Name: Sabit Görüntüleme prometafaz ve Metafaz Mayoz ve I Teknikleri Drosophila Oositler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Öğrenin Drosophila oositlerinde mayoz I sırasında iğ iplikçik montajı ve kromozom yönelimini sitolojik olarak incelemek için sabit görüntüleme tekniklerini. Bu yöntem, sentrozomlar olmadan iğ iplikçik bipolaritesinin nasıl kurulduğunu araştırmaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

CENP-C antikorunu sağladığı için Christian Lehner'e ve FISH önerileri için Eric Joyce'a teşekkür ederiz. McKim laboratuvarındaki çalışmalar, NIH'den (GM101955) bir hibe ile finanse edildi.

Not: Aksi belirtilmediği sürece, işlemler oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Sıcaklık kontrollü inkübatör sinek yetiştirme için sıcaklıkları korumak için kullanılan ve aksi belirtilmediği sürece haçlar vardır. 1. hazırlıklar <ol><li> Sinekler hazırlayın. <ol><li> oosit koleksiyonları prometafaz zenginleştirilmiş. <ol><li> Net yetişkin sağlıklı, genç stok veya çapraz kültürlerinden uçar. 25 ° C&#39;de iki gün için yaş şişe. Not: Genellikle, iki sağlıklı şişe yeterli olacaktır, daha çok bazı çapraz kültürler için gerekli olabilir, ancak. </li><li> İki gün sonra, şişe (bu noktada, 0 ila 2 gün geçmiş) ~ 100 ila 300 kadın toplar. kadın bakire olması gerekmez. Bir şişenin yanına maya hamur dab ekleyin ve 30 kadın ve mayalı şişeleri içine 10 ila 15 erkek her koyun. 25 ° C&#39;de iki gün için yaş şişeler. </li></ol></li><li> Oosit Koleksiyonlar metafaz zenginleştirilmiş. <ol><li> Hisse senedi veya çapraz KÜLTÜR gelen ~ 100 ila 300 kadın toplamakes. Bir şişenin yanına maya hamur dab ekleyin ve 30 kadın yer mayalı şişe içine (ilave hiçbir erkek ile birlikte) her biri. 25 ° C &#39;de üç ila beş gün için yaş şişeler. </li></ol></li></ol></li><li> Çözümler hazırlayın. Not: Aksi belirtilmediği sürece, Solutions, oda sıcaklığında süresiz depolanabilir. <ol><li> Robb tampon Modifiye hazırlama (5x): 500 mM HEPES, 500 mM sukroz, 275 mM sodyum asetat, 200 mM potasyum asetat, 50 mM glukoz, 6 mM magnezyum klorid, 5 mM kalsiyum klorid. 7.4 pH değerini elde etmek için potasyum hidroksit: 8 sodyum hidroksit: 10 K 11 kullanın. filtrasyon ile sterilize; kaynatmayın. -20 ° C&#39;de saklayın. ~ 1x Robb&#39;un oosit başına hazırlık 200 ml hazırlamak için gerekli olarak çözülme. </li><li> Tespit Çözümleri. <ol><li> Seçenek # 1: formaldehit / heptan tespit hazırlayın. Sabitleme tampon hazırlayın: 1x Fosfat tamponlu tuz (PBS) artı 150 mM sukroz. kullanmak için, 687,5 ul Sabitleme Tampon ve 312,5 ul% 16 formaldehit ile taze yapmakoosit hazırlık başına. DİKKAT: Davlumbaz formaldehit çözümlerini kullanırken eldiven giyin. kurumsal kurallarına göre bertaraf edilmelidir. </li><li> Seçenek # 2: formaldehit / kakodilat tespit hazırlayın. Düzeltme Mix hazırlayın: 250 mM sükroz, 100 mM potasyum asetat (pH 7.5), 25 mM sodyum asetat (pH 7.0) ve 25 mM EGTA (pH 8.0). kullanmak için, 400 ul taze karışımı saptamak yapmak 100 ul potasyum kakodilat (1 M, pH 7.2), ve oosit prep 500 ul% 16 formaldehid. DİKKAT: Potasyum kakodilat Arsenik içerir. </li></ol></li><li> 1x PBS artı% 1 veya% 0.05 Triton X-100 PBS / Triton X-100 hazırlayın. 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> 1 x PBS, (ağ / hac)% 0.5 BSA ve% 0.1 Tween-20: PBS-Tween 20 Sığır Serum Albumin (BSA) (PTB) hazırlayın. bir hafta boyunca 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> Situ Hibridizasyon (FISH) Çözümleri floresan. <ol><li> Hazırlama 20X Sodyum klorür-sodyum sitrat (SSC): 3 M sodyum klorür ve 0.3 M sodyum sitrat. </li><li> Hazırlama 2x SSC-Tween-20 (SSCT) 2X SSC artı% 0.1 Tween-20. oosit hazırlık başına taze ~ 20 ml olun. </li><li> formamid çözümler hazırlayın: 2 x SSC,% 0.1 Tween-20, ayrıca formamid. 1 ml% 20 formamid, 0.5 mL% 40 formamid, ve oosit hazırlık başına 2 ml% 50 formamid, taze olun. DİKKAT: Davlumbaz formamid çözümlerini kullanırken eldiven giyin. kurumsal kurallarına göre bertaraf edilmelidir. </li><li> (Ağırlık / hacim) 2X SSC,% 50 formamid,% 10 dekstran sülfat: hibridizasyon çözeltisi hazırlayın. 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> BALIK Probes. <ol><li> Order HPLC ile arıtma sahip oligonükleotid (dizileri için Tablo 1 &#39;e bakınız) ve 5&#39; flüoresan modifikasyonu (örneğin Cy3 veya Cy5) istenen. 50 ng / | il Tris-EDTA (TE) içinde süspanse edin. NOT: Her zaman ışık maruz oligos koruyun. </li></ol></li></ol></li></ol> Geç evre Drosophila Oosit 2. Koleksiyonu <ol><li> Gibi <em&gt; plastik ve cam sopa intakt membranlı Drosophila oositlerin öncesi kat bir 5 ml tüp ve PTB ile oosit hazırlık başına bir süspanse içinde. </li><li> karbon dioksit ile tüm ~ 100 ila 300 mayalı sinekler uyutmak ve ~ 100 ml 1x Robb&#39;un Tamponu içeren bir blender ekleyin. Darbe üç kez (~ 1 sn her). aktivasyonunu önlemek için &lt;için 20 dakika Robb en içinde oosit tutun. NOT: Alternatif olarak, oosit dişilerden el-disseke edilebilir. Bu yöntemin avantajı, daha az kadın gerektirmesidir. Ancak, bakım hipoksi 7 ile bağlantılı bozulmaları önlemek için sadece birkaç dakikaya kadar karbon dioksite maruz sınırlamak için dikkat edilmelidir. </li><li> Büyük beden parçalarını kaldırmak için 250 ml behere büyük örgü (~ 1.500 mm) süzülür. Birçok bozulmamış karnı yine örgü, yeniden eziyet ek Robb&#39;un Tampon kullanarak malzeme ve filtre üzerinde kalırsa. Daha sonra mümkün olduğunca büyük vücut parçaları gibi birçok kaldırarak, üst tabaka aspire ~ 2 dk dinlendiriniz. </li><li> Fi250 ml&#39;lik bir cam kaba, küçük elek (~ 300 um) vasıtasıyla ltresi. Ek Robb adlı ve kaplamalı Pasteur pipet kullanarak ilk beher dışına kalan oosit durulayın. yerleşmek ~ 3 dk edelim; oosit dışarı razı olacak. Aspire off ama ~ 10 ml. </li><li> kaplanmış 5 ml tüp içine sığacak kadar 10 ml kadar dökün. , Yerleşmek sıvı kaldırmak ve kalanı tekrar edelim. Ek Robb adlı ve kaplamalı Pasteur pipet kullanarak kaptan dışarı kalan oosit durulayın. 3-5 dakika ~ 5 ml tüp dinlendiriniz. </li></ol> 3. İlaç Tedavileri (İsteğe bağlı) <ol><li> Coat her oosit hazırlık için PTB ile ikinci 5 ml tüp. 1 ml Robb birbirlerinin oosit hazırlık için, her (Tablo 2), uygun bir çözücü (kontrol) ya da ilaç ekleyin. </li><li> İkinci kaplanmış 5 ml tüp içine bölünmüş oositler. , Yerleşmek Let sıvı kaldırmak ve bir tüp içine 1 ml Robb en artı çözücü eklemek ve 1 ml Robb en artı ilaç ikinci tüpe. Ilaç tedavisi (Tablo 2) uygun zaman miktarı için Nutate. Let yerleşmek. </li></ol> 4. Sabitleme <ol><li> Aspire tüm sıvı ve hemen 1 ml Fix ekleyin. </li><li> Seçenek # 1: Formaldehit / heptan sabitleme (Fixation Tampon artı% 5 formaldehit). <ol><li> Bir nutator 2.5 dakika için düzelt. 1 mi heptan ve 1 dakika vorteksleyin ekleyin. yerleşmek ~ 1 dk olsun. </li><li> tüm sıvı çıkarın ve sonra PBS 1x 1 ml ekleyin. Vortex 30 sn. yerleşmek ~ 1 dk olsun. </li><li> tüm sıvı çıkarın ve sonra 1x PBS ile tüp doldurun. Not: Oositler hemen kullanılabilir ya da oda sıcaklığında birkaç saat boyunca nutator tutulabilir. </li></ol></li><li> Seçenek # 2: Formaldehit / kakodilat sabitleme (Mix artı% 8 formaldehit ve 100 mM kakodilat Fix). <ol><li> Bir nutator 6 dakika düzelt. 2 dakika dinlendiriniz. sıvı çıkarın ve sonra 1x PBS ile tüp doldurun. Not: Oositler hemen kullanılabilir ya da oda sıcaklığında birkaç saat boyunca nutator tutulabilir. </li></ol></li></ol> 5. Membranlar çıkarma ( &quot;Rolling&quot;) <ol><li> kaplanmış yeniden süspanse kullanarak, bir cam slayt buzlu (kumlanmış) kısmına ~ 500 ila 1000 oosit ekleyin. tüm vücut parçaları ve yabancı madde kullanarak forseps çıkarın. oosit kurumasına izin vermeyin; gerektiğinde 1x PBS ilave edin. </li><li> Periyodik mikroskop altında ilerleyişini kontrol (. En iyi şekilde çalışır oosit genelinde lamel kenarına sürükleyerek) kaldırılır tüm membranların kadar oosit ve yavaşça &quot;roll&quot; oosit üstünde bir lamel yerleştirin gerektiğinde daha 1x PBS ekledi. oosit yok edecek çok fazla basınç olarak özen gösterin. NOT: immünfloresans sadece, (immünofloresan olan veya olmayan) FISH için Adım 6 ile devam için, Adım 7 ile devam edin. </li></ol> Drosophila OOSİT 6. Antikor Boyama <ol><li> Ekstraksiyon ve Engelleme <ol><li> ~ 15 mi, PBS /% 1 Triton X-100 ihtiva eden 15 ml konik bir tüp içine haddelenmiş oosit durulayın. en az 1.5 saat için bu çözüm ve en fazla 2 saat içinde Nutate oositler.Bu adım, antikor nüfuz etmesini sağlar. </li><li> oosit ~ 2 dk dinlendiriniz. Mümkün olduğunca çok sayıda membran ile birlikte sıvı çıkarın, daha sonra PBS ekleme /% 0.05 Triton X-100. NOT: Zarlar haddelenmiş oosit daha yavaş geçer. </li><li> oosit ~ 2 dk yerleşmek izin, sonra tüm ama ~ 1 ml sıvı kaldırmak. Transfer oosit 1.5 ml tüp mezun oldu ve kalan sıvı çıkarın. 1 saat boyunca bloke etmek ve nutate 1 mi ATB ekleyin. </li></ol></li><li> antikor Boyama <ol><li> Embriyoların karşı sekonder antikor Ön emilim. Not: Bu adım, Drosophila proteinleri ile spesifik olmayan antikor reaksiyonları arka plan boyaması ortadan kaldırır. <ol><li> Toplayın ve tipik prosedür 8 uyarınca Drosophila embriyolar (~ 25 ul) düzeltmek. -20 ° C&#39;de metanol içinde depolayın. </li><li> , Embriyolardan, metanolün çıkması, 15 dakika boyunca 800 ul metanol artı PBS 1X 200 ul ve nutate ekleyin. süpernatan 500 ul çıkarın ve PBS 1X 500 ul ile değiştirin. Daha sonra 15 dakika boyunca nutate. (Yıkar ~ 1 saat olmak üzere toplam) iki kez tekrarlayın ve sonra PTB bitirmek. Not: Embriyolar hemen kullanılabilir ya da oda sıcaklığında birkaç saat boyunca nutator tutulabilir. </li><li> , Sıvı çıkarın oosit hazırlık başına 200 ul PTB ile doldurun ve uygun dilüsyonlarda floresan etiketli sekonder antikor ekleyin (son hacim 300 ul olacağını göz önünde bulundurarak;. Adım 7.4) Nutate 4 ° C&#39;de gece boyunca (tercih edilir) ya da 3 ila 4 saat boyunca oda sıcaklığında karıştırılmıştır. Not: önceden absorbe antikorlar Aşama 6.2.4 kullanılacaktır. NOT: mümkün olduğu kadar floresan antikorlar eklenmiştir kez karanlıkta örnekleri tutun. </li></ol></li><li> , Oosit sıvıyı çıkarmak 300 ul PTB ile doldurun ve uygun dilüsyonlarda primer antikorlar ekleyin. 4 ° C&#39;de bir gece boyunca Nutate (tercih edilir) ya da 3 ila 4 saat boyunca oda sıcaklığında karıştırılmıştır. </li><li> Yıkama 1 ml PTB 15 dakika her biri için dört kez oosit. </li><li> Kaldıroosit, sıvı, embriyolar (sekonder antikor önceden absorbe) üstte yüzen madde 200 ul ekle. Ardından 300 ul PTB ile doldurun. 3 ila 4 saat (tercihen) veya gece boyunca 4 ° C&#39;de oda sıcaklığında Nutate. </li><li> 1 mi PTB ile 15 dakika boyunca bir kez oosit yıkayın, sıvıyı ayırın. Daha sonra, 7 dakika boyunca 0.5 ul Hoechst 33342 ve 500 ul PTB ve nutate ekleyin. </li><li> 1 mi PTB ile her biri 15 dakika için iki kere oosit yıkayın. Not: Oositler hemen slayt üzerine monte edilebilir veya görüntüleme için hazır olana kadar 4 ° C&#39;de PTB depolanabilir. </li></ol></li></ol> 7. BALIK (Above Adım 5 Devam) <ol><li> ~ 15 ml 2x SSCT içeren 15 ml konik tüp içine yuvarlandı oosit durulayın. oosit ~ 2 dk dinlendiriniz. 0.5 ml sıvı mümkün olduğu kadar çok membran ile birlikte tüm ama ~ çıkarın. NOT: Zarlar haddelenmiş oosit daha yavaş geçer. </li><li> Transferi 0.5 ml tüp oosit ve kalan sıvıyı çıkarın. Arda eklemek ve 500 ul kaldırmak% 20,% 40,% 50 formamid çözeltiler, her çözelti içinde 10 dakika için nutating. NOT: Oositler formamid yüksek oranları ile yavaş geçer. </li><li> daha sonra 1 5 saat boyunca 37 ° C&#39;de 500 ul% 50 formamid çözeltisi ve nutate ekleyin sıvıyı ayırın. NOT: Daha uzun inkubasyon daha sonda penetrasyon ile sonuçlanır. </li><li> En fazla 100 ° den ul oosit bırakarak sıvı çıkarın ve 36 ul hibridizasyon çözeltisi artı prob 2 ul (50 ng / | il) ve 2 ul su veya 2. prob (Tablo 1) 2 ul ekle. </li><li> gece boyunca 37 ° C&#39;de su banyosunda kuluçkaya bırakılır, ardından 3 dakika boyunca (FISH için) ya da 20 dakika (balık artı immünofloresan), 80 ° C, 91 ° C de inkübe edilir. Not: Bu adımlar, bir PCR gerçekleştirilebilir. </li><li> sıvı çıkarmayın. 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de 500 ul% 50 formamid çözeltisi ve nutate ekleyin. </li><li> , Sıvı kaldırmak, yerleşmek Let 500 ul% 50 formamid çözüm ekleyin, bir1 saat süre ile 37 ° C &#39;de D nutate. </li><li> , Sıvının çıkması, yerleşmek izin 10 dakika için oda sıcaklığında 500 ul% 20 formamid çözeltisi ve nutate ekleyin. </li><li> (Tekrarlama birkaç kez ters, sonra sıvı ekleyin kaldır, yerleşmek izin verin.) 500 ul 2x SSCT üç hızlı yıkar gerçekleştirin yerleşmek edelim, sıvı kaldırmak, daha sonra 4 saat boyunca 500 ul ATB ve nutate ekleyin. </li></ol> 8. Antikor Boyama FISH sonra <ol><li> , Oosit sıvıyı çıkarmak 300 ul PTB ile doldurun ve FITC konjuge 10 ul anti-α-tubulin antikor ekleyin. Seçenek olarak ise, diğer antikorlar, yukarıda protokol izlenerek, kullanılabilir. gece boyunca, oda sıcaklığında Nutate. </li><li> daha sonra, 7 dakika boyunca 0.5 ul Hoechst 33342 ve 500 ul PTB ve nutate ekleyin sıvının çıkması, 500 ul PTB ile 15 dakika boyunca bir kez oosit yıkayın. </li><li> 500 ul PTB ile her biri 15 dakika için iki kere oosit yıkayın. Not: Oositler hemen slayt üzerine monte edilebilir ya da hazır olana kadar 4 ° C&#39;de PTB depolanabilirgörüntüleme. mümkün olduğu kadar floresan antikorlar eklenmiştir kez karanlıkta oosit tutun. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1in"> Tekrarlama Ad </td><td fo:width="1in"> Kromozom </td><td> Oligo Sırası * </td></tr><tr><td> 359 </td><td> X </td><td> GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC </td></tr><tr><td> AACAC </td><td> 2 </td><td> AACACAACACAACACAACACAACACAACACAACACAACAC </td></tr><tr><td> dodeka </td><td> 3 </td><td> CCCGTACTGGTCCCGTACTCGGTCCCGTACTCGGT </td></tr><tr><td> 1.686 </td><td> 2 + 3 </td><td> AATAACATAGAATAACATAGAATAACATAG </td></tr><tr><td> AATAT </td><td> 4 (+ Y) </td><td> AATATAATATAATATAATATAATATAATAT </td></tr><tr><td colspan="3"> * Eric Joyce, kişisel iletişim, Sullivan ve ark diğer dizilerden 359 dizisi. 8 </td&gt; </tr></tbody></table> Tablo 1: Drosophila sentromerine tekrarlar için FISH probları. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> İlaç </td><td> çözücü </td><td> stok konsantrasyonu </td><td> Nihai konsantrasyon </td><td> Tedavinin zamanı </td><td> Efekt </td></tr><tr><td> kolşisin </td><td> etanol </td><td> 125 mM </td><td> 150 uM </td><td> 10 dakika ya da 30 dakika </td><td> olmayan kinetochore (10 dakika) 9 veya Tüm (30 dakika) mikrotübül destabilize </td></tr><tr><td> paklitaksel </td><td> DMSO </td><td> 10 mM </td><td> 10 uM </td><td> 10 dk </td><td> mikrofona stabilizerotubules </td></tr><tr><td> Binucleine 2 </td><td> DMSO </td><td> 25 mM </td><td> 25 uM </td><td> 20 dakika </td><td> Aurora B kinaz 10 inhibe </td></tr></tbody></table> Tablo 2: İlaç tedavisi.

<ol><li>Bridges, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-disjunction+as+proof+of+the+chromosome+theory+of+heredity%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Non-disjunction as proof of the chromosome theory of heredity.</a> Genetics. 1 (1), 1-52 (1916).</li>
<li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+err+%28meiotically%29+is+human%3A+the+genesis+of+human+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).</li>
<li>Theurkauf, W. E., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+spindle+assembly+in+Drosophila+females%3A+behavior+of+nonexchange+chromosomes+and+the+effects+of+mutations+in+the+nod+kinesin-like+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Meiotic spindle assembly in Drosophila females: behavior of nonexchange chromosomes and the effects of mutations in the nod kinesin-like protein.</a> J Cell Biol. 116 (5), 1167-1180 (1992).</li>
<li>Zou, J., Hallen, M. A., Yankel, C. D., Endow, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microtubule-destabilizing+kinesin+motor+regulates+spindle+length+and+anchoring+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A microtubule-destabilizing kinesin motor regulates spindle length and anchoring in oocytes.</a> J Cell Biol. 180 (3), 459-466 (2008).</li>
<li>Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+of+a+role+for+heterochromatin+in+meiotic+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation.</a> Cell. 86 (1), 135-146 (1996).</li>
<li>Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congression+of+achiasmate+chromosomes+to+the+metaphase+plate+in+Drosophila+melanogaster+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes.</a> Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).</li>
<li>Gilliland, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+transiently+sequesters+mps1+and+polo+to+collagenase-sensitive+filaments+in+Drosophila+prometaphase+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Hypoxia transiently sequesters mps1 and polo to collagenase-sensitive filaments in Drosophila prometaphase oocytes.</a> PLoS One. 4 (10), e7544(2009).</li>
<li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSullivan%2C+W+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Radford, S. J., Hoang, T. L., Głuszek, A. A., Ohkura, H., McKim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+and+End-On+Kinetochore+Attachments+Are+Coordinated+to+Achieve+Bi-orientation+in+Drosophila+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Lateral and End-On Kinetochore Attachments Are Coordinated to Achieve Bi-orientation in Drosophila Oocytes.</a> PLoS Genet. 11 (10), e1005605(2015).</li>
<li>Smurnyy, Y., Toms, A. V., Hickson, G. R., Eck, M. J., Eggert, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binucleine+2%2C+an+isoform-specific+inhibitor+of+Drosophila+Aurora+B+kinase%2C+provides+insights+into+the+mechanism+of+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Binucleine 2, an isoform-specific inhibitor of Drosophila Aurora B kinase, provides insights into the mechanism of cytokinesis.</a> ACS Chem Biol. 5 (11), 1015-1020 (2010).</li>
<li>Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+activation+of+Drosophila+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro activation of Drosophila eggs.</a> Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).</li>
<li>Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+meiotic+divisions+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes.</a> Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).</li>
<li>Tavosanis, G., Llamazares, S., Goulielmos, G., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+for+gamma-tubulin+in+the+acentriolar+female+meiotic+spindle+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Essential role for gamma-tubulin in the acentriolar female meiotic spindle of Drosophila.</a> EMBO J. 16 (8), 1809-1819 (1997).</li>
<li>Endow, S. A., Komma, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+dynamics+during+meiosis+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Spindle dynamics during meiosis in Drosophila oocytes.</a> J Cell Biol. 137 (6), 1321-1336 (1997).</li>
<li>Matthies, H. J., Clarkson, M., Saint, R. B., Namba, R., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMatthies%2C+HJ+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 67-85 (2000).</li>
<li>Colombié, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+roles+of+Incenp+crucial+to+the+assembly+of+the+acentrosomal+metaphase+spindle+in+female+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dual roles of Incenp crucial to the assembly of the acentrosomal metaphase spindle in female meiosis.</a> Development. 135 (19), 3239-3246 (2008).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Drosophila Oositler evreleme bir ince uzun karyosome genellikle metafaz oositlerden prometafaz ayırt karyosome şeklini kullanarak, prometafaz oositlerinde görülmekle birlikte sorunlu olabilir. prometafaz sırasında, karyosome, yuvarlak bir şekil olarak başlar uzar ve daha sonra oosit metafaz tutuklama yaklaştıkça bir yuvarlak şekle geri çekilir. Bu, pek çok prometafaz oositler uzatılmış karyosome yok demektir. mutant ya da ilaçla tedavi oosit incelendiğinde ek olarak...

Mayoz bölünme çalışması bazen "genetiğin genetiği" olarak tanımlanır. Bunun nedeni, kromozom kalıtımının ve bağımsız çeşitliliğin temel özelliklerinin, gamet üretimi sırasında kromozomların ayrılması yoluyla gerçekleştirilmesidir. Kromozom kalıtım teorisinin önemli bir gösterimi 1916'da Calvin Bridges'in Drosophila melanogaster1'deki çalışmasından geldi. Drosophila'daki bu ve diğer klasik genetik çalışmaları, genetik anlayışımıza büyük katkı sağladı. Bununla birlikte, Drosophila oositlerindeki mayotik kromozomların sitolojik incelemesi zor olmuştur. Bunun başlıca nedeni, iğ bir araya geldiğinde ve kromozomlar ayrışma için yönlendirildiğinde, geç evre Drosophila oositlerinin immünofloresansının, oositi antikorlara karşı geçilmez hale getiren zarların varlığı tarafından engellenmesidir.
Bu zorluğa rağmen, Drosophila oositleri, kromozom davranışı ve iğ montajı çalışmaları için çekici bir model olmaya devam etmektedir. Bunun nedeni, Drosophila'da bulunan güçlü genetik araçların yanı sıra, kromozomlar yönlendirildiğinde ve iğ tamamen oluştuğunda, oositlerin metafaz I'de tutuklanmasıdır. Bu, hücre bölünmesinin bu önemli aşamasında çok sayıda oositin toplanmasını ve incelenmesini kolaylaştırır. Ek olarak, oosit kromozom ayrışmasının incelenmesi için genetik manipülasyona uygun basit bir model organizma, insan üreme sağlığı anlayışımıza önemli bir katkı sağlayabilir. Kromozom sayısındaki hatalar, insanlarda düşük ve doğum kusurlarının önde gelen genetik nedenidir2. Bu hataların çoğu oositte kadar izlenebilir ve artan anne yaşı ile ilişkilidir. ABD'deki annelerin ortalama yaşı artıyor ve bu da bunu önemli bir halk sağlığı sorunu haline getiriyor.
Burada, oosit zarlarının nasıl çıkarılacağının bir gösterimi de dahil olmak üzere, Drosophila oositlerinin sitolojik incelemesi için yöntemleri açıklıyoruz. Bu yöntemler, ilk olarak Theurkauf ve Hawley3, Zou ve arkadaşları tarafından tanımlanan protokollerin modifikasyonlarıdır.4 ve Dernburg ve ark.5. Ayrıca, ilk olarak Gilliland ve arkadaşları tarafından tanımlanan bir protokole dayanarak, oositlerin farklı aşamalarının zenginleştirilmesi için yöntemler de dahil ediyoruz.6. Son olarak, Drosophila oositlerinin ilaç tedavisi için talimatlar ekliyoruz. Bu yöntemler birlikte, Drosophila'da oosit kromozom ayrışması ve iğ montajının sitolojik olarak incelenmesine izin verir.

<table><tbody><tr><td>15 ml konik tüpler</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>% 16 formaldehit</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>18505</td><td>TEHLİKELİ; Açıldıktan sonra bir ay sonra atın</td></tr><tr><td>250 ml beherler</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml'lik tüpler</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>aktif kuru maya</td><td>Bir</td><td>macun yapmak için çeşitli su ile karıştırın fıstık ezmesi</td>anti-&alfa;-tubulin antikoru FITC Sigma F2168 klonu DM1A Binucleine 2 ile konjuge edilmiştir <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>B1186</td><td>TEHLİKELİ</td></tr><tr><td>blender</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sığır serum albümini</td><td>Sigma</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>kalsiyum klorür</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kolşisin</td><td>Sigma</td><td>C-9754</td><td>TEHLİKELİ</td></tr><tr><td>lameller</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td>No. 1 1/2</td></tr><tr><td>dekstran sülfat</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>forseps</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>5622</td><td>Dumont cımbız yüksek hassasiyetli sınıf stil 5</td></tr><tr><td>formamid</td><td>Sigma</td><td>47670-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>cam slaytlar</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td></td></tr><tr><td>glikoz</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dereceli 1.5 ml tüpler</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>EM-5330</td><td>çeşitli satıcılardan temin edilebilir</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>magnezyum klorür</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>büyük ağ (~ 1.500 & mikro; m)</td> <td>VWR</td><td>AA43657-NK</td><td>çeşitli formatlar ve diğer tedarikçiler, 12 veya 14 gözenekli</td></tr><tr><td>küçük ağ (~ 300 ve mikro; m)</td> <td>Spektrum laboratuvarları</td><td>146 424</td><td>çeşitli formatlar, örneğin , 146 422 veya 146 486</td></tr><tr><td>nutatör</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipetleri</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>potasyum asetat</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kakodilik asit</td><td>Sigma</td><td>C0125</td><td>TEHLİKELİ; Alternatif olarak, sodyum kakodilat potasyum ile ikame edilebilir</td></tr><tr><td> hidroksit</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sodyum asetat</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sodyum klorür</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sodyum sitrat</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sodyum hidroksit</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sükroz</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>taksol (paklitaksel)</td> <td>Sigma</td><td>T1912</td><td>TEHLİKELİ</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>PI-28314</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher</td><td>PI-28320</td><td></td></tr><tr><td>girdap</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sabit görüntüleme prometafaz ve metafaz mayoz ve i teknikleri<em&gt; drosophila</em&gt; oositler

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

İnsan oositlerinde kromozom ayrışması hataya açıktır, bu da düşük ve doğum kusurlarının önde gelen genetik nedeni olan anöploidi ile sonuçlanır. Model organizmalardan alınan oositlerdeki kromozom davranışının incelenmesi, insan oositlerinin anöploidiye duyarlılığının moleküler temelini ortaya çıkarmak için çok umut vaat etmektedir. Drosophila melanogaster, 100 yılı aşkın araştırma, topluluk ve teknik geliştirme ile genetik manipülasyona uygundur. Bununla birlikte, Drosophila oositlerinde kromozom davranışını ve iğ düzeneğini görselleştirmek, esas olarak oositi çevreleyen ve antikorlara nüfuz edemeyen zarların varlığından dolayı belirli zorluklara sahiptir. Burada, bu önemli model organizmada kromozom ayrışmasının moleküler diseksiyonuna izin veren Drosophila oositlerinde mayoz I iğ düzeneğinin ve kromozom davranışının toplanması, hazırlanması ve görüntülenmesi için protokolleri açıklıyoruz.

Burada tarif edilen metodlar mayoz üç aşamadan (Şekil 1) temsil eden geç evre Drosophila oosit toplama neden olur. Profaz Oositler karyosome (Şekil 1A) çevreleyen bölgede tübülin sinyal eksikliği ile görünür çekirdek zarfına varlığı ile ayırt edilir. Prometafaz nükleer zarf arıza sırasında iğ monte ediyor sonra dönemdir. Prometafaz sırasında karyosome, farklı bir şekil alır, ana karyosome kütlesi (Şekil 1B) ayrı 4. kr...

Olgun Drosophila oositlerinin toplanması, hazırlanması ve görüntülenmesi için protokoller sunuyoruz. Bu yöntemler, mayoz bölünme sırasında kromozom davranışının ve iğ montajının ve işlevinin görselleştirilmesine izin verir.

Sabit Görüntüleme prometafaz ve Metafaz Mayoz ve I Teknikleri<em&gt; Drosophila</em&gt; Oositler

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...

Bu prosedürün genel amacı, mayoz I sırasında iğ iplikçik kurulumunun ve kromozom yöneliminin sitolojik incelemesi için Drosophila oositlerini hazırlamaktır. Bu yöntem, iğ bipolaritesinin nasıl kurulduğu ve sentrozomların yokluğunda kromozomların nasıl çift yönlü yönlendiği gibi mayoz alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, antikor penetrasyonunu engelleyen oosit membranlarının etkili bir şekilde uzaklaştırılması ve böylece immunofloresansa olanak sağlanmasıdır. Başlamak için, oositlerin yüzeylere yapışmasını önlemek amacıyla beş milimetrelik bir tüpün ve pastör pipetinin iç kısmını PTB ile önceden kaplayın.Bir blender'a 100 mililitre ROB tamponu ekleyin ve ardından 100 ila 300 adet anestezi uygulanmış sinek ekleyip bir saniyelik üç kısa darbe (pulse) uygulayın. Elde edilen bulamacı, gözenekleri yaklaşık 1.500 mikrometre olan geniş gözenekli bir süzgeç aracılığıyla 250 mililitrelik bir behere süzün. Filtratı yaklaşık iki dakika boyunca çökelmeye bırakın ve ardından mümkün olduğunca çok büyük gövde parçasını uzaklaştırarak üst katmanı aspire edin.Süspansiyonu, gözenek boyutu 300 µm olan daha küçük bir süzgeç aracılığıyla tekrar 250 mL'

techniques-for-imaging-prometaphase-metaphase-meiosis-i-fixed

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol, mikroenjeksiyon ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme kullanımı...

Mitoz incelenmesi için Mikroenjeksiyon Teknikleri Drosophila melanogaster Sinsityal Embriyo

Oosit mayotik olgunlaşması sırasında kromozom segregasyon hataları nedeniyle anöploidi yatkındır. Anöploid yumurta, kısırlık, düşüklere veya gelişimsel bozukluklar, Down sendromu gibi neden olabilir. Burada, yumurta ve mayotik olgunlaşma incelemek ve Ploidi değerlendirmek için yöntemler seçim malzemeleri tanıtmak için yöntemler açıklanmaktadır.

Fare Oosit Mikroenjeksiyon, olgunlaşması ve ploidi Değerlendirmesi

Bireysel hazırlanması Drosophila</emCanlı Görüntüleme için> Yumurta Chambers

SAC kardeş kromatidler arasında mitotik segregasyon izlenmesi, sinyali başlatır nerede kinetochore olduğunu. A metodunda kromozom hareketi ile kinetochore proteinler ve koordinasyon birinin seçilmesi ve devir görselleştirme tarif...

Living Görselleştirilmesi Dinamik Kinetochore Protein Davranış ve Kromozom Hareket tarafından Mitotik Checkpoint incelenmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Sinsityal Embriyolar

Drosophila geç evre oositlerinin immün boyanması, oositlerin çevresindeki zarlar nedeniyle zor olabilir. Bu videoda, oositlerin elde edilmesi, bunların sabitlenmesi ve immün boyama için zarların çıkarılması için yüksek verimli bir yöntem açıklanmaktadır. Öne çıkan protokol, mayoz bölünmenin farklı aşamalarını görselleştirmek için kullanılan geç evre oositlerle bu teknikleri göstermektedir.

İmmün boyama için sabit Drosophila oositlerinin hazırlanması: dış zarı sabitlemek ve çıkarmak için yüksek verimli bir yöntem

Izole edilmesi ve faz kontrast ve floresan mikroskobu ile görüntüleme için Drosophila testis örnekleri (canlı ve sabit) hazırlanması için yöntemler burada tarif edilmiştir.

Spermatogenez sitolojik analizi: Canlı ve Sabit Hazırlıklar<em&gt; Drosophila</em&gt; Testisler

Bu el yazması Xoluşturmak için ayrıntılı bir yöntem sunuyor-kromozom kol sonda ve kız kardeşi durumunu incelemek için performans gösteren Floresans in situ hibridizasyon (balık) Kromatit uyum içinde prometafaz ve metafaz tutuklandı Drosophila yumurta. Bu iletişim kuralı segregasyonun kol uyum bozulmamış veya kesintiye farklı genotip içinde olup olmadığını belirlemek için uygundur.

Kol uyum içinde prometafaz ve metafaz durumunu izlemek için Floresans In Situ hibridizasyon (balık) kullanarak ben Drosophila yumurta

İnsan hastalığı ile ilişkili genetik varyantların ele haline başladığınızda, sistemler ile tanımlanan bu değişik biyolojik önemi hızla değerlendirileceği geliştirmeye giderek önem kazanmaktadır. Bu iletişim kuralı insan gen işlevi kadın mayoz sırasında ben fare yumurta kullanarak değerlendirilmesi yöntemlerini açıklar.

Mayoz sırasında insan gen işlevini değerlendirmek için fare yumurta kullanarak ben

Sinapslardaki mayotik hatalar ve rekombinasyon, memeli oositlerinde yaygındır. Bu süreçlerde yer alan proteinlerin titiz analizi, oogenezin nasıl ve neden sıklıkla yanlış gittiğini anlamak için çok önemlidir. Burada sunulan teknikler, farelerde oosit kalitesini değerlendirmek için rekombinasyon ve sinapsların kapsamlı bir şekilde izlenmesine izin verir.

Sinapsis ve Rekombinasyonun Değerlendirilmesi için Fare Oositlerinden Mayotik Kromozom Yayılımlarının Hazırlanması

Mezoskopik floresan tomografi doku kesit floresan mikroskopi penetrasyon sınırları ötesinde faaliyet göstermektedir. Tekniği çok projeksiyon aydınlatma ve foton bir taşıma açıklamasına dayanmaktadır. Biz, in vivo morfolojilerinden tüm vücut 3B görselleştirme, GFP ifade kanat hayali diskler...

Mezoskopik Floresans Tomografi için In-vivo Görüntüleme Geliştirme Drosophila</em

Öğrenin Drosophila oositlerinde mayoz I sırasında iğ iplikçik montajı ve kromozom yönelimini sitolojik olarak incelemek için sabit görüntüleme tekniklerini. Bu yöntem, sentrozomlar olmadan iğ iplikçik bipolaritesinin nasıl kurulduğunu araştırmaya yardımcı olur.

Sabit Görüntüleme prometafaz ve Metafaz Mayoz ve I Teknikleri

Daha fazla video keşfet