RNA ölçülmesi için bir yöntem K 6 -methyladenosine Değişiklikler

Modifiye kuzey lekeleme tekniğinin genel amacı, RNA'daki N6-metiladenosin, n6A modifikasyonlarını ölçmek ve çeşitli RNA'lardaki modifikasyonları tespit etmektir. Bu yöntem, N6-metiladenozin modifikasyonları gibi RNA epigenetiğinin rolündeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, RNA'nın etkili bir şekilde ayrılmasını, deneysel tasarımlar için daha iyi standardizasyonu ve RNA'larda n6A modifikasyonunun net bir şekilde tanımlanmasını sağlamasıdır.

Bu yöntem, RNA'daki n6A modifikasyonları hakkında bilgi sağlayabilir ve ayrıca farklı tespit antikorlarına sahip diğer RNA modifikasyonlarına da uygulanabilir. Deneye başlamak için, ribonükleaz dekontaminasyon solüsyonunu kağıt havlulara püskürtün ve pipetleri ve laboratuvar tezgahı yüzeylerini silin. Kağıt havluları nükleaz içermeyen suyla ıslatın ve pipetleri ve laboratuvar tezgahı yüzeylerini tekrar silin.

Dört santigrat derecede tutulan RNA izolasyon çözeltisini elde edin ve yaklaşık 75 miligram fare dokusuna bir mililitre çözelti ekleyin. Dokuyu homojenize etmek için üstten bir karıştırıcı kullanın. Ardından, bir mililitre numune homojenatı başına 100 mikrolitre 1-Bromo-3-kloropropan veya BCP ekleyin.

Tüpleri 15 saniye boyunca kuvvetlice çalkalayın ve toplam RNA izolasyonuna devam edin. Bir spektrofotometre kullanarak, 260 nanometre ve 280 nanometredeki absorbansı not ederek RNA konsantrasyonunu belirleyin. %0.8 agaroz jel elektroforezi gerçekleştirerek RNA numune kalitesini kontrol edin.

Tüm elektroforez ekipmanını dietilpirokarbonat veya DEPC su ile durulayın. 2.5 gram agarozu, ardından 215 mililitre DEPC suyunu bir Erlenmeyer şişesinde birleştirin ve karışımı bir mikrodalgada tamamen eritin. Çözelti eridikten sonra 12,5 mililitre 10X MOPS tamponu ekleyin.

Ve şişeye 22,5 mililitre% 37 formaldehit. Daha sonra çözeltiyi 1,5 milimetre kalınlığında bir tarakla elektroforez aparatına dökün. Temiz bir tarak kullanarak, kabarcıkları jelin kenarlarına doğru itin.

Jelin oda sıcaklığında katılaşmasına izin verin. Daha sonra, jelin kuyucuklarını durulamak ve jeli önceden çalıştırmak için önceden hazırlanmış 1X MOPS çalışma tamponunu kullanın. RNA örneklerini jelin kuyucuklarına yükleyin, ardından jeli çalıştırın.

Ertesi gün, jeli UV ışığı altında inceleyin ve fotoğraflayın. Aktarımı hazırlamak için jeli kesin ve kullanılmayan kısmı çıkarın. 500 mililitre 10X tuzlu sodyum sitrat veya SSC tamponu hazırlayın.

Jeli 10X SSC tamponu ile iki kez yıkayın. Jeli kaplayacak kadar büyük bir filtre kağıdı tabakası kesin. Jel ile aynı boyutta dört parça filtre kağıdı kesin.

Ardından, pozitif yüklü naylon membran tabakasını jel ile aynı boyutta kesin. Doğru yönlendirmeyi sağlamak için jel ve zar üzerinde bir işaretleyici olarak bir çentik işaretleyin. Membranı 2X SSC tamponuna batırın.

Transfer tepsisine 500 mililitre 10X SSC tamponu dökün. Büyük filtre kağıdı tabakasını cam plakanın üzerine yerleştirin ve filtre kağıdını transfer tamponu ile ıslatın. Ardından baloncukları açmak için bir pipet kullanın.

İki parça önceden kesilmiş filtre kağıdını transfer tamponuna batırın ve filtre kağıdının ortasına yerleştirin. Baloncukları çıkarın. Daha sonra jeli üst tarafı aşağı bakacak şekilde filtre kağıdının üzerine yerleştirin ve zarı jelin ve zarın çentiklerini hizaladığınızdan emin olarak jelin üzerine yerleştirin.

Ardından, zarın üzerine iki parça önceden kesilmiş filtre kağıdı yerleştirin. Katmanlar arasındaki baloncukları çıkarın. Havluların yalnızca jel ve zardan geçen tamponu emdiğinden emin olmak için jelin etrafına plastik sargı uygulayın.

Ardından kağıt havluları filtre kağıdının üzerine koyun. Havluların üzerine büyük boy bir cam plaka yerleştirin ve yığının üzerine bir ağırlık koyun ve RNA'nın gece boyunca jelden zara geçmesine izin verin. Aktarımı takiben, membranı nemli halde tutun 2X SSC tamponunda.

İki yaprak filtre kağıdını 10X SSC tamponuna daldırın, ardından yaprakları UV çapraz bağlayıcıya yerleştirin. RNA'nın emilen tarafının yukarı baktığından emin olun, ardından zarı filtre kağıdının üzerine yerleştirin. Otomatik çapraz bağlantı modunu seçin ve ışınlamayı başlatmak için başlat düğmesine basın.

Jelden zara RNA transferini doğrulamak için zarı ve jeli bir UV jel görüntü yakalayıcı ile inceleyin. Membranı% 5 yağsız sütte TBST tamponunda oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edin. Membranı gece boyunca dört santigrat derecede m6A antikor çözeltisi içinde inkübe edin.

Ertesi gün, membranı 15 dakika boyunca TBST tamponu ile üç kez yıkayın. Daha sonra, zarı HRP konjuge eşek anti-tavşan antikor çözeltisinde oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Bir saat sonra, membranı 15 dakika boyunca TBST tamponu ile üç kez yıkayın.

Geliştirilmiş kemilüminesans substratını uygulayın. Dijital görüntüleyici ile kemilüminesansı yakalayın. Son olarak, m6A kantifikasyonuna geçin ve görüntüyü kullanarak bağıl m6A kemilüminesan yoğunluğunu ölçün J.Mouse karaciğer RNA'ları dört saatlik aralıklarla örneklendi ve modifiye kuzey blotlama tekniği ile incelendi.

rRNA'ların, mRNA'ların ve küçük RNA'ların metilasyonu açıkça tespit edildi. Temsili m6A lekeleri, toplam RNA için ve vahşi tip farelerin karaciğerlerinden rRNA olmadan gerçekleştirildi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa dört gün içinde yapılabilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, RNA epigenetiği alanındaki araştırmacıların sirkadiyen ritim ve obezite ile ilgili insan fizyolojisi üzerindeki etkilerini keşfetmelerinin yolunu açtı.