Name: Brillouin Spektroskopisi için Ekstraselüler Matriks Proteini Elyaf Hazırlama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Öğrenin, Brillouin spektroskopisi için ekstraselüler matriks kollajen ve elastin liflerinin hazırlama yöntemini. Bu protokol, biyomalzemelerin mikro-mekanik özelliklerini kırılma indisi bilgisi olmadan tam olarak belirlemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Mühendislik ve Fizik Bilimleri Araştırma Konseyi [hibe numarası EP/M028739/1] tarafından desteklenmiştir. RSE, 2015 Santander Lisansüstü Araştırma Ödülü tarafından desteklenmiştir.

Dikkat: Biyolojik güvenlik protokolleri ve kullanılmadan önce ilgili tüm malzeme güvenlik bilgi formlarını (MSDS) danışın. Bu deneylerde kullanılan lazer sınıfı 3B lazer olduğu; Sistemin güvenli bir kullanım için yerel kurallara uyulması gereklidir. kişisel koruyucu ekipman (koruyucu gözlük) kullanımı da dahil olmak üzere lazer spektroskopisi ölçümü yaparken tüm uygun güvenlik uygulamalarını kullanın. Kuyruk tendonlar AB düzenlemelerine 1099/2009 uyarınca ve Hayvanların Refahı (kesim veya öldürme) 1995 Sığır ense ligament yerel bir mezbahaya elde edilen Yönetmelikte başka amaçlar için ötenazi 7-8 haftalık Wistar sıçanların elde edilmiştir. Örnek Elyaf hazırlanması 1. Not: hücre dışı matrisin protein liflerin farklı prosedürler kullanılarak, çeşitli dokulardan elde edilebilir. Protokoller yaygın uygulanan prosedürlere dayanan rafine edildi. <ol><li><strosıçan kuyruğu kolajen liflerinin ng&gt; Ekstraksiyon <ol><li> Vücut ağırlığı, sodyum pentobarbıton 100 mg / kg intraperitonal enjeksiyon ile bir sıçan Kurban. Sonra tek kenar jilet ile bastırarak, vücut ile temas noktasında doğrudan kuyruk sever. ince film kuyruk sarın ve gerekene kadar -20 ° C&#39;de dondurulur saklayın. </li><li> Dondurucu kuyruk toplamak yine oda sıcaklığında fosfat tamponlu serum fizyolojik (PBS) çözeltisi (pH 7.4) ile doldurulmuş bir petri tabağına çözülme bırakın, sonra dondurulmuş ve iken yakın ucundan 20 mm uzunluğunda bir bölümü kesilmiş. </li><li> kuyruk çözülmüş sonra, cildi bölmek için bir neşter kullanılarak segmentin uzunluğu boyunca bir kesi yapmak. Sonra kuyruk omur dört kılıflı tendon demetleri ortaya çıkarmak için geri soyma. </li><li> Ince forseps kullanarak ve herhangi bir ön gerginlik uygulamak için dikkatli olmak, pr yavaşça kılıf dışına her lif çekmek ve v sodyum asid w /% 0.01 ile distile su içeren bir şişede (NaN 3) için koyunolay bakteriyel büyüme ve mağaza buzdolabında. Tek bir kuyruk etrafında otuz tendon lifleri verir. </li><li> I kolajen saf lifli türü elde etmek için, proteoglikanlar ve diğer tüm nonkollagenöz malzemeyi çıkarmak için tendon liflerine üç bölüm enzimatik sindirim sürecini 10 uygulanır. <ol><li> Önce, 200 rpm&#39;de bir çalkalama inkübatöründe 37 ° C&#39;de 24 saat süre ile, pH 8.0, 0.05 M Tris-tamponu, 0.06 M sodyum asetat (CH3 COONa) 0,125 U / ml kondroitinaz ABC lifleri bırakın. </li><li> Daha sonra, pH 6.0&#39;da 0.05 M Tris tamponu, 0.15 M sodyum klorür (NaCI) &#39;de 1 U / ml streptomis hyaluronidaz lifleri sokmak ve 37 ° C&#39;de 24 saat boyunca çalkalama inkübatöründe dönün. </li><li> Son olarak, 37 ° C&#39;de çalkalama inkübatöründe 16 saat pH 7.2&#39;de 0.05 M sodyum fosfat (NaHPO 4) ve 0.15 M NaCl tripsin, 1 mg / ml lifleri bırakın. </li></ol></li><li> damıtılmış su ihtiva eden viyaller içinde soğutulmuş saflaştırılmış elyafı depolayacaktır wiÖlçüm için gerekene kadar inci% 0.01 NaN3 bakteriyel büyümeyi önlemek için. </li></ol></li><li> Sığır ense ligament gelen elastin liflerin Ekstraksiyon <ol><li> , Mezbahaya sığır ense ligament elde sarılmak film sarın ve kullanılana kadar -20 ° C&#39;de dondurulmuş saklayın. </li><li> Saf elastin üretmek için, dondurucu bağ toplamak aşağıdaki gibi, Lansing edilen prosedüre göre bir kaynar su banyosu içinde 11 bağ, oda sıcaklığında çözülme bir neşter kullanarak bozabilir ve sindirimi için izin verir. <ol><li> damıtılmış su içinde bir sodyum hidroksit (NaOH) içindeki bir 0.1 M çözelti hazırlayın ve dokuları kapsayan konik bir şişe içinde yağdan arındırılmış bağ ekleyin. </li><li> 45 dakika boyunca 95 ° C&#39;de bir su banyosu içinde balon kaynatın. </li><li> sindirim şişesi ligament çıkarın ve pH 7.0 (pH metre kullanılarak izlenmiştir) elde edilinceye kadar damıtılmış su içinde sürekli olarak çözünmeyen doku bloğu yıkayın. </li><li> Nihai doku kaldırmakçözelti yıkama ve kapalı bir kap içinde (bakteri büyümesini önlemek için,% 0.01 NaN3 ile karışık) ve buzdolabında saklayın damıtılmış su içinde daldırın. </li></ol></li><li> Buzdolabından doku toplamak ve daha büyük blok (uzun 20 50 mm, yaklaşık 2 mm kalınlığında) uzakta hafifçe daha küçük elastin kesimleri çekmek için çok fazla kuvvet ve ön gerginlik, kullanım cımbız uygulamak için dikkatli olmak ve koyun PBS çözeltisi (pH 7.4) içeren bir Petri kabı. </li><li> Ince forseps kullanarak, yavaşça 1 mm kalınlığında çevresinde küçük lif demetleri alay ve bir neşter kullanılarak birkaç mm uzunlukta kesin. </li><li> (Bakteri büyümesini önlemek,% 0.01 NaN3) ile ve ölçüm için gerekli kadar bunları buzdolabında saklayın damıtılmış su ihtiva eden şişelere lifleri aktarın. </li></ol></li><li> Yansıtıcı tabaka üzerine lifleri Montaj <ol><li> Bir elmas kesici kullanılarak, yansıtıcı silikon slayt bir parça kesti. </li><li> Bir hidratlanmış compartme oluşturmak içinnt, (bir elyafın sığacağı kadar geniş) merkezinde içi boş bir kesim ile silikon slayt üzerinde uygun ve silikon alt-tabaka üzerine yerleştirmek için Parafilm bir şerit kesilir. Not: Adım 1.3.4 mühürlü, dört tarafın bir havaya açık kalır, böylece kuru elyaf ölçümler için, U-biçimli bir parafilm kesilir. </li><li> Depolama çözeltisinden tek bir lifin toplamak ve örnek yıkamak için 5 dakika boyunca oda sıcaklığında saf su dolu küçük bir Petri tabağına yerleştirin ince forseps bir çift kullanımı, buzdolabı lifleri çıkarın. Sonra, lif toplamak ve silikon tabaka üzerinde parafilm oyuk merkezine transfer. Dikkatli: Bu işlem sırasında gererek lif zarar kaçının ve bu mekanik özelliklerinde bir değişiklik neden olabileceğinden tabaka üzerinde örnek yeni bir yön kaçının. </li><li> fiber üzerinden ince bir cam lamel yerleştirin ve altındaki parafilm eritmek için cam yüzey üzerinde hafifçe ısıtılmış havyaya geçirerek odasına mühürcam. Dikkatli: çok yakın lehim ucu getiren veya aşırı substrat ısıtma vermeyerek lif zarar kaçının. </li><li> Küçük bir ağırlığı altında düz bir yüzeye mühürlü odasına yerleştirin ve numuneye zarar kaçınarak numune ve silikon substrat arasında iyi bir temas sağlamak için yaklaşık 12 saat boyunca bekletin. </li><li> vidaları kullanarak, ağırlık kaldırmak ve alt tabaka üzerinde yerinde odasının sabitleyin. </li></ol></li></ol> 2. Brillouin Deney kurma ve Fiber Spectra Edinme <ol><li> Numune kompartımanı hazırlanması <ol><li> Ve hacim konumunu saçılması (Şekil SI-1&#39;e bakınız 2 Φ = 90 °) sabit bir saçılma açısı korurken örnek düzlem döndürme etkinleştirmek için bir gonyometre ile donatılmış dikey bir tutucu üzerine bir parçası 1.3 olarak hazırlanan örnek monte edin. </li><li> le ile örnek lazer ışığı doğru bir odak ayarlaması gerçekleştirmekns. 9 Dikkatli: Lazer çıkış gücü çok yüksek olabilir ve örnek bir yanık üretebilir. örneğe zarar vermemek için çok yüksek iyi bir hassasiyet verecek şekilde yeterince yüksek ayarlanmış değil emin olun. İşte örnek üzerinde yaklaşık 76 mW gücünde kullanılır. Bu husus, bu ince ve lazer yanması ile üretilen ısıyı yardımcı olan bir alt-tabaka ile temas içinde olduğu dikkate alındığında, örnek yanma olmadan iyi bir duyarlılık elde etmek için yeterli olmuştur. </li><li> Bir Vernier ölçeğini kullanarak olay lazer ışınına 45 ° açı (Φ) de örnek yerleştirin. bir ölçüm çalışan ve (aşağıya bakınız) spektrumunda piklerin yoğunluğu maksimize ederek en uygun konumlandırma elde edin. </li></ol></li><li> Spektrometre kurma <ol><li> Edinimi ve verilerin manipülasyonu için yazılımı açın ve örnek 12 bir Brillouin spektrumunun satın kurdu. Burada açıklanan prosedür mu geçerlidirltipass tandem interferometre (Şekil SI-1A). </li><li> bağımsız kontrol ünitesi tarafından piezo uygulanan gerilimleri değişen iki Fabry-Perot (FP) interferometreleri hizalayın. Bu ön-hizalama işlemi için, her FP tarafından yansıyan ışık görüyoruz. İki hekimleri tarafından yansıtılan yoğunluğu sıfır eğilimi, doğru hizalama ulaşılır. </li><li> Tayfı kalibre: erişilebilir frekans aralığı ya da serbest spektral aralığının (FSR), iki adet birinci AP boşluğun aynalar, L, FSR = C / 2 L&#39;lik, c, ışığın hızı ile arasındaki uzaklığa bağlı olduğu, L dial-ölçü ile ölçülür. </li><li> İki FP interferometreler taramalarını senkronize etmek ve tandem multipass konfigürasyonuna optik sistemini açmak. iletilen lazer ışık yoğunluğu bir geri besleme kontrolü otomatik olarak ölçüm sırasında iki FP hizalanmasını koruyacaktır. </li></ol></li><li> Ölçüm of Brillouin Spectra Dikkatli: Brillouin spektrum numune ve bu parametrelerin çok dikkatli kontrol sıcaklık ve hidrasyon son derece bağlıdır tekrarlanabilir spektrumları elde anahtarıdır. <ol><li> numunenin bir Brillouin spektrumu kazanılmasını başlatın ve iyi bir sinyal-gürültü oranı elde edilene kadar çalıştırın. Bu numunenin saçılma tesir kesiti, konsantrasyon ve kalınlığına bağlı olarak birkaç dakika sürebilir. NOT: Orada işaret-gürültü oranı için pratik kural değil ama spektral kalite analiz belirli örneğe dayalı deneye tarafından kontrol edilir. spektral kalite ve ölçüm süresi arasında bir trade-off, bu nedenle deneysel parametreler belirli uygulamaya göre seçilmesi gerekir vardır. </li><li> kuru numune ölçümü için, birbirini izleyen spektrumları alır - her biri için, aşama 2.3.1 şu - tepe noktalarının konumu kadar olan herhangi bir değişiklik Is görülmektedir. Numune oda atmosferi ile dengede olduğu ve daha fazla kurutma spektrumu etkiler, bu başarılır. </li><li> (V saçılma düzlemine ışık polarizasyon göreceli yatay yönde dikey ve H açılımı VV veya VH) ve lif eksenine her açıda spektrumları elde ışık polarizasyonu seçiniz (Î¸ Şekil SI-1) örneği de çevirerek elle düzlem. </li><li> sonraki işlemler için dosya Brillouin spektrumları kaydedin. </li></ol></li></ol> Brillouin Spectra 3. Analizi NOT: Brillouin zirveleri Fit analizi çeşitli fonksiyonları kullanılarak yapılabilir. Bu viskoelastik medyada sönümlü akustik modları kaynaklanan zirveleri için geçerli bir model olarak bir sönümlü harmonik osilatör (DHO) işlevi 4,13 seçildi. <ol><li> Brillouin zirveleri Fit analizi <ol><li> inci ilgi zirve için spektral aralığı seçine Brillouin spektrum. </li><li> spektral arka plan sıfırdan çok daha yüksek olması durumunda uyum içinde bir temel etkinleştirin. NOT: Bazal spektrumları arasında değişebilir. Düzeltme sistematik ve tekrarlanabilir bir şekilde tatbik olduğundan emin olun. </li><li> Yakınsama elde edilir ve en iyi eğri uydurma elde iteratif kadar ilgi Brillouin zirvesine bir DHO işlevi 4,13 kullanarak uydurma detaylı en küçük kareler uygulayın. Ardından, dosyaya uygun sonuçları kaydedin. </li><li> Her Brillouin ikilisinin iki doruklarına uyum parametrelerinden ortalama değerler elde. </li><li> tepe frekansı akustik dalga hızını hesaplayın (aşağıda ifadesini kullanarak). </li><li> Θ grafikler, örneğin, lif eksenine açısı vs akustik dalga hızı aracılığıyla uygun sonuçlar çizilir Ve bu elastikiyet tensör katsayıları gibi mekanik miktarlarda ayıklamak için (9 akustik anizotropik sistemler için, örneğin) ilgili modeller uygulamak. </li></ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Brillouin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+de+la+lumi%C3%A8re+et+des+rayonnes+X+par+un+corps+transparent+homog%C3%A8ne%3B+influence+de+l%27agitation+thermique%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Phys%22%5BJournal%5D)">Diffusion de la lumière et des rayonnes X par un corps transparent homogène; influence de l'agitation thermique.</a> Ann. Phys. 17, 88-122 (1922).</li>
<li>Caponi, S., Corezzi, S., Mattarelli, M., Fioretto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+effects+on+the+elastic+properties+of+amorphous+polymeric+materials%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Stress effects on the elastic properties of amorphous polymeric materials.</a> J. Chem. Phys. 141 (21), 214901(2014).</li>
<li>Mattarelli, M., Montagna, M., Still, T., Schneider, D., Fytas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibration+spectroscopy+of+weakly+interacting+mesoscopic+colloids%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Vibration spectroscopy of weakly interacting mesoscopic colloids.</a> Soft Matter. 8 (15), 4235-4243 (2012).</li>
<li>Comez, L., Masciovecchio, C., Monaco, G., Fioretto, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aComez%2C+L+%22Solid+State+Physics%22">Solid State Physics</a>. Robert, E. C., Robert, L. S. 63, Academic Press. 1-77 (2012).</li>
<li>Madami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+a+propagating+spin+wave+induced+by+spin-transfer+torque%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Direct observation of a propagating spin wave induced by spin-transfer torque.</a> Nat. Nanotechnol. 6 (10), 635-638 (2011).</li>
<li>Harley, R., James, D., Miller, A., White, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phonons+and+the+elastic+moduli+of+collagen+and+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phonons and the elastic moduli of collagen and muscle.</a> Nature. 267 (5608), 285-287 (1977).</li>
<li>Cusack, S., Miller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+elastic+constants+of+collagen+by+Brillouin+light+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Determination of the elastic constants of collagen by Brillouin light scattering.</a> J. Mol. Biol. 135 (1), 39-51 (1979).</li>
<li>Vaughan, J. M., Randall, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brillouin+scattering%2C+density+and+elastic+properties+of+the+lens+and+cornea+of+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Brillouin scattering, density and elastic properties of the lens and cornea of the eye.</a> Nature. 284 (5755), 489-491 (1980).</li>
<li>Palombo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanics+of+fibrous+proteins+of+the+extracellular+matrix+studied+by+Brillouin+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Biomechanics of fibrous proteins of the extracellular matrix studied by Brillouin scattering.</a> J. R. Soc. Interface. 11 (101), (2014).</li>
<li>Sivan, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+accumulation+of+pentosidine+in+aggrecan+and+collagen+from+normal+and+degenerate+human+intervertebral+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Age-related accumulation of pentosidine in aggrecan and collagen from normal and degenerate human intervertebral discs.</a> Biochem. J. 399 (1), 29-35 (2006).</li>
<li>Leon, W. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSoskel%2C+NT+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 144, Academic Press. 196-214 (1987).</li>
<li>Fioretto, D., Scarponi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+a+glassy+polymer+studied+by+Brillouin+light+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Mater.+Sci.+Eng.+A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of a glassy polymer studied by Brillouin light scattering.</a> Mater. Sci. Eng. A. 521-522, 243-246 (2009).</li>
<li>Palombo, F., Madami, M., Stone, N., Fioretto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+mapping+with+chemical+specificity+by+confocal+Brillouin+and+Raman+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Mechanical mapping with chemical specificity by confocal Brillouin and Raman microscopy.</a> Analyst. 139 (4), 729-733 (2014).</li>
<li>Scarcelli, G., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistage+VIPA+etalons+for+high-extinction+parallel+Brillouin+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Multistage VIPA etalons for high-extinction parallel Brillouin spectroscopy.</a> Opt. Express. 19 (11), 10913-10922 (2011).</li>
<li>Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Measurement+of+Age-Related+Stiffening+in+the+Crystalline+Lens+by+Brillouin+Optical+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">In Vivo Measurement of Age-Related Stiffening in the Crystalline Lens by Brillouin Optical Microscopy.</a> Biophys. J. 101 (6), 1539-1545 (2011).</li>
<li>Scarcelli, G., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Brillouin+optical+microscopy+of+the+human+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo Brillouin optical microscopy of the human eye.</a> Opt. Express. 20 (8), 9197-9202 (2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Brillouin saçılım spektroskopisi bir protein lif esnekliği tansörünün bileşenleri tek tek görülmemiş detaylı olarak karakterize edilebilir bir benzersiz bir araçtır. Ayrıca, ölçümler mikroskopik ölçekte yapılabilir ve böylece karmaşıklığı, önemi, mekanik ve muhtemelen işlevsel anlamak için, ilk defa, bize izin biyolojik yapıların mikro ölçekli mekaniği içine yeni anlayışlar bize verecektir matris mimarisi ve biyokimya son yıllarda açığa edildiği. teknik GHz frekans aralığında mekanik özelliklerini ölçer. Bu etki, yapısal Biyopolimerlere için daha önce araştırılmış olmamıştı ve her iki yükseltir ve elastikiyet moleküler mekanizmaları hakkında temel soruları yanıtlamak için araçlar sağlar. Biz hayvan dokularından kolajen ve elastin lifleri ayıklamak ve Brillouin scatteri ölçmek için adımlar tarifFiber biyomekanik tam açıklamasını elde etmek için bir yansıtıcı substrat kullanılarak ng spektrumları. protokolü içinde kritik adımlar saflaştırılmış lifler edilen ve uygun deneysel koşullar lifli proteinlerin tekrarlanabilir ölçümler için yerinde olmasını sağlamak olanlardır. Ancak, ekstraksiyon işlemleri liflerin mekanik özellikleri değiştirebilir akılda tutulmalıdır. Tekniğin Değişiklikler microfocused Brillouin saçılımı ve haritalama için optik mikroskop ile bağlantı 13 yaklaşır içerir ve tamamlayıcı teknikler ile mümkün kombinasyonu (örneğin, Raman saçılması). Tekniğin Güncel uygulamalar ağırlıklı olarak eksize biyolojik materyaller üzerinde duruldu, ancak önemli gelişmeler, örneğin, çoklu VIPA etalonu 14 dayananlar, zaten uygulamaları bir dizi iblis ile başucunda benchtop bu tekniğin çevirisini mümkün yapıyoruzin vivo uygulamalarında potansiyeli dahil 15,16 strated. VIPA yaklaşımı açıklamak ne bir alternatiftir; daha hızlı bir alma zamanına sahip ancak burada analiz gibi zorunlu opak örnekleri için uygun değildir. onların kontrast yarı-elastik ışık reddetmek için yeterli olmaz çünkü Ayrıca, bir yansıtıcı yüzeye kullanımı VIPA etalonları kullanmak set-up pratik değildir. Bir spektral veri kümesi ve malzeme doğal olarak zayıf saçılma kesit alımı hızına ilişkin sınırlamalar dinamik biyolojik sistemlere ve derin dokularda veri edinimi uygulamaları sınırlayabilir, ancak teknik iyileştirmeler mevcut performansı artırabilir. BLS ekstraselüler matriks üzerinde temel biyofizik araştırma önemli bir araç olmayı vaat ve böylece yeni matris büyüme sırasında mekanik özelliklerinin evriminin anlayışlar ve patolojik onların kaybı üretmek içindejenerasyon. Ancak, ölçümler invaziv olmayan ve bu nedenle in vivo üstlenilen olabileceğini hatırlamak önemlidir. Nitekim, bu zaten kornea 16 elde edilmiştir ve bu çalışma bağ dokusu hastalıklarının geniş bir yelpazede için yeni tanı araçlarının geliştirilmesi için bir platform sağlayabilir. Ultrason elastografi ve atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) mikromekanik ölçüm alternatif yöntemler vardır, ancak TYD tekniği, AFM aksine, eski ve daha (bir hücre içi ölçekte) daha iyi uzaysal çözünürlük sunuyor numune üzerinde hiçbir mekanik kuvvetleri dayatır ve sınırlı değildir sadece yüzey özelliklerinin analizi. makroskopik suşları Young modülü Mpa için (daha detaylı bilgi başka bir yerde rapor edilecektir) ait iken kolajen ve elastin Brillouin modülleri, GPa aralığında. Bu sonuca bağlı olarak, uyarım frekansı üzerinde güçlü bir bağımlılığı olan bir difransiyel esneklik katsayısı gösterirliflerin viskoelastik davranış. TYD biyomedikal sorunlar ve geniş bir malzeme yelpazesi uygulanabilir. Bu fizyoloji ve biyolojik dokuların patolojisi sorularını yanıtlayan yardımcı yanı sıra moleküler düzeyde malzeme ve etkileşimlerin temel olarak anlaşılması için fiziksel bir araç sağlayabilir.

Brillouin ışık saçılması (TYD) etkisi bir malzemede termal olarak aktive edilmiş akustik fononların görünür ışığın esnek olmayan saçılma oluşur 1922 yılında 1 Léon Brillouin tarafından keşfedilmiştir. Katı hal fiziği ise, akustik fononlar bir kafes içinde tüm atomların tutarlı titreşimler vardır. Bir kafes içinde atomların iki alternatif türlerinin tek boyutlu zincir IR absorpsiyon ve Raman saçılması (Şekil 1) probed BLS tarafından ortaya akustik fononların, ve optik fononların arasındaki farkı gösteren basit bir modeldir. Optik Fononlar atomların dışı faz hareketler iken akustik fononlar, (boyuna akustik fononlar) ya da yayılma yönüne (enine akustik fononlar) dik yayılma doğrultusu boyunca bir deplasman zinciri içindeki atom faz-hareketler salınımlı elektrik dipol momenti üreten (boyuna veya enine mod). BLS spectroskopi 1920&#39;lerden beri analitik bilim kullanılmıştır; Ancak, 1980&#39;lerde tek beri yüksek kontrast ölçümleri tandem multipass Fabry-Perot spektrometresi kullanımı ile mümkün. O zamandan beri, 2-4 ve manyetik malzemeler (foton-magnon etkileşimi yoluyla) (foton-fonon etkileşmesi istismar edilir) Yoğun madde analitik uygulamalar için TYD gelişmelerin giderek artan sayıda yaklaşık 5 getirilmiştir. Biyomedikal uygulamalarda 6-8 seminal eserler burada uygulanan bir ve esnekliği tansörünün tam açıklamasını ulaşmak için trombosit benzeri konfigürasyonda bir yansıtıcı substrat kullanılarak önceden 9 açıklanan dahil olmak üzere, çeşitli yaklaşımların geliştirilmesi rotayı açmıştır Bir örnek. Bu çalışmada, biz, lifli proteinler elastin bağ dokusunda hücre dışı matriks temel bileşenlerinin TYD spektroskopi uygulamak ve ben-kollajen yazın. TI kolajen ype örneğin tendon gibi dokularda, esas itibariyle katı lifler oluşturmak için kapsamlı çapraz bağlama ile yanal ve boylamsal olarak monte sert, üçlü sarmal bir moleküldür. kollajen ağları genellikle elastin ağları ile, alışılmadık, entropi ve çevresi ile hidrofobik etkileşimlerin bir kombinasyonu yoluyla uzun menzilli elastikiyetini üretir ve bu tür akciğer ve deri gibi dokuların fonksiyonları için gerekli olan bir protein bir arada yaşıyor. Her iki lifler güncel araştırma bir altıgen kristal modeli kullanılarak modellenmiştir. 9 bölüm 1, biz hayvan dokularından lifleri ayıklamak ve spektroskopik ölçümler için numune hazırlamak için protokol açıklar. part 2, Brillouin cihazı kurma ve elyaftan spektrumları elde etmek için prosedür sunulmuştur. Part 3 burada yer alan ilgili mekanik bilgileri ayıklamak için Brillouin spektrumları uygulanan veri analizi ayrıntılarını verir. Ardından, temsili sonuçlar sunulmuş ve Tartışılan vardırd.

<table><tbody><tr><td><güçlü >Kondroitinaz ABC< / güçlü ></td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C2905</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Tris Tamponu < / güçlü ></td><td>Fluka</td><td>93358</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Sodyum Asetat< / güçlü ></td> <td>Fisher Scientific</td><td>S608-500</td><td></td></tr> <tr><td><güçlü >PBS< / güçlü ></td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr> <tr><td><güçlü > Sodyum Azide</güçlü></td><td>Fisher Scientific</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Streptomyces Hyaluronidase&nbsp; < / güçlü ></td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>H1136-1AMP</td><td></td></tr> < <tr><td>güçlü > Sodyum Klorür< / güçlü ></td> <td>Fisher Scientific</td><td>S7653</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Tripsin < / güçlü ></td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T4665</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Sodyum Fosfat< / güçlü ></td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr> <tr><td><güçlü > Sodyum Hidroksit < / güçlü></td><td>Fisher Scientific</td><td>S320-500</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Saf Su</güçlü></td><td>Millipore</td><td>ZRQS0P3WW</td><td>Şirket içinde üretilmiştir</td></tr><tr><td><güçlü>Damıtılmış Su</güçlü></td><td>Bibby Scientific Limited</td><td>D4000</td><td>Sudan kurum içinde üretilmiştir durgun</td></tr><tr><td><güçlü>Euthatal</güçlü></td><td>Merial&nbsp;</td><td>J01601A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Tandem İnterferometre TFP-1</güçlü></td><td>JRS Bilimsel Aletler</td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>dondurucu</güçlü></td><td>Lec</td><td>TU55144</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Buzdolabı</güçlü></td><td>Zanussi</td><td>ZBA15021SA</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Sıcak Plaka</güçlü></td><td>Fisher Bilimsel</td><td>SP88857206</td><td></td></tr><tr><td>< güçlü > Kelepçeler< / güçlü ></td><td>VWR</td><td>241-7311 ve 241-7201</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Kelepçe Standı< / güçlü ></td><td>VWR</td> <td>ve nbsp; 241-0093</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Termometre</güçlü></td><td>Fisher Scientific</td><td>13-201-401</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>streç film</güçlü></td><td>Sainsbury's</td><td>7650540</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Parafilm</güçlü></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><<tr><td>güçlü>Silikon</güçlü></td><td>IDB Teknolojileri</td><td>Yok Katalog</td><td>yok sayı. İstek üzerine sipariş verin.</td></tr><tr><td>< güçlü > Kapak Camı< / güçlü ></td><td>VWR</td><td>631-1571</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Konik Şişe< / güçlü ></td><td>VWR</td><td>214-1175</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Beher< / güçlü ></td><td>VWR</td><td>213-0469</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Ölçüm Silindiri< / güçlü ></td><td>VWR</td><td>612-3838</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Şişe< / güçlü ></td><td>VWR</td><td>548-0051 & 548-0863</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Petri Tabağı</güçlü></td><td>VWR</td><td>391-0441</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Neşter</güçlü></td><td>Swann Morton Ltd</td><td>&nbsp; 0914 & 0308</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Elmas Yazıcı</güçlü></td><td>RS Aletleri</td><td>394-217</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Havya</güçlü></td><td>RS Aletleri</td><td>231-5332</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>İnce Forseps</güçlü></td><td>VWR</td><td>232-0188</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Çift Mikro Spatula</güçlü></td><td>VWR</td><td>Çeşitli Boyutlar</td><td></td></tr><tr><td><güçlü > pH Metre< / güçlü ></td> <td>Hanna Aletleri</td><td>HI-2210-02</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Orbital Çalkalayıcı< / güçlü ></td> <td>IKA</td> <td>& nbsp; </td><td></td>0002819000</tr></tbody></table>

brillouin spektroskopisi için ekstraselüler matriks proteini elyaf hazırlama

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

Brillouin spektroskopisi biyomedikal alanda gelişmekte olan bir tekniktir. Görünür ışığın, termal olarak indüklenen akustik dalgalar veya birkaç km/sn hızla yayılan fononlarla etkileşimi yoluyla bir numunenin mekanik özelliklerini araştırır. Materyalin elastikiyeti ve yapısı ile ilgili bilgiler tahribatsız temassız bir şekilde elde edilmekte, böylece in vivo uygulamaların ve patolojinin potansiyel teşhisinin yolu açılmaktadır. Bu çalışma, Brillouin spektroskopisinin, hücre dışı matrisin elastin ve tripsin sindirilmiş tip I kollajen liflerindeki biyomekanik çalışmasına uygulanmasını açıklamaktadır. Ekstraselüler matriksin fibröz proteinleri biyolojik dokuların yapı taşlarıdır ve mekanik ve fiziksel davranışlarının araştırılması, normal dokularda yapı-fonksiyon ilişkilerinin kurulması ve hastalıkta meydana gelen değişikliklerin anahtarıdır. Numune hazırlama prosedürleri ve ardından yansıtıcı bir substrat kullanılarak Brillouin spektrumlarının ölçümü, optik sistemin ayrıntıları ve spektral veri analizi yöntemleri ile birlikte sunulmaktadır.

Bu deneme için (Şekil SI-1A) &#39;da kullanılan Brillouin spektroskopisi cihazı daha önce tarif edilmiştir. Şekil 9&#39;da, tek modlu örnek 76 mW&#39;lık çıkış gücü 532 nm katı-hal lazer kullanmaktadır. A 20 cm akromatik objektif numune üzerine lazer ışığını odaklanır ve bir backscattering geometri örnekten saçılan ışık toplar. Tandem pasolu Fabry-Perot interferometre sonra düşük gürültü fotodiyot detektörü tarafından tespit edilir saçılan ışık, filtre edilmesi için kullanılır. Bu yaklaşım, son derece etalonu oynak piezo-tarama yoluyla yüksek kontrast (yaklaşık 120 dB) ve istikrar sağlar. Bir polarizör ve analizör olaydan ve dağınık ışık polarizasyonu seçmek tanıtılmaktadır. Spectra genellikle o polarize olay ışık kutuplaşma dikey (V) yön ve alternatif dikey (V) seçerek analizörü seçerek sabit tutulur ile elde edilirdağınık ışık kutuplaşma r yatay (H) yönünde. Bu yapılandırmada, boyuna ve enine akustik modlar sırası ile tespit edilir. Tipik Brillouin spektrumu nedeniyle esnek saçılma ve örneğin mekanik imzası olan eşit kaydırılmış tepe veya Brillouin çifti, bir veya daha fazla grup için yoğun bir merkezi tepe noktasına sahiptir. Bu ölçümlerde, dağınık ışık yüzeyi (PS modları) paralel seyahat toplu fononların gelen numune substrat arayüzünde gelen ışığın yansıması sonra, numune yarı dik ve seyahat toplu fononların hem kaynaklı olabilir. 9 Şekil 2 30 GHz ücretsiz spektral aralığı, 0.2 GHz çözünürlükte VV kutuplaşma ile elde edilen kuru ve sulandırılmış tripsin-sindirilmiş kollajen liflerinin BLS spektrumlarını göstermektedir ve yaklaşık 10 dk toplama zamanıYelpazenin başına. Her spektrum θ dönme belirli bir açıya karşılık gelir (Şekil SI-1C). PS modu (9.85 ± 0.03) GHz (Şekil 2A) de iken İçeride ISTV melerin RWMAIWi&#39;nin = 0 ° C&#39;de kuru kollajen lif, uzunlamasına modları (18.92 ± 0.02) GHz&#39;de toplu zirve doğurur. Aynı aralıkta İçeride ISTV melerin RWMAIWi&#39;nin değiştirilmesi üzerine düşük frekanslarda PS pik değişimleri θ 90 ° (fonon radyal yön sondalama) 0 ° (lifin eksenel yönlendirme tarama fonon) arasında gider, dökme tepe ise sadece hafif kırmızı kaymalar (fonon rotasyon boyunca bir yarı-radyal yönde sondalama). Islak kollajen lif nedeniyle boyuna fononların iki tepe noktası yaklaşık 10.5 GHz hızında toplu tepe ve 4.9 GHz (Şekil 2B) PS tepe, deney boyunca temelde değişmemiştir. Bu 18.92 verilerine göre en yüksek frekansı 80 ila% 100 azalma gösterir (ve 9.85 GHz sırasıyla) ve bu yüzden hidrasyon nedeniyle malzemenin sertliği, bir. hidratlı kollajen toplu ve PS modları elastik sabitleri su oynadığı baskın rol ile, su ve lif katkılarının bir arada olduğunu öne sürerek, saf su modları frekansında yakın yalan olduğunu unutmayın. Şekil 3, θ = VH polarizasyonda 30 ° ölçülen kuru tripsin ile sindirilmiş kollajen lif spektrumunu gösterir; VV polarizasyon bir kaçak PS ve dökme pikleri de dikkat edilmesi sağlar. Enine modları (4.1 ± 0.2) GHz (θ = 0 °) 0 ° 90 ° &#39;ye kadar θ değişiklikler olarak biraz mavi-vardiya bir tepe oluşturmaktadır. Enine ve PS zirveleri hem Fit sonuçları da gösterilmiştir. Tepe parametreler çıkarıldı ve akustik dalga hızları V L = v l / √2 olarak türetilmiştir <em&gt; v eğrisi-fit zirveleri analizi ve l ile elde edilen mod frekans dalgaboyu, 532 nm olmasıdır. Bu geometri, malzemenin kırılma indisi bilgisi akustik modu hızının elde edilmesi için gerekli değildir Not (saçılma geometrisine bağlı olarak, qS k = 2 i (Φ) sin Şekil SI-1b, c), bu nedenle Bu yaklaşım özellikle avantajlı hale. Şekil 4, açılı Î¸&#39;nın bir fonksiyonu olarak boyuna ve enine metodları ile elde edilen akustik dalga hızı (PS T tepe) bir grafiğidir . Aşağıdaki denklemler A1 ve A2 - - altıgen simetrik elastik katı 7 modeline uyum analizi kuru tripsin-sindirilmiş Çeşidi elastikiyet tensörün beş bileşenlerini ben lifleri (Tablo 1) kollajenin sağlar. 9 tarafından verilen = <img alt="denklem 1" src="/files/ftp_upload/54648/54648eq1.jpg" /> (A1) <img alt="denklem 2" src="/files/ftp_upload/54648/54648eq2.jpg" /> (A2) ρ malzemenin yoğunluğu ve C 11, C 33, 44 ° C ve C 13 olduğu altıgen simetrili sistemler karakterize beş elastik sabitlerinin dörttür. Beşinci sabit 12 C, 12 ° C 11 C, yaklaşık ilişki elde edilebilir -. 2 C 44 7 Katsayılar, daha önce saflaştırılmamış kollajen fibe elde edilenlere benzerdirrs. 9 A fark fark elastik modülü E ǁ ve e benzer değerlere yansıdığı 13 c katsayısı oluşur <img alt="Dik" src="/files/ftp_upload/54648/54648fig_flippedT.jpg" /> saflaştırılmış kolajen için (yaklaşık 7.2 ve 7.7 GPa). Şekil 5 θ karşı Islak kollajen uzunlamasına akustik dalga hızının bir grafiğidir . Bu durumda, frekansta hiçbir periyodik değişimi hatası içinde sabit bir hız vererek görülmektedir. 6 θ = 0 ° C&#39;de ölçülen kuru ve sulu elastin lifleri spektrumunu göstermektedir. Enine modları, bu örnekler için tespit edilememiştir. Kuru elastin, dökme pik 8.2 GHz 9 (13 ve kuru kollajen gelen bir zirve daha düşük% 20) PS modunda iken 16.8 GHz meydana gelir. Islak elastin lifleri toplu p sunmakeak de (12.30 ± 0.01) GHz (kuru elastin toplu zirve fazla sıklıkta% 37 daha düşük). Islak elastin PS modu çünkü bu frekanslarda elastik tepe yoğun kuyruk spektrumunda belirgin değildir. Öte yandan, yaklaşık 7.5 GHz hızında tepe toplu suya atfedilir. Şekil 7 İçeride ISTV melerin RWMAIWi&#39;nin kuru elastin lif akustik dalga hızının bağımlılığını gösterir. Bu verilerden, esneklik tensör parçaları (ve mekanik modülü), ıslak kolajen gibi (Tablo 1). 9 elde edildi, suyla elastin lifleri mekanik modülünde izotropi kanıt vardır. Bu sonuçlar Brillouin spektroskopisi sertlik, kompozisyon ve malzemenin yapısal yönleri ile ilgili bilgi verebilir nasıl gösterir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54648/54648fig1.jpg" /> Fi1. şekil akustik ve atomların tek boyutlu zincir optik Fononlar. tek boyutlu bir iki atomlu zincir akustik ve optik titreşimlerin şematik. Atomlar kitle m 1 ve m 2 ve dönüşümlü edilir. Oklar atomların yer değiştirmeleri göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54648/54648fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54648/54648fig2.jpg" /> Tripsin ile saflaştırılmış Çeşidi Şekil 2. Brillouin spektrumlan I fare kuyruk tendon lifleri hücre oranında yerleştirilmiştir. (A) Kuru lif ve (B) spektrumu derece olarak, lif eksen İçeride ISTV melerin RWMAIWi&#39;nin farklı açıda VV ölçümlerinden fiber hidratlanmış. Saf damıtılmış su bir spektrumu da gösterilmiştir. Spektrumlar toplu tepe yoğunluğuna (yükseklik) normalize edilmiştir.<html> Etiketler B ve PS sırasıyla toplu ve paralel-yüzey modları ile ilgili zirveleri göstermek. Hata çubukları standart hata (sayılarında karekökü) gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54648/54648fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54648/54648fig3.jpg" /> Kuru tripsin-saflaştırılmış tip Şekil 3. Brillouin spektrum ben sıçan kuyruğu tendon lifleri kollajen. Spectrum İçeride ISTV melerin RWMAIWi&#39;nin bir VH ölçümden = 30 °. Etiketler T, PS ve B sırasıyla, paralel-yüzey ve toplu modları enine ilgili zirveleri göstermek. hem T ve PS modları için sönümlü harmonik osilatör (DHO) modeli kullanılarak fit analiz sonuçları da gösterilmiştir. Hata çubukları standart hatası (sayılarında karekökü) gösterir./54648fig3large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54648/54648fig4.jpg" /> Şekil lif eksenine açısı vs kuru tripsin-saflaştırılmış kollajen akustik dalga hızının 4. Konu. Brillouin zirveleri uygun analizlerden elde edilen kuru kollajen lif boyuna ve enine akustik dalga hızları. Veriler altıgen simetrik esnek katı bir model yerleştirilmiştir. Kırmızı çizgi: Denklem A1 (R2 = 0.99); mavi çizgi: Denklem A2 (R = 0.36 2). Hata çubukları Brillouin spektrumları uygun bir Levenberg-Marquardt doğrusal olmayan en küçük kareler sonra kovaryans matrisinin köşegen elemanları karekökü elde edilen standart hataları göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54648/54648fig4large.jpg" target="_blank">Daha büyük bir versi görmek için buraya tıklayınız</a><html> bu rakamın üzerinde. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54648/54648fig5.jpg" /> Lif eksenine açısı vs ıslak tripsin-saflaştırılmış kollajen uzunlamasına akustik dalga hızı Şekil 5. Konu. Brillouin zirveleri uygun analizlerden elde edilen hidrate kollajen lif boyuna akustik dalga hızı. gösterilen çizgi göz için bir kılavuzdur ve bu aralıkta akustik dalga hızının ortalama değerini verir. Hata çubukları Brillouin spektrumları uygun bir Levenberg-Marquardt doğrusal olmayan en küçük kareler sonra kovaryans matrisinin köşegen elemanları karekökü elde edilen standart hataları göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54648/54648fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> jpg &quot;/&gt; Sığır ense ligament gelen elastin liflerin Şekil 6. Brillouin spektrumları. İçeride ISTV melerin RWMAIWi&#39;nin kuru ve sulandırılmış fiber Spectra = 0 °. Spektrumlar toplu tepe yoğunluğuna (yükseklik) normalize edilmiştir. Etiketler B ve PS sırasıyla toplu ve paralel-yüzey modları ile ilgili zirveleri göstermek. B, F ve B W sırasıyla, lif ve su dökme zirveleri bakın. Hata çubukları standart hata (sayılarında karekökü) gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54648/54648fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/54648/54648fig7.jpg" /> Lif eksenine açısı vs kuru elastin boyuna akustik dalga hızı Şekil 7. Konu. Kuru elastin yalan Boyuna akustik dalga hızıer Brillouin zirveleri uygun analizlerden elde edilen. Veriler altıgen simetrik esnek katı bir model yerleştirilmiştir. Kırmızı çizgi: Denklem A1 9 (R = 0.74 2). Hata çubukları Brillouin spektrumları uygun bir Levenberg-Marquardt doğrusal olmayan en küçük kareler sonra kovaryans matrisinin köşegen elemanları karekökü elde edilen standart hataları göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54648/54648fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Yan Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54648/54648supfig1.jpg" /> Şekil SI-1. Brillouin set-up ve TYD saçılma geometri şematik. (A) katı-hal lazer tarafından yayılan olay ışık bir akromatik lens aracılığıyla numune gönderilir. Toplu akustik fononların tarafından ve reflektör kaynaklanan kişiler tarafından saçılan ışıknumune ile temas halinde olan alt-tabaka yüzeyinin en ışık ection bir foto çoğaltıcı ile tandem pasolu Fabry-Perot interferometre ile filtre edildi ve tespit lens tarafından toplanır. FP1 ve FP2 tandem set-up oluşturan iki interferometreleri göstermektedir. Bir polarize gelen ışığın polarizasyonunun seçer ve çözümleyici saçılan ışığın polarizasyon seçmek için kullanılır. Yansıtıcı silikon alt-tabaka yüzeyi ile temas halinde olan bir örnek ile (B) TYD geometrisi. Bir cam slayt (gösterilmemiştir) bir bölme mühürlemek için numune üzerine yerleştirilmiştir ve hafif bir basınç taban köşelerinde ped vasıtasıyla uygulanır. Olay ışık (k i) merceğinden, hava numune arayüzü (k &#39;i) en kırılır ve numune substrat arayüzü odaklanmıştır geçer. Aynı lens tarafından toplanan dağınık ışık toplu fononların hem etkileşim sonuçları (q ( &#39;s k)b) ve numune (q s olanlar seyahat PS). . Işığın yön ve yüzey normali arasındaki açılar Φ ve Φ &#39;olarak belirtilen (C) örnek benimsenen koordinat sisteminin şematik diyagramıdır; z liflerin yönüne olağanüstü eksen paralel tanımlar. Açılar θ ve α z sırasıyla -Axis b fononlar q s yönü ve q arasında olanlardır s &#39;k, k s i&#39;, k i k. Olayın dalgasayıları ve hafif dağınık, q b, q s, sırasıyla dökme ve PS modları, dalga vektörleri. (Ref 9. yayımlanmaktadır) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54648/54648supfig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <pfo class = &quot;jove_content&quot;: keep-ile-next.within sayfa = &quot;always&quot;&gt; Tablo akustik dalga hızlarının uygun analizlerden elde edilen 1. Elastik tensör katsayıları Ben lifleri kollajen kuru tripsin-saflaştırılmış Çeşidi Elastik tensör katsayıları (. Bu iş) ve elastin lifleri (ref 9). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> örnek </td><td colspan="2"> Elastik katsayılar (GPa) </td></tr><tr><td> tripsin ile sindirilmiş kollajen </td><td> c 33 </td><td> 18.7 ± 0.1 </td></tr><tr><td></td><td> C 11 </td><td> 14.4 ± 0.2 </td></tr><tr><td></td><td> C 44 </td><td> 3.4 ± 0.1 </td></tr><tr><td></td><td> Cı 12 </td><td> 7.2 ± 0.2 </td></tr><tr><td></td><td> Cı 13 </td><td> 11.2 ± 0.3 </td></tr><tr><td> elastin </td><td> c 33 </td><td> 11.5 ± 0.2 </td></tr><tr><td></td><td> C 11 </td><td> 10.4 ± 0.1 </td></tr><tr><td></td><td> C 44 </td><td> 1.9 ± 0.2 </td></tr><tr><td></td><td> Cı 12 </td><td> 6.6 ± 0.2 </td></tr><tr><td></td><td> Cı 13 </td><td> 6.8 ± 0.3 </td></tr></tbody></table>

Tam elastik özelliklerini çıkarmak için hücre dışı matrisin elastin ve tripsin saflaştırılmış tip I kollajen liflerine Brillouin ışık saçılma spektroskopisinin uygulanması için bir protokol sunuyoruz.

Brillouin Spektroskopisi için Ekstraselüler Matriks Proteini Elyaf Hazırlama

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

Bu prosedürün genel amacı, Brillouin spektroskopi ölçümleri için örnek bölmesine yerleştirilecek hücre dışı matris protein lifi, kolajen veya elastin örneği hazırlamaktır. Bu yöntem kullanılarak, Brillouin spektroskopi ölçümlerinde kullanılmak üzere hayvan kaynaklı bağ dokulardan hücre dışı matrise ait kolajen ve elastin lifleri elde edilebilir. Bu yaklaşımın temel avantajı, örneğin mikro-mekanik özelliklerinin, malzemenin kırılma indisi hakkında ön bilgiye gerek duyulmadan tamamen belirlenebilmesidir.Kuyruk hâlâ donmuşken, proksimal uçtan 20 milimetre uzunluğunda bir segment kesin ve dokuyu oda sıcaklığındaki PBS ile doldurulmuş bir petri kabında çözdürün. Kuyruk çözüldüğünde, cildi ayırmak için örneğin uzunluğu boyunca bir bistüri ile insizyon yapın ve kuyruk omurları etrafındaki dört kılıf tendon demetini ortaya çıkarmak için dokuyu geriye doğru soyun. İnce pensler kullanarak, her bir lifi kılıftan nazikçe çıkarın ve 4 °C'de saklamak üzere %0,01 ağırlık/hacim sodyum azid ile desteklenmiş distile su içeren bir viyale yerleştirin.Saf fibröz tip bir kolajen elde etmek için lifleri, tris tamponu ve sodyum asetat içeren kondroitinaz ABC içerisinde, sarsıntılı inkübatörde 37 °C'de 24 saat boyunca bekletin. Ertesi gün lifleri, tris tamponu ve sodyum klorür içeren streptomyces hyaluronidaz içerisine aktarıp sarsıntılı inkübatörde 37 °C'de 24 saat daha bekletin. Ardından lifleri, sodyum fosfat ve sodyum klorür içeren tripsin içerisinde sarsıntılı ortamda 37 °C'de 16 saat boyunca bekletin.Saflaştırılmış lifler, ihtiyaç duyulana kadar %0,01 sodyum azide eklenmiş distile su içeren viallerde dört derece Celsius'ta saklanabilir. Bovine nuchal ligament elastin liflerini ekstrakte etmek için öncelikle taze elde edilmiş bovine nuchal ligamentten yağları uzaklaştırın. Tüm adipoz doku temizlendikten sonra ligamenti konik bir erlene aktarın ve dokuyu distile su içerisinde taze hazırlanmış sodyum hidroksit ile kaplayın.Ligamanı 95 °C'lik bir su banyosunda 45 dakika boyunca kaynatın. Ardından, çözünmeyen bloğu distile suyla dolu bir beaker içerisinde defalarca yıkayın. pH 7,0 değerine ulaşıldığında, dokuyu %0,01 sodyum azit eklenmiş distile suyun içine daldırın ve gerekene kadar dört °C'de saklamak üzere kabı mühürleyin.Saklama işleminden sonra, cımbız kullanarak büyük bloktan yaklaşık iki milimetre kalınlığında ve 20 ila 50 milimetre uzunluğunda daha küçük elastin segmentlerini nazikçe çekip çıkarın. Segmentleri PBS içeren bir petri kabına yerleştirin ve ince pensler kullanarak segmentlerden yaklaşık bir milimetre kalınlığındaki fiber demetlerini nazikçe ayıklayın. Ardından, bir skalpel kullanarak demetleri birkaç milimetre uzunluğunda fragmanlara bölün ve fiber parçalarını, ihtiyaç duyulana kadar dört derece Celsius'ta saklanmak üzere %0,01 sodyum azide ile desteklenmiş distile su içeren vialere aktarın.Fiberi yansıtıcı bir altlığa monte etmek için öncelikle elmas kesici kullanarak yansıtıcı silikon lamdan bir parça kesin. Ardından, merkezinde bir fiber parçasını tutacak kadar büyük bir boşluk bulunan bir para-film şeridi kesin ve para-filmi silikon altlığın üzerine yerleştirin. Şimdi, ince uçlu bir pens yardımıyla tek bir fiberi 4 °C'deki saklama çözeltisinden, oda sıcaklığındaki saf suyla dolu küçük bir petri kabına aktarın.5 dakika sonra, durulanan fiberi silikon substrat üzerindeki para-film boşluğunun merkezine aktarın. Ardından fiberin üzerine ince bir cam lamel yerleştirin ve camın altındaki para-filmi eritmek için ısıtılmış bir havya camın üzerine nazikçe bastırın. Sabit bir saçılma açısı ve hacim konumu korurken numunenin düzlem içi rotasyonuna olanak sağlamak için, numuneyi gonyometre ile donatılmış dikey bir tutucuya monte edin ve gelen lazer ışınına 45 derecelik açıyla konumlandırın.Sıfır derecelik belirli bir rotasyon açısındaki kuru kolajen liflerinde, boylamasına modlar 18,92 gigahertz'de bir hacimsel pik oluştururken, yüzeye paralel modlar 9,85 gigahertz'de bir pik oluşturur. Belirli rotasyon açısı 90 dereceye yaklaştığında yüzeye paralel pik daha düşük frekanslara kayarken, aynı açı aralığında hacimsel pik yalnızca hafif bir kırmızıya kayma gösterir. Islak kolajen liflerinde, hacimsel pikin 10,5 gigahertz'de ve yüzeye paralel pikin 4,9 gigahertz'de olmasıyla iki pik deney boyunca esasen değişmeden kalır; bu durum frekansta %80 ila %100 oranında bir azalmaya işaret eder ve hidratize olmuş malzemenin azalan sertliğini açıklar.Bu şekilde, kuru kolajenin yüzeye paralel ve transvers piklerinden elde edilen akustik dalga hızlığının, belirli bir dönme açısının fonksiyonu olarak grafiği gösterilmektedir. Sıfır derecelik belirli bir dönme açısında ölçülen kuru elastin liflerinde, bulk piki 16,8 gigahertz'de ve yüzeye paralel mod 8,2 gigahertz'de meydana gelmektedir. Ancak, ıslak elastin lifleri, kuru elastinin bulk pikine göre %37 daha düşük bir frekansta bulk piki sergileyerek lif sertliğinde bir azalma olduğunu göstermektedir.Kuru kolajende olduğu gibi, kuru elastin liflerin mekanik özelliklerinde de anizotropiye dair kanıtlar bulunmaktadır ve bu durum, Brillouin spektroskopisinin ilgilenilen belirli malzemelerin sertliği, bileşimi ve yapısal özellikleri hakkında ilgili veriler elde etmedeki etkinliğini göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, Brillouin ışık saçılım spektroskopisine dayalı mikro-mekanik testler için kolajen ve elastin lif örneklerinin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

preparation-extracellular-matrix-protein-fibers-for-brillouin

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu video, hücre kültürü için uygun, uyumlu, ekstrasellüler matriks (ECM) kaplanmamış maddeler imal etmek için kullanılan deneysel teknikler göstermek ve çekiş gücü mikroskopi için uygun ve hücre davranışı üzerindeki etkilerinin gözlenmesi ECM sertlik.

Hücresel Daralma miktarının Şikayet Matrisler hazırlanması

Raman spektroskopisi temassız için uygun bir tekniktir, canlı hücreler, doku mühendisliği yapıları ve doğal dokuların etiket ücretsiz analizidir. Kaynak özgü spektral parmak izi oluşturulur ve çok değişkenli analiz kullanılarak analiz edilebilir.

Raman Spektroskopisi kullanarak Hücreler ve Ekstrasellüler Matriks Temassız, Etiket ücretsiz izleme

Bu model sistem bir tahribatsız şekilde endojen kolajen (yeniden) organizasyonu gerçek zamanlı çalışma için kullanılabilecek bir miyofibroblast nüfuslu fibrin jel başlar. Bu model sistemi, farklı hücre kaynakları, orta katkı maddeleri ile birlikte kullanılabilir gibi çok ayarlanabilir, ve özel ihtiyaçlarına göre kolay bir şekilde adapte edilebilir.

Mühendislik Fibrin tabanlı Doku miyofibroblastlar ve Kısıtlar Uygulamasından Yapıları ve Hücre ve Kollajen (Re) Organizasyon tetikleyebilecek süzün

Çok çekirdekli bir fiberin her bir çekirdeğine aynı fiber Bragg ızgaralarını yazmak için bir teknik açıklıyoruz. Bu, fiber kaplamanın kavisli yüzeyi tarafından merceklenmeyi azaltmak için optik yola ek bir yüzey eklenerek elde edilir.

Çok çekirdekli Fibers Bragg Izgaralar Yazma

Electrospun nanolifler oranı, mükemmel mekanik bütünlüğü ağırlığı ve hücre büyümesi ve çoğalması desteklemek için yüksek bir yüzey alanı vardır. Bu nanolifler biyomedikal uygulamalarda geniş bir yelpazesi var. Burada Elektrospinning tekniği kullanılarak, keratin / PCL nanolifler imal ve doku mühendisliğinde olası uygulamalar için lifleri karakterize.

Biyomedikal Mühendisliği için keratin bazlı nanofiber sentezi

Burada hızlı bir Brillouin spektrometresi inşa etmek için bir protokol mevcut. Neredeyse görüntülü faz dizi Basamaklı (VIPA) etalonları 1000'den fazla kat daha hızlı geleneksel tarama Fabry-Perot spektrometresi daha ölçüm hızına erişmek. Bu gelişme in vivo düşük güç seviyelerinde doku ve biyomalzemelerin Brillouin analizi için araçlar sağlar.

Brillouin Saçılma Analiz Yüksek Hızlı Alt GHz Spektrometre

Biz bir hızlı continuous-wave-teşvik-Brillouin-saçılma (CW-SBS) Spektrometre inşaatı tarif. Spektrometre tek frekanslı diyot lazerler istihdam ve ilâ 100-fold mevcut CW-SBS Spektrometreler olanların daha hızlı bir atomik Buhar çentik-iletim spectra yüksek spektral çözünürlüklü bulanık/sigara-bulanık örneklerinin elde etmek için filtre hızlandırır. Bu geliştirme yüksek hızlı Brillouin malzeme çözümleme sağlar.<br...

Yüksek hızda sürekli uyarılan Brillouin saçılma Spektrometre için malzeme analizi

Bu iletişim kuralı bir rejeneratif iskele implant parçası olarak preklinik değerlendirme için uygun olan yara onarım için hedeflenen tüm hücre dışı matriks elyaf üretim hedeftir. Bu iplikler fibroblastlar hollow fiber membranlar üzerinde kültür tarafından üretilen ve membranlar dağılması tarafından ayıklanır.

Hücre dışı matriks liflerinin kurban Hollow Fiber membran hücre kültürü ile üretim

Genel amacımız, hücrelerin yönlendirilmiş aksonal büyümeye yol açan hücre dışı ipuçlarını nasıl algıladığını anlamaktır. Burada, akson büyümesini ve yol bulmayı yöneten belirli olayları incelemek için hücre dışı matriks bileşenlerinin tanımlanmış mikro desenlerini üretmek için kullanılan Proteinlerin Hafif Kaynaklı Moleküler Adsorpsiyon metodolojisini açıklıyoruz.

Hücre Dışı Matriks Proteinlerine Hücre Yanıtlarını İncelemek Için Mikro-Desenleme için PRIMO Sistemini Kullanan Proteinlerin Işık Kaynaklı Moleküler Adsorpsiyonu

Burada, protein monomerini kontrollü bir dizi ile protein polimeri oluşturan enzimler tarafından biraraya getirmek ve tek moleküllü kuvvet spektroskopisi çalışmaları için yüzeyde hareketsiz hale getirmek için bir protokol sokuyoruz.

OaAEP1-Tek Moleküllü Kuvvet Spektroskopisi İçin Polimerize Proteinin Aracılı Enzimatik Sentezi ve Immobilizasyonu

Bu makale, Brillouin mikrospektroskopisi kullanılarak 3D bir matriks içinde yaşayan sferoidlerin mekanik karakterizasyonu için bir protokolü tanımlar. Bu tamamen optik yöntem, mikro ölçekli çözünürlük ve nicel mekanik özelliklerle küresel görselleştirmeyi mümkün kılar. Bu yaklaşımın mekanik fenotipleme için etkileri vardır; örneğin, tümör sferoidlerinin patolojik durumlarını 3D mikro ortamda belirlemek.

Brillouin Spektroskopisi Kullanılarak Sferoidlerin Mekanik Haritalanması

Öğrenin, Brillouin spektroskopisi için ekstraselüler matriks kollajen ve elastin liflerinin hazırlama yöntemini. Bu protokol, biyomalzemelerin mikro-mekanik özelliklerini kırılma indisi bilgisi olmadan tam olarak belirlemenizi sağlar.

Brillouin Spektroskopisi için Ekstraselüler Matriks Proteini Elyaf Hazırlama

Daha fazla video keşfet