Fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri Saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma
November 4th, 2016
Biz pDC fonksiyonel çalışmalar için, lupus-eğilimli farelerin kemik iliğinden, yüksek saflıkta plazmasitoid dendritik hücreleri (PDC) izole etmek için sıralama floresans ile aktive edilmiş hücre kullanarak bir protokol sunulmuştur.
Bu deneyin genel amacı, işlevlerinin incelenmesi için lupus eğilimli farelerin kemik iliğinden yüksek saflıkta plazmositoid dendritik hücreleri veya PDC'yi izole etmektir. Bu yöntem, lupus gelişiminin geç evresinde interferon alfa üreten PDC gibi belirli bir bağışıklık hücresi popülasyonunun özellikleriyle ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, bir ila birkaç hedef popülasyonun manyetik boncuk ayıklamadan daha yüksek bir saflıkta zenginleştirilebilmesidir.
Hasattan sonra, arka bacak kemiklerini ve dört mililitre tam ortamı bir havan içine aktarın. Toplam hacmi 10 mililitreye çıkarmak için altı mililitre taze tam ortam ekleyin. Ve kemikleri bir havaneli ile nazikçe kırın.
Kemik iliğini serbest bırakmak için havaneli hafifçe karıştırın. Ardından, tüm ortamı 70 mikronluk bir süzgeçten geçirerek buz üzerinde 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Harca 10 mililitre taze tam orta ekleyin.
Ve süpernatanı kemikler beyaz görünene kadar iki kez daha süzün. Daha sonra, kemik iliği hücrelerini santrifüjleyin ve peleti 10 mililitre taze tam ortamda yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpte beş mililitre taze hazırlanmış yoğunluk gradyan ortamına yerleştirin ve katmanları bozmamaya dikkat edin.
Ve hücreleri santrifüjleme ile ayırın. Ardından, çözeltinin en üstteki sekiz mililitresini dikkatlice çıkarın ve iki mililitrelik buffy kaplamayı interfazda toplayın. İzole edilmiş mononükleer hücrelere 12 mililitre buz gibi soğuk tam ortam ekleyin ve ters çevirerek karıştırmak için tüpü kapatın.
Ardından, hücreleri santrifüjleme ile peletleyin. Hücreleri FACS'a boyamak için, onları dört santigrat derecede 100 mikrolitre CD1632FC bloke edici antikorda yeniden süspanse edin. 10 dakika sonra, hücreleri dört mililitre buz gibi soğuk ayırma tamponunda yıkayın ve hücreleri 100 mikrolitre uygun hücre yüzeyi boyama antikor kokteyli ile etiketleyin.
Karanlıkta dört santigrat derecede 15 dakika boyunca. Herhangi bir bağlanmamış floresan konjuge antikoru çıkarmak için hücreleri dört mililitre buz gibi soğuk ayırma tamponunda yıkayın. Ardından, peleti 500 mikrolitre FACS yükleme solüsyonunda yeniden süspanse edin ve numuneyi buz üzerindeki bir FACS tüpüne aktarın.
Kompanzasyon kontrollerini boyamak için, tüp başına 10 ila altıncı splenosit bir kez alikot edin. Hücreleri dört mililitre ayırma tamponu ile yıkayın ve peletleri 100 mikrolitre ayırma tamponunda yeniden süspanse edin. Daha sonra, ana hücre yüzeyi antikor kokteylinden uygun floresan konjuge antikoru karşılık gelen her bir kompanzasyon tüpüne ekleyin ve karıştırmak için tüpleri sallayın.
Karanlıkta 15 dakika sonra, dört santigrat derecede, tüm numuneleri ayırma tamponu ile yıkayın ve peletleri 500 mikrolitre buz gibi soğuk ayırma tamponunda yeniden askıya alın. 500 mikrolitre FACS yükleme çözeltisinde yeniden askıya alınan DAPI tüpü hariç. Floresanla aktive edilmiş hücre ayırma ile hedef hücre popülasyonunu saflaştırmak için, ayırma valflerinin altına antibiyotiklerle desteklenmiş 500 mikrolitre FBS içeren toplama tüplerini yükleyin.
Ardından, boyanmamış tüpü yükleyin ve her floresan yoğunluğu için negatif kapıyı ayarlamak için 10.000 olay toplayın. Ve her floresan yoğunluğu için pozitif kapıyı ayarlamak için tek leke kompanzasyon tüplerinde 10.000 olay. Sıralanmış hücre popülasyonunun kapılarını ayarlamak için deneysel örnekten 3.000 olay toplayın.
Hedef hücre popülasyonunu manuel olarak geçit etmek için X ve Y erişim grafiğinin parametreleri olarak floresan yoğunluklarını kullanma. Ardından, hedef hücre popülasyonunu toplama tüpüne sıralayın. Sıralamanın sonunda, hücrelere dört mililitreye kadar buz kömürü tam ortamı ekleyin.
Daha sonra, tüpü kapatın ve hücreleri ters çevirerek karıştırın. Saflaştırılmış hücreleri, süpernatantın son 200 mikrolitresi hariç hepsini aspire ederek santrifüjleme ile peletleyin. Daha sonra, peleti bir mililitre buz gibi soğuk tam ortamda yeniden süspanse edin ve hücreleri ikinci bir santrifüjleme için 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.
Son olarak, süpernatantın son 100 mikrolitresi hariç hepsini aspire edin ve sıralanan hücre popülasyonunu kullanıma kadar buz üzerinde saklayın. Lupus eğilimli farelerden kemik iliği plazmasitoid dendritik hücrelerin manyetik olarak aktive edilmiş hücre sınıflandırması, zenginleştirmeden sonra sadece% 7.75'lik bir saflık ile sonuçlanır. Bununla birlikte, FACS'tan zenginleştirilmiş plazmositoid dendritik hücreler, sıralama sonrası %96.4 kadar yüksek bir saflık gösterir.
Yüksek saflık sağlamak için, mononükleer kemik iliği hücreleri önce kapılanır ve ileri ve yan saçılma parametreleri ile döküntülerden ayrılır. İleri saçılma genişliğine karşı ileri saçılma yüksekliği ve yan saçılma genişliğine karşı yan saçılma yüksekliği kullanılarak, agregalar tarafından üretilen yanlış pozitif sinyalleri önlemek için tek hücreler daha fazla geçitlenir. Canlı tek DAPI negatif hücreler daha sonra CD11c pozitif, CD11B negatif hücre yüzey ekspresyonu ile kapılanır ve B220 pozitif, PDCA-1 pozitif hedef kemik iliği plazmositoid dendritik hücre popülasyonunun daha fazla kapılanmasına izin verir.
Sıralanmış PDC popülasyonu sadece yüksek saflıkta değil, aynı zamanda in vitro CPG stimülasyonu üzerine IFNalfa üretme yeteneği ile fonksiyonel olarak normaldir. Bu prosedürü denerken, hücre canlılığını korumak için kemikleri kırmayı ve salınan kemik iliğini hafifçe karıştırmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, zenginleştirilmiş hücre popülasyonlarının gen ekspresyonu veya işlevi hakkında ek soruları yanıtlamak için RNA dizilimi veya in vitro kültür ve stimülasyon gibi diğer yöntemler uygulanabilir.
Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, PDC araştırmacılarının bu güçlü hücrenin lupus ve lupus eğilimli fare modellerinin geliştirilmesindeki rolünü keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, lupus eğilimli farelerin kemik iliğinden yüksek oranda saflaştırılmış bir PDC popülasyonunun nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, floresan aktive hücre sıralama kullanarak lupus eğilimli farelerin kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücrelerin (pDC) izole edilmesi için bir protokol sunmaktadır. Yöntem, pDC'lerin sonraki fonksiyonel çalışmaları için yüksek saflık sağlamayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- İmmünoloji
- Hücre Biyolojisi
- Otoimmünlük
Arka Plan
- Plasmasitoid dendritik hücreler, bağışıklık tepkileri için kritik öneme sahiptir.
- Özellikle lupus ilerlemesi sırasında interferon alfa üretirler.
- Doğru fonksiyonel analiz için yüksek saflıkta izolasyon esastır.
- Floresan aktive hücre sıralama, geleneksel yöntemlere göre avantajlar sunar.
Çalışmanın Amacı
- Lupus eğilimli farelerden pDC'leri izole etmek.
- pDC'lerin fonksiyonel özelliklerini incelemek.
- Lupus'ta bağışıklık hücresi davranışı hakkındaki anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Lupus eğilimli farelerden kemik iliği hasadı.
- İzolasyon için floresan aktive hücre sıralama kullanımı.
- Hücre işleme için tam ortam hazırlama.
- Sıralama için hücreleri serbest bırakmak üzere kemiklerin kırılması.
Ana Sonuçlar
- Yüksek saflıkta pDC'lerin başarılı bir şekilde izole edilmesi.
- Lupus'ta pDC fonksiyonu hakkında daha gelişmiş anlayış.
- Floresan aktive hücre sıralamanın avantajlarının gösterilmesi.
- Gelecek çalışmalar için güvenilir bir protokol sağlanması.
Sonuçlar
- Protokol, fonksiyonel çalışmalar için pDC'leri etkili bir şekilde izole etmektedir.
- Bulgular, lupus patolojisinin anlaşılmasına katkıda bulunur.
- Gelecek araştırmalar bu metodoloji üzerinde geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Isolating rare immune cell populations with high purity is critical for mechanistic de-risking in target validation and preclinical model development. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) enables precise phenotypic separation of plasmacytoid dendritic cells from lupus-prone mouse bone marrow, supporting reliable functional assays and translational biomarker discovery. This approach reduces biological noise in early discovery, improving predictive confidence for downstream therapeutic hypothesis testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of plasmacytoid dendritic cell function in lupus pathogenesis by isolating a pure population for interferon alpha production studies.
- Operational Value: Achieves up to 96.4% purity post-sorting, significantly exceeding magnetic-activated cell sorting alternatives.
- Strategic Value: Supports target confidence by reducing cellular heterogeneity in functional readouts, aiding go/no-go decisions in immunomodulator screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified plasmacytoid dendritic cells suitable for in vitro stimulation assays, such as CpG-induced interferon alpha measurement.
- Operational Value: Permits simultaneous separation of multiple cell populations, increasing experimental throughput and assay standardization.
- Strategic Value: Creates a reproducible input for screening workflows, enabling reliable compound evaluation against defined immune phenotypes.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system using lupus-prone mouse models to study plasmacytoid dendritic cell contributions to autoimmunity.
- Operational Value: Isolated cells remain functionally normal, capable of interferon alpha production upon stimulation, validating assay readiness.
- Strategic Value: Facilitates translational continuity from discovery to preclinical validation by supplying well-characterized primary cells for mechanism-of-action studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum, supporting early target validation through phenotypic screening and enabling lead identification via functional readouts in purified immune cells.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating plasmacytoid dendritic cells to clarify their role in interferon-driven lupus pathology.
- Screening: Delivers standardized, high-purity cell populations for reproducible functional assays and compound screening.
- Analytics: Enables quantitative dependent variable measurements such as cytokine production, flow cytometry readouts, and purity assessment via forward/side scatter gating.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through use of lupus-prone mice, aligning with mechanistic de-risking in autoimmune disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for isolating rare immune cells across multiple immunology and autoimmunity projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through reduction of mechanistic ambiguity in immune cell function studies.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined gating strategies and compensation controls.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions and reduced late-stage biological risk in immunomodulator development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on reliable preclinical data from purified cell populations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, cell staining, and compensation controls for accurate fluorescence-activated cell sorting.
- Dependent on instrumentation including flow cytometers, sorting equipment, and centrifugation systems for bone marrow processing.
- Necessitates cross-team standardization of antibody panels, gating strategies, and sorting protocols across immunology and assay development groups.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to other model systems or tissue sources beyond mouse bone marrow.
- Includes practical limitations such as the need for gentle bone marrow disruption to preserve cell viability and the time-intensive nature of multi-step purification.
