Name: Protein-protein etkileşimleri çalışmak için aracı olarak floresan Anizotropi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Öğrenin, SBDS ve EFL1 protein etkileşimlerini floresan anizotropi ile nicel ve nitel olarak analiz etme yöntemini. Bu teknik, hücresel fonksiyonları anlamak için protein biyokimyası alanında güçlü bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, CONACyT proje numaraları 167359 ve 177138 ile DGAPA-UNAM proje numarası IN201615'den gelen mali desteği kabul ederler.

1. SBDS-Flash etiket Protein Ekspresyonu ve Saflaştırılması Not: anizotropi deneyler için, bir flaş-eklentisi Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, PCR ile kodlama sekansı, insan SBD&#39;ler C-terminaline ilave edilmiştir sekansına karşılık gelir. Bu konstrukt, sentezleme vektörü pRSET-A alt klonlandı ve N-terminali hekzahistidin etiketi (His-tag) kodlayan bir proteini ifade etmek üzere E. coli C41 hücrelerine transforme edildi, sekansı ve bir C-terminus Flash etiket 10 kodlama insan SBDS. <ol><li> SBDS-Flaş protein ifadesi <ol><li> Yetkili E. Transform Standart bir ısı şok protokolü 19 kullanılarak plazmid pRSET-HisSBDS-Flash ile coli C41 hücreleri. 100 ug / ml ampisilin ile desteklenmiş bir katı Luria-Bertani (LB) ortamı içinde, hücreler plaka. LB katı ortam bileşimin 10 g NaCI, 5 g maya ekstresi, 10 g tripton, 1 L hacminde 20 g agar oluşur. </li><li> 37 ° C &#39;de kültür dönüştürülmüş bakteriler kadar600 nm&#39;de (600) absorbans 100 ug / ml ampisilin ile desteklenmiş LB sıvı ortam 1 L 0.5-0.7 ulaşır. </li><li> kültüre 0.5 mM izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid eklenerek proteinin ifadesini uyarmak ve tekrar 5 saat boyunca inkübasyona devam edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 3800 x g&#39;de santrifüj ile bakteriyel bir süspansiyon toplayın. süpernatantı. Bu noktada, -20 ° C&#39;de hücre pelletini depolamak ya da protein saflaştırma için hemen kullanın. </li></ol></li><li> SBDS-Flaş protein saflaştırma Not: tüm kromatografi adımları hızlı protein sıvı kromatografi (FPLC) sistemi veya bir peristaltik pompa kullanılarak gerçekleştirilir. Ni2 + -affinity kromatografisi 5 ml hızlı akış kolonu kullanır. Anyonik değiştirme kromatografisi, 5 mi, güçlü sülfopropil katyon değiştirici kolon kullanılmıştır. 3 ml / dakika akış hızı, tüm kromatografi adımları için kullanıldı. <ol><li> SBDS Lizis B 35 ml hücrelerin tekrarUffer 4 dk 10 saniye ve 30 saniye arasında çevrimleri kullanılarak bir toplam süre için sonikasyon ile 1 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF) ve parçalanmasıyla ile takviye (50 mM fosfat tamponu pH 7.5, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol), 4, ° C. </li><li> 4 ° C&#39;de 50 dakika boyunca 9000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> süpernatant tutun ve hücresel enkaz kaldırmak için pelet atın. </li><li> SBDS Lizis tamponunun 3 sütun hacmi (CV) ile Ni 2+ afinite sütunu dengelenmesi ve kolona süpernatan açıklık bütün getirmektedir. </li><li> SBDS lizis tamponu 3 CV ile yıkanarak bağlanmamış protein çıkarın ve SBDS elüsyon tamponu 3 CV (50 mM fosfat tamponu pH 7.5, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol) ile elüte. </li><li> 50 mM fosfat tampon maddesi pH 6.5 ile elüt edilmiştir Protein 6 kat seyreltilir ve 0.22 um selüloz zar içerisinden filtre edilerek mümkün olan agrega kaldırmak. </li><li> Düşük bir tuzu S sütunun 3 CV sülfopropil katyon değiştirme sütunu dengeyetampon maddesi (50 mM fosfat tampon maddesi, pH 6.5, 50 mM NaCI) ve önceki adımda elde edilen protein örnek getirmektedir. </li><li> Yıkama ilişkisiz düşük tuz S kolon tamponu 3 CV malzeme ve 50 mM fosfat tamponu pH 6.5, 1 M NaCI ile tek bir adımda proteinini ayrıştırmak. </li><li> 50 mM fosfat tampon maddesi pH 6.5 ile elüt edilmiştir, protein 3.3 kat seyreltilir. 15 dakika boyunca 3800 x g&#39;de santrifüj ile ultrafiltrasyon cihazları ile protein konsantre edilir. Sıvı nitrojen içinde protein dondurma ve sonraki kullanıma kadar -80 ° C&#39;de saklayın. </li><li> SDS-PAGE analizi ve Coomassie boyama ile 20 proteinin saflığını teyit. </li></ol></li></ol> 2. EFL1 Protein Expression and Purification NOT: EFL1 Gal 1/10 farklı promotör 21 ve vektör pRS426 içinde Saccharomyces cerevisiae MAT A 3&#39;UTR&#39;sinden düzenlemesi altında ifade edildi. Rekombinant protein, bir Tütün Etch Virüsü proteaz birleştirilmiş insan EFL1 izoformunu 1 (kodlarTEV) tanıma alanı, ve C-terminalinde bir hekzahistidin etiketi. <ol><li> EFL1 protein ekspresyonu <ol><li> S. Transform Standart bir lityum asetat ile protokolü 22 kullanılarak plazmid pRS426-EFL1TevHis ile cerevisiae BCY123 hücreleri. % 2 (a / h) glukoz ile desteklenmiş urasil (SD-Ura) olmadan ortam üzerinden sentetik damla tüm dönüştürülmüş hücreler plaka. SD-ura oluşan kompozisyon, amino asitler olmadan 8 g maya nitrojen bazı, 11 g kasamino asitleri, 55 g adenin sülfat, 55 g tirosin, 60 mg lösin ve 1 L hacminde 60 mg triptofan içerir. </li><li> 600% 0.5 (a / h) glukoz ile desteklenmiş SD-ura 1.8 1 L ulaşıncaya kadar Kültür, 30 ° C &#39;de maya dönüştürdü. </li><li> kültüre galaktoz (ağ / hac)% 2.8 eklenerek proteinin ifadesini uyarmak ve 30 ° C de 18 saat inkübasyona devam edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 3800 x g&#39;de santrifüjleme ile, maya süspansiyonu toplanır. süpernatantı.Bu noktada, -20 ° C&#39;de hücre pelletini depolamak ya da protein saflaştırma için hemen kullanın. </li></ol></li><li> EFL1 protein saflaştırma Not: tüm kromatografi adımları bir FPLC sistemi veya peristaltik bir pompa kullanılarak gerçekleştirilir. Ni2 + -affinity kromatografisi / dakika 3 ml bir akış oranında bir 5 ml hızlı akış kolonu kullanır. Ebat eksklüzyon kromatografisi 125 ml kolon, 1 ml / dk&#39;lık bir akış oranında Superdex 200 reçinesi ile önceden paketlenmiş kullanır. <ol><li> , 1 mM PMSF ve 1 mM benzamidin ile takviye EFL1 lisiz tamponu (50 mM Tris-HCI, pH 8, 300 mM NaCI, 20 mM imidazol, 5 mM MgCl2,% 10 gliserol), 50 ml hücrelerin tekrar tarafından hücrelerin bozulması 4 ° C&#39;de, 2 dak ve KAPALI 15 dakika için 6 dakika ile döngü, toplam zaman cam boncuk (çap = 0.5 mm) kullanılarak bir kordon çırpıcı sürtünme. </li><li> 4 ° C&#39;de 50 dakika boyunca 9000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> süpernatant tutun ve hücresel enkaz kaldırmak için pelet atın. </li&gt; <li> EFL1 lizis tamponu 3 CV Ni2 + afinite sütunu dengeye ve sütun üzerine tüm berrak yüzer getirmektedir. </li><li> EFL1 lizis tamponu 3 CV ile yıkanarak bağlanmamış protein çıkarın ve EFL1 elüsyon tamponu 3 CV (50 mM Tris-HCI pH 8, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, 5 mM MgCl2,% 10 gliserol) ile elüte. </li><li> Anizotropi tamponu 1.5 CV (50 mM Tris-HCI pH 7.5, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2,% 10 gliserol, 5 mM β-merkaptoetanol) ile ebat eksklüzyon kolonu dengelenmesi. </li><li> 1 ml istenen hacme 3,800 x g&#39;de santrifüj ile ultrafiltrasyon cihazları ile Ni2 + afinite sütunundan elüt EFL1 proteini için konsantre edilir. Boyut dışlama kolonundan ilgili örnek tanıtılması. </li><li> Tasfiye edilen proteini toplamak ve yaklaşık 30 uM&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar ultrafiltrasyon yoluyla konsantre edilir. Flaş sonraki kullanıma kadar -80 ° C&#39;de, sıvı azot ve mağaza protein dondurma. th doğrulayınSDS-PAGE analizi ve Coomassie boyama ile 20 protein e saflık. </li></ol></li></ol> Flaş Floresan Boya 4 &#39;, 5&#39;-Bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) Floresein ile SBDS-FLASH 3. Etiketleme <ol><li> , 4 &#39;3 nmol olan 5&#39;-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) Anizotropi tamponu, 5 ul hacminde Floresein boyası SBDS-Flash proteininin 3 nmol karıştırın. </li><li> Reaksiyon, 4 ° C &#39;de 8 saat boyunca sürmesine izin verin. ücretsiz boya kaldırmak için gece boyunca anizotropi tampona karşı örnek dialyze. </li><li> etiketli proteinin% ölçmek için Lambert-Beer yasası kullanın. 280 nm ve uygun hacimde bir kuartz küvet kullanarak bir spektrofotometre ile 508 nm&#39;de absorbansı ölçülür. NOT: Aşağıdaki molar soğurma katsayıları (M -1 cm -1) düşünün: <img alt="Equation1B" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq1B.jpg" /></li><li> Denklem 2 kullanılarak etiketli SBDS-FLASH protein konsantrasyonu hesaplayın. <img alt="Equation2" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq2.jpg" /></li><li> Önceki adımdaki hesaplanan C SBDS-Flaş ikame ederek Denklem 3 kullanılarak toplam SBDS protein konsantrasyonu hesaplayın. <img alt="Equation3" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq3.jpg" /></li><li> Denklem 4 kullanılarak etiketli protein yüzdesini hesaplayın. <img alt="Equation4" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq4.jpg" /></li></ol> 4. Floresan Anizotropi Deneyleri Not: Anizotropi deneyleri, bir polarizasyon araç kutusu ve veri toplama aracı arasında yazılım Resim anizotropi programı kullanılarak yapıldı ile donatılmış bir spektrofotometreyi yapıldı. Eksitasyon dalga boyu 8 nm spektral bant genişliği ile 494 nm&#39;de ve emisyon 530 ± 25 nm bant-geçiş filtresi kullanılarak kaydedildi. Ölçümler, 5 mm yol uzunluğu 10 ile 200 ul küvet içinde, 25 ° C de yapıldı. <ol><li><html> Bir floresan küvet içinde, anizotropi tamponunda 30 nM SBDS-FLASH 200 ul koyun ve 30 uM EFL1 2 ul titre. İyice karıştırın ve reaksiyon anizotropi değerinin ölçülmesi önce 3 dakika bekletin. </li><li> EFL1 40 ul toplam hacme kadar adımı tekrar 4.1 eklenmiştir. </li></ol> 5. Veri Analizi <ol><li> Bir doğrusal olmayan en küçük kareler regresyon algoritması kullanılarak uygun bağlanma modeline veri monte edin. En yaygın bağlayıcı modelleri için denklemleri Tablo 1&#39;de sunulmuştur. </li><li> Uygun 23 artıklar inceleyerek proteinler arasındaki etkileşimi açıklar iyi modeli değerlendirin. Ek deneyler ile seçilen modelini desteklemektedir. </li></ol> Tablo 1. Ortak protein-protein etkileşim bağlayıcı modelleri ve onları tanımlayan matematiksel denklemler.0 / 54640table1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="tablo 1" src="/files/ftp_upload/54640/54640table1.jpg" />

<ol><li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).</li>
<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340, 245-246 (1989).</li>
<li>Michnick, S. W., Hien Ear, P., Landry, C., Malleshaiah, M. K., Messier, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolkit+of+protein-fragment+complementation+assays+for+studying+and+dissecting+large-scale+and+dynamic+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">A toolkit of protein-fragment complementation assays for studying and dissecting large-scale and dynamic protein-protein interactions in living cells.</a> Methods in Enzymology. 470, 336-366 (2010).</li>
<li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+%28TAP%29+method%3A+a+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li>
<li>Dwane, S., Kiely, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+used+to+study+how+protein+complexes+are+assembled+in+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng+Bugs%22%5BJournal%5D)">Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades.</a> Bioeng Bugs. 2 (5), 247-259 (2011).</li>
<li>Snider, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+protein+interaction+network+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of protein interaction network mapping.</a> Mol Syst Biol. 11 (12), 848(2015).</li>
<li>Fersht, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFersht%2C+A+%22Structure+and+mechanism+in+protein+science%3A+a+guide+to+enzyme+catalysis+and+protein+folding%22">Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein folding</a>. Baldwin, R. L. , W. H. Freeman and Company. 191-214 (2002).</li>
<li>Menne, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Shwachman-Bodian-Diamond+syndrome+protein+mediates+translational+activation+of+ribosomes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The Shwachman-Bodian-Diamond syndrome protein mediates translational activation of ribosomes in yeast.</a> Nat Genet. 39 (4), 486-495 (2007).</li>
<li>Boocock, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+SBDS+are+associated+with+Shwachman-Diamond+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in SBDS are associated with Shwachman-Diamond syndrome.</a> Nat Genet. 33 (1), 97-101 (2003).</li>
<li>Garcia-Marquez, A., Gijsbers, A., de la Mora, E., Sanchez-Puig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+Guanine+Nucleotide+Exchange+in+the+Elongation+Factor-like+1+%28EFL1%29+GTPase+by+Mutations+in+the+Shwachman-Diamond+Syndrome+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Defective Guanine Nucleotide Exchange in the Elongation Factor-like 1 (EFL1) GTPase by Mutations in the Shwachman-Diamond Syndrome Protein.</a> J Biol Chem. 290 (29), 17669-17678 (2015).</li>
<li>Gijsbers, A., Garcia-Marquez, A., Luviano, A., Sanchez-Puig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guanine+nucleotide+exchange+in+the+ribosomal+GTPase+EFL1+is+modulated+by+the+protein+mutated+in+the+Shwachman-Diamond+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Guanine nucleotide exchange in the ribosomal GTPase EFL1 is modulated by the protein mutated in the Shwachman-Diamond syndrome.</a> Biochem Biophys Res Commun. 437 (3), 349-354 (2013).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+fluorescence+spectroscopy%22">Principles of fluorescence spectroscopy</a>. , Third, Springer US. (2010).</li>
<li>Nishigaki, T., Treviño, C. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNishigaki%2C+T+%22Tools+to+understand+protein-protein+interactions%22">Tools to understand protein-protein interactions</a>. Gòmez, I. 37, Transworld Research Network. 1-14 (2012).</li>
<li>Johnson, I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohnson%2C+I+%22The+Molecular+Probes+Handbook%3A+A+Guide+to+Fluorescent+Probes+and+Labeling+Technologies%22">The Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies</a>. , 11th, Life Technologies Corporation. (2010).</li>
<li>Sabnis, R. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSabnis%2C+RW+%22Handbook+of+Fluorescent+Dyes+and+Probes%22">Handbook of Fluorescent Dyes and Probes</a>. , Wiley. (2015).</li>
<li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo%3A+synthesis+and+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications.</a> J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).</li>
<li>Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+covalent+labeling+of+recombinant+protein+molecules+inside+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells.</a> Science. 281 (5374), 269-272 (1998).</li>
<li>Rashidian, M., Dozier, J. K., Distefano, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+labeling+of+proteins%3A+techniques+and+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Enzymatic labeling of proteins: techniques and approaches.</a> Bioconjug Chem. 24 (8), 1277-1294 (2013).</li>
<li>Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManiatis%2C+T+%22Molecular+cloning%3A+A+laboratory+manual%22">Molecular cloning: A laboratory manual</a>. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).</li>
<li>West, R. W. Jr, Chen, S. M., Putz, H., Butler, G., Banerjee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL1-GAL10+divergent+promoter+region+of+Saccharomyces+cerevisiae+contains+negative+control+elements+in+addition+to+functionally+separate+and+possibly+overlapping+upstream+activating+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">GAL1-GAL10 divergent promoter region of Saccharomyces cerevisiae contains negative control elements in addition to functionally separate and possibly overlapping upstream activating sequences.</a> Genes Dev. 1 (10), 1118-1131 (1987).</li>
<li>Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+intact+yeast+cells+treated+with+alkali+cations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations.</a> J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).</li>
<li>Eftink, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+methods+for+studying+equilibrium+macromolecule-ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence methods for studying equilibrium macromolecule-ligand interactions.</a> Methods Enzymol. 278, 221-257 (1997).</li>
<li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+Substrates+to+the+Central+Pore+of+the+Vps4+ATPase+Is+Autoinhibited+by+the+Microtubule+Interacting+and+Trafficking+%28MIT%29+Domain+and+Activated+by+MIT+Interacting+Motifs+%28MIMs%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Binding of Substrates to the Central Pore of the Vps4 ATPase Is Autoinhibited by the Microtubule Interacting and Trafficking (MIT) Domain and Activated by MIT Interacting Motifs (MIMs).</a> J Biol Chem. 290 (21), 13490-13499 (2015).</li>
<li>Sanchez-Puig, N., Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+natively+unfolded+HIF-1alpha+ODD+domain+to+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Binding of natively unfolded HIF-1alpha ODD domain to p53.</a> Mol Cell. 17 (1), 11-21 (2005).</li>
<li>Trusch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+Region+of+the+Ubiquitin+Regulatory+X+%28UBX%29+Domain-containing+Protein+1+%28UBXD1%29+Modulates+Interdomain+Communication+within+the+Valosin-containing+Protein+p97%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The N-terminal Region of the Ubiquitin Regulatory X (UBX) Domain-containing Protein 1 (UBXD1) Modulates Interdomain Communication within the Valosin-containing Protein p97.</a> J Biol Chem. 290 (49), 29414-29427 (2015).</li>
<li>Kamp, F., Beyer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+alpha-synuclein+affects+the+lipid+packing+in+bilayers+of+small+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemsitry%22%5BJournal%5D)">Binding of alpha-synuclein affects the lipid packing in bilayers of small vesicles.</a> The Journal of Biological Chemsitry. 281, 9251-9259 (2006).</li>
<li>Bujalowski, W. M., Jezewska, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Intensity%2C+Anisotropy%2C+and+Transient+Dynamic+Quenching+Stopped-Flow+Kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Spectroscopic+Methods+of+Analysis%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Intensity, Anisotropy, and Transient Dynamic Quenching Stopped-Flow Kinetics.</a> Spectroscopic Methods of Analysis. 875, 105-133 (2012).</li>
<li>Asano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+interaction+between+EFL1+and+SBDS+is+mediated+by+an+intrinsically+disordered+insertion+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Direct interaction between EFL1 and SBDS is mediated by an intrinsically disordered insertion domain.</a> Biochem Biophys Res Commun. 443 (4), 1251-1256 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur ve rekabet eden hiçbir mali çıkarları yoktur.

proteinleri ile en biyokimyasal deneyler kullanılan tekniğe bakılmaksızın, saf protein değil, aynı zamanda onların büyük miktarlarda sadece gerektirir. Burada sunulan olduğu gibi, bu nedenle, bu deney türü için kullanılan proteinler, heterolog ekspresyonu ile elde edilir. Floresans spektroskopisi çalışılan molekül içinde bir florofor varlığını gerektirmektedir. en çok protein için ortak olan ve her ikisi de mevcut olacağından aromatik artıklar, protein-protein etkileşimleri incelemek için analiz, sinyal zorlaştırmaktadı...

Hücreler sürekli birbirleri ile etkileşim biomacromolecules çok sayıda içerir. Bu ilişki, sinyal iletimi, gen ifadesi ve diğerleri arasında, hücre göçünün düzenlenmesinde işleyişi sorumlu hücre yoluna katılabilir kompleksleri yol açar. bir hücrede meydana gelen tüm protein-protein etkileşimleri interaktom bilinen bir ağ ihtiva eder. Saccharomyces cerevisiae&#39;de de proteinlerin% 70&#39;den fazla etkileşim ortakları 1 sahip olduğu gösterilmiştir. Bir hücrenin interaktom anlamak ve fonksiyonları karmaşıklığı ve canlıların çeşitliliği ilgili bilgileri sağlar. Çeşitli metodolojiler, protein-protein etkileşimlerini belirlemek ve tanımlamak için tarif edilmiştir. Bu tür maya iki-hibrid 2, protein fragmanı tamamlama deneyleri 3, kütle spektrometrisi ve protein microarra bağlanmış afinite saflaştırma 4 olarak koyun yöntemlerle yüksek Farklıys bir etkileşim 5,6 tanımlamak için kullanılır. tespit kez, bunu doğrulamak için gerekli olan ve bu bir vaka ile ayrı ayrı değişebilir. Tipik haliyle, bu deneyler, gen silinmesi veya proteinlerin bir aşırı ifadesi ile etkileşim çifti, örneğin, tek tek üyelerin seviyesinde, etkileşim kendisini kesintiye içerir, ve daha sonra diğer üyesinin özelliklerindeki değişiklik ya da işlev için ideal hücresel düzeyde. Daha sonra, biyo-fiziksel teknikler 7 moleküler düzeyde protein-protein etkileşimlerini tanımlamak için kullanılır. kalorimetri ve floresan spektroskopi nicelik ve mekanik olarak bunları tarif etmek için kullanılır ise, bu amaca yönelik olarak, protein kompleksleri yapısı X-ışını kristalografisi, nükleer manyetik rezonans ve kriyo-elektron mikroskobu ile tespit edilir. Bu çalışmada, floresan anizotropi GTPaz EFL1 ve SBD arasındaki etkileşimi karakterize etmek için bir teknik olarak kullanılanS proteini. Bu proteinler, 60S ribozomal alt birim 8 yüzeyinden ökaryotik başlatma faktörünün 6 salınmasını teşvik ederek ribozomların sentezine katılmadığını. SBDS proteini EFL1 guanosin difosfata 10,11 için afiniteye azaltılması için bir guanin nükleotid değişim faktörü olarak Shwachman-Diamond sendromu, 9 ve hareket olarak bilinen bir hastalık mutasyona uğrar. SBD&#39;ler Hastalık mutasyonlar EFL1 ile etkileşimi ortadan kaldırmak ve böylece aktivasyonunu engeller. Floresans anisotropi yaygın protein peptid veya protein, nükleik asit etkileşimleri incelemek için biyolojik uygulamalarda kullanılır. Bir fluorofor kısmen polarize emisyon polarize ışık sonuçları ile heyecanlı olduğu ilkesine dayanmaktadır. Floresans anisotropi Denklem 1 ile tanımlanır: <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq1.jpg" /> Ben VV ve VH nerededikey 12 ışık polarize ile örnek heyecanlı olduğunda dikey olarak (VV) ve yatay (VH) floresan yoğunlukları emisyonu polarize. Floresans anisotropi fluorofor dönme difüzyon hızını etkileyen faktörlere karşı duyarlıdır ve bu nedenle sıcaklık, çözelti viskozitesi ve fluorofor görünür molekül büyüklüğüne bağlıdır. başka protein ve böyle bir değişiklik ile etkileşime girdiğinde bir florofor artar içeren bir proteinin bariz boyutu daha sonra anizotropide bir değişiklik olarak değerlendirilebilir. Daha spesifik olarak, kendi floresan ömrü çözüm göreceli yavaş dönen bir fluorofor nispeten büyük bir anizotropi sergileyecek bu nedenle büyük bir ben VV değeri ve küçük ben VH değerine sahip olacak ve. Onların floresan ömrü hızla göreceli takla fluorophores için, VV ve VH benzer olacaktır ve bunların anizotropi değeri küçük olacaktır 12 </sup&gt; (Şekil 1). Buna ek olarak, gürültü ölçümü için iyi bir anizotropi sinyali için, ilgili molekülün dönme korelasyon zaman benzer bir floresan ömrü olan bir flüorofor olması gereklidir. Aksi takdirde, doğru bir kompleks serbest protein arasında ve anizotropi farkı kayıt yapmak mümkün değildir. Örneğin, 100 da düşük molekül ağırlıklı bir bileşiğin bağlanmış örneğin flöresin ve rodamin edildiği gibi 4 nsaniye yakın bir ömür süresi olan bir flüoresan probun anizotropi 0.05. kDa 0.29 olan anizotropi değerini artırır 160 bir moleküle bağlanması; doğru ölçülebilir bir fark. Bunun aksine, olan bir artış, moleküler boyut olarak değişmektedir 65 1.000 kDa bir bağlama reaksiyonda yer kişi aynı flüoresan prob sadece doğru bir şekilde ölçülmesi için çok küçük olan 0,3 0.28 bir anisotropi değişikliği ile sonuçlanacaktır. Bu senaryoda, 400 nsaniye bir ömür boyu bir prob 12 daha uygun olacaktır. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54640/54640fig1.jpg" /> Floresan anizotropi ve prosedürü ölçmek için kullanılan ekipmanın 1. şematik gösterimi Şekil. Bir protein-protein etkileşim deneyi ölçüm floresan anizotropi gerçekleştirmek için kullanılan ekipman şematik gösterimi. Bir etkileşim ortağı bağlanması üzerine artar hızlı ekran küçük anizotropi takla flüoroforlan. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54640/54640fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Floresan uygulamaları ele moleküllerin herhangi bir fluorofor varlığını gerektirir. florofor üç türü vardır, protein-protein etkileşimleri incelemek için: 1) proteinleri içinde mevcut triptofan kalıntısı, 2), yeşil flüoresan protein (GFP) ve deriva gibi kimyasal bağlanmış fluorophores ve 3) flüoresan füzyon partnerleritives. Çoğu protein, yapısı bir etkileşimi ölçmek için en kolay yol, ilgili floresans spektrumları değişiklikleri izleyerek veya triptofan artıklarının floresan yoğunluğu değişiklikleri izleyerek, triptofanı kalıntılarına sahip olacak şekilde. Bununla birlikte, triptofan artıklarının analizi karmaşıklaştıran iki protein içinde mevcut olabilir. Bir fluorofor nedeniyle bir etkileşim onun floresan özelliklerini değiştirmek için Öte yandan, bu ya da bağlanma yeri yakınında bulunan gerekiyor ve bu etkileşim kendisi müdahale olabilir. GFP gibi hacimli fluorophores kullanıldığında bu özel dikkat gerektirir. Bu florofor hiçbiri bağlanma çalışmaları için kullanılabilir, bu süreden sonra katılan proteinlerin birine dışsal fluorophores tanıtmak gereklidir. Birçok kimyasal olarak sentezlenmiş fluorophores biri kovalent gibi amin grupları (bir lisin ya da N-terminal yan zincir) ve sistein tiyol grupları olarak reaktif gruplar yoluyla proteinlere bağlanabilir. Fiodoasetamid ve maleimid tiol-reaktif gruplar, 13 ise izotiyosiyanat ve süksinimidil esterlerin ile luorophore türevleri amid grubu ile reaksiyona girer. Floresan uygulamalarda en yaygın olarak kullanılan boya fluoresein türevleri ve rodamin, yeşil boya, kumarinler, BODIPY fluorophores ve Alexa Fluor boyalardır. Piyasada mevcut fluorophores ve bunların kullanımı ayrıntılı bir listesi referanslar 14,15 bulunabilir. Başarılı bir etiketleme için, reaktif grup proteinin yüzeyi ile açık olmalıdır, fakat polipeptidler tipik olarak reaktif işlevsel grupların çok sayıda, mevkiye-özgü modifikasyonu almak çok zordur. Bu çalışmada, ilgili protein, SBDS, birden fazla site etiketleme ile sonuçlanabilir 5 serbest sistein ve 33 lisin bulunmaktadır. Sigara üniforma etiketleme bağlama etkileyebilir ve farklı fluorofor molekülleri bağlanması üzerine farklı floresan yoğunluğu sinyallerini ortaya çıkarabilir olarak veri analizi zorlaştıracaktır. ove içinBu sorunu rcome biz FLASH florofor, 4 &#39;site doğrudan etiket, 5&#39;-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) floresein SBDS proteini kullanılır. Bu motifi X sistein 16,17 dışında herhangi bir amino asit olduğu sekansı CCXXCC oluşan flaş etiketi olarak bilmek dört aralıklı sistein için büyük bir benzerliği olan bir arsenoxide boyadır. Bu Tetracysteine ​​motifi birlikte proteinin genel kat bozulmasını önlemek için, uygun bir bağlayıcı ile genetik mühendisliği ile N- veya proteinin C-terminaline ilave edilmiştir. FLASH boya ve FLASH etiketinin oluşan bir çift ilk hücreler 17 oturma yeri belirli etiket protein için tasarlanmıştır, ancak, aynı zamanda, burada örnek olarak olduğu gibi, in vitro olarak, saflaştırılmış proteinleri etiketlemek için kullanılabilir. Buna ek olarak, enzimatik stratejiler aynı zamanda, proteinlerin 18 site-spesifik işlevselleştirilmesini sağlamak için geliştirilmiştir. Bu yazıda floresan anizotropi a yararlılığını açıklarsa aracı protein-protein etkileşimleri incelemek için. niceliksel bilgi deneysel verilerin uyum elde edilebilir ise ciltleme eğri şeklinin basit bir muayene ile değerlendirilebilmektedir.

<table><tbody><tr><td>0,5 mm Cam boncuklar</td><td>Biospec Ürünler</td><td>11079105</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Formedium</td><td>TRIS01</td><td>Ultra saf</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>boya 4',5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) floresein</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>LC6090</td><td>Bu kit, bir FlAsH etiketini etiketlemek için boyayı içerir</td></tr><tr><td>Ampiciline</td><td>IBI Shelton Scientific, Inc</td><td>IB02040</td><td></td></tr><tr><td>D (+) - Susuz Glikoz</td><td>Orta</td><td>GLU03</td><td></td></tr><tr><td>D (+) - Galaktoz</td><td>Orta</td><td>GAL03</td><td></td></tr><tr><td>L-Lösin</td><td>Orta</td><td>DOC0157</td><td></td></tr><tr><td>L-Triptofan ve nbsp;</td><td>Orta</td><td>DOC0189</td><td></td></tr><tr><td>Bezamidin hidroklorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6506-5G</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Altın Biyoteknoloji, Inc</td><td>P-470-25</td><td>Fenilmetilsülfonil florür</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Formedium</td><td>NAC02</td><td>Sodyum Klorür ve nbsp;</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Tecsiquim, S.A. de C.V.</td><td>GT1980-6</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>1725711000</td><td>Magnezyum Klorür</td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399-500G</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786-500G</td><td>Potasyum fosfat dibazik</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139-500G</td><td>Sodyum fosfat monobazik</td></tr><tr><td>Maya azot bazı amino asitsiz</td><td>Orta</td><td>CYN0410</td><td></td></tr><tr><td>Maya özü</td><td>Formedium</td><td>YEM03</td><td>Mikro Granül</td></tr><tr><td>L-Tirozen</td><td>Formedium</td><td>DOC0193</td><td></td></tr><tr><td>Adenin sülfat</td><td>Orta</td><td>DOC0230</td><td></td></tr><tr><td>kasamino asitler</td><td>içinmedium</td><td>CAS03</td><td></td></tr><tr><td>Tripton</td><td>IBI Shelton Scientific, Inc</td><td>IB49182</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Formedium</td><td>IPTG025</td><td></td></tr><tr><td>Filtrasyon üniteleri</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>UFC901096</td><td>Amicon Ultra-15, membran PLGC Ultracel-PL, 10&nbsp; kDa</td></tr><tr><td>Membran Filtre</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>GSWP04700</td><td>Membran Filtre, karışık selüloz esterleri, Hidrofilik, 0.22&nbsp; &mikro; m, 47&nbsp; mm, beyaz, düz</td></tr><tr><td>Ni2+ afinite sütunu</td><td>QIAGEN</td><td>30760</td><td>Kartuş önceden 5&nbsp; ml Ni-NTA Süper Akışlı</td></tr><tr><td>Güçlü Sülfopropil katyon değiştirici kolonu</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>17-5157-01</td><td>HiTrap SP Sepharose FF 5 ml</td></tr><tr><td>Boyut Dışlama sütunu</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>28989335</td><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 PG</td></tr><tr><td>Floresan hücresi</td><td>Hellma Analytics</td><td>111-057-40</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre</td><td>Agilent Technologies</td><td>G6860AA</td><td>Cary 60 UV-Vis</td></tr><tr><td>Çalkalayıcı</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>SHKA4000-7</td><td>MaxQ 4000 Tezgah üstü sıcaklık aralığı Ortam-15 ° C ila 60 ° C; C</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>75004271</td><td>Heraeus Megafuge 16R</td></tr><tr><td>FPLC</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>Durdurulan</td><td>FPLC sistemi iletkenliği UV-MM II monitör P500 pompa fraksiyonu</td></tr><tr><td>Spektroflorometre Olis</td><td></td><td>Polarizasyon</td><td>Araç Kutusu ile uygulanabilir Olis DM 45</td></tr></tbody></table> yok

protein-protein etkileşimleri çalışmak için aracı olarak floresan anizotropi

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein etkileşimi, bir canlı organizmanın işlevinde önemli bir rol oynamaktadır. bir etkileşim tespit ve doğrulandıktan sonra yapısal ve mekanik düzeyde bunu karakterize etmek gereklidir. Çeşitli biyokimyasal ve biyofiziksel yöntemler bu amaçla mevcut. Bir fluoroforla işaretlenmiş proteinin floresans yoğunluğu, protein-protein etkileşimi üzerine sabit kaldığı durumlarda Bunlar arasında floresan anizotropi, özellikle kullanılan güçlü bir tekniktir. Bu teknikte, bir florofor ile işaretlenmiş proteinin seçici gelen ışın ile göreceli yönelimine göre florofor bir alt kümesi uyaran bir uygun dalga boyunda dikey olarak kutuplanmış ışık eksite edilir. Ortaya çıkan emisyon ayrıca, dikey ve yatay düzlemlerde ilişki anizotropi (r) tanımlayan bir yönü vardır: r (I VV -I VH) / (I VV + 2I VH), ben VV ve ben = nerede <sUB&gt; VH sırasıyla dikey ve yatay bileşenleri floresan yoğunlukları vardır. Fosforlu anisotropi, bir flüorofor, protein-protein etkileşimi sırasında değişmiş bir protein, bağlı bir fluorofor, yani görünür molekül boyutu dönme difüzyon duyarlıdır. Bu metinde, protein-protein etkileşimlerini incelemek için bir araç olarak floresans anizotropi kullanımı Shwachman-Diamond Sendromu (SBDS) mutasyona uğramış protein ve uzama faktörü gibi-1 GTPaz (EFL1) arasındaki bağlanma gidermek için örneklendirilmiştir. Geleneksel olarak, bir florofor ile proteinin etiketlenmesi tiol grupları (sistein) veya proteinin amino gruplarının (N-terminal amin ya da lisin) içinde gerçekleştirilir. Ancak, SBDS bunun bölgeye yönelik etiketleme izin vermedi birkaç sistein ve lysines sahiptir. Alternatif bir teknik, boya 4 &#39;de, 5&#39;-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) floresein özellikle Tetracysteine ​​motifi, Cys- etiketlemek için kullanıldıCys-Pro-Gly-Cys-Cys, genetik rekombinant SBDS proteinin C-terminalinde tasarlanmıştır. Deneysel verilerin uydurma bu proteinler arasındaki bağlanma modu nicel ve mekanik bilgi verdi.

Herhangi bir anizotropi deneyi gerçekleştirmek için türlerin bir karışımı gözlenen anizotropi Denklem 5 ile temsil edilir çünkü fluorofor floresan yoğunluğu büyük değişiklikler ekarte etmek önemlidir: <img alt="Equation5" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq5.jpg" /> F i her bir bileşenin ve r fraksiyonel floresan temsil nereye i<...

Protein etkileşimleri bir hücrenin işlevi merkezinde yer alıyor. Kalorimetre ve spektroskopik teknikleri yaygın onları karakterize etmek için kullanılır. Burada Shwachman-Diamond Sendromu (SBD&#39;ler) mutasyona uğramış protein ve Uzama faktörü benzeri 1 GTPaz (EFL1) arasındaki etkileşimi incelemek için bir araç olarak floresan anizotropi açıklar.

Protein-protein etkileşimleri çalışmak için aracı olarak floresan Anizotropi

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Bu deneyin genel amacı, Floresan Anizotropisi kullanarak ilgilenilen iki protein arasındaki etkileşimi değerlendirmek ve nicelleştirmektir. Bu ölçümler; etkileşimleri hücresel fonksiyonlar için önemli olan proteinler gibi, protein biyokimyası ve protein biyofiziği alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu tekniğin temel avantajı, protein-protein etkileşimi hakkında nicel ve nitel bilgiler elde edebilmemizdir. Saflaştırılmış SBDS-FlAsH proteini hazırlamak için, öncelikle mililitre başına 100 µg ampisilin içeren bir litre LB sıvı besiyeri hazırlayın. Ardından, transformasyon yapılmış bakterileri 600 nm'deki optik yoğunluk 0,5 ila 0,7'ye ulaşana kadar 37 °C'de kültüre edin.Kültüre 0.5 millimolar IPTG ekleyerek SBDS-FlAsH protein ekspresyonunu indükleyin ve inkübasyona beş saat daha devam edin. Ardından, bakteriyel süspansiyonu 4 °C'de, 3800 ×g kuvvetinde on dakika santrifüj ederek toplayın. Süpernatantı uzaklaştırın.Hücreleri, bir millimolar PMSF ile desteklenmiş 35 mililitre SBDS liziz tamponunda yeniden süspande edin. Dört santigrat derecede, on saniye açık ve 30 saniye kapalı döngülerle toplam dört dakika boyunca sonikasyon uygulayarak liziz gerçekleştirin. Ardından, örneği dört santigrat derecede 50 dakika boyunca 9, 000 xg hızda santrifüjleyin.Hücresel kalıntıları uzaklaştırmak için süpernatantı saklayın ve peleti atın. Nikel afinite kolonunu üç kolon hacmi SBDS lizis tamponu ile dengeledikten sonra, açıklığa kavuşturulmuş süpernatantın tamamını kolona aktarın. Üç kolon hacmi SBDS lizis tamponu ile yıkayarak bağlanmamış proteinleri uzaklaştırın.Kolon yıkamasının ardından, bağlanmış proteini üç kolon hacmi SBDS elüsyon tamponu ile elüe edin. Proteini daha fazla saflaştırmak için, sülfopropil katyon değiştirici kolonu üç kolon hacmi düşük tuzlu S kolon tamponu ile dengeleyin. Proteini 50 millimolar fosfat tamponu pH 6.5 ile altı kat seyreltin ve kolona yükleyin.Bağlanmamış materyali üç kolon hacmi kadar Düşük tuzlu S kolon tamponu ile yıkayın. Ardından, kolona 50 milimolar fosfat tamponu PH 6.5, bir molar sodyum klorür ekleyerek proteini tek adımda elüe edin. Elüatı 50 milimolar fosfat tamponu PH 6.5 ile üç kat seyreltin.Ardından, proteini ultrafiltrasyon cihazları ile 3800 ×g'de on beş dakika santrifüj ederek konsantre edin. Bu tür deneylerde kullanılan proteinlerin kalitesi oldukça önemlidir. Kullanılan protein örnekleri yüksek saflıkta değilse, verilerin yorumlanması karmaşıklaşır.SBDS-FlAsH proteinin saflığını SDS-PAGE analizi ve Coomassie boyama ile doğrulayın. Proteini sıvı azot ile hızlıca dondurun ve daha sonraki kullanıma kadar -80 °C'de saklayın. Saflaştırılmış EFL1 proteini hazırlamak için, öncelikle transforme edilmiş mayayı, 600 nm'deki optik yoğunluk 1,8'e ulaşana kadar, %0,5 glikoz ile desteklenmiş urasil içermeyen bir litre sentetik drop-out ortamında 30 °C'de kültüre alın.Kültüre %2.8 galaktoz ekleyerek protein ekspresiyonunu indükleyin ve inkübasyonu 30 °C'de 18 saat boyunca sürdürün. Maya süspansiyonunu, 4 °C'de 10 dakika boyunca 3800 ×g'de santrifüj ederek toplayın. Santrifüj işleminin ardından süpernatantı uzaklaştırın.Hücreleri, 1 mM PMSF ve 1 mM benzamidin ile desteklenmiş 50 mL EFL1 lizis tamponu içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri, cam boncuklar kullanarak bir bead-beater ile, 4 °C'de iki dakika açık ve on beş dakika kapalı olacak şekilde toplam altı dakika boyunca sürtünme yoluyla parçalayın. Ardından, örneği 4 °C'de 50 dakika boyunca 9.000 ×g'de santrifüjleyin.Hücresel kalıntıları uzaklaştırmak için üst fazı saklayın ve çökelek kısmını atın. Ardından, nikel afinite kolonunu üç kolon hacmi EFL1 lizis tamponu ile dengeleyin. Berraklaştırılmış üst fazın tamamını dengelenmiş kolona yükleyin.Kolonu üç kolon hacmi EFL1 lizis tamponu ile yıkayarak bağlanmamış proteinleri uzaklaştırdıktan sonra, bağlı proteini üç kolon hacmi EFL1 elüsyon tamponu ile elüe edin. EFL1 proteinini daha ileri düzeyde saflaştırmak için, boyut dışlama kolonunu 1,5 kolon hacmi Anizotropi tamponu ile dengeleyin. Nikel afinite kolonundan elüe edilen EFL1 proteinini, 3800 ×g merkezkaçtırma ile ultrafiltrasyon cihazları kullanarak bir mililitreye konsantre edin. Ardından, konsantre edilmiş örneği boyut dışlama kolonuna yükleyin.Elüye edilen proteini toplayın ve ultrafiltrasyon yoluyla yaklaşık 30 µM nihai konsantrasyona kadar konsantre edin. EFL1 proteininin saflığını SDS-PAGE analizi ve Coomassie boyaması ile doğrulayın. Proteini sıvı nitrojen içinde şok dondurun ve daha sonraki kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.Üç nanomol SBDS-FlAsH proteinini, beş mikrometre hacmindeki anizotropi tamponu içinde üç nanomol lumio green boyası ile karıştırın. Reaksiyonun dört santigrat derecede sekiz saat boyunca gerçekleşmesini sağlayın. Sekiz saat sonra, serbest boyayı uzaklaştırmak için örneği gece boyunca anizotropi tamponuna karşı diyalize edin.Bir Kuvars Küvet kullanarak spektrofotometrede 280 nanometre ve 508 nanometre dalga boylarındaki absorbansları ölçün. Ardından, metin protokolünde açıklandığı şekilde, işaretli protein yüzdesini belirlemek için Lambert-Beer Yasasını kullanın. Anizotropi değerini ölçmeden önce, protein solüsyonundan gelen her filtrasyon adımı, tüm örneğin çözeltiye aktarıldığından ve homojen hale geldiğinden emin olunarak dikkatle gerçekleştirilmelidir.Bir Floresan Küvetin içine, anizotropi tamponu içinde 200 µL 30 nM SBDS-FlAsH yerleştirin ve iki µL 30 µM EFL1 titre edin. İyice karıştırın ve anizotropi ile floresan değerini ölçmeden önce reaksiyonu üç dakika bekletin. Toplam 40 µL EFL1 eklenene kadar bu işlemi tekrarlayın.Son adım olarak, verileri metin protokolünde açıklandığı üzere varsayılan bir bağlanma modeline uydurun. Herhangi bir anizotropi deneyi gerçekleştirmek için floresan yoğunluğundaki büyük değişimleri dışlamak önemlidir. Burada gösterildiği gibi, SBDS-FlAsH'ın floresansı, EFL1'e bağlandığında belirgin bir şekilde değişmez.SBDS-FlAsH içeren bir Kuvars Küvet içine EFL1 titrasyonu, başlangıçta gözlemlenen anizotropide bir artışla sonuçlanır. EFL1'in ardışık eklemeleri, doğrusal olmayan en küçük kareler regresyonu kullanılarak varsayılan bir bağlanma modeline uydurulabilen ilgili bağlanma eğrisini tanımlar. Bu durumda, tek bağlanma bölgesi modeli deneysel verileri uygun şekilde tanımlamamaktadır.Bunun yerine, iki özdeş olmayan bağlanma bölgesi modeli deneysel verileri uygun şekilde tanımlamaktadır. Uzmanlaşıldığında, floresan anizotropi bağlanma deneyi, düzgün bir şekilde yürütüldüğü takdirde üç saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, büyük miktarlarda saflaştırılmış proteinin mevcut olması önemlidir.Bu prosedürle paralel olarak, uygun bağlanma modelini desteklemek amacıyla fragman tabanlı komplementasyon analizi veya incelenen proteinin farklı domainleri ile floresan anizotropi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, floresan anizotropi ile takip edilen bir bağlanma deneyinin nasıl yürütüleceği konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız.

fluorescence-anisotropy-as-tool-to-study-protein-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu protokol bir FRET tabanlı yakınlık tahlil kullanarak nasıl görüntü protein-protein etkileşimleri açıklar.

Görüntüleme Protein-protein etkileşimleri In vivo</em

Bu video, hücre-hücre temaslarında hücre yüzeyi proteinleri arasındaki etkileşimi tespit etmek için floresan dalgalanma spektroskopisinin kullanımını göstermektedir. Bir floresan proteini ile etiketlenmiş ilgilenilen transmembran yapışma reseptörünü eksprese ederek ve spektral olarak ayrılmış iki floresan etiketi barındıran iki farklı hücre popülasyonunu karıştırarak, farklı renkli floresan ile iki komşu hücrenin reseptörleri arasındaki trans-etkileşim, floresan yoğunluğundaki dalgalanmalardaki...

Hücre Temaslarında Protein Etkileşimini İncelemek için Floresan Dalgalanma Spektroskopisi

Bu video, protein homo-oligomerizasyonunu incelemek için floresan dalgalanma spektroskopisi (FFS) tekniğini göstermektedir. Bir numunedeki floresan etiketli proteinler, FFS kullanılarak protein oligomerizasyonu incelenirken bir ajan kullanılarak dimerize edilir. Konfokal bir mikroskop kullanılarak, proteinler küçük gözlem hacmine girip çıktıkça, proteinlerin oligomerik durumunu belirlemek için floresan moleküllerinin parlaklığındaki dalgalanmaların analizi yapılır.

Protein Homo-Oligomerizasyonunu İncelemek için Floresan Dalgalanma Spektroskopisi

Bu videoda, florofor etiketli Shwachman-elmas sendromu (SBDS) proteini ile uzama faktörü benzeri 1 GTPaz (EFL1) arasındaki etkileşimleri incelemek için floresan anizotropi tekniğini açıklıyoruz. SBDS proteinlerinin kademeli olarak artan EFL1 konsantrasyonları ile inkübe edilmesinde, iki protein arasında başarılı bir etkileşime işaret eden anizotropide sabit bir artış gözlenir.

Protein-Protein Etkileşimlerinin Floresan Anizotropi Tabanlı Tespiti

Bu videoda, transkripsiyon faktörleri ve DNA arasındaki etkileşimi izlemeye yardımcı olan yüksek performanslı floresan anizotropisi açıklanmaktadır. Test, florofor etiketli DNA'nın moleküler rotasyonu veya anizotropisine bağlı polarizasyon derecesini ölçerek, florofor etiketli bir DNA molekülünün spesifik transkripsiyon faktörü ile etkileşimlerini izler.

Transkripsiyon Faktörü-DNA Bağlanma Afinitesini Belirlemek için Floresan Anizotropisi

Burada, üç renkli smFRET veri ve onun analizi ile 3D ensemble gizli Markov modeli elde etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yaklaşım ile bilim adamları Kinetik bilgi cooperativity veya ilişkili etkileşimler de dahil olmak üzere karmaşık protein sistemlerden ayıklayabilirsiniz.

Üç renkli tek molekül FRET Protein etkileşimleri korelasyon çalışma için kullanma

Bu iletişim kuralı için ticari ışık mikroskobu tarama kullanarak floresans dalgalanma spektroskopisi üzerinde temel protein homo-Oligomerizasyonda vitro miktarının kalibrasyon-Alerjik bir yaklaşım açıklar. Doğru satın alma ayarları ve analiz yöntemleri gösterilir.

Kalibrasyon-Alerjik Vitro miktar Protein Homo-Oligomerizasyonda ticari araçları ve ücretsiz, açık kaynak parlaklık analiz yazılımı kullanarak

Bu iletişim kuralı hücre-hücre etkileşimleri, yani proteinler hücre kavşaklar, doğrudan canlı hücreler içinde lokalize arabuluculuk proteinler arasındaki etkileşimler araştırmaya floresans dalgalanma spektroskopisi temelli bir yaklaşım açıklar. Biz aleti kalibrasyon, veri toplama ve analizi, olası yapay doku kaynaklarına düzeltmeler dahil olmak üzere ayrıntılı yönergeler sağlar.

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

İki florofor molekülü arasındaki Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET), canlı hücredeki protein etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir. Burada, alıcı ve konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak donör molekülünün söndürülmesi ile alıcının duyarlılaştırılmış emisyonunu tespit ederek canlı hücrelerde FRET'nin nasıl ölçüleceğine dair bir protokol sağlanmaktadır.

FRET'e duyarlı emisyona sahip canlı hücrelerdeki protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Modern floresan etiketleme tekniklerini kullanarak canlı hücrelerdeki membran reseptör dinamiklerini incelemek için Förster Rezonans Enerji transferi (FRET) ile birlikte canlı hücre çift renkli floresan çapraz korelasyon spektroskopisi (FCCS) gerçekleştirmek için deneysel bir protokol ve veri analizi iş akışı sunuyoruz.

Canlı Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi ve Protein Dinamiklerini incelemek için Çift Renkli Floresan Çapraz Korelasyon Spektroskopisi

Burada, konfokal mikroskopi modunda tek molekül seviyesinde zamanla çözülen floresan anizotropi kullanarak biyomoleküllerin yerel esnekliğini ve dinamiklerini incelemek için protokolü sunuyoruz.

Biyomoleküllerde Yerel Esnekliği Karakterize Etmek için Tek Moleküllerden Zamanla Çözülen Floresan Anizotropisi

Öğrenin, SBDS ve EFL1 protein etkileşimlerini floresan anizotropi ile nicel ve nitel olarak analiz etme yöntemini. Bu teknik, hücresel fonksiyonları anlamak için protein biyokimyası alanında güçlü bir araçtır.

Protein-protein etkileşimleri çalışmak için aracı olarak floresan Anizotropi

Daha fazla video keşfet