Name: Bozulmamış Fare Adacık için β-hücre mitogenlerin Sürekli İdaresi Ex Vivo Biyolojik olarak parçalanabilir poli (laktik-ko-glikolik asit) mikro kullanılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Öğrenin, fare adacıklarında beta hücre proliferasyonunu incelemek için biyobozunur PLGA mikrokürelerle sürekli bileşik salınımı yöntemini. Bu teknik diyabet tedavileri için yeni araştırma olanakları sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, bu el yazmasını eleştirel bir şekilde okuduğu için Bethany Carboneau'ya (Vanderbilt Üniversitesi) teşekkür eder. Ayrıca adacık izolasyonları için Anastasia Coldren'e (Vanderbilt Üniversitesi Tıp Merkezi Adacık Tedarik ve Analiz Merkezi) ve santrifüj ve doku kültürü tesislerinin kullanımı için Dr. Alvin C. Powers'a (Vanderbilt Üniversitesi Tıp Merkezi) ve Dr. David Jacobson'a (Vanderbilt Üniversitesi) teşekkür ederiz. Bu araştırma, NIH hibe DK20593 tarafından desteklenen Vanderbilt Diyabet Araştırma ve Eğitim Merkezi'nin Adacık Tedarik ve Analiz Çekirdeğinin kullanımını içeriyordu. Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği Doktora Sonrası Bursu (14POST20380262) ile RCP'ye ve Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı'ndan (1-2011-592) ve Gazi İşleri Bakanlığı'ndan (1BX00090-01A1) M.A.G.'ye hibe ile desteklenmiştir.

Tüm prosedürler onaylanmış ve Vanderbilt Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi ile uygun olarak yapıldı. Fluorofor ile 1. Etiketleme COI (İsteğe bağlı) <ol><li> Mikroküre kargo görselleştirmek için, örneğin süksinimidil esterlerin ya da floresan türevleri gibi (bir protein ile ilgili, örneğin) bir serbest primer amini ile reaksiyona girecek bir floresan boya, seçin. dimetil sülfoksit 200 ul (DMSO) içinde fluorofor (COI mol göre) 8x mol fazlalığı içinde çözündürülür. </li><li> Süspanse bir taşıt çözeltisi içinde 800 ul&#39;lik nihai bir hacme (62.5 ng / ul nihai konsantrasyona) &#39;ye kadar COI 50 mg. Araç çözeltisi COI kaynağına bağlı olarak değişiklik gösterecektir. Not: tipik bir araç çözeltiler, fosfat tamponlu tuz (PBS) veya DMSO içerir. </li><li> Adım 1.1 fluorofor / DMSO çözeltisi tüm ekleyin ve ÇÇ&#39;nı tekrar süspansiyon. Vorteks gece boyunca 4 ° C &#39;de. Seçenek olarak ise, oda sıcaklığında, reaksiyon karışımı vorteks4 saat (RT). </li><li> etiketleme reaksiyonu takiben, bir tuz giderme kolonu kullanılarak aşırı fluorofor çıkarın. <ol><li> tuz giderme kolonundan saklama tamponu boşaltın ve iyonu giderilmiş su 16 ml ile yıkayın. üzerinden tüm akışını atın. </li><li> tuz giderme kolonuna floresan etiketli COI ekleyin. iyonu giderilmiş su, 1.2 ml ile elüte ve akış toplar. </li><li> Tekrar yıkama adımı ek dört kez, her iyonu giderilmiş su, 1.2 ml ilave ve ayrı bir örnek olarak akışı toplamak. </li><li> -80 ° C de örnekler üzerinden toplanan tüm akış dondurma ve 24 saat boyunca üretici talimatlarına göre liyofilize edin. </li></ol></li></ol> 2. Su-içinde-yağ-içinde-su emülsiyon çözücü buharlaştırma yöntemi ile Mikroküre Hazırlama COI yüklü <ol><li> İlk su fazının (W1) oluşturmak için iyonu giderilmiş suyun 100 ul 1 mg floresan etiketli COI ekleyin. </li><li> poli 65 mg çözülür (laktik-ko-glikolik acid) (50:50 laktid: glikolid, molekül ağırlığı 54.000 - bir mikrosantrifüj tüpü içinde, diklorometan içinde 750 ul 69,000). 10 Ultrasonicate - (160 W) 30 sn tamamen PLGA çözmek için. Bu yağ fazı (O) oluşturmaktadır. </li><li> damla damla bir şekilde Ç evresine adım 2.1 oluşturulan W1 faz bütün ekleyin. W1 / O fazı oluşturmak için 30 saniye için 20,000 rpm&#39;de bir elle tutulan homojenleştirici kullanılarak emülsiyon haline. </li><li> 30 saniye için 20,000 rpm&#39;de 1%, 15 ml (ağırlık / hacim), sulu bir poli (vinil alkol) (PVA) solüsyonu, damla damla bir tarzda W1 / O faz her ekleme ve elle tutulan homojenleştirici kullanılarak emülsiyon haline . </li><li> solventi çıkarmak ve sulu fazın üretilmesi için, 1 saat için bir döner buharlaştırıcı kullanılarak 635 mm Hg vakum için 200 ml yuvarlak tabanlı bir şişe ve konuyu adım 2.4 oluşturulan emülsiyon tüm aktarın. </li><li> Sulu fazın kısım 1 mi adım 2.5 ila on dört mikrosantrifüj tüpleri oluşturulur. 7,500 de mikrosantrifüj tüpleri içinde sulu çözeltinin santrifüj8 dakika için xg. NOT: Bu adımda, mikro kalan sulu çözelti içinde mevcut olan ve bir mikrosantrifüj tüpüne altına konsantre edilmiştir. </li><li> mikrosantrifüj tüpü altındaki mikro küreler rahatsız etmeyecek şekilde dikkatli bir şekilde, bir mikropipet ile mikrosantrifüj tüpleri pipetleme sulu çözelti 900 ul çıkarın. <ol><li> Her bir mikrosantrifüj tüpüne deiyonize su 1 ml eklenerek aşırı PVA&#39;nın mikro küreleri yıkayın. mikrosantrifüj tüpü altındaki mikro küreler rahatsız etmeyecek şekilde 8 dakika boyunca 7.500 x g&#39;de santrifüj ve yeniden dikkatli bir mikropipet ile mikrosantrifüj tüpleri pipetleme sulu çözelti 900 ul çıkarın. Not: Geri kalan 100 ul sulu çözelti elde mikro küreler içerir. </li></ol></li><li> -80 ° C de aşama 2.7 üretilen sulu bir mikroküre çözelti dondurularak. </li><li> göre bir dondurarak kurutucunun kullanarak Lyophilize mikroküreler üreticinin-20 ° C&#39;de talimatları saklayın. Not: Tamamen PLGA mikro küreler eritilmesi ve serbest protein 7, standart bir eğriye protein konsantrasyonu görece belirleyerek COI yükleme etkinliğini ölçmek. </li><li> Bir negatif kontrol olarak, (bundan sonra kontrol mikro-küreler olarak adlandırılır) &quot;boş&quot; mikro-küreler toplu oluşturur. Not: Kontrol mikrosferlerin üretimi adım 1.2 araç çözeltisi 800 ul Resim COI eklenmesiyle hidrofilik COI yüklü mikro-üretimi ile aynıdır. β-hücresi mitojen deneyi için COI yüklenmiş PLGA mikro küreler PLGA göreceli kütle konsantrasyonunda maçı kontrol parçacıklar. </li></ol> Adacık Kültür Medya ve Pre-tahlil Medya 3. hazırlanması <ol><li> sağlam fare adacıkları kültür 200 ml ortam hazırlayın: RPMI 11 mM glukoz,% 10 at serumu, 100 U / ml penisilin G ve 100 ug ile desteklenmiş 1640 ortamında ml streptomisin (bundan sonra ise şu şekilde de ifade /) Kültür ortamı sağlar. Not 1: fetal sığır serumu (FBS) farklı olarak, at serumu plasental laktojen, proliferasyon tahlilinde analiz boşa β-hücresi proliferasyonu, bir indükleyici yoksundur. NOT 2: PLGA mikroküreler kullanmadan önce sterilize edilmez gibi, kültür ortamına antibiyotik eklenmesi mikrobiyolojik kontaminasyonu önlemek için çok önemlidir. </li><li> 50 ml konik tüp içinde bir elektronik pipet ve yer ile adacık kültür ortamı 25 ml çıkarın. ön-deney ortamı oluşturmak için 0.2 mM EGTA bir son konsantrasyon ile 50 ml konik bir tüp içinde doku adacığı kültür ortamı 25 mL Supplement. NOT: EGTA eklenmesi hafif adacık mimarisi değiştirmeden adacık hücre-hücre kişileri gevşetir. Bu adacık iç hücrelere ulaşabilir ÇÇ&#39;nı sağlamaya yardımcı olur ve merkezi adacığın nekroz önlemeye yardımcı olur. </li></ol> Bozulmamış Fare Adacık 4. Kültürleme <ol><li> önceden seçilen suşu, cinsiyet, ag bozulmamış adacıkları izolePankreas 8,9 rutin bir kolajenaz sindirimi ardından fare E ve genotip. Havuz birlikte örneklerinden gibi gelen adacıklar. </li><li> Kısım adacık kültür ortamı 200 ul, 96 oyuklu bir doku kültür plakasının bir oyuğuna 40 adacıklar. kuyu başına Görme boyut maç adacıklar (numuneler arasındaki adacık denklik (IEQ) kesin bir değerlendirme gerekli değildir). bir buharlaştırma tamponu sağlamak için, 200 ul steril su ile adacıkları ile gözlere hemen bitişik boş kuyu doldurun. Kültür% 95 hava ve% 5 CO2 atmosferi altında bir gece boyunca 37 ° C &#39;de ortam adacıklar. </li></ol> COI yüklü ve Kontrol PLGA Mikrokürelerinin 5. Yeniden süspansiyon <ol><li> gece boyunca doku adacığı çıktıktan sonra, liyofilize COI yüklü PLGA mikro-bir kısım ön deney ortamı eklenerek tekrar süspansiyon mikro bu mikrosantrifüj tüpü içinde COI nihai konsantrasyonu, 10 ng / ml (belirli bir miktarda COI miktarı, olduğu oluşturulan microspheres adım 2.9) &#39;de tespit edilmiştir. 4 ° C&#39;de 10 sn uzun puls W 160 ° C&#39;de 10 dakika boyunca bir buzlu su banyosu içinde yeniden süspansiyon haline getirildi COI yüklü mikro küreler sonikasyon. </li><li> Liyofilize kontrol PLGA mikrokürelerin eşit kütlesine öncesi deney ortamı aynı hacimde ekleyerek yeniden süspanse kontrolü PLGA mikroküreler. 4 ° C&#39;de 10 sn uzun puls W 160 ° C&#39;de 10 dakika boyunca bir buzlu su banyosu içinde yeniden süspansiyon haline kontrol PLGA mikro küreleri sonikasyon. </li><li> Görme mikro küreler iki cam lamelleri arasında yeniden süspanse mikroküreler 2 ul pipet ile dağılmış onaylayın. Epifloresans veya aydınlık mikroskop 40X objektif kullanılarak mikroküreler gözünüzde canlandırın. </li><li> mikro-belirgin çekiş hala görünür ise, 4 ° C&#39;de 10 sn uzun bakliyat ve yeniden süspansiyon haline getirilmiş mikro kürelerin tekrar görselleştirme W 160 ° C&#39;de ek bir 10 dakika boyunca bir buzlu su banyosu içinde sonikasyon. </li></ol> ÇÇ yüklü veya Control PLGA Mikrokürelerinin ile Adacık 6. Tedavi &lt;/ P&gt; <ol><li> her bir COI yüklü mikro-küreleri ile tedavi edilmesi için, 100 ul&#39;lik bir son hacim ve önceden belirlenmiş bir son konsantrasyona ön-deney ortamı, yeniden süspansiyon haline ÇÇ mikro-10 ng / ul seyrelterek deney ortamı hazırlar. Not: protein uygun nihai konsantrasyon Bu deney için kullanılan her COI için değişecektir. İdeal olarak, nihai bir konsantrasyon aralığı test edilmiştir. </li><li> her bir kontrol olarak kullanılmak üzere, adım 6.1 COI yüklü mikro küreler seyreltilmesi için kullanılan aynı seyreltme hacimde Aşama 5.2&#39;de elde yeniden süspanse kontrol PLGA mikro-seyreltilmesiyle kontrol deneyi ortamı hazırlar. NOT: Kontrol deney ortamı ile tedavi Adacık boş mikroküreler deneysel sonuçlar üzerine olabilecek etkisi algılanmasını sağlamak için bir negatif kontrol olarak görev yapacak. </li><li> Dikkatle Resim adacıklar kuyulardan yerinden olan bu gibi bir mikropipet ile her bir adacık kültür ortamında 100 ul çıkarın. Yavaşça 100 mikron eklemekDeney ortamı veya her bir kontrol deney ortamı 100 ul l. </li><li> Üç gün boyunca% 95 hava ve% 5 CO2 atmosferi altında 37 ° C &#39;de adacıklar inkübe edin. </li></ol> 7. Mikroskop Slaytlar üzerine Sağlam adacıklar Dispersleme <ol><li> Üç gün sonra, adacıklar çıkarmak için değil dikkatli bir şekilde tüm kuyulardan tahlil ortamı çıkarın ve atmak için bir mikropipet kullanın. Yavaşça tahlil medya onları yıkamak için adacıklar PBS ul 200 ekleyin. Dikkatlice çıkarın ve bir mikropipet ile PBS atmak ve yavaşça ilave 200 ul PBS ile tekrar adacıklar yıkayın. </li><li> Çıkarın ve mikropipet ile PBS atmak ve% 0.025 tripsin 100 ul, 2 mM EDTA çözeltisi ekleyin. 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Pipetleyin tripsin-EDTA çözeltisi yukarı ve adacıklar görsel tek hücrelere dağılması teyit kadar aşağı her 2 dakikada adacıklar bir ışık mikroskobu kullanılarak (hücre bazı küçük kümeleri hala mevcut olabilir unutmayın). her bir kuyunun bireyin tüm hacmi aktarınly labeled- mikrosantrifüj tüpleri içine. </li><li> Tripsin-aracılı hücre ayrışmasını durdurmak için her mikrosantrifüj tüp adacık kültür ortamı 400 ul ekleyin. </li><li> 4 ° C &#39;de 100 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj örnekleri mikrosantrifüj tüplerine altına adacık hücreleri pelet. </li><li> Yavaşça 200 ul taze adacık kültür ortamı bir mikropipet kullanarak süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. </li><li> Bir sito-santrifüj kullanarak, santrifüj yüklü mikroskop lamı üzerine 3 dakika boyunca 140 xg&#39;de adacıklar ayrışmış. </li><li> Oda sıcaklığında hava kuru slaytlar 10 dakika, daha sonra bir hidrofobik işaretleme kalemi ile ayrışmış adacıklar etrafında bir kutu çizin. </li><li> 10 dakika boyunca oda sıcaklığında 75 ul% 4 paraformaldehit (PFA) ile hücrelerin sabitleyin. % 4 PFA çıkarın ve yavaşça PBS 75 ul iki kez yıkama hücreleri. Yıkama işleminden sonra, 75 ul% 0.2 Triton X-100, PBS içinde 10 dakika boyunca hücreler geçirgenliği. Daha sonra, 75 ul PBS ile yıkama hücreleri. Dikkat: PFA, alerjik karsinojenik ve toksik olduğu bilinmektedir. </li></ol&gt; 8. İmmünofloresan İnsülin için Dissosiye Adacık Etiketleme ve Hücre Çoğalma Marker, Ki67 <ol><li> 100 slayt kapasiteli mikroskop lamı kutusunun alt iki ıslak kağıt havlu koyarak nemli odasına hazırlayın. </li><li> Yeri nemli odasında aşağı düz (yukarı bakacak şekilde hücreler) slaytlar. bir mikropipet kullanarak, önceki yıkama aşamasından PBS aspire ve bloke etme çözeltisi 75 ul ekleyerek etiketleme için numune hazırlanması (% 5 normal eşek serumu, PBS içinde (NDS)) numuneler için antikorların spesifik olmayan bağlanma bloke her kaydırın. Oda sıcaklığında 1 saat için bloke çözüm slaytlar inkübe edin. </li><li> Yavaşça aspire mikropipet kullanılarak gine domuzu anti-insülin ile ve tavşan anti-Ki 67 antikorları ihtiva eden birincil antikor çözeltisinin 75 ul bloke etme çözeltisi, PBS içinde% 5 NDS 1 ug / ml seyreltilmiştir. 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. NOT: hücre çoğalması Alternatif belirteçleri hücre nükleer antijeni (PCNA) ve phosph çoğalan içerirohistone H3 (PH3), </li><li> Yavaşça bir mikropipet kullanarak birincil antikor çözüm aspire ve 75 ul PBS ile hücreleri yıkayın. PBS aspire bir mikropipet kullanarak ve hücreler iki kez daha, 75 uL PBS ile her zaman yıkayın. Oda sıcaklığında 1 saat için bloke etme çözeltisi 2 ug / ml&#39;ye seyreltilmiş 75 ul anti-kobay Cy5 sekonder antikor ve anti-tavşan Cy3 ikincil antikor ile her bir örnek inkübe edin. NOT: Zaten mikroküreler etiketlemek için kullanılan aynı ya da spektral örtüşen florofor ile işaretlenmiş sekonder antikorlar kullanmayın. </li><li> Mikropipet kullanılarak ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca PBS içinde 300 nM DAPI 75 ul inkübe aspire sekonder antikor çözeltisi. Aspire DAPI bir mikropipet kullanarak ve 5 dakika boyunca iyonu giderilmiş su içinde durulayın. </li><li> Yavaşça bir mikropipet kullanarak numunelerin su aspire. bir damla bir cam lamel antifade reaktifi ihtiva eden hızlı kuruyan monte çözeltisi (yaklaşık 100 ul) nokta. o, aşağı mikroskop lamı örnek tarafı ters çevirinmontaj çözümü nto. Yavaşça kabarcıklarını çıkarmak ve yumuşak bir temizleme dokusu ile aşırı sıvı silip bir pipet ucu kullanılarak slayt karşı lamel basın. lamelleri oda sıcaklığında bir gece boyunca kurumaya bırakılır. </li></ol> 9. Görüntü Alma ve Analiz <ol><li> görüntü elde etmek için ekli kamera ile bir Epifloresans mikroskop kullanın. Her fluorofor için en uygun pozlama süresi (- Ki67 için insülin 80 msn ve 250 msn DAPI için tipik olarak 20 milisaniye, 40) belirler. görüntü elde etme parametreleri tüm örnekler için eşit olduğundan emin olun. </li><li> Her numune için, elle 3,000 insülin pozitif hücrelerin sayısı ve bunların da Ki67 pozitif kaç saymak. Sadece iyi tanımlanmış ve açıkça görülebilir bir çekirdeği insülin-pozitif hücrelerin sayısı. insülin-pozitif hücre sayısı ile Ki67 pozitif / insülin-pozitif hücrelerin sayısını bölünmesi ve 100 ile çarpılması ile her numune için β-çoğalan hücrelerin yüzdesini hesaplayın. </li><li> Gün sonraβ-hücresi proliferasyonunda anlamlı bir fark kontrol ve tek yönlü bir varyans analizi ticari olarak temin istatistiksel yazılım kullanarak bu sonuçlara bakarak deney örnekleri arasında mevcut olan, her bir numune için β-hücrelerinin yüzdesinin etermining, belirler. </li></ol>

<ol><li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-cell+deficit+and+increased+beta-cell+apoptosis+in+humans+with+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes.</a> Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).</li>
<li>Levy, J., Atkinson, A. B., Bell, P. M., McCance, D. R., Hadden, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-cell+deterioration+determines+the+onset+and+rate+of+progression+of+secondary+dietary+failure+in+type+2+diabetes+mellitus%3A+the+10-year+follow-up+of+the+Belfast+Diet+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Diabet+Med%22%5BJournal%5D)">Beta-cell deterioration determines the onset and rate of progression of secondary dietary failure in type 2 diabetes mellitus: the 10-year follow-up of the Belfast Diet Study.</a> Diabet Med. 15 (4), 290-296 (1998).</li>
<li>Bouwens, L., Rooman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+pancreatic+beta-cell+mass%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Regulation of pancreatic beta-cell mass.</a> Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).</li>
<li>McCall, M., Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Update on islet transplantation.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 007823(2012).</li>
<li>Danhier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLGA-based+nanoparticles%3A+an+overview+of+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications.</a> J Control Release. 161 (2), 505-522 (2012).</li>
<li>Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+beta+cell+lines+and+their+applications+in+diabetes+mellitus+research%5BTitle%5D)+AND+%22ALTEX%22%5BJournal%5D)">Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research.</a> ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).</li>
<li>Rui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+release+of+vascular+endothelial+growth+factor+using+poly-lactic-co-glycolic+acid+microspheres%3A+in+vitro+characterization+and+application+in+polycaprolactone+fumarate+nerve+conduits%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits.</a> Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).</li>
<li>Lacy, P. E., Kostianovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+isolation+of+intact+islets+of+Langerhans+from+the+rat+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas.</a> Diabetes. 16 (1), 35-39 (1967).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+pancreatic+islet+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine pancreatic islet isolation.</a> J Vis Exp. (7), e255(2007).</li>
<li>Mukherjee, B., Santra, K., Pattnaik, G., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+characterization+and+in-vitro+evaluation+of+sustained+release+protein-loaded+nanoparticles+based+on+biodegradable+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Preparation, characterization and in-vitro evaluation of sustained release protein-loaded nanoparticles based on biodegradable polymers.</a> Int J Nanomedicine. 3 (4), 487-496 (2008).</li>
<li>Riley, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connective+tissue+growth+factor+modulates+adult+beta-cell+maturity+and+proliferation+to+promote+beta-cell+regeneration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Connective tissue growth factor modulates adult beta-cell maturity and proliferation to promote beta-cell regeneration in mice.</a> Diabetes. 64 (4), 1284-1298 (2015).</li>
<li>Mosser, R. E., Gannon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assay+for+small+scale+screening+of+candidate+beta+cell+proliferative+factors+using+intact+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">An assay for small scale screening of candidate beta cell proliferative factors using intact islets.</a> Biotechniques. 55 (6), 310-312 (2013).</li>
<li>Carvell, M. J., Marsh, P. J., Persaud, S. J., Jones, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+interactions+regulate+beta-cell+proliferation+in+islet-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">E-cadherin interactions regulate beta-cell proliferation in islet-like structures.</a> Cell Physiol Biochem. 20 (5), 617-626 (2007).</li>
<li>Wakae-Takada, N., Xuan, S., Watanabe, K., Meda, P., Leibel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+the+regulation+of+islet+beta+cell+mass+in+mice%3A+the+role+of+E-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for the regulation of islet beta cell mass in mice: the role of E-cadherin.</a> Diabetologia. 56 (4), 856-866 (2013).</li>
<li>Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+programmed+cell+death+in+situ+via+specific+labeling+of+nuclear+DNA+fragmentation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation.</a> J Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).</li>
<li>Kuo, L. J., Yang, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-H2AX+-+a+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).</li>
<li>Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islet+culture+and+preservation+strategies%3A+advances%2C+challenges%2C+and+future+outlook%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook.</a> Cell Transplant. 19 (12), 1523-1535 (2010).</li>
<li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).</li>
<li>Xu, Q., He, C., Xiao, C., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Oxygen+Species+%28ROS%29+Responsive+Polymers+for+Biomedical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Reactive Oxygen Species (ROS) Responsive Polymers for Biomedical Applications.</a> Macromol Biosci. 16 (5), 635-646 (2016).</li>
<li>Makadia, H. K., Siegel, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly+Lactic-co-Glycolic+Acid+%28PLGA%29+as+Biodegradable+Controlled+Drug+Delivery+Carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier.</a> Polymers (Basel). 3 (3), 1377-1397 (2011).</li>
<li>Cui, F., Shi, K., Zhang, L., Tao, A., Kawashima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+nanoparticles+loaded+with+insulin-phospholipid+complex+for+oral+delivery%3A+preparation%2C+in+vitro+characterization+and+in+vivo+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Biodegradable nanoparticles loaded with insulin-phospholipid complex for oral delivery: preparation, in vitro characterization and in vivo evaluation.</a> J Control Release. 114 (2), 242-250 (2006).</li>
<li>Kavanaugh, T. E., Werfel, T. A., Cho, H., Hasty, K. A., Duvall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle-based+technologies+for+osteoarthritis+detection+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Deliv+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Particle-based technologies for osteoarthritis detection and therapy.</a> Drug Deliv Transl Res. , (2015).</li>
<li>Joshi, R. V., Nelson, C. E., Poole, K. M., Skala, M. C., Duvall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+pH-+and+temperature-responsive+microparticles+for+protein+delivery+to+ischemic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Dual pH- and temperature-responsive microparticles for protein delivery to ischemic tissues.</a> Acta Biomater. 9 (5), 6526-6534 (2013).</li>
<li>Poole, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS-responsive+microspheres+for+on+demand+antioxidant+therapy+in+a+model+of+diabetic+peripheral+arterial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease.</a> Biomaterials. 41, 166-175 (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

kültür içinde β-hücresi çoğalmasının bir çalışma tipik olarak birkaç zorluklar tarafından engellenmiştir. İlk olarak, ölümsüzleştirilmiş β-hücresi çizgileri canlı adacıklar endojen β-hücrelerinde bulunan daha çoğalmasının yüksek derecede karakterize edilir. Buna ek olarak, bu ölümsüz hücre kuşakları, normal β-hücresi fonksiyonu için kritik normal yapısını yoksundur. Bu iki olgu sonuçlar, in vivo ya da bütün adacıklar test edildiğinde de geçerli olacaktır ölümsüzleştirilmiş β-hücresi çizgileri kullanılarak elde ...

Pankreas β-hücrelerinin vücuttaki yalnızca insülin üreten hücreler ve kan glukoz homeostazı sürdürmek için önemlidir. Sağlıklı bireylerin yeterli β-hücresi kütlesi ve uygun kan şekeri düzenleme işlevi de, diyabetli kişilerin yeterli β-hücresi kütlesi ve / veya fonksiyonu 1,2 ile karakterize edilmektedir. Β-hücresi çoğalmasını indükleyen sonuçta β-hücresi kütlesini artırmak ve diyabet 3 bireylerde glikoz dengesini geri olabilir önerilmiştir. etkili tedavilerin geliştirilebilir önce ancak, değerlendirme ve bozulmamış adacıklardaki potansiyel β-hücresi proliferatif bileşiklerin doğrulama gereklidir. Diyabetli bireyler haline kadavra insan adacıklar Nakli süredir kan glikoz dengesini geri yükler, ancak kullanılabilirliği ve bu deneysel işlemin başarısı adacıkları kıç nakli için mevcut insan adacık bir sıkıntısı ve ß-hücre ölümüne tarafından engellenirer nakli 4. Hatta insülin üreten hücrelerin çoğalmasını faktörlerin keşfiyle, büyük bir sorun hala in vivo ilgili sitelere bu faktörlerin teslim bulunmaktadır. β-hücresi proliferatif bileşiklerinin sürekli olarak verilmesi için bir strateji, poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA). PLGA FDA kullanım öyküsü, yüksek güvenlik, biyolojik olarak parçalanma ve uzatılmış salım kinetik 5 sayesinde ilaç verme ürünlerini onaylı vardır. Özellikle PLGA in vivo ya da vücutta doğal olarak oluşan metabolitlerin laktik asit ve glikolik asit içine kültüründe ya su ile hidroliz ile degrade laktit ve glikolid kopolimeridir. Kapsüllenmiş madde bileşiği, difüzyon ve / veya bozunma kontrollü salım mekanizmalarının her ikisi tarafından çevredeki salınabilir. COI kapsüllenmesi unencapsula göre reaktif biyolojik alınabilirliğini geliştirmek için, enzimatik bozulmaya karşı koruma sağlarted COI 5. Bu PLGA mikro-kültür, bozulmamış adacıklardaki Aday bileşiklerin uygulanması için kullanılan ve edilebilir nihai olarak canlı üzerinde olduğunu göstermektedir. Transplantasyon protokolleri incelenmiştir önce ex vivo adacıklar için β-hücre mitojenler yönetmek için PLGA etkinliğini test önemlidir. Şu anda, canlı hayvanlarda β-hücresi çoğalmasını ölçmek için herhangi bir teknik yoktur. Deneyler, bu nedenle immunolabeling için Pankreatanın sonraki diseksiyon ve işleme, canlı hayvan bu bileşiklerin tatbikatını gerektiren in vivo potansiyel proliferatif bileşiklerinin etkinliğini değerlendirmek. Bu protokoller, pahalı ve zahmetli olan, ve adacıklar ulaşacak bir garantisi olmadan, sistemik olarak uygulanabilir bileşiğin gerektirir. Bunun aksine, çok ölümsüzleştirilmiş β-hücreleri, kültür insülin üreten hücrelerin çalışma için kullanılabilir, ancak bu hücre hatları adacık mimarisi ve ORTAM eksikliğit organizmalar 6 canlı bulundu. Ölümsüzleştirilmiş β-hücre hatları da, böylece, in vivo endogen β-hücrelerinin daha replikasyon çok daha yüksek bir derecesine sahip proliferasyonunu bileşiklerin analizi komplike olarak karakterize edilir. Bu çalışmada, yetişkin farelerden izole edilen sağlam adacıklar kullanan bir protokol açıklar. β-hücresi çizgileri farklı olarak, bozulmamış adacıklardaki normal adacık mimarisi korur. Benzer şekilde, doğrudan kültür, bozulmamış adacıklardaki proliferatif bileşiklerin uygulanması İn vivo yapılan deneylerde, aksine önemli ölçüde doğru β-hücresi çoğalmasını ölçmek için gerekli olan reaktifler miktarını azaltmaktadır. Bu çalışma, bu örnekte, bir COI yönetmek için PLGA kullanan rekombinant insan bağ dokusu büyüme faktörü (rhCTGF). Bu inci halinde bileşik sürekli salgılanmasına izin veren burada tarif edilen yöntem, kültürlenmiş adacık ham bileşiğin tatbikat üzerine önemli bir avantaj kazandırane medya. Özellikle, bu deney proteinler ve bozulmamış adacıklardaki ilgi antikorların çeşitli yönetmek için değiştirilebilir. α-hücreleri de dahil olmak üzere başka endokrin hücre tipleri üzerinde etkiler de analiz edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Oregon Yeşili 488 Karboksilik Asit, Süksinimidil Ester, 6-izomer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>O6149</td><td>COI'yi florofor</td></tr><tr><td>DMSO Dimetil Sülfoksit</td> ile etiketlemek için <td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-1</td><td>Adım 1'de floroforu çözmek için</td></tr><tr><td>Tek kullanımlık PD-10 Tuz Giderme Sütunları</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td>Adım 1'de</td></tr> <tr><td>kullanılan tuz giderme sütunuResomer RG 505, Poli (D, L-laktid-ko-glikolid), ester sonlu, moleküler ağırlık 54.000 - 69.000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>739960</td><td>Adım 2'de mikrokürelerin oluşturulmasında kullanılır</td></tr><tr><td>Poli (vinil alkol) moleküler ağırlık 89.000 - 98.000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341584</td><td>Adım 2'de mikro kürelerin oluşturulmasında kullanılır</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Scientific</td><td>11879-020</td><td>Adacıkların kültürlenmesi için</td></tr><tr><td>Dekstroz Susuz</td><td>Fisher BioReagents</td><td>200-075-1</td><td>Adacıklar ortamı için takviye</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>Adacıklar için antibiyotikler</td></tr><tr><td>Normal at serumu</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>008-000-121</td><td>Adacıklar için ek</td></tr><tr><td>96 oyuklu doku kültürü plakası</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>Adacıkların</td></tr> <tr><td>kültürü içinEtilen gliko-bis (2-aminoetileter) - N, N, N', N' -tetraasetik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>Ön tahlil adacık ortamı için takviye</td></tr><tr><td>Cytospin 4 Sitosantrifüj</td><td>Termo Bilimsel</td><td>A78300003</td><td>Hücreleri mikroskop slaytları üzerine döndürmek için</td></tr><tr><td>EZ Tek Sitohuni</td><td>Termo Bilimsel</td><td>A78710020</td><td>Hücreleri mikroskop slaytları</td></tr> <tr><td>üzerinde döndürmek içinEtilendiamintetraasetik asit</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP118-500</td><td>Adacıkların ayrıştırılmasında kullanılır</td></tr><tr><td>paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Hücreleri sabitlemek için</td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151</td><td>Geçirgen hücreler için</td></tr><tr><td>Normal eşek serumu</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>İmmünofloresan için bloke edici reaktifler</td></tr><tr><td>Ki67 için anti-Ki67 antikoru</td><td>abcam</td><td>ab15580</td><td>immünofloresan</td></tr><tr><td>Poliklonal Gine Domuzu Anti-İnsülin</td><td>Dako</td><td>A0564</td><td>İnsülin immünofloresan</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure için Eşek Anti-Tavşan</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td>Ki67 immünofloresan</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-175-148</td><td>İnsülin immünofloresan</td></tr><tr><td>için DAPI (4 ',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroklorür)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td>İmmünofloresan Aqua-Mount'ta</td></tr> <tr><td></td><td>çekirdek görselleştirme içinLerner Laboratories</td><td>13800</td><td>Hızlı kuruyan montaj ortamı</td></tr><tr><td>FreeZone -105 > C 4.5 Litre Cascade Tezgah Üstü Dondurarak Kurutma Sistemi</td><td>Labconco</td><td>7382020</td><td>Mikrokürelerin liyofilizasyonu için</td></tr></tbody></table>

bozulmamış fare adacık için β-hücre mitogenlerin sürekli İdaresi<em&gt; ex vivo</em&gt; biyolojik olarak parçalanabilir poli (laktik-ko-glikolik asit) mikro kullanılması

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

biyo gelişimi, pankreas β-hücreleri de dahil olmak, hücre ve doku tiplerinin çeşitli hedeflenen ilaç iletimi için potansiyel önemli ölçüde arttırmıştır. Buna ek olarak, biyomalzeme parçacıklar, hidrojeller ve iskeleleri de eşsiz bir fırsat sunmak sürekli yönetebileceğini için, kontrol ilaç dağıtım ß-hücrelerinin kültür ve nakledilen doku modelleri. Bu teknolojiler sağlam adacıklar ve bir öteleme ilgili sistemini kullanarak aday β-hücre çoğalma faktörleri çalışma izin verir. Ayrıca, bir kültür sistemi içinde β-hücresi çoğalmasının uyarılması için aday faktörlerinin etkinliği ve uygulanabildiğini ortaya in vivo modeller ilerlemeden önce önemlidir. Bu yazıda, ilgi biyobozunur bileşik (ÇÇ) -yüklü poli (laktik-ko-glikolik asit) in situ bırakma o da sürekli etkilerini değerlendirmek amacıyla (PLGA) mikroküreler ile bozulmamış fare adacıklar kültür işbirliği için bir yöntem tarifβ-hücre çoğalması f mitojenik faktörler. Bu teknik, ticari olarak temin edilebilir maddeler kullanarak istediğiniz kargo içeren PLGA mikro küreler oluşturmak için nasıl ayrıntılı olarak anlatılmaktadır. tarif edilen teknik, bir örnek olarak, rekombinant insan bağ dokusu büyüme faktörü (rhCTGF) kullanırken, COI çok çeşitli kolaylıkla kullanılabilir. Buna ek olarak, bu yöntem, β-hücresi çoğalmasını değerlendirmek için gerekli reaktiflerin miktarını en aza indirmek için, 96 gözlü levhalar kullanmaktadır. Bu protokol, hali hazırda alternatif bir biyo materyaller ve hücre yaşamım ve durumu gibi diğer endokrin hücre özelliklerini kullanmak için adapte edilebilir.

Şekil 1, yukarıdaki protokol kullanılarak oluşturulan mikro-görsel bir temsilidir. Burada açıklanan protokol çeşitli büyüklüklerde rhCTGF yüklü mikro küreler elde edilir. Bazı mikro daha büyük (Şekil 2) olabilir ancak mikro kürelerin büyük kısmı, çapı 1 um ila 10 olacaktır. Eğer arzu edilirse, mikro küre boyutu ayarlanmış ve homojenizasyon hızı ve süresi, kullanılan yüzey aktif madde konsantrasyonu, ve her bir su / yağ / su fazı 10<...

Burada, β hücre proliferasyonunun müteakip immünofloresan analizi ile kültürdeki bozulmamış fare adacıklarına ilgi yüklü poli(laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) mikrokürelerinin bileşiğini oluşturmak ve uygulamak için metodoloji sunuyoruz. Bu yöntem, aday β hücreli mitojenlerin etkinliğini belirlemek için uygundur.

Bozulmamış Fare Adacık için β-hücre mitogenlerin Sürekli İdaresi<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Biyolojik olarak parçalanabilir poli (laktik-ko-glikolik asit) mikro kullanılması

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

Bu protokolün genel amacı, bireysel bileşiklerin yetişkin pankreas beta hücresi proliferasyonu üzerindeki etkilerini incelemek amacıyla, kültüre edilmiş sağlam pankreas adacıklarına ilgi duyulan bileşikleri iletmek için Poli(laktik-ko-glikolik Asit) veya PLGA mikroküreleri kullanmaktır. Bu yöntem, sağlam adacıklara yerel olarak ve kontrollü salınım şeklinde iletilen çeşitli bileşikleri test etmek için kullanılabilir. Bu yöntemin temel avantajı; alternatif iletim biyomalzemeleri, ilgi duyulan bileşikler ve uç nokta analizleri için kolayca uyarlanabiliyor olmasıdır.Bu yöntem, ilgi duyulan bileşiklerin, uygulanan in vivo adacık transferi ile birlikte iletilmesi potansiyeline de sahiptir. PLGA mikrokürelerin nasıl hazırlanacağını, laboratuvarımdaki lisansüstü öğrenci Taylor Kavanaugh gösterecek. İlk su fazını oluşturmak için, bir miligram floresan işaretli ilgi duyulan bileşiği 100 µL deiyonize suya ekleyerek başlayın.Ardından, bir sintilasyon şişesinde 750 µL diklorometran içerisinde 65 mg PLGA çözün ve PLGA'nın tamamen çözünmesi için karışımı 160 W gücünde 10 ila 30 saniye boyunca ultrasonikasyona tabi tutun. Bu işlem yağ fazını oluşturur. İlk su fazının tamamını damla damla yağ fazına ekleyin.Ardından, ilk su-yağ fazını oluşturmak için el tipi bir homojenizatör kullanarak çözeltiyi 20, 000 rpm hızında 30 saniye boyunca emülsifiye edin. Daha sonra, ilk su-yağ fazının tamamını 15 mililitre %1 PVA çözeltisi içine damla damla ekleyin ve az önce gösterildiği gibi emülsifiye edin. Sonrasında, emülsiyonun tüm hacmini 200 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir balona aktarın ve sulu fazı oluşturmak için bir döner evaporatör kullanarak çözücüyü 635 mmHg vakum altında bir saat boyunca uzaklaştırın.Sulu fazdan birer mililitre alarak 14 mikrosantrifüj tüpüne paylaştırın ve mikrosferleri santrifüjleme yoluyla çöktürün. Santrifüj işlemi bittiğinde, çökelekleri dağıtmamaya dikkat ederek bir mikropipet yardımıyla her tüpten 900 mikrolitre sulu çözeltiyi uzaklaştırın. Mikrosferleri bir mililitre deiyonize su ile yıkayın ve ardından süpernatantın 900 mikrolitresini dikkatlice uzaklaştırın.Ardından, geri kalan 100 µL süpernatandan sonra 900 µL deiyonize su ekleyin. Daha sonra pelletleri yeniden süspansiyona getirmek için kısa süreliğine vorteksleyin ve sonikleyin. İlgili deney hayvanlarından adacıklar izole edildikten sonra, görsel olarak boyutları eşleşmiş 40 adacığı, 200 µL adacık kültür ortamı içerisinde 96 kuyucuklu bir doku kültürü plağının bir kuyucuğuna ekleyin.Ertesi sabah, tüpteki ilgili bileşiğin nihai konsantrasyonu 10 ng/µL olacak şekilde, bir mikrosfer alikotunu analiz öncesi ortamında yeniden süspanse edin ve mikrosferleri dört derece santigrat sıcaklıkta, buzlu su banyosunda, 10 saniyelik darbelerle 160 watt'ta 10 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun. Ardından, adacıkları yerinden oynatmadan her kuyucuktan 100 µL adacık kültür ortamını dikkatlice uzaklaştırın ve kültürleri 100 µL mikrosfer içeren analiz ortamı ile inkübe edin. Üç gün sonra, adacıkları rahatsız etmeden tüm kuyucuklardaki analiz ortamını dikkatlice dökün ve adacıkları 200 µL PBS ile iki kez nazikçe yıkayın.Adacıklar, 96 kuyucuklu plakaya yalnızca gevşek bir şekilde tutunurlar. Bu nedenle, adacıkların yanlışlıkla yerinden çıkıp atılmaması için ortamın ve PBS'nin her kuyucuktan nazikçe uzaklaştırılması kritik önem taşır. İkinci yıkamadan sonra, adacıkları oda sıcaklığında üç dakika boyunca 100 µL trypsin EDTA çözeltisine nazikçe daldırın ve ikinci dakikadan sonra hafifçe pipetleyin.Her kuyucuktaki hacmin tamamını ayrı mikrocentrifüj tüplerine aktarın ve disosiyasyonu durdurmak için her tüpe 400 µL adacık kültür medyumu ekleyin. Mikrosferle işlem görmüş adacıkları santrifüjleme yoluyla topladıktan sonra, süpernatantları bir mikropipet kullanarak nazikçe uzaklaştırın ve peletleri 200 µL taze adacık kültür medyumu içinde yeniden süspanse edin. Ardından, disosiye olmuş adacıkları bir sitosantrifüj kullanarak şarj edilmiş mikroskop lamları üzerine çöktürün.Havada kuruttuktan sonra, adacıkların etrafını hidrofobik bir işaretleme kalemiyle çerçeveleyin ve hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 75 µL yüzde dört paraformaldehit ile fikse edin, ardından 75 µL PBS ile iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, hücreleri 10 dakika boyunca PBS içinde 0,2% Triton X-100 içeren 75 µL çözelti ile permeabilize edin ve son olarak 75 µL PBS ile yıkayın. Adacıkları immünlekelemek için, önce lamları hücre yüzeyleri yukarı bakacak şekilde nemli bir hazneye yerleştirin ve PBS'yi uzaklaştırın.Ardından, oda sıcaklığında 75 µL normal eşek serumu ile spesifik olmayan bağlanmayı engelleyin. Bir saat sonra, serumu 75 µL ilgili primer antikor ile değiştirip oda sıcaklığında bir saat daha bekletin. İnkübasyonun sonunda, primer antikor çözeltisini dikkatlice aspire edin ve örnekleri 375 µL PBS yıkamalarıyla yıkayın.Ardından adacıkları, ışıktan korunmuş oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübasyon için 75 µL uygun immunofloresan işaretli sekonder antikor ile inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, sekonder antikor solüsyonunu 75 µL Dappy ile değiştirip üç dakika bekletin ve ardından beş dakika deiyonize su ile durulayın. Yıkama işleminin sonunda, anti-solma reaktifi içeren 100 µL hızlı kuruyan montaj solüsyonundan bir damlayı cam bir lamelle damlatın ve bir mikroskop lamini, numune tarafı aşağı gelecek şekilde montaj solüsyonunun üzerine ters çevirerek yerleştirin.Bazı mikroküreler daha büyük olabilse de, mikrokürelerin en büyük kısmı 1-10 mikron çapında olacaktır. Bütün PLGA mikroküreleri ile işlem görmüş adacıkların dağıtılmasını ve ardından gelen immün etiketlemeyi takiben, yıkama basamakları sırasında tamamen uzaklaştırılmamış bütün mikrokürelerin neden olduğu, hücreler arasında herhangi bir etiketleme içermeyen örnek bölgelerinin görülmesi yaygındır. Görüntüleme sonrası, Ki67 insülin pozitif hücrelerin yüzdesi, yazılım görüntü analizi kullanılarak veya etiketli hücrelerin toplam sayısı manuel olarak sayılarak nicelendirilebilir.Az önce gösterildiği gibi, sağlam adacıkların üç gün boyunca rekombinan insan bağ dokusu büyüme faktörü PLGA mikroküreleri ile işlenmesi, beta hücre proliferasyonunda artışla sonuçlanır; bu durum, proteinin mikroküre oluşumu sırasında herhangi bir fonksiyon kaybına uğramadığını kanıtlamaktadır. Bu teknik ustalaşıldığında ve uygun şekilde uygulandığında, bir haftadan kısa sürede sonuçlar verebilir. Bu prosedürü uygularken, deneyinizdeki beta hücre proliferasyonu üzerindeki etkinin, ilgilenilen bileşiğe ve üretilen mikrokürelerin kesin salınım kinetiğine bağlı olarak değişkenlik göstereceğini unutmamak önemlidir.Bu prosedürün ardından, ilgi duyulan bileşiğin in vivo ortamda beta hücre proliferasyonunu tetikleyip tetikleyemeyeceği gibi diğer soruları yanıtlamak için, bileşik yüklü mikrokürelerin sağlam pankreas adacıklarıyla birlikte kotransplantasyonu gibi diğer yöntemler uygulanabilir. PLGA, FDA tarafından onaylanmış cihazlarda ve ilaç iletim sistemlerinde kullanım geçmişine sahiptir; bu nedenle, terapötik yüklerin belirlenmiş dokulara uzun bir süre boyunca iletilmesini isteyen araştırmacılar ve klinisyenler için iyi bir seçenektir. Bu videoyu izledikten sonra, bileşik yüklü PLGA mikrokürelerin nasıl üretileceği ve bunların kültürlenmiş sağlam adacıklara nasıl uygulanacağı konusunda kapsamlı bir anlayış kazanmış olmalısınız.Paraformaldehit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken uygun kişisel koruyucu donanım giymek gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

sustained-administration-cell-mitogens-to-intact-mouse-islets-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Burada, tip 2 diyabetin fare modelinden adacıkların izolasyonu için bir protokol, Leprdb ve 2 foton mikroskobu kullanan sağlam adacıklardan insülin sekresyonunun ölçümü için bir canlı hücre testinin ayrıntılarını sunuyoruz.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Tip 2 Diyabet Fare Modeli: Bozulmamış Islets Of Pankreas Adacık İzolasyonu ve Canlı hücre 2-Foton Görüntüleme

Bu protokol, murine iz izolasyonunu ve bir desellularize iskele üzerine tohumlamayı gösterir. İskele destekli adacıklar streptozotosin (STZ) ile indüklenen diyabetik farelerin epididimal yağ yastığı içine nakledildi. Isletler nakil alanından kurtuldu ve hiperglisemik durumu tersine çevirdi.

Diyabetik Farenin Epididimal Yağ Tabağında Iskelelerin İskele Destekli Nakli

Bu adacık izolasyon protokolü ekroz dokuyu sindirmek için kollajenaz enjeksiyonunun yeni bir rotasını ve adacıkları farelerden arındırmak için basitleştirilmiş bir degrade prosedürünü tanımlamıştır. Enzimatik sindirim, degrade ayırma/arıtma ve adacık el toplama içerir. Başarılı yalıtım fare başına 250-350 yüksek kaliteli ve tam işlevsel adacıklar verebilir.

Farelerden Pankreas Adacık İzolasyon için Basit Bir Yüksek Verimlilik Protokolü

Bir mouse adacıkları omental nakli için bir yöntem tanıttı. İzole adacıkları hidrojel ile karıştırılır ve karışımı bir diyabetik fare omental kese yerleştirilir. Daha sonra kan şekeri izlenir ve IMMUNO-histochemical çözümleme yapılır.

Adacık nakli için Mouse omentumun için bir yöntemi

Pankreas adacık nakli normoglycemia tip 1 diyabet için bir yoludur. Bu makale nakli tekniği normal glikoz düzeyleri diyabetik farelerde korumak için intraportal rota üzerinden üzerinde duruluyor.

İntraportal fare modeli pankreas adacıkları nakli

Burada, bir protokol adacık nakli örnek tarafından resimli hidrojel tabanlı hücre tedavisinin içinde vivo doğrulama için mevcut. (hOMING) implantasyon doldurma h Omental matris adacık hücre hidrojel karışımı kan damarları engraftment uygun metabolik ortamında en üst düzeye çıkarmak için yakın omental katmanlar arasında implantasyonu sağlar.

İçi Omental adacık nakli kullanarak h Omental matris adacık doldurma (posta)

Bu protokolde inguinal subkutan beyaz yağ dokusuna murine adacık izolasyonu ve transplantasyon yöntemi tanımlanmıştır. İzole syngeneic murine adacıkları bir murine alıcı içine bir bodrum membran hidrojel kullanılarak nakledilir. Alıcıların kan şekeri düzeyi izlenir ve adacık greftlerinin histoloji analizi yapılır.

Inguinal Subkutan Beyaz Yağ Dokusu (ISWAT) Transplantasyon Modeli Murine Adacıkları

Burada, farelerde klinik olarak ilgili ancak teknik olarak zorlayıcı bir cerrahi prosedür olan intraportal adacık transplantasyonunun başarılı bir şekilde gerçekleştirilmesi için rafine cerrahi prosedürler sunulmaktadır.

Farelerde İntrahepatik Adacık Transplantasyonu Sırasında İnfüzyon Sonrası Portal Ven Kanamasının En Aza İndirgenmesi

Bu çalışma, fare pankreasındaki fonksiyonel birincil adacıqları ve asinar hücreleri verimli bir şekilde çıkaran basitleştirilmiş bir yöntem geliştirdi ve Akut Pankreatit Kaynaklı Diyabetin patogenezinde hücrelerarası iletişimi incelemek için değerli bir araç sağladı.

Farelerden Birincil Adaçik Ve Birincil Pankreas Asinar Hücrelerinin Eşzamanlı İzolasyonu İçin Basit ve Hızlı Bir Yöntem

İnsan kök hücresinden türetilen pankreas kök hücresi adacıklarının immunodefisive farelere in vivo implantasyon ve sonraki analizler için kas içi nakli için minimal invaziv bir protokol sunuyoruz.

Farelerde İnsan Pluripotent Kök Hücresinden Türetilen Pankreas Endokrin Hücrelerinin Intramusküler Nakli

Öğrenin, fare adacıklarında beta hücre proliferasyonunu incelemek için biyobozunur PLGA mikrokürelerle sürekli bileşik salınımı yöntemini. Bu teknik diyabet tedavileri için yeni araştırma olanakları sunar.

Bozulmamış Fare Adacık için β-hücre mitogenlerin Sürekli İdaresi Ex Vivo Biyolojik olarak parçalanabilir poli (laktik-ko-glikolik asit) mikro kullanılması (Video) | JoVE Journal

Bozulmamış Fare Adacık için β-hücre mitogenlerin Sürekli İdaresi

Daha fazla video keşfet