olduğu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı çok güvenilir ve sağlam olmasıdır.

Sulandırma prosedürünüz belirli bir lipit bileşimi ve tercih edilen bir deterjan için oluşturulduktan sonra. Bu işleme başlamak için, yuvarlak tabanlı bir şişeye mililitre POPC ve kloroform çözeltisi başına 1435 mikrolitre 25 miligram eklemek için bir cam şırınga kullanın. POPC'nin POPG'ye dokuz ila bir molar oranında 52.5 mikro malipid elde etmek için mililitre başına 25 miligram 25 miligram POPG ve kloroform ekleyin.

Ardından, 145 RPM'ye ayarlanmış bir döner buharlaştırıcı kullanarak lipitleri 30 dakika kurutun. Kurutma tamamlandıktan sonra, şişeyi oda sıcaklığında üç saat boyunca bir vakumlu desikatöre aktarın. Ardından, ölen lipit filmi nemlendirmek için 10 mililitre tampon A ekleyin.

Homojen bulanık bir süspansiyon oluşana kadar şişeyi hafifçe döndürün. Süspansiyonu oda sıcaklığında bir su banyosunda 10 dakika boyunca 40 kilohertz frekansında sonikleştirin. Daha sonra bir ekstrüder kullanarak numuneyi 10 kez 400 nanometre gözenek boyutuna sahip bir zardan geçirin.

Bunu, numuneyi 200 nanometre gözenek boyutuna sahip bir zardan dört kez geçirerek ikinci bir ekstrüzyon döngüsü ile takip edin. Çapı yaklaşık 175 nanometre olan büyük unilameller fospolipid vezikülleri içeren, gözle görülür şekilde daha net süspansiyonu bir kenara koyun. Ekstrüzyon tamamlandıktan sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi 13 x 100 milimetre cam tüplerde standartları hazırlayın.

Ardından, her bir LUV ve proteolipozom örneğinden 10 mikrolitre benzersiz bir cam tüpe ekleyin ve 40 mikrolitre deiyonize damıtılmış su ile seyreltin. Her tüpe 300 mikrolitre perklorik asit ekleyin ve bir ısıtma bloğunda 145 santigrat derecede bir saat ısıtın. Buharlaşmayı önlemek için her tüpün üzerine bir mermer yerleştirin.

Daha sonra tüpleri oda sıcaklığına soğumaya bırakın ve her birine bir mililitre deiyonize damıtılmış su ekleyin. Her birine litre başına 12 gram amonyum molibdat ve litre başına 50 gram sodyum askorbat içeren taze hazırlanmış bir çözeltiden 400 mikrolitre ekleyin ve karıştırmak için girdap ekleyin. Buharlaşmayı önlemek için mermer kullanarak tüpleri 100 santigrat derecede 10 dakika ısıtın.

Ardından tüpleri ısıtma bloğundan çıkarın ve oda sıcaklığına soğumaya bırakın. 797 nanometreye ayarlanmış bir spektrometre kullanarak, standartları kullanarak bir kalibrasyon eğrisi elde edin. Ardından, numunelerin işlenmemiş maddeye karşı emilimini ölçün ve fosfat içeriğini belirleyin.

Her bir ekstrüde LUV süspansiyonundan 800 mikrolitreyi iki mililitrelik benzersiz bir mikrofüze tüpüne pipetleyerek başlayın. Her tüpe 5.3 mikrolitre tampon A ve 34.7 mikrolitre hacim başına %10 kütle-kütle DDM ekleyin, tampon A'da çözünmüş. Daha sonra, numuneleri uçtan uca karıştırma ile oda sıcaklığında üç saat inkübe edin.

Numuneler inkübe edilirken, bir cam beherdeki boncuk numunesi başına 400 miligram tartın. Boncukları metanol örneği başına beş mililitre ile yıkayın ve 10 dakika boyunca yavaşça karıştırın. Bu yıkamayı metanol için bir kez, üç kez su ile ve bir kez tampon A ile tekrarlayın. Numune inkübasyonunun son 30 dakikası boyunca, bir nitrojen akışı altında vidalı kapaklı bir cam tüpte NBD etiketli fosfolipid numunesi başına 9.5 mikrolitre kurutun.

Ardından, kurutulmuş fosfolipidi çözmek için tampon A'ya hacim başına %0.1 DDM numune başına 45 mikrolitre ekleyin. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, çözünmüş MBD etiketli fosfolipid çözeltisini her numuneye ekleyin. Daha sonra, yedi milimolar DDM konsantrasyonuna sahip bir mililitrelik nihai hacim elde etmek için% 0.1 DDM, tampon A ve DDM ile çözündürülmüş opsin'i istenen miktarda ekleyin.

Bir zar proteininin sulandırılması, veziküllerin yeterli deterjanla muamele edilmesiyle sağlanır, böylece şişme çözülmez. Ve her lipit bileşimi ve deterjan için ampirik olarak bulunması gereken bu koşullar, proteinin lipozomlara entegre olacağıdır. Numuneleri oda sıcaklığında bir saat karıştırın.

Daha sonra, her tüpe 80 miligram hazırlanmış polistiren boncuk ekleyin ve uçtan uca karıştırma ile oda sıcaklığında bir saat tekrar inkübe edin. Her numuneye 160 miligram daha polistiren boncuk ekleyin ve uçtan uca karıştırma ile oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. Kuluçka tamamlandığında, numuneleri, boncukları geride bırakarak, her biri 160 miligram taze boncuk içeren temiz cam tüplere aktarın.

Işıktan koruyarak gece boyunca dört santigrat derecede uçtan uca karıştırın. Ardından, numuneleri boncuklar olmadan benzersiz mikro sigorta tüplerine aktarın. Scramblase aktivite testine hazırlık olarak tüpleri buzun üzerine yerleştirin.

Plastik bir karıştırma çubuğu içeren plastik bir kübete 1950 mikrolitre tampon A ekleyerek başlayın. Daha sonra hazırlanan protealipozom örneğinden 50 mikrolitre ekleyin. Numunenin floresan spektrometrede beş saniye boyunca sürekli karıştırarak dengelenmesine izin verin.

Numune dengelenirken, 0.5 molar tamponsuz tris içinde bir molar ditiyonit çözeltisi hazırlayın. Floresan izlemeyi 470 nanometre uyarma, 530 nanometre emisyon ve 0,5 nanometre yarık genişliği ile başlatın. Sabit bir sinyal elde etmek için 50 saniye boyunca kayıt yapın.

Ardından, kübete 40 mikrolitre bir molar ditiyonit çözeltisi ekleyin. Floresanı en az 500 saniye boyunca kaydedin. Son olarak, verileri metin protokolünde belirtildiği gibi analiz edin.

Floresan verilerinin tam bir analizi için, sulandırılamayan veziküllerin fraksiyonunu belirlemek için. Sulandırılmış veziküllerdeki proteinlerin ve lipitlerin geri kazanımı ve ayrıca veziküllerin boyut dağılımı. Bu çalışmada, opsin, floresan bazlı bir test kullanılarak scramblase aktivitesini karakterize etmek için büyük unilamellar veziküller halinde yeniden yapılandırılmıştır.

Veziküller, dış ve iç broşürler arasında eşit olarak dağılan NBD-PC ile sulandırılır. Ditiyonit, vezikülün dışındaki NBD'nin nitro grubunu floresan olmayan bir amino grubuna indirgeyerek protein içermeyen lipozomlarda floresansın %50 azalmasına neden olur. Bununla birlikte, opsin, iç ve dış broşür arasındaki NBD hareketini kolaylaştırdığında, tam bir floresan kaybı meydana gelir.

Bu yaklaşımın farklı protein-fosfolipid oranlarında temsili sonuçları burada görülebilir. Floresan azalmasının kapsamı, sıfır ila 4.95 mikrogram arasında değişen veziküllere yeniden oluşturulan opsin miktarı ile artar. Belirtilen zamanda ditiyonit ilave edildi ve NBD floresansı 400 saniye boyunca izlendi.

Floresan azalması, daha yüksek protein-fosfolipid oranlarında daha önemlidir, en büyük azalma %85'tir. Kırmızı eğri, opsin için mono-üstel bir uyumu temsil eder. Kesikli gri çizgiler, opsin'in monomerler, önceden oluşturulmuş dimerler veya önceden oluşturulmuş tetramerler olarak veziküllere yeniden yapılandırılması için mono-üstel uyumları temsil ederken.

Tanımladığımız yöntem, farklı ihtiyaçlara kolayca uyarlanabilir. Prosedürler çok yönlüdür ve gelecekte diğer membran proteinlerinin fosfolipid scramblase aktivitesini tanımlamak ve karakterize etmek için kullanılabilir. Sulandırma işlemi herhangi bir zar proteinine uygulanabilir.

Bu teknik, opsin'i biyokimyasal olarak doğrulanmış ilk fosfolipid scramblase olarak tanımlamamızı sağladı ve daha sonra proteinin farklı doğrulama durumlarının aktivitesini ve farklı lipitleri taşıma kabiliyetini karakterize etmemize izin verdi.