Bozulmamış Fare Adacık için β-hücre mitogenlerin Sürekli İdaresi

Bu protokolün genel amacı, bireysel bileşiklerin yetişkin pankreas beta hücresi proliferasyonu üzerindeki etkilerini incelemek amacıyla, kültüre edilmiş sağlam pankreas adacıklarına ilgi duyulan bileşikleri iletmek için Poli(laktik-ko-glikolik Asit) veya PLGA mikroküreleri kullanmaktır. Bu yöntem, sağlam adacıklara yerel olarak ve kontrollü salınım şeklinde iletilen çeşitli bileşikleri test etmek için kullanılabilir. Bu yöntemin temel avantajı; alternatif iletim biyomalzemeleri, ilgi duyulan bileşikler ve uç nokta analizleri için kolayca uyarlanabiliyor olmasıdır.

Bu yöntem, ilgi duyulan bileşiklerin, uygulanan in vivo adacık transferi ile birlikte iletilmesi potansiyeline de sahiptir. PLGA mikrokürelerin nasıl hazırlanacağını, laboratuvarımdaki lisansüstü öğrenci Taylor Kavanaugh gösterecek. İlk su fazını oluşturmak için, bir miligram floresan işaretli ilgi duyulan bileşiği 100 µL deiyonize suya ekleyerek başlayın.

Ardından, bir sintilasyon şişesinde 750 µL diklorometran içerisinde 65 mg PLGA çözün ve PLGA'nın tamamen çözünmesi için karışımı 160 W gücünde 10 ila 30 saniye boyunca ultrasonikasyona tabi tutun. Bu işlem yağ fazını oluşturur. İlk su fazının tamamını damla damla yağ fazına ekleyin.

Ardından, ilk su-yağ fazını oluşturmak için el tipi bir homojenizatör kullanarak çözeltiyi 20, 000 rpm hızında 30 saniye boyunca emülsifiye edin. Daha sonra, ilk su-yağ fazının tamamını 15 mililitre %1 PVA çözeltisi içine damla damla ekleyin ve az önce gösterildiği gibi emülsifiye edin. Sonrasında, emülsiyonun tüm hacmini 200 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir balona aktarın ve sulu fazı oluşturmak için bir döner evaporatör kullanarak çözücüyü 635 mmHg vakum altında bir saat boyunca uzaklaştırın.

Sulu fazdan birer mililitre alarak 14 mikrosantrifüj tüpüne paylaştırın ve mikrosferleri santrifüjleme yoluyla çöktürün. Santrifüj işlemi bittiğinde, çökelekleri dağıtmamaya dikkat ederek bir mikropipet yardımıyla her tüpten 900 mikrolitre sulu çözeltiyi uzaklaştırın. Mikrosferleri bir mililitre deiyonize su ile yıkayın ve ardından süpernatantın 900 mikrolitresini dikkatlice uzaklaştırın.

Ardından, geri kalan 100 µL süpernatandan sonra 900 µL deiyonize su ekleyin. Daha sonra pelletleri yeniden süspansiyona getirmek için kısa süreliğine vorteksleyin ve sonikleyin. İlgili deney hayvanlarından adacıklar izole edildikten sonra, görsel olarak boyutları eşleşmiş 40 adacığı, 200 µL adacık kültür ortamı içerisinde 96 kuyucuklu bir doku kültürü plağının bir kuyucuğuna ekleyin.

Ertesi sabah, tüpteki ilgili bileşiğin nihai konsantrasyonu 10 ng/µL olacak şekilde, bir mikrosfer alikotunu analiz öncesi ortamında yeniden süspanse edin ve mikrosferleri dört derece santigrat sıcaklıkta, buzlu su banyosunda, 10 saniyelik darbelerle 160 watt'ta 10 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun. Ardından, adacıkları yerinden oynatmadan her kuyucuktan 100 µL adacık kültür ortamını dikkatlice uzaklaştırın ve kültürleri 100 µL mikrosfer içeren analiz ortamı ile inkübe edin. Üç gün sonra, adacıkları rahatsız etmeden tüm kuyucuklardaki analiz ortamını dikkatlice dökün ve adacıkları 200 µL PBS ile iki kez nazikçe yıkayın.

Adacıklar, 96 kuyucuklu plakaya yalnızca gevşek bir şekilde tutunurlar. Bu nedenle, adacıkların yanlışlıkla yerinden çıkıp atılmaması için ortamın ve PBS'nin her kuyucuktan nazikçe uzaklaştırılması kritik önem taşır. İkinci yıkamadan sonra, adacıkları oda sıcaklığında üç dakika boyunca 100 µL trypsin EDTA çözeltisine nazikçe daldırın ve ikinci dakikadan sonra hafifçe pipetleyin.

Her kuyucuktaki hacmin tamamını ayrı mikrocentrifüj tüplerine aktarın ve disosiyasyonu durdurmak için her tüpe 400 µL adacık kültür medyumu ekleyin. Mikrosferle işlem görmüş adacıkları santrifüjleme yoluyla topladıktan sonra, süpernatantları bir mikropipet kullanarak nazikçe uzaklaştırın ve peletleri 200 µL taze adacık kültür medyumu içinde yeniden süspanse edin. Ardından, disosiye olmuş adacıkları bir sitosantrifüj kullanarak şarj edilmiş mikroskop lamları üzerine çöktürün.

Havada kuruttuktan sonra, adacıkların etrafını hidrofobik bir işaretleme kalemiyle çerçeveleyin ve hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 75 µL yüzde dört paraformaldehit ile fikse edin, ardından 75 µL PBS ile iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, hücreleri 10 dakika boyunca PBS içinde 0,2% Triton X-100 içeren 75 µL çözelti ile permeabilize edin ve son olarak 75 µL PBS ile yıkayın. Adacıkları immünlekelemek için, önce lamları hücre yüzeyleri yukarı bakacak şekilde nemli bir hazneye yerleştirin ve PBS'yi uzaklaştırın.

Ardından, oda sıcaklığında 75 µL normal eşek serumu ile spesifik olmayan bağlanmayı engelleyin. Bir saat sonra, serumu 75 µL ilgili primer antikor ile değiştirip oda sıcaklığında bir saat daha bekletin. İnkübasyonun sonunda, primer antikor çözeltisini dikkatlice aspire edin ve örnekleri 375 µL PBS yıkamalarıyla yıkayın.

Ardından adacıkları, ışıktan korunmuş oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübasyon için 75 µL uygun immunofloresan işaretli sekonder antikor ile inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, sekonder antikor solüsyonunu 75 µL Dappy ile değiştirip üç dakika bekletin ve ardından beş dakika deiyonize su ile durulayın. Yıkama işleminin sonunda, anti-solma reaktifi içeren 100 µL hızlı kuruyan montaj solüsyonundan bir damlayı cam bir lamelle damlatın ve bir mikroskop lamini, numune tarafı aşağı gelecek şekilde montaj solüsyonunun üzerine ters çevirerek yerleştirin.

Bazı mikroküreler daha büyük olabilse de, mikrokürelerin en büyük kısmı 1-10 mikron çapında olacaktır. Bütün PLGA mikroküreleri ile işlem görmüş adacıkların dağıtılmasını ve ardından gelen immün etiketlemeyi takiben, yıkama basamakları sırasında tamamen uzaklaştırılmamış bütün mikrokürelerin neden olduğu, hücreler arasında herhangi bir etiketleme içermeyen örnek bölgelerinin görülmesi yaygındır. Görüntüleme sonrası, Ki67 insülin pozitif hücrelerin yüzdesi, yazılım görüntü analizi kullanılarak veya etiketli hücrelerin toplam sayısı manuel olarak sayılarak nicelendirilebilir.

Az önce gösterildiği gibi, sağlam adacıkların üç gün boyunca rekombinan insan bağ dokusu büyüme faktörü PLGA mikroküreleri ile işlenmesi, beta hücre proliferasyonunda artışla sonuçlanır; bu durum, proteinin mikroküre oluşumu sırasında herhangi bir fonksiyon kaybına uğramadığını kanıtlamaktadır. Bu teknik ustalaşıldığında ve uygun şekilde uygulandığında, bir haftadan kısa sürede sonuçlar verebilir. Bu prosedürü uygularken, deneyinizdeki beta hücre proliferasyonu üzerindeki etkinin, ilgilenilen bileşiğe ve üretilen mikrokürelerin kesin salınım kinetiğine bağlı olarak değişkenlik göstereceğini unutmamak önemlidir.

Bu prosedürün ardından, ilgi duyulan bileşiğin in vivo ortamda beta hücre proliferasyonunu tetikleyip tetikleyemeyeceği gibi diğer soruları yanıtlamak için, bileşik yüklü mikrokürelerin sağlam pankreas adacıklarıyla birlikte kotransplantasyonu gibi diğer yöntemler uygulanabilir. PLGA, FDA tarafından onaylanmış cihazlarda ve ilaç iletim sistemlerinde kullanım geçmişine sahiptir; bu nedenle, terapötik yüklerin belirlenmiş dokulara uzun bir süre boyunca iletilmesini isteyen araştırmacılar ve klinisyenler için iyi bir seçenektir. Bu videoyu izledikten sonra, bileşik yüklü PLGA mikrokürelerin nasıl üretileceği ve bunların kültürlenmiş sağlam adacıklara nasıl uygulanacağı konusunda kapsamlı bir anlayış kazanmış olmalısınız.

Paraformaldehit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken uygun kişisel koruyucu donanım giymek gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.