Name: Fosfolipid Scramblase Aktivitesinin bir floresan bazlı analiz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Öğrenin, opsin ile rekonstitüe edilmiş lipozomlarda fosfolipid scramblase aktivitesini floresan bazlı analizle ölçmeyi. Bu güvenilir yöntem, hücreler arası lipid taşıma mekanizmalarını anlamak için protein kimliğini belirlemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Velux Stiftung (A.K.M.), NIH hibe EY024207 (A.K.M.) ve Avusturya Bilim Fonu (FWF) projesi J3686 (B.P.) tarafından desteklenmiştir.

Lipozomlar ve Proteoliposomes hazırlanması 1. <ol><li> Lipozom oluşumu <ol><li> Bir cam şırınga kullanılarak, POPC bir molar oranda 52.5 umol lipidler elde etmek için bir yuvarlak tabanlı şişeye kloroform (25 mg / ml) ve 160 ul POPG (kloroform içinde, 25 mg / ml) 1.435 ul POPC ekleyin: POPG = 9: 1 arasındadır. </li><li> (Su banyosu çözücünün, bu hacim için gerekli olan) 145 rpm&#39;lik bir dönme hızında bir döner buharlaştırıcı kullanılarak 30 dakika boyunca lipidleri Kuru, daha sonra oda sıcaklığında, gece boyunca en az 3 saat, ya da bir elektrikli desikatöre balona (RT). </li><li> 50 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCI, 10 ml ile kurutuldu lipid filminin hidratlanması yavaşça homojen, bulanık bir süspansiyon elde edilene değin balon dönen tarafından (bundan sonra tampon A olarak ifade edilecektir); NOT: Bu aşamada lipid konsantrasyonu hiçbir kayıp bugüne kadar meydana gelmiş gerektiği gibi 5.25 mM olması bekleniyor. </li><li> Bir frekans O, oda sıcaklığında 10 dakika için bir su banyosu içinde süspansiyon sonikasyonf 40 kHz. Çözelti biraz daha net görünecektir. </li><li> Bir ekstrüder kullanılarak 200 nm gözenek boyutuna sahip bir zar boyunca 4 geçiş ekstruderden bir ikinci döngü ve ardından 400 nm gözenek büyüklüğü olan bir membrandan süspansiyon 10 kez geçer. NOT: Elde edilen luvs ortalama çapı ~ 175 nm. Gerekirse, luvs büyüklüğü ve homojenliği, üreticinin talimatlarına uygun olarak dinamik ışık dağılımı ile kontrol edilebilir. </li><li> Bölüm 1.2&#39;de anlatıldığı gibi) LUV süspansiyonun fosfolipid konsantrasyonu ölçmek. NOT: ekstrüzyon sırasında kayıpların, konsantrasyon genelde yaklaşık 3.6 mM olduğu için. </li><li> Hemen kullanılmadığı takdirde, yaklaşık 2 hafta boyunca 4 ° C&#39;de luvs saklayın. </li></ol></li><li> fosfolipid Niceleme Not: fosfolipid Sulandırma için kullanılan LUV süspansiyon konsantrasyonu, hem de en sonunda üretilen proteoliposomes olduğu gibi belirlemek için, numunenin bir alikotu subje olanperklorik asit ile oksidasyonu cted. Bu prosedür daha sonra aykırı 23 ile karşılaştırıldığında kolorimetrik deneyi ile ölçülür, inorganik fosfat serbest bırakmak için fosfolipidleri parçalar. <ol><li> Iyonu giderilmiş damıtma suyu içinde sodyum fosfat, 40 mM stok çözeltisi (Na 2 HPO 4) hazırlanması. </li><li> 4 mM ve kalibrasyon standartları olarak görev yapacak çözümler çalışan 0.4 mM elde etmek için deiyonize distile su ile stok solüsyonu sulandırmak. </li><li> Çalışma çözüm kullanılarak, 0 ila 50 ul&#39;lik nihai bir hacimde 80 nmol sodyum fosfat kadar 13 x 100 mm 2 cam tüplerde standartlar hazırlandı. </li><li> LUV ve proteoliposome numunelerin her sayısal olarak 10 ul alın ve 13 x 100 mm 2 cam tüplerde GKD 2 O 40 ul seyreltin. Not: luvs ve proteoliposomes lipid konsantrasyon aralığında olduğu 2.5-5 uM, örnek 10 ul 25-50 nmol yağ fosfor içermelidir.</li><li> bir ısıtma bloğu içinde 145 ° C de 1 saat süre ile standart ve numuneleri ve ısı her 300 ul perklorik asit ekleyin. buharlaşmasını önlemek için tüplerde mermerleri koyun. </li><li> Tüpler oda sıcaklığında soğumaya bırakılmıştır ve GKD 2 O 1 ml ekle </li><li> Yeni hazırlanmış 12 g / L amonyum molibdat ve 50 g / L sodyum askorbat ve vorteks her karıştırmak için 400 ul ekle. </li><li> tüpler üzerine mermer ile 100 ° C &#39;de 10 dakika süre ile ısı. ısıtma bloğu tüpleri çıkarın ve oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. </li><li> 797 nm&#39;lik bir dalga boyunda bir spektrometre ile boş (0 nmol sodyum fosfat ihtiva eden standart bir örnek) karşı örneklerin absorbansı ölçülür. </li><li> Kalibrasyon standart bir eğriye karşı örneklerin fosfat içeriğini belirlemek. </li></ol></li><li> Opsin şifreden Not: deterjan doğasına bağlı, hem de yeniden oluşturma için en uygun şişme koşulların belirlenmesi için gerekli olanLuvs lipit bileşimi ve konsantrasyonu. Luvs süreci şişme kendi ışık saçılması özelliklerini değiştirmek olarak Rigaud ve Levy 24 ve Geertsma ve ark., 25 tarafından gözden absorbansı (Şekil 2) ölçerek izlenebilir. <ol><li> Pipet luvs 800 ul (bölüm 1.1, ekstrüzyondan sonra lipit geri kazanımı% 70 olarak, luvs beklenen konsantrasyonu 3.6 mM fosfolipiddir) 2 ml mikrofüj tüpüne. </li><li> DCM tampon A içinde çözülmüştür (w / v) Tampon A 5.3 ul% 10 34.7 ul ekle </li><li> sonu aşırı uç karıştırma ile, oda sıcaklığında 3 saat süreyle inkübe edilir. </li><li> Bu arada polistiren taneler hazırlamak: <ol><li> örnek başına boncuk 400 mg kullanın ve bir cam beher tartılır. </li><li> su ile, metanol ile iki kez, üç kez yıkayın ve bir kez tampon A ile her bir yıkama adımı kullanım için 5 ml sıvı, 10 dakika boyunca yavaşça karıştırın. NOT: polistiren hazırlamak için tavsiye edilirörneğin aynı anda birden fazla numune için boncuklardan 6 g tartın ve sıvının 75 ml ile yıkanır. Aşırı boncuklar birkaç gün boyunca buzdolabında saklanır. </li></ol></li><li> Numune başına, 0.4 mol% sonuçta NBD-PC 9.5 ul (1 mg / kloroform içinde mi,: vezikül destabilizasyonu son 30 dakika boyunca bir vida kapaklı bir cam tüp içinde NBD-etiketli fosfolipid ( &#39;sulandırma cam tüp&#39;) kuru Toplam fosfolipid) bir cam tüp içinde bir azot akımı altında kurutulur ve daha sonra,% 0.1, 45 ul (tampon a içinde ağırlık / hacim) DDM içinde çözüldü </li><li> Vezikül destabilizasyonu 3 saat 1 ml nihai hacim% 0.36 içeren bir örneğin çözündürüldü-NBD-etiketli fosfolipid DCM çözülmüş protein ekleyin ve tamponlar (a / h), yani, 7 mM, DCM. <ol><li> Bu nedenle, (% 0.1 DDM içinde çözülmüş) NBD-PC&#39;nin 45 ul,% 0.1 DDM 60 ul tampon A 55 ul (bir kontrol numunesi olarak kullanılan) proteinsiz lipozomları üretmek için; proteoliposomes için Sınava eklemekple,% 0.1 DDM (~ 110 ng / | il tipik bir stok çözeltiden), proteinin 40 ul, NBD-PC&#39;nin 45 ul,% 0.1 DDM 20 ul ve tampon 55 ul (% 0.1 DDM içinde çözülmüş) . NOT: Ayrıca sırası olarak listelenmiş olmalıdır. </li></ol></li><li> Oda sıcaklığında sonuna göre ek bir saat sonu için örnek karıştırın. </li><li> Hazırlanan polistiren boncuklar 80 mg ekleme ve son aşırı uç oda sıcaklığında 1 saat karıştırılarak, örnek inkübe edin. </li><li> Sonraki polistiren boncuklar ilave 160 mg ekleme ve son aşırı uç oda sıcaklığında ilave bir 2 saat boyunca karıştırılarak inkübe edilir. </li><li> Taze polistiren boncuklar 160 mg ihtiva eden bir cam vida kapaklı tüp örnek (arkasına harcanan polistiren boncuklar bırakarak) aktarın ve 4 ° C&#39;de bir gece karıştırılır. NOT: örnek aktarmak ve boncuk emme kadar önlemenin en kolay yolu biraz pozitif basınç ile cam tüpün dibine itilir Pasteur pipeti kullanmaktır. pipet ucu sıkıca bir kezTüpün alt, daha sonra örnek bir boncuk müdahalesi olmaksızın kolayca çekilebilir. </li><li> Ertesi sabah, scramblase aktivite deneyi için hazırlık olarak buz üzerinde boncuklar ve yeri üzerinde taşıyan olmayan bir mikrofüj tüpüne örnek aktarmak. </li></ol></li></ol> 2. Scramblase Aktivite Deneyi Not: tampon A ile seyreltilmiştir lipozomlar veya proteoliposomes floresans yoğunluğu bir floresan spektrometresinde ditionit ilave edildikten sonra zaman içinde izlenir. istikrarlı başlangıç ​​yoğunluğu elde etmek için, floresans sürekli karıştırılan örnek ditionit ilave edilmeden önce en az 50 saniye (ya da sabit bir sinyal elde edilene kadar) için kaydedilir ve daha sonra ditionit ilave sonra en az 500 saniye boyunca takip edilir. <ol><li> mini karıştırma-bar içeren plastik küvete tampon A 1950 ul ekleyin. </li><li> (Lipozomlar) hazırlanan Proteo 50 ul ekleyin ve örnek floresan spektrfotometrik dengeye izinBirkaç saniye sabit karıştırma ile ölçer. </li><li> Bu arada, 0.5 M tamponlanmamış Tris (iki numune mikrofüj tüpüne ditiyonit 20 mg tartılır ve 114 içinde çözülür örneğin; 1 M ditionit ihtiva eden bir çözelti hazırlamak ul buz soğukluğunda doğrudan kullanımdan önce ve sonraki için buz üzerinde tutulur, 0.5 M Tris örnek). Not: ditionit solüsyonu taze hazırlanmış olması ve hazırlandıktan sonra fazla 20 dakika kullanılmamalıdır; Birçok ölçümleri yapılacak olduğunda, ditiyonit alikotları önceden tartıldı ve hemen kullanım öncesi eritilebilir. </li><li> floresan izleme başlatın (uyarma 470 nm, emisyon 530 nm, genişliği 0.5 nm yarık). </li><li> kayıt floresan (mümkünse küvet odasının kapağındaki septum kullanın) başladıktan sonra küvet 50 sn 1 M ditiyonit çözeltisi 40 ul ekleyin ve bir daha 400-600 saniye floresan kaydetmeye devam ediyor. </li><li> Bölüm 3&#39;te tarif edildiği gibi analiz edin. </li></ol> 3..Veri analizi <ol><li> Scrambling kinetiği <ol><li> Başlangıç ​​floresans tanımlayarak scramblase aktivite deneyi ile elde edilen her bir numune floresans izleme karakterize, K i ditiyonit ekleme ve son-nokta floresan, K, ulaştığı öncesinde&gt; 400 saniye sonra. F öncesinde ditiyonit ilavesinden 30 saniye süre ile floresans ortalama değer olarak, her bir örnek için tespit edildi. </li><li> Floresan azalma ölçüde, R = 100 karşılık gelen uç nokta veri belirleme • F / F i. Biz opsin içeren proteoliposomes için protein içermeyen lipozomlar ve R P terimleri R L kullanın. </li></ol></li><li> Fonksiyonel Yeniden yapılandırılmış Scramblase molekül ağırlıklarının belirlenmesi <ol><li> aşağıdaki denkleme göre flüoresans indirgeme veri dönüştürme: p (≥1 scramblase) = (R P - R L) / (R max - R L) (Denklem 1) NOTR max yeterli protein örnekteki tüm veziküller en az bir işlevsel scramblase sahip olacak şekilde yeniden zaman elde edilen maksimum azalma ve p sulandırılmış bir numune içindeki özel bir vezikül &#39;scramblase aktif&#39; olduğu olasılığı olduğu durumda, örneğin, en az bir işlevsel scramblase sahiptir. R max yerine beklenen% 100 (deneysel&gt; 1 mg / mmol PPR ile opsin proteoliposomes için tespit edilebilir R max) ve tipik% 82.5 3 ise R L değeri tipik olarak 45% 3. R max olarak &lt;% 100 veziküllerin bir alt popülasyonunun sulandırma dirençli olduğu varsayılmıştır. R max =% 82.5 için, protein kabul edemiyor veziküllerin kesir 0.35 olduğunu. </li><li> aşağıdaki gibi Poisson istatistiklerine göre p (≥1 scramblase) ve PPR (mg protein / mmol fosfolipid) arasındaki ilişkiyi açıklar: e - p (≥1 scramblase) 1 = <s&gt; -m = 1 kadar - exp (-PPR / a) (Denklem 2) Not: Burada mg protein / mmol fosfolipid birimlerinde vezikül ve α = mono- üstel uygun sabit ortalama scramblases M = sayısı. </li><li> veziküllerin bir kısmını (tartışma) bile yüksek ppr çabalıyorlar katkıda bulunmaz olarak, denklem için değiştirin: p (≥1 scramblase) = 1 - exp (-PPR * / α) (Denklem 3) NOT: Burada f, bu durumda, PPR * = PPR / 0.65 (Denklem 4) içinde, veziküllerin refrakter nüfusu veya PPR * = PPR / (1- f). Not: uygun sabit bir α, bir mono- üstel fonksiyon PPR * karşı p (≥1 scramblase) &#39;in bir grafiğini uydurma ile belirlenir. Opsin (moleküler ağırlığı 41.7 kDa) işlevsel 175-nm çaplı veziküller içine yeniden oluşturulmasını Eğer bir monomer olarak, α = 0.187 mg mmol -1 (her vezikül 280.000 fosfolipid 26 vardır). Opsin dimerleşir Eğer önceden α sonra, scramblase aktif veziküller vermek üzere 3 sulandırma için= 0.37 mg mmol -1. PPR yerine PPR * analizi için kullanılacak olsaydı, o zaman gelen α değerleri 0.122 ve 0.244 mg mmol -1 olacaktır. a bu tahmin değerleri tüm opsin molekülleri fonksiyonel yetkili olduğunu varsayıyorum. moleküllerin yalnızca bir kısmını lipidler karıştırmak için yetkili ise, o a karşılık gelen değerleri daha büyük olacaktır. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Ernst, O. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+and+animal+rhodopsins%3A+structures%2C+functions%2C+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Microbial and animal rhodopsins: structures, functions, and molecular mechanisms.</a> Chem. Rev. 114, 126-163 (2014).</li>
<li>Menon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opsin+is+a+phospholipid+flippase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol.+CB%22%5BJournal%5D)">Opsin is a phospholipid flippase.</a> Curr. Biol. CB. 21, 149-153 (2011).</li>
<li>Goren, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+phospholipid+scramblase+activity+of+a+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Constitutive phospholipid scramblase activity of a G protein-coupled receptor.</a> Nat. Commun. 5, 5115(2014).</li>
<li>Ernst, O. P., Menon, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+scrambling+by+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol.+Sci.+Off.+J.+Eur.+Photochem.+Assoc.+Eur.+Soc.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Phospholipid scrambling by rhodopsin.</a> Photochem. Photobiol. Sci. Off. J. Eur. Photochem. Assoc. Eur. Soc. Photobiol. , (2015).</li>
<li>Sanyal, S., Menon, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flipping+lipids%3A+why+an%27+what%27s+the+reason+for%3F%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Flipping lipids: why an' what's the reason for?</a> ACS Chem. Biol. 4, 895-909 (2009).</li>
<li>Bevers, E. M., Williamson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+scramblase%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Phospholipid scramblase: an update.</a> FEBS Lett. 584, 2724-2730 (2010).</li>
<li>Leventis, P. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+and+function+of+phosphatidylserine+in+cellular+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes.</a> Annu. Rev. Biophys. 39, 407-427 (2010).</li>
<li>Quazi, F., Lenevich, S., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCA4+is+an+N-retinylidene-phosphatidylethanolamine+and+phosphatidylethanolamine+importer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">ABCA4 is an N-retinylidene-phosphatidylethanolamine and phosphatidylethanolamine importer.</a> Nat. Commun. 3, 925(2012).</li>
<li>Quazi, F., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-binding+cassette+transporter+ABCA4+and+chemical+isomerization+protect+photoreceptor+cells+from+the+toxic+accumulation+of+excess+11-cis-retinal%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">ATP-binding cassette transporter ABCA4 and chemical isomerization protect photoreceptor cells from the toxic accumulation of excess 11-cis-retinal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 5024-5029 (2014).</li>
<li>Ben-Shabat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+a+nonaoxirane+from+A2E%2C+a+lipofuscin+fluorophore+related+to+macular+degeneration%2C+and+evidence+of+singlet+oxygen+involvement%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Formation of a nonaoxirane from A2E, a lipofuscin fluorophore related to macular degeneration, and evidence of singlet oxygen involvement.</a> Angew. Chem. Int. Ed Engl. 41, 814-817 (2002).</li>
<li>Sparrow, J. R., Wu, Y., Kim, C. Y., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+meets+all-trans-retinal%3A+the+making+of+RPE+bisretinoids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Phospholipid meets all-trans-retinal: the making of RPE bisretinoids.</a> J. Lipid Res. 51 (2010), 247-261 (2010).</li>
<li>Schütt, F., Davies, S., Kopitz, J., Holz, F. G., Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodamage+to+human+RPE+cells+by+A2-E%2C+a+retinoid+component+of+lipofuscin%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Photodamage to human RPE cells by A2-E, a retinoid component of lipofuscin.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 2303-2308 (2000).</li>
<li>Picollo, A., Malvezzi, M., Accardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMEM16+proteins%3A+unknown+structure+and+confusing+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">TMEM16 proteins: unknown structure and confusing functions.</a> J. Mol. Biol. 427, 94-105 (2015).</li>
<li>Mohammadi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+FtsW+as+a+transporter+of+lipid-linked+cell+wall+precursors+across+the+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Identification of FtsW as a transporter of lipid-linked cell wall precursors across the membrane.</a> EMBO J. 30, 1425-1432 (2011).</li>
<li>Meeske, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MurJ+and+a+novel+lipid+II+flippase+are+required+for+cell+wall+biogenesis+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">MurJ and a novel lipid II flippase are required for cell wall biogenesis in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 6437-6442 (2015).</li>
<li>Ruiz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Flippases+for+Bacterial+Peptidoglycan+Biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Lipid+Insights%22%5BJournal%5D)">Lipid Flippases for Bacterial Peptidoglycan Biosynthesis.</a> Lipid Insights. 8, 21-31 (2015).</li>
<li>Rick, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+the+wzxE+gene+of+Escherichia+coli+K-12+encodes+a+protein+involved+in+the+transbilayer+movement+of+a+trisaccharide-lipid+intermediate+in+the+assembly+of+enterobacterial+common+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evidence that the wzxE gene of Escherichia coli K-12 encodes a protein involved in the transbilayer movement of a trisaccharide-lipid intermediate in the assembly of enterobacterial common antigen.</a> J. Biol. Chem. 278, 16534-16542 (2003).</li>
<li>Suzuki, J., Imanishi, E., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+phosphatidylserine+by+Xk-related+protein+family+members+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Exposure of phosphatidylserine by Xk-related protein family members during apoptosis.</a> J. Biol. Chem. 289, 30257-30267 (2014).</li>
<li>Suzuki, J., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+scrambling+on+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Phospholipid scrambling on the plasma membrane.</a> Methods Enzymol. 544, 381-393 (2014).</li>
<li>Alaimo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+but+interchangeable+mechanisms+for+flipping+of+lipid-linked+oligosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Two distinct but interchangeable mechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides.</a> EMBO J. 25, 967-976 (2006).</li>
<li>Ernst, C. M., Peschel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad-spectrum+antimicrobial+peptide+restistance+by+MprF-mediated+aminoacylation+and+flipping+of+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbial%22%5BJournal%5D)">Broad-spectrum antimicrobial peptide restistance by MprF-mediated aminoacylation and flipping of phospholipids.</a> Mol. Microbial. 80 (2), 290-299 (2011).</li>
<li>Vehring, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flip-flop+of+fluorescently+labeled+phospholipids+in+proteoliposomes+reconstituted+with+Saccharomyces+cerevisiae+microsomal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Flip-flop of fluorescently labeled phospholipids in proteoliposomes reconstituted with Saccharomyces cerevisiae microsomal proteins.</a> Eukaryot. Cell. 6, 1625-1634 (2007).</li>
<li>Rouser, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+dimensional+then+%5Bsic%5D+layer+chromatographic+separation+of+polar+lipids+and+determination+of+phospholipids+by+phosphorus+analysis+of+spots%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">Two dimensional then [sic] layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots.</a> Lipids. 5, 494-496 (1970).</li>
<li>Rigaud, J. -L., Lévy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).</li>
<li>Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+reconstitution+of+ABC+transporters+and+assays+of+translocator+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function.</a> Nat. Protoc. 3, 256-266 (2008).</li>
<li>Mimms, L. T., Zampighi, G., Nozaki, Y., Tanford, C., Reynolds, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+vesicle+formation+and+transmembrane+protein+incorporation+using+octyl+glucoside%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phospholipid vesicle formation and transmembrane protein incorporation using octyl glucoside.</a> Biochemistry. 20, 833-840 (1981).</li>
<li>Malvezzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-dependent+phospholipid+scrambling+by+a+reconstituted+TMEM16+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel.</a> Nat. Commun. 4, 2367(2013).</li>
<li>Eckford, P. D. W., Sharom, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reconstituted+P-glycoprotein+multidrug+transporter+is+a+flippase+for+glucosylceramide+and+other+simple+glycosphingolipids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">The reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter is a flippase for glucosylceramide and other simple glycosphingolipids.</a> Biochem. J. 389, 517-526 (2005).</li>
<li>Marek, M., Günther-Pomorski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+Flippase+Activity+in+Proteoliposomes+Using+Fluorescent+Lipid+Derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Assay of Flippase Activity in Proteoliposomes Using Fluorescent Lipid Derivatives.</a> Methods Mol. Biol. 1377, 181-191 (2016).</li>
<li>Coleman, J. A., Kwok, M. C. M., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+purification%2C+and+functional+reconstitution+of+the+P4-ATPase+Atp8a2%2C+a+phosphatidylserine+flippase+in+photoreceptor+disc+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Localization purification, and functional reconstitution of the P4-ATPase Atp8a2, a phosphatidylserine flippase in photoreceptor disc membranes.</a> J. Biol. Chem. 284, 32670-32679 (2009).</li>
<li>Coleman, J. A., Quazi, F., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+P4-ATPases+and+ABC+transporters+and+their+role+in+phospholipid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mammalian P4-ATPases and ABC transporters and their role in phospholipid transport.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1831, 555-574 (2013).</li>
<li>Romsicki, Y., Sharom, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+flippase+activity+of+the+reconstituted+P-glycoprotein+multidrug+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phospholipid flippase activity of the reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter.</a> Biochemistry. 40, 6937-6947 (2001).</li>
<li>Zhou, X., Graham, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+phospholipid+translocase+activity+with+purified+Drs2p%2C+a+type-IV+P-type+ATPase+from+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of phospholipid translocase activity with purified Drs2p, a type-IV P-type ATPase from budding yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16586-16591 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Scramblase etkinlik tahlili olduğu opsin fosfolipid scramblase aktivitesi 2 bulunmaktadır belirlemek için ilk olarak sağladı. Tahlil da bize özgüllük test ederek opsin en scramblase etkinliğini karakterize izin (biz böyle Şekil 1A NBD-PC için gösterilen, ya da gibi bir asil zinciri üzerindeki NBD ile etiketlenmiş NBD-fosfatidiletanolamin olarak NBD etiketli muhabiri lipidlerin çeşitli kullanılan ana grup, NBD-sfingomiyelin veya NBD- fosfatidilserin 2), vezikül lipit kompozisyonu (e...

Fotoreseptör rodopsin (referans 1, örneğin gözden) bir prototip G protein-eşli reseptör, tanımlanacak ilk fosfolipid scramblase ve biyokimyasal olarak 2,3 sunmaktadır. Scramblases transbilayer fosfolipid hareketin özünde yavaş oranını artırmak fosfolipid taşıyıcıları olan bir çift yönlü fizyolojik uygun seviyelere, ATP-bağımsız bir şekilde 4-6. Eylemlerinin örnekleri endoplazmik retikulum ve konstitütif karıştırıcı olarak glikosilasyon yolakları 5 çeşitli zar homeostaz ve büyüme için gerekli olan bakteriyel sitoplazmik membranda bulunur. Bu gibi etki ettiği Ayarlı fosfolipid apoptotik hücrelerin yüzeyi üzerinde fosfatidilserin (PS) ortaya çıkarmak için gerekli olan her karıştırma bir makrofaj 7 -Sinyal &quot;me-yemeği&quot; ve protein faktörü üretimini katalize aktive kan plateletleri üzerinde prokoagülan yüzey sağlarkan pıhtılaşması için gerekli s. Fotoreseptör disk membranlarda, rodopsin en çabalıyorlar faaliyeti ATP-bağımlı, tek yönlü lipid tarafından oluşturulan iki tabakalı iki zar broşürleri arasındaki fosfolipid dengesizliği ortadan kaldırmak için önerilen ABCA4 4,8,9 10-12 Flippase edilmiştir. Rodopsin plazma membranında PS maruz için gereken 2 + -bağımlı scramblases (referans 2, TMEM16 protein ailesinin üyeleri, Ca olarak tanımlanmıştır fotoreseptör diskleri bir scramblase olarak rapor kadar scramblases fizyolojik önemine rağmen, kimlik elde edilememiştir 13) ve bir lipid II peptidoglikan sentezinin 14 için gerekli olan scramblase gibi bakteriyel protein FtsW önerilmiştir. Bu keşifler yöntem describ Oluşan proteoliposomes lipozomlarda saflaştırılmış proteinlerin yeniden oluşturulması ve scramblase etkinliğinin gösterilmesi dayanmaktadırBurada ed. Diğer potansiyel scramblases 15-21 - peptidoglikan biyosentezinde rol MurJ ve Amj proteinleri, WzxE ve ilgili proteinler O-antijeni öncüleri karıştırıcı karışmış, MprF proteini, bakteriyel sitoplazma zarından olarak amino fosfatidilgliserol yerini değiştirmek için gerekli olan ve Xkr8 aile üyeleri önerilmiştir bu apoptotik hücre yüzeyi üzerinde PS maruz - biyokimyasal test edilmesi gerekmektedir. Bu tespit ve scramblase etkinliğini karakterize etmek sağlam bir testin önemini vurgulamaktadır. Burada, bir floresans bazlı deney kullanılarak elde edilen proteoliposomes büyük tek tabakalı veziküller (luvs) saflaştırılmış opsin tekrar oluşturulmasını, fotoreseptör rodopsin apoprotein ve scramblase aktivitesi daha sonra analiz tarif eder. heterolog ifade ve opsin saflaştırılması için literatürde mevcut birkaç iyi tanımlanmış protokoller bu nedenle olmaz, vardırBu protokolde tarif; yaklaşık 100 ng FLAG etiketli, ısı ayarlı opsin verir Goren ve ark. 3&#39;te tarif protokollerini kullanan /% 0.1 ul (ağırlık / hacim) dodecylmaltoside (DCM). Sulandırma şişmeyen fakat çözünmez olduğu için, yeterli deterjan ile luvs muamele edilmesiyle elde edilmektedir. Bu koşullar altında, bir membran proteini - protein deterjan miseller halinde temin - lipozomlar entegre ve proteoliposomes sonuçlanan deterjanın alınması üzerine lipozom zarı içine yeniden hale gelir. (% 0.1 (ağırlık / hacim) DCM içinde saflaştırılmış proteini olarak elde edilmiştir) opsin tekrar oluşturmak için, LUVler POPC (1-palmitoil-2-oleoil sn -glisero-3-fosfokolin) ve POPG karışımı (1-hazırlanır palmitoil-2-oleoil sn -glisero-3- [fosfo-rak- (1-gliserol)]) ve opsin ve NBD-PC eklemeden önce DDM ile doyuruldu. Deterjan daha sonra polistiren boncuklar ile örnek muamele etmek suretiyle uzaklaştırılır. lass = &quot;jove_content&quot;&gt; floresans bazlı analiz temel ilkesi Şekil 1B &#39;de gösterilmiştir. Luvs simetrik NBD-PC veya diğer NBD etiketli floresan fosfolipid muhabiri (Şekil 1A) bir eser miktarı ile yeniden edilmektedir. ditionit ilave üzerinde NBD nitro grubu gibi bir zar geçirgenliği olmayan dianyon, luvs dış broşürde NBD-PC molekülleri işlenen floresan olmayan bir floresan olmayan amino grubuna indirgenir. de NBD-PC molekülleri de ditiyonit deneyi (&lt;10 dakika), zaman ölçeğinde membran hareket mümkün olduğundan, bu floresan sinyalin% 50 azalma ile sonuçlanır. Lipozomlar, bir scramblase ile yeniden Ancak, eğer, iç yaprakçıkta NBD-PC moleküller azaltılır dış hızla karıştırmak olabilir. Bu ideal bir durumda (Şekil 1C) floresans toplam kayıp ile sonuçlanır. ES / ftp_upload / 54.635 / 54635fig1.jpg &quot;/&gt; . Şekil 1: scramblase aktivite deneyinin şematik temsili tahlil, bir flüoresan NBD-etiketli raportör lipid kullanır; NBD-PC gösterilmiştir (A). Büyük tek tabakalı veziküller NBD-PC&#39;nin eser miktarı ile tekrar kurulmuştur. Sulandırma dış ve iç broşürlerde eşit olarak dağıtılır NBD-PC ile, simetrik veziküller üretir. Ditiyonit (S2 O 4 2-) kimyasal olmayan bir floresan amino grubuna NBD nitro grubunu azaltır. Ditiyonit (B, yukarıda) ile birlikte protein içermeyen lipozomlar tedavisi azaltılır, dış sayfada tek NBD-PC moleküllerinin floresan bir% 50 azalmaya neden olan: ditiyonit negatif yüklü ve NBD-PC molekülleri ile tepkimeye zarı geçemez iç broşürde. Opsin içeren proteoliposomes (B, alt), bir ditiyonit tedavi, yani scramblase aktif proteoliposomes, f% 100 kaybına yol açaropsin olarak luorescence iç ve dış broşürde arasında NBD-PC hareketini kolaylaştırır. (C) ditionit ile protein içermeyen lipozomlar ve opsin içeren proteoliposomes tedavi elde edilen idealize floresan izlerini gösterir. floresans kaybı oranı ditionit ile NBD kimyasal indirgeme karıştırıcı kimyasal tepkime oranından daha büyük veya eşit bir hızda gerçekleşir, ve bu oran-sınırlayıcı olduğunu gösteren her iki durumda da aynıdır. Gerçek bir deneyde elde edilen izleri Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54635/54635fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Bu tarif yöntemleri diğer saflaştırılmış proteinleri, hem de deterjan 22 mikrozomları ekstre, örneğin, elde edilen zar proteinlerinin karışımlarını sulandırmak ve analiz etmek için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfokolin</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>850457C</td><td>POPC</td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfo-rak- (1-gliserol) (sodyum tuzu)</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>840457C</td><td>POPG</td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-{6- [7-nitro-2-1,3-benzoksadiazol-4-il)amino]heksanoil}-sn-glisero-3-fosfokolin</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>810130C</td><td>NBD-PC</td></tr><tr><td>4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit</td><td>VWR Bilimsel</td><td>EM-5330</td><td>HEPES</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-1KG</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Dodesil-&beta;-D-maltosid</td><td>Anatrace</td><td>D310 5 GM</td><td>DDM</td></tr><tr><td>Florimetre küvetleri</td><td>sigma</td><td>C0918-100EA</td><td>küvetler</td></tr><tr><td>Spektroflorometre</td><td>Foton Teknolojisi Uluslararası, Inc.</td><td>florimetre</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidrosülfit teknik sınıf,% 85</td> <td>Sigma</td><td>157953-5G</td><td>ditiyonit</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5 yazılımı</td><td></td><td></td><td>Prizma</td></tr><tr><td>Tris Tabanı</td><td>VWR</td><td>JTX171-3</td><td>Tris</td></tr><tr><td>LIPEX 10 ml ekstruder ve nbsp;</td><td>Kuzey Lipitler, Inc.</td><td></td><td>Ekstruder</td></tr><tr><td>Whatman, Drenaj diski, PE, 25 mm</td><td>Sigma</td><td>28156-243</td><td>Disk desteği</td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore Paletle Kazınmış Membranlar, 0.4 & m, 25 mm çaplı</td><td>Sigma</td><td>WHA110607</td><td>400 nm membran</td></tr><tr><td>Whatman Nucleopore Track-Etched Membranlar, 0.2 & m, 25 mm çaplı</td><td>Sigma</td><td>WHA110606</td><td>200 nm membran</td></tr><tr><td>sodyum fosfat</td><td>Sigma</td><td>S3264-500G</td><td></td></tr><tr><td>VWR Kültür Tüpleri, Tek Kullanımlık, Borosilikat Cam, 13 x 100 mm</td><td>VWR Scientific</td><td>47729-572</td><td>cam tüpler</td></tr><tr><td>Perklorik asit</td><td>Sigma</td><td>30755-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum Molibdat Tetrahidrat</td><td>Sigma</td><td>A-7302</td><td>amonyum molibdat</td></tr><tr><td>(+)- Sodyum L-askorbat</td><td>Sigma</td><td>A7631-25G</td><td>sodyum askorbat</td></tr><tr><td>Bio-Beads SM2 adsorbanları</td><td>Bio Rad</td><td>1523920</td><td>polistiren boncuklar</td></tr><tr><td>&nbsp; 2.0 ml Mikrotüpler şeffaf</td><td>VWR Scientific</td><td>10011-742</td><td>Sulandırma tüpleri</td></tr><tr><td>Sulandırma cam tüp</td><td>VWR Scientific</td><td>53283-800</td><td>Sulandırma cam tüpleri</td></tr><tr><td>Zetasizer&nbsp;</td><td>Malvern&nbsp;</td><td></td><td>Dls</td></tr></tbody></table>

fosfolipid scramblase aktivitesinin bir floresan bazlı analiz

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Scramblases çift yönlü bir ATP-bağımsız bir şekilde membran çift-tabakanın fosfolipidleri transloke. İlk scramblase tespit ve biyokimyasal, fotoreseptör rodopsin apoproteini opsin edilmiştir doğrulanmış olması. Rodopsin ışık algılama sorumludur retina çubuk fotoreseptör membranlarının lokalize bir G-protein bağlı reseptördür. Rodopsin adlı scramblase faaliyeti onun ligandı 11- sis -retinal, yani bağlı değildir, apoprotein opsin da bir scramblase olarak aktiftir. karıştırıcı konstitütif ve regüle fosfolipid hücre fizyolojisinde önemli rol oynamakla birlikte, sadece bir kaç fosfolipid scramblases kadar opsin yanında tespit edilmiştir. Burada opsin en scramblase aktivitesinin bir floresans bazlı analiz tarif eder. Opsin fosfatidilkolin, fosfatidilgliserol ve flüoresan NBD-etiketli bilgisayar (1-p izi miktardan oluşan büyük tek katmanlı lipozomlar içine kuruluralmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-benzoksadiazol-4-il) amino] heksanoil} - sn -glisero-3-fosfokolin). Scramblase aktivitesi vezikül iç broşürde bulunan NBD-PC molekülleri floresans kimyasal membranını geçemediği için bir indirgeyici madde ile elimine edilir dış yaprakçık erişebilir ne ölçüde ölçülerek belirlenir. Bu tarif yöntemler genel olarak uygulanmaktadır ve diğer membran proteinleri scramblase aktivitelerini belirlemek ve karakterize etmek için kullanılabilir.

Bir flüoresan bazlı analiz kullanarak scramblase aktivitesinin karakterize edilmesi için luvs halinde opsin tekrar oluşturulmasını tarif eder. Biz çabalıyorlar opsin aracılı fosfolipid oranı üzerinde bir alt sınır koymak için ve opsin işlevsel veziküller içine yeniden oluşturulmasını hangi oligomerik durumunu belirlemek için sonuçları analiz. uygun sulandırma koşullarını belirlemek için, deneysel da proteinin sokulmasından açı...

Opsin ile sulandırılmış büyük unilameller lipozomlarda fosfolipid karıştırmayı ölçmek için floresan bazlı bir test tarif ediyoruz.

Fosfolipid Scramblase Aktivitesinin bir floresan bazlı analiz

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Bu prosedürün genel amacı, tipik bir G proteini kenetli reseptörü büyük unilameller veziküllere yeniden yapılandırmak ve floresan tabanlı bir analiz kullanarak fosfolipidlerin bir lipid çift katmanı boyunca gerçekleştirdiği 80p bağımsız translokasyon yeteneğini ölçmektir. Bu yöntem, hücreler arası lipid taşınımı alanındaki, lipidleri karıştırabilen (scramble) proteinlerin moleküler kimliklerinin ne olduğu ve mekanizmalarının nasıl çalıştığı gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, oldukça güvenilir ve sağlam olmasıdır.Belirli bir lipid kompozisyonu ve tercih edilen bir deterjan için rekonstitüsyon prosedürünüz belirlendikten sonra, bu prosedüre başlamak için bir cam şırınga kullanarak yuvarlak tabanlı bir balona 25 mg/mL konsantrasyonundaki POPC ve kloroform çözeltisinden 1435 µL ekleyin. Dokuz bir POPC/POPG molar oranında 52,5 µmol lipid elde etmek için 25 mg/mL konsantrasyonundaki POPG ve kloroform çözeltisinden 160 µL ekleyin.Ardından, lipidleri 145 RPM'ye ayarlanmış bir döner evaporatör kullanarak 30 dakika boyunca kurutun. Kurutma işlemi tamamlandığında, balonu oda sıcaklığında üç saat boyunca bir vakumlu desikatöre aktarın. Daha sonra, kurumuş lipid filmini hidrate etmek için 10 mililitre tampon A ekleyin.Homojen ve bulanık bir süspansiyon oluşana kadar erleni hafifçe çalkalayın. Süspansiyonu, oda sıcaklığındaki bir su banyosunda 40 kilohertz frekansında 10 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun. Ardından, bir ekstrüder kullanarak numuneyi 400 nanometer gözenek boyutuna sahip bir membrandan 10 kez geçirin.Bunu, numuneyi 200 nanometre gözenek boyutuna sahip bir membrandan dört kez geçirerek gerçekleştirilecek ikinci bir ekstrüzyon döngüsüyle takip edin. Çapı yaklaşık 175 nanometre olan büyük tek tabakalı fosfolipid vezikülleri içeren, gözle görülür şekilde daha berrak olan resulting süspansiyonu kenara ayırın. Ekstrüzyon tamamlandıktan sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi 13 x 100 milimetrelik cam tüplerde standartları hazırlayın.Ardından, her bir LUV ve proteolipozom örneğinden 10 µL'yi ayrı bir cam tüpe ekleyin ve 40 µL deiyonize distile su ile seyreltin. Her tüpe 300 µL perklorik asit ekleyin ve bir ısıtma bloğunda 145 °C'de bir saat boyunca ısıtın. Buharlaşmayı önlemek için her tüpün üzerine bir misket yerleştirin.Ardından tüplerin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve her birine bir mililitre deiyonize distile su ekleyin. Her birine, litre başına 12 gram amonyum molibdat ve litre başına 50 gram sodyum askorbat içeren taze hazırlanmış bir çözeltiden 400 mikrolitre ekleyin ve karıştırmak için vortekslenmesini sağlayın. Buharlaşmayı önlemek için misketler kullanarak tüpleri 100 °C'de 10 dakika boyunca ısıtın.Ardından tüpleri ısıtma bloğundan çıkarın ve oda sıcaklığına gelene kadar bekleyin. 797 nanometreye ayarlanmış bir spektrometre kullanarak standartlarla bir kalibrasyon eğrisi elde edin. Daha sonra, örneklerin absorbansını kör örneğe karşı ölçün ve fosfat içeriğini belirleyin.Her bir ekstrüde edilmiş LUV süspansiyonundan 800 µL'yi ayrı bir 2 mL'lik microfuse tüpüne pipetleyerek başlayın. Her tüpe 5,3 µL tampon A ve tampon A içinde çözünmüş %10 kütle/hacim DDM'den 34,7 µL ekleyin. Ardından, örnekleri oda sıcaklığında, uçtan uca karıştırarak üç saat boyunca inkübe edin.Numuneler inkübe olurken, cam bir behere numune başına 400 miligram boncuk tartın. Boncukları numune başına beş mililitre metanol ile yıkayın ve 10 dakika boyunca yavaşça karıştırın. Bu yıkama işlemini metanol ile bir kez, su ile üç kez ve tampon A ile bir kez tekrarlayın. Numune inkübasyonunun son 30 dakikasında, vidalı kapaklı cam bir tüpteki numune başına 9,5 mikrolitre NBD etiketli fosfolipidi azot akımı altında kurutun.Ardından, kurutulmuş fosfolipidi çözmek için her örneğe tampon A içerisinde %0,1 (kütle/hacim) DDM'den 45 µL ekleyin. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, çözünmüş MBD işaretli fosfolipid çözeltisini her örneğe ekleyin. Daha sonra, toplam hacmi 1 mL ve DDM konsantrasyonunu 7 mM yapacak şekilde, sırasıyla %0,1 DDM, tampon A ve istenen miktarda DDM ile çözülmüş opsini ekleyin.Bir membran proteininin yeniden konstitüsyonu, veziküllerin, şişme gerçekleşecek ancak çözünme olmayacak şekilde yeterli deterjanla muamele edilmesiyle gerçekleştirilir. Her lipid kompozisyonu ve deterjan için ampirik olarak belirlenmesi gereken bu koşullarda, protein lipozomlara entegre olacaktır. Örnekleri oda sıcaklığında bir saat boyunca karıştırın.Ardından, her tüpe hazırlanan polistiren boncuklardan 80 milligrams ekleyin ve uçtan uca karıştırma ile oda sıcaklığında bir saat daha inkübe edin. Her örneğe 160 milligrams daha polistiren boncuk ekleyin ve uçtan uca karıştırma ile oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. İnkübasyon tamamlandığında, örnekleri boncukları geride bırakarak, her biri 160 milligrams taze boncuk içeren temiz cam tüplere aktarın.Işık korumalı olarak, dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca uçtan uca karıştırın. Ardından, boncuklar hariç olmak üzere örnekleri ayrı mikrofüj tüplerine aktarın. Scramblase aktivite testi hazırlığı için tüpleri buz üzerine yerleştirin.Plastik bir karıştırma çubuğu içeren plastik bir küvete 1950 µL tampon A ekleyerek başlayın. Ardından, hazırlanan protealipozom örneğinden 50 µL ekleyin. Örneği, sürekli karıştırma ile floresan spektrometrede beş saniye boyunca dengeye bırakın.Numune dengelenirken, 0,5 molar tamponlanmamış tris içerisinde bir molar ditiyonit çözeltisi hazırlayın. Floresan izlemeyi 470 nanometre eksitasyon, 530 nanometre emisyon ve 0,5 nanometre yarık genişliği ile başlatın. Kararlı bir sinyal elde etmek için 50 saniye boyunca kayıt yapın.Ardından, küvete 40 µL bir molar dityonit çözeltisi ekleyin. Floresan değerlerini en az 500 saniye boyunca kaydedin. Son olarak, verileri metin protokolünde belirtildiği şekilde analiz edin.Rekonstitüe edilemeyen vezikül oranının belirlenmesi için floresans verilerinin eksiksiz bir analizi yapıldığında; rekonstitüe veziküllerdeki protein ve lipid geri kazanımı ve ayrıca veziküllerin boyut dağılımı değerlendirilir. Bu çalışmada, floresans tabanlı bir analiz kullanarak scramblase aktivitesini karakterize etmek amacıyla opsin, büyük unilameller veziküllere rekonstitüe edilmektedir.Veziküller, dış ve iç yapraklara eşit şekilde dağılan NBD-PC ile yeniden oluşturulur. Ditiyonit, vezikülün dış kısmındaki NBD'nin nitro grubunu floresan olmayan amino gruplarına indirger ve bu durum protein içermeyen lipozomlarda floresansta %50 azalmaya yol açar. Ancak, opsin NBD'nin iç ve dış yapraklar arasındaki hareketini kolaylaştırdığında, floresansın tamamen kaybolduğu görülür.Bu yaklaşımın farklı protein-fosfolipid oranlarındaki temsili sonuçları burada görülebilir. Floresans azalma miktarı, veziküllere yeniden konstrükte edilen ve 0 ile 4.95 µg arasında değişen opsin miktarı ile birlikte artmaktadır. Ditionit belirtilen zamanda eklenmiş ve NBD floresansı 400 saniye boyunca izlenmiştir.Floresans azalması, daha yüksek protein-fosfolipid oranlarında daha belirgindir ve en yüksek azalma %85'tir. Ardından, Polson istatistikleri kullanılarak veziküllerde en az bir scramblase bulunma olasılığı olan uç nokta floresans azalması, scramblase aktivitesi olasılığını belirlemek için kullanılır. Kırmızı eğri, opsin için mono-eksponansiyel uyumu temsil eder. Kesikli gri çizgiler ise opsinin veziküllere monomerler, önceden oluşmuş dimerler veya önceden oluşmuş tetramerler olarak yeniden yapılandırılmasının mono-eksponansiyel uyumlarını temsil eder.Tanımladığımız yöntem farklı ihtiyaçlara kolayca uyarlanabilir. Prosedürler çok yönlüdür ve gelecekte diğer membran proteinlerinin fosfolipid skramblaz aktivitesini belirlemek ve karakterize etmek için kullanılabilir. Rekonstitüsyon prosedürü herhangi bir membran proteinine uygulanabilir.Bu teknik, opsini biyokimyasal olarak doğrulanmış ilk fosfolipid skramblaz olarak tanımlamamıza ve ardından proteinin farklı konformasyonel durumlarının aktivitesini ve farklı lipidleri taşıma kapasitesini karakterize etmemize olanak sağlamıştır.

a-fluorescence-based-assay-of-phospholipid-scramblase-activity

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Biz gramicidin kanal aktivitesinin bir ölçüsü olarak floresan su verme hızı monitörleri hızlı bir floresan bazlı analiz tanıtmak. Gramicidin kanalları, çift katlı kapsayan proteinler tarafından algılanan, çift katlı lipid özellikleri değişiklikleri izlemek için moleküler kuvvet dönüştürücüler olarak kullanılır.

Gramicidin tabanlı Floresan Testi; çift katlı lipid Özellikleri değiştirmek için Küçük Moleküller Potansiyel Belirleme

MACS ve Annexin V-konjuge manyetik boncuk ve hedef lipid ve Annexin V-bağlayıcı fosfatidilserin sentezlenen lipid veziküller hedef lipid protein etkileşim test etmek için. Ortak hedef lipid bağlı Proteinler saflaştırılmış ve boncuk elüsyon sonra analiz edilir.

Manyetik Aktif Hücre Ayırma (LIMACS) kullanarak Lipid veziküllü aracılı Afinite Kromatografisi: Protein-lipit Etkileşim Analiz Roman Yöntemi

Bu videoda, hücre zarı taklitleri (büyük unilamellar veziküller veya LUV'ler, bir floresan boya ve bir söndürücü ile kapsüllenmiş) kullanarak hücreye nüfuz eden peptitlerin hücre zarlarıyla etkileşimlerini incelemek için floresan sızıntı testi tartışılmaktadır.

Membran ile Hücreye Nüfuz Eden Peptit Etkileşimini İncelemek için Floresan Sızıntı Testi

Bu videoda, mikroakışkan platform adı verilen, desteklenen bir lipid çift tabakasının fosfatidiletanolamin lipidine etiketlenmiş pH'a duyarlı floresan boya kullanarak, pH modülasyon testini kullanarak mikroakışkan bir modelde protein-fosfoinositid etkileşimlerini gösteriyoruz. Proteinin fosfolipide bağlanmasından sonra pH'daki modülasyonlar floresan söndürmeye neden olur.

Protein-Fosfoinositid Etkileşimlerini Tespit Etmek için Desteklenen Lipid Çift Katmanları Üzerinde pH Modülasyon Testi

Bir damlacık tek tabakasını düz bir monotabaka üzerine birleştirerek sıvı-akışkan arayüzünde yüzey aktif bir türün yanal difüzyonunu ölçmek için yeni bir teknik sunuyoruz.

Bir Damlacık birleştirme sonra Floresan Kurtarma Fosfolipid Monolayer İki boyutlu Difüzyon Tedbir

PI (4,5) P2 çeşitli hücresel fonksiyonlarını düzenler, ancak hücre plazma zarı kendi nano örgütü tam olarak anlaşılamamıştır. Etiketleme PI pleckstrin homoloji alanı ile kaynaşmış bir çift renkli flüoresan sonda ile (4,5) P2, biz nanometre ölçeğinde (4,5) p plazma membranında 2 dağılımını PI incelemek için yeni bir yaklaşım tarif .

Roman Floresan Probları Plazma Membran Fosfatidilinositol 4,5-bisfosfatın tek molekül Süper çözünürlüklü görüntüleme

Burada, pH modülasyonuna dayalı etiketsiz bir yöntem kullanarak protein-fosfoinositid etkileşimlerini incelemek için bir mikroakışkan platform bağlamında desteklenen bir lipid çift katmanı sunmaktayız.

PIP-on-a-chip: Protein-fosfoinositid Etkileşimlerinin Etiketsiz Bir Çalışması

Bu protokol lipozomların imalatını ve bunların bir yüzeyüzerinde nasıl hareketsiz hale getirilebildiğini ve floresan mikroskopi kullanılarak büyük bir paralel şekilde tek tek nasıl görüntülenebileceğini açıklar. Bu, popülasyonun tek lipozomları arasındaki boyutun ve bileşimsel homojenliğin nicelikselleştirilmesine olanak sağlar.

Bireysel Lipozomlar Arasındaki Bileşimsel Homojenliği Saptamak için Kantitatif Floresan Mikroskopesi Bazlı Tek Lipozom Testi

Floresan sızıntı tahlili, peptit/membran etkileşimlerinin araştırılmasını sağlayan basit bir yöntemdir, böylece çeşitli biyolojik süreçlere dahil olmaları ve özellikle hücre nüfuz eden peptitlerin doğrudan hücresel translokasyon işlemi sırasında fosfolipid bilayerleri rahatsız etme yeteneği.

Hücre Delici Peptit ile Membran Dengesizleşmesini Araştırmak için Floresan Sızıntı Tahlil

Burada, bir proteinin fosfatidiylserine veya fosfatidiliinositol 4-fosfat in vitro'yuayıklayıp taşımadığını belirlemek için floresan lipid sensörleri ve lipozomlar kullanarak protokolleri açıklıyoruz.

Membranlar Arasında Fosfataylserine/Fosfatidiylinositol 4-Fosfat Değişiminin Floresan Bazlı Ölçümleri

Lipozomal membran geçirgenliğini değerlendirmek için geleneksel tekniklere göre üstün hassasiyet ve çözünürlükle uygun maliyetli bir yöntem sunuyoruz. Yeni bir kapsüllenmiş ligand ikame reaksiyonu kullanan bu teknik, model membranlarda fosfolipaz A2 ile indüklenen değişiklikleri tespit eder. Standart analizlerle kolayca entegre edilen bu erişilebilir yaklaşım, membran biyofiziği ve toksin etkileşimlerini incelemek için çözünürlüğü artırır.

Fosfatidilinositol Fosfat Gruplarının Venom PLA2'nin Membranotropik Etkisi Üzerindeki Etkilerini Araştırmak için Bir Lipozom Membran Geçirgenlik Testi

Öğrenin, opsin ile rekonstitüe edilmiş lipozomlarda fosfolipid scramblase aktivitesini floresan bazlı analizle ölçmeyi. Bu güvenilir yöntem, hücreler arası lipid taşıma mekanizmalarını anlamak için protein kimliğini belirlemeye yardımcı olur.

Fosfolipid Scramblase Aktivitesinin bir floresan bazlı analiz

Daha fazla video keşfet