Fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri Saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma

Bu deneyin genel amacı, işlevlerinin incelenmesi için lupus eğilimli farelerin kemik iliğinden yüksek saflıkta plazmositoid dendritik hücreleri veya PDC'yi izole etmektir. Bu yöntem, lupus gelişiminin geç evresinde interferon alfa üreten PDC gibi belirli bir bağışıklık hücresi popülasyonunun özellikleriyle ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, bir ila birkaç hedef popülasyonun manyetik boncuk ayıklamadan daha yüksek bir saflıkta zenginleştirilebilmesidir.

Hasattan sonra, arka bacak kemiklerini ve dört mililitre tam ortamı bir havan içine aktarın. Toplam hacmi 10 mililitreye çıkarmak için altı mililitre taze tam ortam ekleyin. Ve kemikleri bir havaneli ile nazikçe kırın.

Kemik iliğini serbest bırakmak için havaneli hafifçe karıştırın. Ardından, tüm ortamı 70 mikronluk bir süzgeçten geçirerek buz üzerinde 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Harca 10 mililitre taze tam orta ekleyin.

Ve süpernatanı kemikler beyaz görünene kadar iki kez daha süzün. Daha sonra, kemik iliği hücrelerini santrifüjleyin ve peleti 10 mililitre taze tam ortamda yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpte beş mililitre taze hazırlanmış yoğunluk gradyan ortamına yerleştirin ve katmanları bozmamaya dikkat edin.

Ve hücreleri santrifüjleme ile ayırın. Ardından, çözeltinin en üstteki sekiz mililitresini dikkatlice çıkarın ve iki mililitrelik buffy kaplamayı interfazda toplayın. İzole edilmiş mononükleer hücrelere 12 mililitre buz gibi soğuk tam ortam ekleyin ve ters çevirerek karıştırmak için tüpü kapatın.

Ardından, hücreleri santrifüjleme ile peletleyin. Hücreleri FACS'a boyamak için, onları dört santigrat derecede 100 mikrolitre CD1632FC bloke edici antikorda yeniden süspanse edin. 10 dakika sonra, hücreleri dört mililitre buz gibi soğuk ayırma tamponunda yıkayın ve hücreleri 100 mikrolitre uygun hücre yüzeyi boyama antikor kokteyli ile etiketleyin.

Karanlıkta dört santigrat derecede 15 dakika boyunca. Herhangi bir bağlanmamış floresan konjuge antikoru çıkarmak için hücreleri dört mililitre buz gibi soğuk ayırma tamponunda yıkayın. Ardından, peleti 500 mikrolitre FACS yükleme solüsyonunda yeniden süspanse edin ve numuneyi buz üzerindeki bir FACS tüpüne aktarın.

Kompanzasyon kontrollerini boyamak için, tüp başına 10 ila altıncı splenosit bir kez alikot edin. Hücreleri dört mililitre ayırma tamponu ile yıkayın ve peletleri 100 mikrolitre ayırma tamponunda yeniden süspanse edin. Daha sonra, ana hücre yüzeyi antikor kokteylinden uygun floresan konjuge antikoru karşılık gelen her bir kompanzasyon tüpüne ekleyin ve karıştırmak için tüpleri sallayın.

Karanlıkta 15 dakika sonra, dört santigrat derecede, tüm numuneleri ayırma tamponu ile yıkayın ve peletleri 500 mikrolitre buz gibi soğuk ayırma tamponunda yeniden askıya alın. 500 mikrolitre FACS yükleme çözeltisinde yeniden askıya alınan DAPI tüpü hariç. Floresanla aktive edilmiş hücre ayırma ile hedef hücre popülasyonunu saflaştırmak için, ayırma valflerinin altına antibiyotiklerle desteklenmiş 500 mikrolitre FBS içeren toplama tüplerini yükleyin.

Ardından, boyanmamış tüpü yükleyin ve her floresan yoğunluğu için negatif kapıyı ayarlamak için 10.000 olay toplayın. Ve her floresan yoğunluğu için pozitif kapıyı ayarlamak için tek leke kompanzasyon tüplerinde 10.000 olay. Sıralanmış hücre popülasyonunun kapılarını ayarlamak için deneysel örnekten 3.000 olay toplayın.

Hedef hücre popülasyonunu manuel olarak geçit etmek için X ve Y erişim grafiğinin parametreleri olarak floresan yoğunluklarını kullanma. Ardından, hedef hücre popülasyonunu toplama tüpüne sıralayın. Sıralamanın sonunda, hücrelere dört mililitreye kadar buz kömürü tam ortamı ekleyin.

Daha sonra, tüpü kapatın ve hücreleri ters çevirerek karıştırın. Saflaştırılmış hücreleri, süpernatantın son 200 mikrolitresi hariç hepsini aspire ederek santrifüjleme ile peletleyin. Daha sonra, peleti bir mililitre buz gibi soğuk tam ortamda yeniden süspanse edin ve hücreleri ikinci bir santrifüjleme için 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Son olarak, süpernatantın son 100 mikrolitresi hariç hepsini aspire edin ve sıralanan hücre popülasyonunu kullanıma kadar buz üzerinde saklayın. Lupus eğilimli farelerden kemik iliği plazmasitoid dendritik hücrelerin manyetik olarak aktive edilmiş hücre sınıflandırması, zenginleştirmeden sonra sadece% 7.75'lik bir saflık ile sonuçlanır. Bununla birlikte, FACS'tan zenginleştirilmiş plazmositoid dendritik hücreler, sıralama sonrası %96.4 kadar yüksek bir saflık gösterir.

Yüksek saflık sağlamak için, mononükleer kemik iliği hücreleri önce kapılanır ve ileri ve yan saçılma parametreleri ile döküntülerden ayrılır. İleri saçılma genişliğine karşı ileri saçılma yüksekliği ve yan saçılma genişliğine karşı yan saçılma yüksekliği kullanılarak, agregalar tarafından üretilen yanlış pozitif sinyalleri önlemek için tek hücreler daha fazla geçitlenir. Canlı tek DAPI negatif hücreler daha sonra CD11c pozitif, CD11B negatif hücre yüzey ekspresyonu ile kapılanır ve B220 pozitif, PDCA-1 pozitif hedef kemik iliği plazmositoid dendritik hücre popülasyonunun daha fazla kapılanmasına izin verir.

Sıralanmış PDC popülasyonu sadece yüksek saflıkta değil, aynı zamanda in vitro CPG stimülasyonu üzerine IFNalfa üretme yeteneği ile fonksiyonel olarak normaldir. Bu prosedürü denerken, hücre canlılığını korumak için kemikleri kırmayı ve salınan kemik iliğini hafifçe karıştırmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, zenginleştirilmiş hücre popülasyonlarının gen ekspresyonu veya işlevi hakkında ek soruları yanıtlamak için RNA dizilimi veya in vitro kültür ve stimülasyon gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, PDC araştırmacılarının bu güçlü hücrenin lupus ve lupus eğilimli fare modellerinin geliştirilmesindeki rolünü keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, lupus eğilimli farelerin kemik iliğinden yüksek oranda saflaştırılmış bir PDC popülasyonunun nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız.