Protein-protein etkileşimleri çalışmak için aracı olarak floresan Anizotropi

Protein etkileşimleri bir hücrenin işlevi merkezinde yer alıyor. Kalorimetre ve spektroskopik teknikleri yaygın onları karakterize etmek için kullanılır. Burada Shwachman-Diamond Sendromu (SBD'ler) mutasyona uğramış protein ve Uzama faktörü benzeri 1 GTPaz (EFL1) arasındaki etkileşimi incelemek için bir araç olarak floresan anizotropi açıklar.

Bu deneyin genel amacı, Floresan Anizotropi kullanarak ilgilenilen iki protein arasındaki etkileşimi değerlendirmek ve ölçmektir. Bu önlemler önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Protein biyokimyası ve protein biyofiziği alanı, etkileşimleri hücresel fonksiyon için önemli olan protein gibi.

Bu tekniğin temel avantajı, protein-protein etkileşimi hakkında nicel ve nitel bilgi elde edebilmemizdir. Saflaştırılmış SBDS-FlAsH proteini hazırlamak için, önce mililitre ampisilin başına 100 mikrogram ile takviye edilmiş bir litre LB sıvı ortamı hazırlayın. Ve içinde kültür, 600 nanometredeki optik yoğunluk 0,5 ila 0,7'ye ulaşana kadar bakterileri 37 santigrat derecede dönüştürdü.

Kültüre 0.5 milimolar IPTG ekleyerek SBDS-FlAsH protein ekspresyonunu indükleyin ve inkübasyona beş saat daha devam edin. Daha sonra, bakteri süspansiyonunu dört santigrat derecede on dakika boyunca 3800 kez G'de santrifüjleme ile toplayın. Süpernatanı çıkarın.

Hücreleri, bir milimolar PMSF ile desteklenmiş 35 mililitre SBDS lizis yağında yeniden süspanse edin. Dört santigrat derecede on saniye açık ve 30 saniye kapalı döngüleri kullanarak toplam dört dakikalık bir süre boyunca sonikasyon ile Lyse. Ardından, numuneyi dört santigrat derecede 50 dakika boyunca 9.000 kez G'de santrifüjleyin.

Süpernatanı koruyun ve hücresel kalıntıları gidermek için paleti atın. Nikel afinite kolonunu üç kolon hacmi SBDS lizis tamponu ile dengeledikten sonra, tüm arıtılmış süpernatanı kolona yerleştirin. Bağlanmamış proteini, üç sütun hacmi SBDS lizis tamponu ile yıkayarak çıkarın.

Kolon yıkamayı takiben, bağlı proteini üç kolon hacmi SBDS elüsyon tamponu ile elüte edin. Proteini daha da saflaştırmak için, sülfopropil katyon değiştirici kolonunu üç kolon hacmi Düşük tuzlu S kolon tamponu ile dengeleyin. Proteini 50 milimolar fosfat tamponu PH 6.5 ile altı kat seyreltin ve kolona ekleyin.

Bağlanmamış malzemeyi üç sütun hacminde Düşük tuzlu S sütun tamponu ile yıkayın. Daha sonra, kolon üzerine 50 milimolar fosfat tamponu PH 6.5, bir molar sodyum klorür ekleyerek proteini bir adımda elüte edin. Elüatı 50 milimolar fosfat tamponu PH 6.5 ile üç kat seyreltin.

Daha sonra, proteini on beş dakika boyunca 3800 kez G'de santrifüjleme ile ultra filtrasyon cihazlarıyla konsantre edin. Bu tür bir deneyde kullanılan proteinlerin kalitesi çok güçlüdür. Kullanılan protein numuneleri yüksek saflıkta değilse, verilerin yorumlanması karmaşık hale gelir.

SDS-PAGE analizi ve Coomassie boyama ile SBDS-FlAsH proteininin saflığını doğrulayın. Proteini sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun ve daha fazla kullanılana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Saflaştırılmış EFL1 proteinini hazırlamak için, ilk kültür, 600 nanometredeki optik yoğunluk 1.8'e ulaşana kadar yüzde 0.5 glikoz ile desteklenmiş, urasil içermeyen bir litre sentetik bırakma ortamında 30 santigrat derecede mayayı dönüştürdü.

Kültüre yüzde 2.8 galaktoz ekleyerek protein ekspresyonunu indükleyin ve inkübasyona 30 santigrat derecede 18 saat devam edin. Maya süspansiyonunu, dört santigrat derecede on dakika boyunca 3800 kez G'de santrifüjleme ile toplayın. Santrifüjlemeyi takiben süpernatanı çıkarın.

Hücreleri, bir milimolar PMSF ve bir milimolar benzamidin ile desteklenmiş 50 mililitre EFL1 lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Dört santigrat derecede iki dakikalık açık ve on beş dakikalık döngüler kullanarak toplam altı dakikalık bir süre boyunca cam boncuklar kullanarak bir boncuk çırpıcı üzerinde sürtünme ile hücreleri bozun. Ardından, numuneyi dört santigrat derecede 50 dakika boyunca 9.000 kez G'de santrifüjleyin.

Süpernatanı koruyun ve hücresel kalıntıları gidermek için damağı atın. Ardından, nikel afinite kolonunu üç kolon hacmi EFL1 lizis tamponu ile dengeleyin. Tüm arıtılmış süpernatanı dengelenmiş kolona yerleştirin.

Sütunu üç kolon hacmi EFL1 lizis tamponu ile yıkayarak bağlanmamış proteini çıkardıktan sonra, bağlı proteini üç kolon hacmi EFL1 elüsyon tamponu ile elüte edin. EFL1 proteinini daha da saflaştırmak için, boyut dışlama kolonunu 1.5 kolon hacmi Anizotropi tamponu ile dengeleyin. Nikel afinite kolonundan kaçan EFL1 proteinini, 3800 kez G'de santrifüjleme ile ultra filtrasyon cihazlarıyla bir mililitreye konsantre edin, ardından konsantre numuneyi boyut dışlama kolonuna yerleştirin.

Sızan proteini toplayın ve ultra filtrasyon ile yaklaşık 30 mikromolar nihai konsantrasyona konsantre edin. EFL1 proteininin saflığını SDS-PAGE analizi ve Coomassie boyama ile doğrulayın. Proteini sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun ve daha fazla kullanılana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.

SBDS-FlAsH proteininin üç nanomolünü, beş mikrometre hacminde bir anizotropi tamponunda üç nanomol lumio yeşili boya ile karıştırın. Reaksiyonun dört santigrat derecede sekiz saat devam etmesine izin verin. Sekiz saat sonra, serbest boyayı çıkarmak için numuneyi gece boyunca anizotropi tamponuna karşı diyalize edin.

Emicileri bir Kuvars Küvet kullanarak bir spektrofotometrede 280 nanometre ve 508 nanometrede ölçün. Ardından, metin protokolünde açıklandığı gibi etiketli proteinin yüzdesini ölçmek için Lambert-Beer Yasasını kullanın. Anizotrofi değerini ölçmeden önce, protein lejyonundan gelen her filtrasyon adımı, tüm numunenin çözeltiye dağıtıldığından ve homojen hale geldiğinden emin olarak dikkatli bir şekilde yapılmalıdır.

Bir Floresan Küvetinde, 200 mikrolitre 30 nanomolar SBDS-FlAsH'yi anizotrofi tamponuna yerleştirin ve iki mikrolitre 30 mikromolar EFL1'i titre edin. İyice karıştırın ve anizotrofi ve floresan değerini ölçmeden önce reaksiyonun üç dakika beklemesine izin verin. Toplam 40 mikrolitre EFL1 hacmi eklenene kadar bu işlemi tekrarlayın.

Son adım olarak, verileri metin protokolünde açıklandığı gibi varsayılan bir bağlama modeline sığdırın. Herhangi bir anizotrofi deneyi yapmak için, floresan yoğunluğundaki büyük değişiklikleri dışlamak önemlidir. Burada gösterildiği gibi, SBDS-FlAsH'nin floresansı, EFL1'e bağlandıktan sonra gözle görülür şekilde değişmez.

EFL1'in SBDS-FlAsH içeren bir Kuvars Küvete titrasyonu, ilk gözlenen anizotrofinin artmasına neden olur. EFL1'in birkaç ilavesi, varsayılan bir bağlama modeline doğrusal olmayan en küçük kareler regresyonu kullanılarak sığdırılabilecek karşılık gelen bağlama eğrisini açıklar. Bu durumda, tek bir bağlama bölgesi modeli deneysel verileri uygun şekilde tanımlamaz.

Bunun yerine, iki özdeş olmayan bağlanma bölgesi modeli, deneysel verileri uygun şekilde tanımlar. Bir kez ustalaştıktan sonra, floresan anizotrofisi bağlama deneyi, uygun şekilde yapılırsa üç saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, büyük miktarlarda saflaştırılmış proteine sahip olmak önemlidir.

Bu prosedüre paralel olarak, uygun bağlanma modelini desteklemek için fragman bazlı tamamlama testi veya çalışılan proteinin farklı alanları ile floresan anizotrofisi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, bir bağlama deneyinin ardından floresan anizotrofisinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.