RNA ölçülmesi için bir yöntem

Modifiye edilmiş northern blotting tekniğinin genel amacı, RNA'daki N6-metiladenosin (n6A) modifikasyonlarını ölçmek ve çeşitli RNA'lardaki modifikasyonları tespit etmektir. Bu yöntem, N6-metiladenosin modifikasyonları gibi RNA epigenetiğinin rolündeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, RNA'nın etkili bir şekilde ayrıştırılmasını, deneysel tasarımlar için daha iyi bir standardizasyonu ve RNA'lardaki n6A modifikasyonunun net bir şekilde belirlenmesini sağlamasıdır.

Bu yöntem, RNA'daki n6A modifikasyonları hakkında bilgi sağlayabilir ve farklı saptama antikorları kullanılarak diğer RNA modifikasyonlarına da uygulanabilir. Deneye başlamak için, kağıt havluların üzerine ribonükleaz dekontaminasyon solüsyonu püskürtün ve pipetleri ile laboratuvar tezgah yüzeylerini silin. Kağıt havluları nükleaz içermeyen su ile ıslatın ve pipetleri ile laboratuvar tezgah yüzeylerini tekrar silin.

Dört derece Celsius'te muhafaza edilen RNA izolasyon solüsyonunu temin edin ve solüsyondan 1 mL'yi yaklaşık 75 mg fare dokusuna ekleyin. Dokuyu homojenize etmek için bir üstten karıştırıcı kullanın. Ardından, her 1 mL örnek homojenatı için 100 µL 1-Bromo-3-kloropropan veya BCP ekleyin.

Tüpleri 15 saniye boyunca kuvvetlice çalkalayın ve toplam RNA izolasyonuna geçin. Bir spektrofotometre kullanarak, 260 nanometre ve 280 nanometrelerdeki absorbansı kaydederek RNA konsantrasyonunu belirleyin. %0,8 agaroza jel elektroforezi gerçekleştirerek RNA örneğinin kalitesini kontrol edin.

Tüm elektroforez ekipmanlarını dietilpirokarbonat veya DEPC'li su ile durulayın. Bir Erlenmeyer balonuna 2,5 gram agaroz ve ardından 215 mililitre DEPC'li su ekleyin ve karışımı bir mikrodalga fırında tamamen eritin. Çözelti eridikten sonra, 12,5 mililitre 10X MOPS tamponu ekleyin.

Ardından erlene 22,5 mililitre %37'lik formaldehit ekleyin. Daha sonra solüsyonu 1,5 milimetre kalınlığında bir tarak bulunan elektroforez cihazına dökün. Temiz bir tarak kullanarak hava kabarcıklarını jelin kenarlarına itin.

Jelin oda sıcaklığında katılaşmasını bekleyin. Ardından, jelin kuyucuklarını durulamak ve jeli ön çalıştırmaya tabi tutmak için önceden hazırlanmış 1X MOPS çalıştırma tamponu kullanın. RNA örneklerini jelin kuyucuklarına yükleyin ve ardından jeli çalıştırın.

Ertesi gün, jeli UV ışığı altında inceleyin ve fotoğraflayın. Transferi hazırlamak için jeli kesin ve kullanılmayan kısmını çıkarın. 500 mililitre 10X salin sodyum sitrat veya SSC tamponu hazırlayın.

Jeli iki kez 10X SSC tamponu ile yıkayın. Jeli örtecek büyüklükte bir adet filtre kağıdı tabakası kesin. Filtre kağıdından jelle aynı boyutta dört parça kesin.

Ardından, pozitif yüklü naylon membrandan bir tabakayı jel ile aynı boyutta kesin. Doğru yönlendirmeyi sağlamak için jel ve membran üzerinde işaretleyici olarak bir çentik oluşturun. Membranı 2X SSC tamponunda bekletin.

Transfer tepsisine 500 mililitre 10X SSC tamponu dökün. Büyük filtre kağıdı tabakasını cam plakanın üzerine yerleştirin ve filtre kağıdını transfer tamponu ile ıslatın. Ardından, oluşan hava kabarcıklarını bir pipet yardımıyla giderin.

Önceden kesilmiş iki parça filtre kağıdını transfer tamponunda ıslatın ve filtre kağıdının merkezine yerleştirin. Varsa hava kabarcıklarını giderin. Daha sonra jeli üst yüzeyi aşağı gelecek şekilde filtre kağıdının üzerine yerleştirin ve jelin çentikleri ile membranın çentiklerini hizaladığınızdan emin olarak membranı jelin üzerine yerleştirin.

Ardından, membran üzerine önceden kesilmiş iki parça filtre kağıdı yerleştirin. Katmanlar arasındaki hava kabarcıklarını giderin. Havluların yalnızca jel ve membrandan geçen tampon çözeltiyi emdiğinden emin olmak için jelin etrafını streç filmle sarın.

Ardından, filtre kağıdın üzerine kağıt havlular yerleştirin. Havluların üzerine büyük boyutlu bir cam plaka ve yığının üzerine bir ağırlık koyun; RNA'nın jelden membrana gece boyunca aktarılmasını sağlayın. Aktarımın ardından, membranı 2X SSC tamponu içinde nemli tutun.

İki adet filtre kağıdını 10X SSC tamponuna daldırın, ardından kağıtları UV crosslinker cihazına yerleştirin. RNA emen tarafın yukarıye baktığından emin olun ve ardından membranı filtre kağıdının üzerine yerleştirin. Otomatik crosslink modunu seçin ve ışınlamayı başlatmak için başlat düğmesine basın.

RNA'nın jelden membrana transferini doğrulamak için membranı ve jeli bir UV jel görüntüleme sistemi ile inceleyin. Membranı, oda sıcaklığında bir saat boyunca TBST tamponu içerisindeki %5 yağsız süt ile bloke edin. Membranı, dört derece Celsius'ta gece boyunca m6A antikor çözeltisi ile inkübe edin.

Ertesi gün, membranı TBST tamponu ile 15 dakika boyunca üç kez yıkayın. Ardından, membranı oda sıcaklığında bir saat boyunca HRP konjuge eşek anti-tavşan antikor çözeltisinde inkübe edin. Bir saatin ardından, membranı TBST tamponu ile 15 dakika boyunca üç kez yıkayın.

Geliştirilmiş kemilüminesans substratını uygulayın. Kemilüminesansı dijital bir görüntüleyici ile yakalayın. Son olarak, m6A kantifikasyonuna geçin ve Image J kullanarak göreceli m6A kemilüminesans yoğunluğunu ölçün. Fare karaciğer RNA'ları dört saatlik aralıklarla örneklenmiş ve modifiye edilmiş northern blotting tekniği ile incelenmiştir.

rRNA'ların, mRNA'ların ve küçük RNA'ların metilasyonu net bir şekilde tespit edildi. Yabanıl tip farelerin karaciğerlerinden elde edilen toplam RNA ve rRNA'sız RNA için temsilci m6A blotları gerçekleştirildi. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde yürütüldüğü takdirde dört günde tamamlanabilir.

Geliştirildikten sonra bu teknik, RNA epigenetiği alanındaki araştırmacıların sirkadiyen ritim ve obezite ile ilgili insan fizyolojisi üzerindeki etkileri keşfetmelerinin önünü açmıştır.