Name: Fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri Saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Öğrenin, lupus eğilimli farelerin kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma kullanarak yüksek saflıkta izole etmeyi. Bu yöntem, interferon alfa üreten hücrelerin fonksiyonel özelliklerini incelemek için araştırmacılara yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine'deki Flow Sitometri Laboratuvarı'na flow sitometri çekirdek tesisinin kullanımı için teşekkür ederiz. Bu çalışma XML'in başlangıç fonları tarafından desteklendi. XL, Biyomedikal ve Veterinerlik Bilimleri yüksek lisans programında Stamps Fellow'dur.

NOT: MRL / Mp-Fas lpr lupus eğilimli fareler yetiştirilen ve Virginia Tech (Hayvan Refahı Güvencesi sayısı Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) gereklerine itibaren belirli bir patojen içermeyen tesiste muhafaza edildi (MRL / lpr): A3208-01). Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu önerileri ile tam uyum içinde yürütülmüştür. Tüm hayvan deneyleri IACUC protokolü # 12-062 altında gerçekleştirilmiştir. 1. Hücre Kültürü Orta ve Sıralama Tampon <ol><li> Tüm hücre kültürü ortamı (C 10),% 10 fetal sığır serumu, 1 mM sodyum piruvat,% 1, 100 MEM temel olmayan amino asitler, 10 mM HEPES, 55 uM 2-merkaptoetanol, 2 mM L-glutamin ile takviye edilmiş RPMI 1640 ile hazırlayın 100 U / ml penisilin-streptomisin. </li><li> ayırma tamponu hazırlayın 10 mM HEPES ile desteklenmiş 1 x Hank&#39;in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile (dolu HBSS), 2.5 mg / ml sığır serumu albümini,0,05 mM MgCl2 ve 0.2 U / ml DNaz I </li></ol> 2. Fare diseksiyonu <ol><li> 4 ml C10 içeren iki 6 cm çapında yemekleri hazırlayın. buz üzerinde yemekleri yerleştirin. </li><li> CO 2 inhalasyon yoluyla fare Euthanize. </li><li> dalak hasat ve buz üzerinde C10 ile bir tabak içinde tutmak. <ol><li> diseksiyon plaka üzerinde yukarı bakacak şekilde karın fare aşağı pin. % 70 etanol püskürtülerek vücudu sterilize edin. </li><li> Cildi kesin ve altında boyun pubis eklemi ventral orta hat boyunca kas duvarından cilt ayırmak. </li><li> Ayak bileği ilk kesi arka bacak boyunca cildi kesin. </li><li> arka yüzlerine cilt pin ve diyafram ilk kesi yerden kenarlarında kas duvarı kesti. </li><li> kafanın sağ tarafında kas duvarı geri pin. </li><li> ince bağırsak altında ve mide yanında farenin sağ tarafta dalak bulun. inci bir ucunu Pick upe dalak ve mide ayırın. </li></ol></li><li> femur ve tibia da dahil olmak üzere, her iki arka bacaklarda kesip, ve mümkün olduğunca tüm kasları kaldırın. <ol><li> kan damarları önlemek için çalışıyoruz, keskin bir makas ile ayak bileği pelvik / kalça ekleminden arka bacak boyunca kasları kesti. </li><li> Kemik iliği içeriğinin maruz kalmadan pelvis / kalça eklemi ve ayak bileği / ayak eklem keserek arka uzuv ayırmak. </li><li> tekrar tekrar jilet ile çizilme ve ortak noktalarda kasları keserek kemikler üzerinde temiz kalan kaslar. </li></ol></li><li> buz üzerinde 4 ml C10 içeren 6 cm çanak kemikleri tutun. Bir sonraki fare diseksiyon geçin. </li></ol> 3. splenosit yalıtımı <ol><li> Resim kırmızı renkli görünür olana kadar 4 mi C10 ihtiva eden çanak üzerine 70 mikron hücre süzgecinden karşı şırınga pistonu yavaşça dalak homojenize edilir. </li><li> süzgeç a ile çanak içine ilave 6 ml C10 eklend sonra 15 ml konik tüp toplam 10 ml hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> 5 dakika, 4 ° C, 800 xg&#39;de konik tüp santrifüjleyin. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, süpernatan aspire ve 2 ml 1 x kırmızı kan hücresi (RBC) liziz tamponu içinde hücre pelletini. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> İnkübasyondan sonra, 5 dakika, 4 ° C, 800 x g hızında santrifüj konik tüp. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, süpernatan aspire ve 1 ml C10 hücre pelletini. herhangi bir büyük kümeleri (ölü hücreler) atın ve daha sonra buz üzerinde tüp tutun. NOT: Birçok küçük kümeleri varsa, bir kez hücre süspansiyonu filtre 70 mikron hücre süzgeç kullanın. </li><li> otomatik bir hücre sayacı tripan mavisi ile hücre sayısı. </li></ol> 4. Kemik iliği Hücre İzolasyonu <ol><li> bir havan içine 4 mi C10 kemik aktarın ve toplam 10 mi C10 lik bir hacim oluşturmak için 6 ml C10 ekleyin. </li><li> ap kullanarak harç yavaşça kemikleri çatlakestle. </li><li> C10 içine kemik iliği serbest bırakmak için tokmak ile hafifçe karıştırın. </li><li> 70 mikron hücre süzgecinden buz üzerinde bir 50 ml konik tüp içine kemik iliği içeren 10 ml C10 aktarın. hala kemikleri içeren harcın içine 10 ml taze C10 ekleyin. NOT: Pipet kırmızı kümeleri görülebilir ise süzgecinden geçirmeden önce kemik iliği yukarı ve aşağı birkaç kez içeren solüsyon. </li><li> Tekrarlayın kez 4.4&#39;e 4.2 adımları tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, kemikler, beyaz görünmelidir. </li><li> 5 dakika, 4 ° C, 800 x g&#39;de 50 ml konik tüp santrifüjleyin. Öte yandan oda sıcaklığında bir 15 mL konik santrifüj tüpü içinde 5 ml Ready-to-use yoğunluk gradyan hazırlarlar. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, süpernatan aspire ve 10 ml C10 hücre pelletini. </li><li> Yavaş yavaş iki faz arasındaki net arayüzü koruyarak, 5 ml yoğunluk gradyan ortamının üstüne 10 ml hücre süspansiyonu katman. Daha sonra 30 dakikada için 1.363 g 15 ml konik tüp santrifüj0 (Fren KAPALI) olarak ayarlanmış hızlanma 9 olarak set ve yavaşlama ile RT (20 ° C). </li><li> Santrifüj işleminden sonra, dikkatle üst 8 ml solüsyon kaldırmak ve yeni bir 15 ml konik tüp içine arabirimi (mononükleer hücrelerin tabakası) 2 ml buffy coat toplamak. </li><li> Kemik iliği tek çekirdekli hücreleri, kap ihtiva eden 15 ml konik tüp, 12 ml buz soğukluğunda C10 ekleyin ve daha sonra iyice karıştırın, 10 dakika, 4 ° C, 800 x g hızında santrifüj tüpü birkaç kez ters çevirin. </li></ol> FACS 5. Hücre Yüzey Boyama <ol><li> örnek boyama <ol><li> anti-fare CD16 / 32 antikor çözeltisi (İN 1-100 seyreltme HBSS-dolu / ml son konsantrasyon 5 ug) hazırlayın. </li><li> Adım 4.10 santrifüjlemeden sonra, süpernatan aspire ve tek çekirdekli hücreler üzerindeki Fc reseptörü bloke etme 100 ul anti-fare CD16 / 32 antikor çözeltisi hücre pelletini. 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. </li><li> (Karınca floresan konjuge antikor karışım hazırlayınI-fare CD11c-PE 1:40 seyrelti, anti-fare CD11 b-APC-Cy7 1:80 seyrelti, anti-fare PUKÖ 1-FITC 1:40 seyreltme ve anti-fare B220-V500 HBSS- bölgesindeki 1:40 seyreltme örnek başına 100 ul nihai hacim) üretici tarafından tavsiye edildiği gibi, tam. NOT: Kullanmadan önce antikorlar titre önemlidir. </li><li> Aşama 5.1.2 içinde 10 dakika inkübe edildikten sonra, anti-fare CD16 / 32 bağlanmamış kaldırmak için 5 dakika, 4 ° C, 800 x g&#39;de 4 mi buzla soğutulmuş HBSS dolu ve santrifüj ekleyin. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, süpernatan aspire ve 100 ul floresan konjuge antikor karışımı içinde hücre pelletini. karanlıkta 15 dakika süreyle buz üzerinde inkübe edin. </li><li> 15 dakika inkübasyondan sonra, bağlanmamış floresans-konjuge antikor kaldırmak için 5 dakika, 4 ° C, 800 x g&#39;de 4 mi buzla soğutulmuş HBSS dolu ve santrifüj ekleyin. </li><li> FACS yükleme solüsyonu (HBSS-tam 500 ng / ml DAPI) hazırlayın. </li><li> Aşama 5.1.6 santrifüjlemeden sonra, süpernatan aspire 500 mikron hücre pelletiniL FACS yükleme çözümü. 12 x 75 mm yuvarlak tabanlı tüpü (FACS tüpü) içine hücre süspansiyonu aktarın ve 1 saat içinde sıralama kadar karanlıkta buz üzerinde tüp tutun. </li></ol></li><li> Tazminat boyanma <ol><li> PE, APC-Cy7, FITC, V500, DAPI veya boyasız olarak etiket 6 FACS tüpleri. 1 x 10 6 hücre / FACS tüplere boru ve en kısım splenositler, 5 dakika, 4 ° C, 800 x g&#39;de 4 mi HBSS-Tam ile yıkayın. NOT: ölü hücrelerden canlı hücreleri ayırt etmek floresan boya, DAPI, DNA-bağlayıcı. DAPI Ölü hücrelerin plazma zarına (fakat canlı hücre) ve bağlama kromozom DNA geçebilir. </li><li> Süpernatantı aspire ve 100 ul HBSS-tam hücre pelletini. </li><li> anti-fare CD19-PE 1:40 seyrelti, anti-fare CD11 b-APC-Cy7 1:80 seyrelti, anti-fare PUKÖ 1-FITC 1:40 seyreltme ya: her bir karşılık gelen FACS tüpü içinde, aşağıdaki antikorların birisi ekleme manufa tarafından tavsiye edildiği gibi anti-fare B220-V500 01:40 seyreltmecturer. Oldukları gibi 5 inci (DAPI) ve 6. (boyasız) FACS tüpler bırakın. sallayarak iyice karıştırın ve 15 dakika boyunca karanlıkta buz üzerinde tüm FACS tüpleri kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> İnkübasyondan sonra, 5 dakika, 4 ° C, 800 x g hızında, her bir tüp ve santrifüj içine FACS tüpler 4 mi buz gibi soğuk HBSS dolu ekleyin. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, süpernatan aspire ve 500 ul buz hücre pelletini 500 ul FACS yükleme çözeltisi içinde tekrar süspansiyon haline getirilir DAPI işaretli tüp, pellet haricinde soğuk HBSS dolu yeniden süspanse edin. sıralama kadar karanlıkta buz üzerinde 6 tüpleri tutarak. </li></ol></li></ol> 6. Hücre Sıralayıcısı üzerinde sıralama NOT: sitometresindeki ve yazılım prosedürü sıralama Operasyonu şirket tarafından sağlanan ayrıntılı bir talimat ile standardize edilmiştir. Kısaca, biz 20 psi 100 mikron nozul, 5 arasında ayarlanabilir hedef hücre konsantrasyonunu kullanmak - ml başına 10 milyon ve% 70 ya da daha yüksek verimlilik ayarlamak (yani, çatışmalar 30 yaşın altında tutulan%). <ol><li> 100 U / ml penisilin-streptomisin içeren 500 ul FBS / tüp ile toplanması FACS tüpü hazırlayın. </li><li> Adım 5.2 den tek leke kompanzasyon tüpleri kullanılarak hücre sıralayıcı tazminat parametrelerini ayarlayın. <ol><li> Her florasan yoğunluğu için negatif bir kapı ayarlama boyanmamış bir tüp içinde 10,000 hücre kaydedin. </li><li> Her floresan yoğunluğu için pozitif kapısı ayarlamak için diğer tek leke tazminat tüplerde 10.000 hücreleri kaydedin. NOT: Yazılım otomatik olarak tazminat parametrelerini hesaplar. </li></ol></li><li> 3000 hücrelerini kaydederek sıralı hücre popülasyonlarının kapılarını ayarlamak için adım 5.1 bir örnek kullanın. el görünüşe göre diğer noktalardan ayrı noktalar grubu olarak X ve Y ekseni grafik geçit hedef hücre popülasyonunun parametre olarak floresan yoğunluğunu kullanılması. NOT: Bu yolluk seti araştırmacıların ihtiyaçlarına göre esnek ve keyfidir. Araştırmacılar, bir ya da daha fazla belirteçler dayalı yüksek saflıkta bekliyorsanız, kapı hareketyüksek gelen floresan yoğunluğuna göre. </li><li> Bir koleksiyon tüp yükleyin ve hedef hücre popülasyonunu sıralamak başlar. </li><li> Tüm örnek tüpleri yapılır kadar sıraladıktan sonra buz üzerinde toplama tüpü tutun. </li><li> 4 ml, sınıra kadar toplama tüpüne buz C10 ekleyin ve karıştırın ters. </li><li> 5 dakika, 4 ° C için 800 xg&#39;de toplama tüpü Santrifüj ve sonra el değmemiş hücre pelet ile yaklaşık 200 ul bırakarak süpernatant aspire. </li><li> hücre pelletini tekrar süspansiyon ve 1,5 ml santrifüj tüpüne Tüm hücre süspansiyonu transfer 1 ml buz gibi soğuk C10 ekleyin. </li><li> Santrifüj bakir hücre peleti 100 ul bırakarak 1.5 mi, 5 dakika, 4 ° C, 800 x g hızında boru ve süpernatan aspire. </li><li> kullanılana kadar buz üzerinde sıralanmış hücre popülasyonlarının saklayın. </li></ol>

<ol><li>Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">Fluorescence activated cell sorting.</a> Rev Sci Instrum. 43 (3), 404-409 (1972).</li>
<li>Herzenberg, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+and+future+of+the+fluorescence+activated+cell+sorter+and+flow+cytometry%3A+a+view+from+Stanford%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford.</a> Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).</li>
<li>Brown, M., Wittwer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+principles+and+clinical+applications+in+hematology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology.</a> Clin Chem. 46 (8 Pt 2), 1221-1229 (2000).</li>
<li>Laerum, O. D., Farsund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+application+of+flow+cytometry%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Clinical application of flow cytometry: a review.</a> Cytometry. 2 (1), 1-13 (1981).</li>
<li>Alvarez-Barrientos, A., Arroyo, J., Canton, R., Nombela, C., Sanchez-Perez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+flow+cytometry+to+clinical+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Applications of flow cytometry to clinical microbiology.</a> Clin Microbiol Rev. 13 (2), 167-195 (2000).</li>
<li>Mattanovich, D., Borth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+cell+sorting+in+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Applications of cell sorting in biotechnology.</a> Microb Cell Fact. 5 (12), (2006).</li>
<li>Aldahlawi, A. M., Elshal, M. F., Damiaiti, L. A., Damanhori, L. H., Bahlas, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+CD95+and+CCR7+expression+on+circulating+CD4%28%2B%29+lymphocytes+revealed+disparate+immunoregulatory+potentials+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Saudi+J+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Analysis of CD95 and CCR7 expression on circulating CD4(+) lymphocytes revealed disparate immunoregulatory potentials in systemic lupus erythematosus.</a> Saudi J Biol Sci. 23 (1), 101-107 (2016).</li>
<li>Cullender, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+immunity+interact+to+quench+microbiome+flagellar+motility+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive immunity interact to quench microbiome flagellar motility in the gut.</a> Cell Host Microbe. 14 (5), 571-581 (2013).</li>
<li>Fernandez, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+fluorescence-based+isolation+of+live+C.+elegans+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-throughput fluorescence-based isolation of live C. elegans larvae.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1502-1510 (2012).</li>
<li>Cai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC-SIGN+expression+on+podocytes+and+its+role+in+inflammatory+immune+response+of+lupus+nephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">DC-SIGN expression on podocytes and its role in inflammatory immune response of lupus nephritis.</a> Clin Exp Immunol. 183 (3), 317-325 (2016).</li>
<li>Blasius, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-surface+molecule+selectively+expressed+on+murine+natural+interferon-producing+cells+that+blocks+secretion+of+interferon-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A cell-surface molecule selectively expressed on murine natural interferon-producing cells that blocks secretion of interferon-alpha.</a> Blood. 103 (11), 4201-4206 (2004).</li>
<li>Welzel, G., Seitz, D., Schuster, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic-activated+cell+sorting+%28MCS%29+can+be+used+as+a+large-scale+method+for+establishing+zebrafish+neuronal+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Magnetic-activated cell sorting (MCS) can be used as a large-scale method for establishing zebrafish neuronal cell cultures.</a> Sci Rep. 5, 7959(2015).</li>
<li>Valli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-+and+magnetic-activated+cell+sorting+strategies+to+isolate+and+enrich+human+spermatogonial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">Fluorescence- and magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and enrich human spermatogonial stem cells.</a> Fertil Steril. 102 (2), 566-580 (2014).</li>
<li>Yamashiro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+change+of+cytokine-activated+neutrophils%3A+inflammatory+neutrophils+are+heterogeneous+and+enhance+adaptive+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses.</a> J Leukoc Biol. 69 (5), 698-704 (2001).</li>
<li>Apostolidis, S. A., Lieberman, L. A., Kis-Toth, K., Crispin, J. C., Tsokos, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dysregulation+of+cytokine+networks+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">The dysregulation of cytokine networks in systemic lupus erythematosus.</a> J Interferon Cytokine Res. 31 (10), 769-779 (2011).</li>
<li>Asselin-Paturel, C., Brizard, G., Pin, J. J., Briere, F., Trinchieri, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+strain+differences+in+plasmacytoid+dendritic+cell+frequency+and+function+revealed+by+a+novel+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse strain differences in plasmacytoid dendritic cell frequency and function revealed by a novel monoclonal antibody.</a> J Immunol. 171 (12), 6466-6477 (2003).</li>
<li>Liao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tacrolimus+Protects+Podocytes+from+Injury+in+Lupus+Nephritis+Partly+by+Stabilizing+the+Cytoskeleton+and+Inhibiting+Podocyte+Apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tacrolimus Protects Podocytes from Injury in Lupus Nephritis Partly by Stabilizing the Cytoskeleton and Inhibiting Podocyte Apoptosis.</a> PLoS One. 10 (7), e0132724(2015).</li>
</ol>

Yazarlar, bu makalenin yayınlanmasıyla ilgili herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Bu yazıda açıklanan protokol, IFNa üretme yeteneğini koruyan canlı pDC'nin yüksek saflıkta zenginleştirilmesi içindir. Bu protokolün uygulamaları, hücresel ve moleküler fonksiyon çalışmaları için MRL/lpr ve diğer fare suşlarının kemik iliğinden pDC ve/veya diğer mononükleer hücrelerin saflaştırılmasını içerir, ancak bunlarla sınırlı değildir. Bu protokoldeki birkaç kritik adım, sıralanan pDC'nin yüksek canlılığını ve saflığını sağlamaktır. İlk önemli adım, kemik iliğinin kemiklerden salınmasıdır. Kemik iliği hücrelerine ...

Seçilen bir hücre popülasyonunun diğer hücrelerden verimli bir şekilde ayrılması, başka türlü mümkün olmayabilecek popülasyonun incelenmesini sağlar. Floresanla aktive edilen hücre sınıflandırma (FACS), ilginç bir hücre popülasyonunu yüksek saflıkta zenginleştirmek için bir yöntemdir. 1,2 Farklı hücre tipleri genellikle, bir hücre popülasyonunu diğerinden ayırt edebilen plazma zarı üzerindeki benzersiz molekülleri veya birkaç molekülün benzersiz bir kombinasyonunu ifade eder. Bu hücre yüzeyi moleküllerinin spesifik floresan konjuge antikorlar tarafından bağlanması üzerine, akış sitometresi / sıralayıcı adı verilen bir tespit makinesi, tek hücre düzeyinde hücreler üzerinde farklı molekül belirteçlerini temsil eden farklı floresan boyaların ışık sinyallerini uyarabilir ve tespit edebilir. Bir ışık sinyalinin varlığından (karşılık gelen yüzey molekülünün pozitif ifadesini temsil eden) veya bir ışık sinyalinin yokluğundan (bir molekülün negatif ifadesini temsil eden) oluşan birleşik bilgi, hücrenin fenotipini tanımlar. Dedektörden geçtikten sonra, aynı fenotipe sahip hücreler, elektrik yüküne dayalı olarak belirlenmiş bir toplama tüpüne yönlendirilir.
FACS, zenginleştirilecek popülasyon floresan ile etiketlendiği sürece çeşitli çalışmalarda yaygın olarak uygulanmaktadır. 3-7 Bağırsak mikrobiyotası 8'deki immünoglobulin (Ig)A kaplı bakterileri IgA kaplı olmayan bakterilerden ayırmak ve floresan proteinleri eksprese eden genetik olarak tasarlanmış hücre popülasyonlarını sıralamak için kullanılmıştır. 9 Daha da önemlisi, aynı anda birden fazla popülasyonu ayırma kapasitesine sahiptir, bu da yalnızca zamandan ve reaktiflerden tasarruf sağlamakla kalmaz, aynı zamanda daha karmaşık çalışma tasarımlarına da olanak tanır. 10 Bununla birlikte, FACS'ın da sınırlamaları vardır. İlgilenilen bir popülasyon çok nadirse (%1'den az), sıralama verimliliği azalabilir ve bu da önemli hücre kaybına neden olabilir. Ek olarak, bazı antikor bağlanması, sıralanan hücre popülasyonunun fonksiyonel değişikliklerini indükleyen hücre içi sinyal iletimini aktive edebilir. 11 Bu nedenle, sıralama için kullanılan fenotip dikkatli bir şekilde seçilmelidir. 
FACS'ın yanı sıra, manyetik olarak aktive edilmiş hücre sıralama (MCS) gibi belirli hücre popülasyonlarının zenginleştirilmesi için hücre yüzeyi belirteçlerine dayanan başka yöntemler de mevcuttur. 12 FACS'a benzer şekilde, manyetik boncuklarla konjuge antikorlar spesifik hücre yüzeyi moleküllerini hedefleyebilir. Antikor-antijen etkileşimi üzerine, manyetik boncuk kaplı hücreler, manyetik bir alandan geçtikten sonra kaplanmamış hücrelerden ayrılabilir. Bununla birlikte, manyetik boncuklar, FACS'taki çeşitli floresan renklerinin aksine ayırt edilemez olduğundan, MCS'de yalnızca sınırlı sayıda molekül hedeflenebilir. Bu nedenle, MCS'nin karmaşık bir yüzey işaretleyici kombinasyonu ile bir hücre fenotipini tanımlaması zordur. 13,14 Ek olarak, MCS ayrıca hedef hücrelerin istenmeyen aktivasyonuna neden olabilir.
Sistemik lupus eritematozus (SLE), 15'in bir fare modeli üzerinde yaptığımız çalışmalarda, plazmositoid dendritik hücreleri (pDC) saflaştırmayı ve hastalığın ilerlemesi ile fonksiyonel değişikliklerini araştırmayı amaçladık. İlk olarak, kararlı durumda murin pDC'sinde yüksek ve benzersiz bir şekilde ifade edilen bir molekül olan PDCA-1'i hedefleyerek kemik iliğinden pDC'yi zenginleştirmek için MCS'yi kullandık. 16 Bununla birlikte, hücre saflığı, muhtemelen SLE gibi enflamatuar bir ortamda PDCA-1'in diğer hücre popülasyonları üzerindeki yukarı regülasyonu nedeniyle beklenmedik bir şekilde düşüktü. 16 Sonuç olarak, yüksek saflıkta pDC'yi CD11c+CD11b-B220+PDCA-1+ popülasyonu olarak ayırmak için dört yüzey işaretleyicisinin (CD11c, CD11b, B220 ve PDCA-1) bir kombinasyonu ile FACS'yi kullandık. Murin pDC'nin başka bir spesifik yüzey işaretleyicisi vardır: Siglec-H. Siglec-H'yi kullanmamaya karar verdik, çünkü bu molekülün antikor bağlanması, pDC'nin IFNa üretme işlevini baskılar. 11

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>yaşam teknolojileri tarafından gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>HyClone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr>Yaşam teknolojileri tarafından<td>sodyum piruvat</td><td>gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>MEM esansiyel olmayan amino asitler</td><td>yaşam teknolojileri tarafından gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td></td><td>HEPES yaşam teknolojileri tarafından gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin &</td><td>yaşam teknolojileri tarafından gibco</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>penisilin-Streptomisin</td><td>yaşam teknolojileri tarafından gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>1x Hank' s Dengeli Tuz Çözeltisi&nbsp;</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14175-079</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA Stok Çözümü</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>SIGMA</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>SIGMA</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>Kırmızı kan hücresi (RBC) lizis tamponu&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>00-4300-54</td><td></td></tr><tr><td>Yoğunluk gradyan ortamı</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>Ficoll-Paque Plus&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-fare CD19-PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>553786</td><td></td></tr><tr><td>anti-fare CD11c-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0114-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-fare CD11b-APC-CY7</td><td>BD Pharmingen</td><td>557657</td><td></td></tr><tr><td>anti-fare PDCA-1-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-3172-81</td><td></td></tr><tr><td>anti-fare B220-V500&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>561226</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Plazmasitoid Dendritik Hücre İzolasyon Kiti II, fare</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-786</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria I akış sitometresi&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>643178</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Diva versiyon 6</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS), akış sitometrisi ile tespit edilen fenotiplere dayalı olarak belirli hücre popülasyonlarını saflaştırmak için kullanılan bir tekniktir. Bu yöntem, araştırmacıların diğer hücrelerin etkisi olmadan tek bir hücre popülasyonunun özelliklerini daha iyi anlamalarını sağlar. Manyetik ile aktive edilmiş hücre sıralama (MCS) gibi diğer hücre zenginleştirme yöntemleriyle karşılaştırıldığında, FACS, akış sitometrisi ile fenotip tespit etme yeteneği nedeniyle hücre ayırma için daha esnek ve doğrudur. Ek olarak, FACS genellikle birden fazla hücre popülasyonunu aynı anda ayırma yeteneğine sahiptir, bu da deneylerin verimliliğini ve çeşitliliğini artırır. FACS'ın bazı sınırlamaları olmasına rağmen, hem in vitro hem de in vivo ortamlarda fonksiyonel çalışmalar için hücreleri saflaştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, pDC'nin in vitro fonksiyonel çalışmaları için lupus eğilimli farelerin kemik iliğinden yüksek saflıkta çok nadir bir bağışıklık hücresi popülasyonu olan plazmositoid dendritik hücreleri (pDC) izole etmek için floresanla aktive edilen hücre sınıflandırmasını kullanan bir protokol sunuyoruz.

Biz yüksek saflıkta kemik iliği PDC zenginleştirmek amaçladık ve IFNa üretme kabiliyetleri konusunda pDC fonksiyonel değişiklikleri incelemek için genç ve yaşlılık hem MRL / lpr lupus eğilimli farelerin diğer hücre türleri etkisi olmadan. Kullanılan ilk arıtma stratejisi Şekil 1&#39;de görüldüğü gibi zenginleştirme sonra sadece% 7,75 saflıkta yol açtı, MCS, oldu. MCS ile karşılaştırıldığında, FACS% 96.4 gibi yüksek saflıkta PDC zenginleştirilmiş. Yüksek saflık sağlamak i...

Biz pDC fonksiyonel çalışmalar için, lupus-eğilimli farelerin kemik iliğinden, yüksek saflıkta plazmasitoid dendritik hücreleri (PDC) izole etmek için sıralama floresans ile aktive edilmiş hücre kullanarak bir protokol sunulmuştur.

Fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri Saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Bu deneyin genel amacı, fonksiyonlarını incelemek üzere lupus eğilimli farelerin kemik iliğinden yüksek saflıkta plazmasitoid dendritik hücreleri (PDC) izole etmektir. Bu yöntem, lupus gelişiminin geç evresindeki interferon alfa üreten PDC'ler gibi belirli bir bağışıklık hücresi popülasyonunun özelliklerine ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bir veya birkaç hedef popülasyonun, manyetik boncukla ayırmaya göre daha yüksek bir saflıkta zenginleştirilebilmesidir.Hasat işleminden sonra, arka bacak kemiklerini ve dört mililitre tam besiyerini bir havana aktarın. Toplam hacmi 10 mililitreye tamamlamak için altı mililitre taze tam besiyeri ekleyin. Ardından kemikleri bir havan eliyle nazikçe kırın.Kemik iliğini serbest bırakmak için havan eliyle nazikçe karıştırın. Ardından, ortamın tamamını 70 µm'lik bir süzgeçten geçirerek buz üzerindeki 50 mL'lik konik tüpe aktarın. Havana 10 mL taze komple ortam ekleyin.Kemikler beyaz görünene kadar süpernatantı iki kez daha filtreleyin. Ardından, kemik iliği hücrelerini santrifüjleyin ve peleti 10 milliliters taze komple ortamda yeniden süspanse edin. Sonrasında, katmanları bozmamaya dikkat ederek hüc

fluorescence-activated-cell-sorting-for-purification-plasmacytoid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Hücrelerin hücre popülasyonlarının bir biyolojik ve kimyasal analiz gerektiren pek çok bilimsel çalışmalar için saflık yüksek bir devlet olmalıdır. Floresan aktive edilmiş hücre sıralama (FACS), saf hücre popülasyonlarının elde etmek için üstün bir yöntemdir.

Floresan Aktive Hücre Ayırma (FACS) Özgül Hücre Nüfus Arıtma

Fare akciğer dendritik hücreler yüksek oranda saflaştırılmış açıklanmıştır. Özgül ağırlık, geleneksel dendritik hücre alt izolasyon verilir.

Fare Akciğer Dendritik Hücrelerinin İzolasyonu

Bu myeloid türevi bastırıcı hücreler (MDSC) işaretleyicidir ve Gr-1 zenginleştirmek için hızlı ve kapsamlı bir...

Akım Sitometri ve Otomatik Manyetik Aktif Hücre Sıralama (AutoMACS) kullanarak Naive ve Pankreas Tümör taşıyan fareler ile myeloid türevi bastırıcı hücreler (MDSC) hazırlanması

Burada, fare intestinal dendritik hücrelerinin (DC'ler) ve makrofajların hızlı izolasyonu için bir metodolojiyi detaylandırıyoruz. İntestinal DC'lerin ve makrofajların fenotipik karakterizasyonu çok renkli akış sitometrik analiz kullanılarak gerçekleştirilirken, fonksiyonel çalışmalar için yüksek saflıkta popülasyonlar elde etmek amacıyla manyetik boncuk zenginleştirmesi ve ardından hücre ayıklama yöntemi kullanılır.

Fare Barsak ayrı dendritik hücreler ve makrofajlar İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Bu videoda, yaygın lenfoid progenitör hücrelerden (CLP'ler) plazmositoid dendritik hücreler (pDC'ler) oluşturmak için bir in vitro test gösterilmektedir. Saflaştırılmış CLP'lerin Fms benzeri tirozin kinaz-3 ligandı (FL) varlığında γ ışınlanmış besleyici hücrelerle birlikte kültürlenmesi üzerine, CLP'ler, varlığı akış sitometrisi kullanılarak doğrulanan yapışmayan pDC'lere farklılaşır.

Ortak Lenfoid Progenitörlerden Plazmasitoid Dendritik Hücrelerin İn Vitro Üretimi

Bu protokol, FACS-aracılı hücre izolasyon hidrodinamik gen transferi, ve Peyer yama bağışıklık alt-akışı analizi içeren teknikleri kullanarak, ortak bir dendritik hücre progenitörlerinden Peyer yama plazmasitoid dendritik hücrelerin farklılaşmasını değerlendirmek için deneysel prosedürler açıklanmaktadır.

Hematopoetik progenitörlerin Evlatlık Transferi kullanarak Peter Parçacıklannda Murin plazmasitoid dendritik hücreleri Gelişimini değerlendirilmesi

Bu çalışmada, Flt3 ligandı varlığında ortak lenfoid progenitörleri AC-6 besleyici hücrelerle birlikte kültürleyerek verimli bir şekilde pDC üretebilen bir in vitro kültür sistemi sunuyoruz.

AC-6 Besleyici Sistemi kullanılarak Ortak Lenfoid progenitörlerin dan Fare plazmositoid dendritik hücreler İn Vitro Nesil

Farklı dendritik hücre alt kümeleri, lenfoid organlarda nadir popülasyonlar olarak bulunur ve bu nedenle immünolojik deneyler için yeterli sayıda ve saflıkta izole edilmesi zordur. Burada, fare splenik dendritik hücrelerinin şu anda bilinen tüm ana alt kümelerinin izolasyonu için yüksek verimli, yüksek verimli bir yöntem açıklıyoruz.

Fare Dendritik Hücre Alt Grupları İzolasyonunda bir Verimli ve Yüksek Verim Yöntem

Lenfositler, adaptif immün yanıtlarda ana oyunculardır. Burada, in vitro ve in vivo lenfosit aktivasyonunda istenen moleküllerin fizyolojik fonksiyonlarını belirlemek için bir lenfosit saflaştırma protokolü sunuyoruz. Açıklanan deneysel prosedürler, kontrol ve genetik olarak değiştirilmiş lenfositler arasındaki fonksiyonel kapasiteleri karşılaştırmak için uygundur.

İzolasyon ve murin lenfositlerin aktivasyonu

Burada, 10 ng / mL GM-CSF / IL-4 ile 7 günlük kültürden sonra farelerden yüksek saflıkta kemik iliği kaynaklı dendritik hücreleri izole etmek ve üretmek için ekonomik ve etkili bir yöntem sunuyoruz.

Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücrelerin Farelerden İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi için Ekonomik ve Verimli Protokol

Tek hücreli/tek çekirdekli transkriptomiklerin ve multi-omiklerin başarısı büyük ölçüde hücrelerin/çekirdeklerin kalitesine bağlıdır. Bu nedenle, hücrelerin/çekirdeklerin dokudan izole edilmesi ve saflaştırılması yüksek düzeyde standartlaştırılmalıdır. Bu protokol, aşağı akış tek çekirdekli multiom testi için beyin ve kemik iliğinden çekirdeklerin hazırlanmasını açıklar.

Tek Çekirdekli Multiom Tahlilleri için Yüksek Kaliteli Beyin ve Kemik İliği Çekirdeği Hazırlığı

Öğrenin, lupus eğilimli farelerin kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma kullanarak yüksek saflıkta izole etmeyi. Bu yöntem, interferon alfa üreten hücrelerin fonksiyonel özelliklerini incelemek için araştırmacılara yardımcı olur.

Fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri Saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma

Daha fazla video keşfet