Name: RNA ölçülmesi için bir yöntem K 6 -methyladenosine Değişiklikler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Öğrenin, RNA epigenetiğinde N6-metiladenozin (m6A) modifikasyonlarını tespit etmek için modifiye northern blotting yöntemini. Bu teknik fare dokusundan RNA izolasyonu ve kemilüminesans ile çalışır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

C.Y.W., Ulusal Sağlık Araştırma Enstitüsü (NHRI-EX101-9925SC), Ulusal Bilim Konseyi (101-2314-B-182-100-MY3, 101-2314-B-182A-009) ve Chang Gung Memorial Hastanesi'nden (CMRPG3B1643, CMRPG3D1002, CMRPG3D0581, CMRPG380091 ve CMRPG3C1763) destek aldı.

NOT: 6 A level rRNA, mRNA ve diğer küçük RNA&#39;lar dahil toplam RNA m. Ribozomal RNA bol M 6 A değişiklikleri, 6 A seviyesi bu gerçeği dikkate almak gerekir m ölçümünü beri. 1. RNA İzolasyon <ol><li> (Kağıt havlu üzerine püskürtülen) ribonükleaz dekontaminasyon solüsyonu kullanarak, pipet ve laboratuar tezgah yüzeyleri silin. Islak kağıt nükleaz içermeyen su ile havlu ve tekrar pipet ve laboratuvar tezgah yüzeyleri silin. </li><li> RNA Ekstraksiyonu <ol><li> Toplam RNA İzolasyon <ol><li> Bir kafa üstü karıştırıcı kullanılarak, doku, 50-100 mg ya da 4 ° C &#39;de muhafaza RNA izolasyon çözeltisi 1 mL 5-10 x 10 6 hücre homojenleştirin. Not: fazla doku (100-150 mg), çünkü burada daha düşük RNA konsantrasyonların farelerden adipoz doku örnekleri için gerekli olabilir. Örnekler fare kalp, karaciğer, iskelet kası, akciğer, beyin kaynaklı ve makrofajlar, daha önce 4 kullanılmıştır. </li><li> İçindeOda sıcaklığında 5 dakika boyunca numune homojenatları cubate. </li><li> Örnek homojenat 1 ml başına 1-bromo-3-kloropropan (BCP) 100 mcL ekleyin. 15 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır tüpleri ve üretici talimatlarına 24&#39;e göre, toplam RNA izole etmek için devam edin. </li></ol></li><li> İzole edilmiş toplam RNA&#39;dan poliadenile mRNA Saflaştırma <ol><li> olarak temin edilebilen kitler veya protokoller kullanılarak poliadenile edilmiş mRNA&#39;nın arındırın. <ol><li> Aşağıdaki çözeltinin her yeniden askıya iyice çalkalanır: 2x bağlama çözeltisi, oligo (dT) polistiren boncuklar ve yıkama solüsyonu. oligo (dT) kullanılmadan önce oda sıcaklığına getirin boncuk emin olun. </li><li> bir ısıtma bloğu içinde 70 ° C&#39;de bir boru ve ısıya hazırlık başına elüsyon çözeltisi 120 uL aktarın. </li><li> Bir mikrosantrifüj tüpe toplam RNA 500 mg kadar pipetle. nükleaz içermeyen su ile 250 mcL ses seviyesini ayarlamak. </li><li> toplam RNA 2x bağlayıcı çözeltisi 250 uL ekleyin böylecedökülmesinden ve vorteks kısaca içeriğini karıştırmak için. </li><li> oligo 15 mcL ekleyin (dT) boncuk ve vorteks iyice karıştırın. </li><li> 3 dakika boyunca 70 ° C&#39;de inkübe karışımı. </li><li> Isıtma bloğu numuneyi çıkarın ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletilir. </li><li> 2 dakika için 15,000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Dikkatle arkasında yaklaşık 50 uL bırakarak süpernatant kaldırmak. </li><li> pipetleme pelet yeniden askıya yıkama solüsyonu 500 mcL ekleyin. </li><li> Bir spin filtre / toplama tüpü kümesine süspansiyonu pipetle. </li><li> 2 dakika için 15,000 x g&#39;de santrifüjleyin. toplama tüpünden sütunu kaldırmak ve flow-through atın. toplama tüpüne sütun dönün. </li><li> Spin filtre üzerine yıkama solüsyonu Pipet 500 uL. </li><li> 15.000 x santrifüj 2 dakika boyunca örn. </li><li> taze toplama tüpüne sıkma filtre aktarın. </li><li> Elüsyon çözeltisi pipetle 50 uL ısıtıldı70 ° C&#39;ye kadar eğirme filtrenin merkezi üzerine. </li><li> 70 ° C&#39;de 2-5 dakika boyunca inkübe edin. 1 dakika için 15,000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Spin filtrenin merkezi üzerine 70 ° C&#39;ye kadar ısıtıldı elüsyon çözeltisi ilave 50 uL pipetle. </li><li> Tekrarlayın Adım 1.2.2.1.18. </li></ol></li><li> 100 ug / mL glikojen, 3 M sodyum asetat tamponu (pH 5.2), ve mutlak etanolün 2.5 hacim 0.1 hacim. -80 ° C de bir gece hızlandırabilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 25 dakika boyunca 15,000 x g&#39;de santrifüjleyin. süpernatant atın. </li><li> % 75 etanol içindeki 1 ml pelet yıkayın. 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 15,000 x g&#39;de santrifüjleyin. Dikkatlice etanol çıkarın. </li><li> 3-5 dakika boyunca hava içinde kurutulur. </li><li> pelet çözmek için nükleaz içermeyen su 10 uL ekleyin. </li><li> -70 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li></ol></li><li> RNA Yeterlilik ve miktarının belirlenmesi <ol><li> Bir spektrofotometre kullanılarak, Notl RNA konsantrasyonunu belirlemek260 nm ve 280 nm &#39;de absorbans ng. A 260 / A 280 oranı 1.8-2.2 olmalıdır. </li><li> % 0.8 agaroz jel elektroforezi 25 kullanılarak RNA örnek kalitesini kontrol edin. NOT: sağlam ökaryotik toplam RNA yoğun 28S ve 18S rRNA bantları göstermesi gerekir. İyi bir RNA preparasyonu için 18S rRNA bandı şiddeti ile 28S oranı ~ 2. </li></ol></li></ol> 2. Jel Elektroforez ve Transferi NOT: Tampon hazırlama protokolleri Tablo 1&#39;de verilmiştir. <ol><li> Formaldehid jel hazırlanması (% 1) <ol><li> diethylpyrocarbonate (DEPC) su ile tüm elektroforez cihazları durulayın. </li><li> Tamamen bir mikrodalga fırınında DEPC su 215 mL agaroz 2.5 g eritin. </li><li> 10x 3- (N-morfolino) propansülfonik asit (MOPS), 12.5 ml tampon ve% 37 formaldehid 22.5 ml. </li><li> 1.5 mm kalınlığında tarak ile elektroforez cihazının içine dökün. </li><li> t kabarcıkları ortadan kaldırmak veya itmekTemiz bir tarak ile jel kenarlarına hem. </li><li> Jel, oda sıcaklığında katılaşmaya izin verin. </li></ol></li><li> Örnek hazırlama <ol><li> örnek tamponu toplam RNA 1-10 ug ve 11.3 uL karıştırın. </li><li> örnek tampon 11.3 uL RNA işaretleyici (1 mcg / ml) 2 ug karıştırın. </li><li> 16 uL bir toplam hacimde 2.2.1 ve 2.2.2 örnekler nükleaz içermeyen su ilave edilir. </li><li> 5 dakika boyunca 60 ° C de ısı ve daha sonra buzda. </li><li> buz üzerinde / ul etidyum bromür 0.1 ug içeren izleme boya 4 uL ile 2.2.3 den örnek 16 mcL karıştırın. DİKKAT: Solunduğunda Ethidium bromür muhtemelen teratojenik ve toksiktir. etidyum bromür güvenlik formu okuyun. </li></ol></li><li> Elektroforez <ol><li> 10x MOPS 200 mL 1x MOPS çalışan tampon yapmak için GKD 2 O 1.800 ml tampon ekleyin. </li><li> jel kuyu durulayın 1x MOPS çalışan tampon kullanın. </li><li> Ön-run tO 5 dakika boyunca 20 V jel. </li><li> Jelin kuyuların içine RNA örnekleri yükleyin. </li><li> Işık maruz kalmasını önlemek için folyo ile örtün. (Gece ​​boyunca) yaklaşık 17 saat süre ile 35 V çalıştır </li><li> Incelemek ve bir UV ışığı altında jel fotoğrafını. </li></ol></li><li> transfer <ol><li> Kullanılmayan kısmı kaldırmak için jel kesti. </li><li> 10x SSC tamponu (20x SSC tamponu 250 mL DEPC su 250 mL) 500 mL hazırlayın. </li><li> 50 rpm&#39;de sallama ile 20 dakika için 10 x SSC tamponu ile iki kere jel yıkayın. </li><li> Transfer tepsi (Şekil 1) transfer tamponu emen bir fitil kağıt, olarak hizmet verecek kadar büyük 1 filtre kağıdı sayfasını kesin. </li><li> jel aynı boyutta filtre kağıdı 4 parça kesin. </li><li> jel aynı boyuta pozitif yüklü bir naylon zar 1 sayfa kesin. </li><li> jel üzerinde çentik ve, uygun yönlenmesinin sağlanması için bir işaretleyici olarak membran işaretleyin. </li><li> 15 dakika boyunca 2 x SSC tamponu membran bekletin. </li><li> 500 ml o dökünf 10x SSC transferi tepsisine tampon. </li><li> cam levha üzerinde büyük filtre kağıdı sayfasını Lay ve transfer tamponu ile filtre kağıdı ıslatın. </li><li> Bir pipet yardımıyla kabarcıkları dışarı rulo. </li><li> transfer tamponuna önceden kesilmiş filtre kağıdı 2 adet ıslatın ve adım 2.4.5 filtre kağıdının ortasına koyun. herhangi bir kabarcıklarını çıkarmak. </li><li> aşağı filtre kağıdı üzerinde jel üst yan yattı. </li><li> jel üstünde membran yerleştirin. jel ve membran çentikler aynı hizaya getirin. </li><li> membran üstüne önceden kesilmiş filtre kağıdı 2 adet koyun ve transfer tamponu ile filtre kağıdı ıslatın. </li><li> tabakalar arasındaki herhangi bir baloncukları giderin. </li><li> havlu sadece jel ve zarından geçen tampon kadar emmek emin olmak için jel etrafında plastik wrap uygulayın. </li><li> Filtre kağıdı üzerine kağıt havlu Stack. </li><li> havlunun üstünde bir büyük boy cam plaka koyun. </li><li> yığının üstüne bir ağırlık yerleştirin. </li><li>RNA membrana jelden transfer etmek için gece boyunca devam edin. </li></ol></li></ol> N 6 -methyladenosine 3. Algılama <ol><li> membran Çapraz bağlama <ol><li> 2x SSC tamponu nemli membran tutun. </li><li> UV çapraz bağlayıcı içine 10x SSC tamponu ile dalmış filtre kağıdı 2 yaprak yerleştirin. </li><li> RNA adsorbe tarafı yukarı bakacak şekilde, filtre kağıdının üstüne membran yerleştirin. </li><li> &quot;Autocrosslink modu&quot; (120,000 μJ) seçin ve ışınlama başlatmak için &quot;Başlat&quot; düğmesine basın. </li><li> membrana jelden RNA transferi onaylamak için UV jel görüntü alıcı ile membran ve jel inceleyin. </li></ol></li><li> Bağışıklık <ol><li> 1 saat boyunca oda sıcaklığında Tween 20 (TBST) tampon Tris-tamponlu tuzlu su içinde% 5 yağsız süt içinde membran engeller. </li><li> 15 dakika boyunca TBST tamponu ile üç kez yıkayın. </li><li> Gecede m 6 A (membran inkübe &lt;em&gt; K 6 -methyladenosine) antikor çözeltisi (1: 1000,% 5 yağsız süt TBST tamponu) 4 ° C&#39;de ilave edildi. </li><li> 15 dakika boyunca TBST tamponu ile üç kez membran yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat boyunca (% 5 yağsız süt TBST tamponu içinde 2.000: 1) HRP ile konjüge edilmiş eşek anti-tavşan antikoru çözelti içinde membran inkübe edin. </li><li> 15 dakika boyunca TBST tamponu ile üç kez membran yıkayın. </li><li> Gelişmiş kemiluminesans substrat (membran cm2 başına 0.125 ml) uygulayın. </li><li> Imalatçının talimatlarına 26 göre bir dijital kamera optimum ayarlarla kemilüminesans yakalar. </li></ol></li><li> m 6 A Niceleme <ol><li> ImageJ yazılımı kullanarak göreceli m 6 A kemilüminesan yoğunluğunu ölçmek. <ol><li> ImageJ yazılım menüsü altında ilgili dosyayı açmak için &quot;Dosya&quot; seçeneğini seçin. </li><li> ImageJ gelen &quot;Dikdörtgen&quot; aracını seçin ve etrafında bir çerçeve çizinsinyaller. </li><li> Ribozomal RNA deneyleri odağı değilse, hesaplama için 18S ve 28S ribozomal RNA m 6 A bantları kaçının. </li><li> Seçilen şeritli onaylamak için &quot;Command&quot; ve &quot;1&quot; i tıklayın. </li><li> Basın &quot;Command&quot; ve &quot;3&quot; Seçilen komplo göstermek için. </li><li> &quot;Düz&quot; aracını tıklayın ve parçalı alanı ayırmak için çizgiler çizmek. </li><li> ölçümleri kaydetmek için &quot;Wand&quot; aracını tıklayın. </li><li> veri verir. </li><li> Etidyum bromür boyama gelen 18S ribozomal RNA bant ile m 6 A düzeylerini normale. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Thammana, P., Held, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+of+16S+RNA+during+ribosome+assembly+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Methylation of 16S RNA during ribosome assembly in vitro.</a> Nature. 251 (5477), 682-686 (1974).</li>
<li>Meyer, K. D., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+epitranscriptome%3A+N6-methyladenosine+and+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamic epitranscriptome: N6-methyladenosine and gene expression control.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 313-326 (2014).</li>
<li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-methyl-adenosine+%28m6A%29+in+RNA%3A+an+old+modification+with+a+novel+epigenetic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Proteomics+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">N6-methyl-adenosine (m6A) in RNA: an old modification with a novel epigenetic function.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (1), 8-17 (2013).</li>
<li>Wang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+FTO+in+adipose+tissue+decreases+Angptl4+translation+and+alters+triglyceride+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Loss of FTO in adipose tissue decreases Angptl4 translation and alters triglyceride metabolism.</a> Sci Signal. 8 (407), 127(2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-methyladenosine-dependent+regulation+of+messenger+RNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability.</a> Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).</li>
<li>Berulava, T., Rahmann, S., Rademacher, K., Klein-Hitpass, L., Horsthemke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-adenosine+methylation+in+MiRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">N6-adenosine methylation in MiRNAs.</a> PLoS One. 10 (2), 0118438(2015).</li>
<li>Deng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+occurrence+of+N6-methyladenosine+in+bacterial+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Widespread occurrence of N6-methyladenosine in bacterial mRNA.</a> Nucleic Acids Res. 43 (13), 6557-6567 (2015).</li>
<li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+N-methyladenosine+methylome+in+eukaryotic+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The dynamic N-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA.</a> Nature. , (2016).</li>
<li>Fustin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-methylation-dependent+RNA+processing+controls+the+speed+of+the+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA-methylation-dependent RNA processing controls the speed of the circadian clock.</a> Cell. 155 (4), 793-806 (2013).</li>
<li>Geula, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells.+m6A+mRNA+methylation+facilitates+resolution+of+naive+pluripotency+toward+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stem cells. m6A mRNA methylation facilitates resolution of naive pluripotency toward differentiation.</a> Science. 347 (6225), 1002-1006 (2015).</li>
<li>Wang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FTO+modulates+fibrogenic+responses+in+obstructive+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy.</a> Sci Rep. , SREP18874 (2016).</li>
<li>Jia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-methyladenosine+in+nuclear+RNA+is+a+major+substrate+of+the+obesity-associated+FTO%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO.</a> Nat Chem Biol. 7 (12), 885-887 (2011).</li>
<li>Du, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+association+study+of+the+m6A+genes+with+major+depressive+disorder+in+Chinese+Han+population%5BTitle%5D)+AND+%22J+Affect+Disord%22%5BJournal%5D)">An association study of the m6A genes with major depressive disorder in Chinese Han population.</a> J Affect Disord. 183, 279-286 (2015).</li>
<li>Wang, C. Y., Yeh, J. K., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Wen, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythm+of+RNA+N6-methyladenosine+and+the+role+of+cryptochrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythm of RNA N6-methyladenosine and the role of cryptochrome.</a> Biochem Biophys Res Commun. 465 (1), 88-94 (2015).</li>
<li>Wang, C. Y., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Tsai, M. L., Wen, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FTO+modulates+circadian+rhythms+and+inhibits+the+CLOCK-BMAL1-induced+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">FTO modulates circadian rhythms and inhibits the CLOCK-BMAL1-induced transcription.</a> Biochem Biophys Res Commun. 464 (3), 826-832 (2015).</li>
<li>Heyn, H., Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Adenine+Code+for+DNA%3A+A+Second+Life+for+N6-Methyladenine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An Adenine Code for DNA: A Second Life for N6-Methyladenine.</a> Cell. 161 (4), 710-713 (2015).</li>
<li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+m%286%29A+Reader+YTHDC1+Regulates+mRNA+Splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear m(6)A Reader YTHDC1 Regulates mRNA Splicing.</a> Mol Cell. 61 (4), 507-519 (2016).</li>
<li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+mRNA+methylation+reveals+enrichment+in+3%27+UTRs+and+near+stop+codons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons.</a> Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).</li>
<li>Horowitz, S., Horowitz, A., Nilsen, T. W., Munns, T. W., Rottman, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+N6-methyladenosine+residues+in+bovine+prolactin+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mapping of N6-methyladenosine residues in bovine prolactin mRNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (18), 5667-5671 (1984).</li>
<li>Resnick, R. J., Noreen, D., Munns, T. W., Perdue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+N6-methyladenosine+in+expression+of+Rous+sarcoma+virus+RNA%3A+analyses+utilizing+immunoglobulin+specific+for+N6-methyladenosine%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Nucleic+Acid+Res+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of N6-methyladenosine in expression of Rous sarcoma virus RNA: analyses utilizing immunoglobulin specific for N6-methyladenosine.</a> Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 29, 214-218 (1983).</li>
<li>Golovina, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+site-specific+detection+of+m6A+nucleoside+presence+in+RNA+based+on+high-resolution+melting+%28HRM%29+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Method for site-specific detection of m6A nucleoside presence in RNA based on high-resolution melting (HRM) analysis.</a> Nucleic Acids Res. 42 (4), 27(2014).</li>
<li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology+of+the+human+and+mouse+m6A+RNA+methylomes+revealed+by+m6A-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq.</a> Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).</li>
<li>Linder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide-resolution+mapping+of+m6A+and+m6Am+throughout+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome.</a> Nat Methods. 12 (8), 767-772 (2015).</li>
<li>Fu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Quantification+of+Methylated+Cytidine+and+Adenosine+in+Cellular+and+Tissue+RNA+by+Nano-Flow+Liquid+Chromatography-Tandem+Mass+Spectrometry+Coupled+with+the+Stable+Isotope-Dilution+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Quantification of Methylated Cytidine and Adenosine in Cellular and Tissue RNA by Nano-Flow Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Coupled with the Stable Isotope-Dilution Method.</a> Anal Chem. 87 (15), 7653-7659 (2015).</li>
<li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondenaturing+agarose+gel+electrophoresis+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (6), 5445(2010).</li>
<li>Wang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FTO+modulates+fibrogenic+responses+in+obstructive+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy.</a> Sci Rep. 6, 18874(2016).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+mapping+reveals+reversible+and+dynamic+N-methyladenosine+methylome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N-methyladenosine methylome.</a> Nat Chem Biol. , (2016).</li>
<li>Sanschagrin, S., Yergeau, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+of+16S+ribosomal+RNA+gene+amplicons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing of 16S ribosomal RNA gene amplicons.</a> J Vis Exp. (90), (2014).</li>
<li>Kukutla, P., Steritz, M., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+ribosomal+RNA+for+mosquito+gut+metagenomic+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Depletion of ribosomal RNA for mosquito gut metagenomic RNA-seq.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li>
<li>Mishima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-Northern+Blotting%3A+Detection+of+RNA+Modifications+by+Using+Antibodies+against+Modified+Nucleosides%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Immuno-Northern Blotting: Detection of RNA Modifications by Using Antibodies against Modified Nucleosides.</a> PLoS One. 10 (11), 0143756(2015).</li>
<li>Klungland, A., Dahl, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+RNA+modifications+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Dynamic RNA modifications in disease.</a> Curr Opin Genet Dev. 26, 47-52 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

RNA modifikasyonlarının hücresel fonksiyon ve fizyolojide önemli rolleri vardır. Bu modifikasyonların düzenlenmesi, işlevi ve homeostazı ile ilgili mevcut anlayış hala araştırılmakta ve genişletilmektedir8. Bu nedenle, RNA modifikasyonlarını değerlendirmek için kesin ve altın standart bir yönteme ihtiyaç vardır. Modifiye edilmiş kuzey lekeleme yöntemi, RNA modifikasyonlarının kesin olarak ölçülmesini ve çeşitli RNA'lardaki modifikasyonların net bir şekilde tanımlanmasını sağlar. Yöntem en az 3 gün gerektirse de standardize edilebilir ve çeşitli deneysel tasarımlarda kullanılabilir. Ayrıca, farklı antikorlarla, farklı RNA modifikasyonlarını tespit edebilir27.
RNA modifikasyonlarını analiz ederken farklı RNA'ları ayırmak önemlidir. Ribozomal RNA, toplam RNA28,29 miktarının büyük bir bölümünü oluşturur. RNA modifikasyonlarının yalnızca toplam RNA'da analiz edilmesinden elde edilen sonuçlar, çoğunlukla rRNA'daki değişiklikleri temsil edecektir. Metilasyon ve rRNA'nın bu tür diğer modifikasyonları, diğer RNA'lardaki değişiklikleri potansiyel olarak maskeleyebilir. Jel ayırma prosedürü ile mRNA ve diğer küçük RNA'ların modifikasyonları daha doğru bir şekilde analiz edilebilir.
m6A immünopresipitasyon ve dizileme ile transkriptom çapında haritalama, her bir RNA22 tipinin modifikasyonu hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. Spesifik RNA'lar hakkında bilgi ve yaklaşık 80-120 bp'lik bir çözünürlük sağlar. m6A-Seq, farklı deneysel koşullar arasındaki modifikasyonları karşılaştırabilse de, bu tür deneyler için uygun standartların ve kontrollerin seçimi zordur18. İmmünopresipitasyonun çoğaltılması zordur ve genellikle tekrarlar arasında önemli farklılıklar gösterir. Ayrıca, m6A-Seq, immünopresipitasyon ve dizileme30'dan önce RNA örneklerinin parçalanmasını gerektirir. Parçalanma süreci, orijinal RNA modifikasyonları üzerinde potansiyel olarak aşırı etkilere neden olabilir. Deney, belirli genin bilgisine ihtiyaç duymuyorsa ancak karşılaştırma için farklı koşullar gerektiriyorsa, mevcut yöntem, çeşitli deney düzenekleri için daha iyi görselleştirme ve kontrol sağlar. 
RNA'nın modifikasyonu, transkripsiyonel kontrolün düzenlenmesinde önemli bir adımdır31. Bununla birlikte, çeşitli fizyolojik alemler altında çeşitli RNA modifikasyonlarının homeostazı ve düzenleyici mekanizmaları hala belirsizdir. Mevcut modifiye edilmiş kuzey lekeleme yöntemi kullanılarak, farklı RNA modifikasyonları ölçülebilir ve karşılaştırılabilir. Ayrıca, RNA modifikasyonlarının değişiklikleri ve düzenlemeleri daha ayrıntılı olarak incelenebilir. Gelecekte, hem klasik kuzey lekeleme hem de modifiye kuzey lekeleme protokollerinden elde edilen deneysel verileri birleştirmek ve RNA biyolojisi hakkında daha fazla bilgi sağlamak da mümkün olabilir.
Modifiye northern blotlama protokolünün başarısını belirleyen en önemli faktör, RNA örneğinin bütünlüğüdür. Bir miktar bozunmaya sahip RNA'lar, iyi klasik kuzey lekeleme sonuçları verebilir, ancak bu, değiştirilmiş kuzey lekeleme sonuçları üzerinde potansiyel olarak önemli bir etkiye sahip olabilir. RNA'nın farklı dokulardaki veya hücre dizilerindeki modifikasyonları da önemli ölçüde değişebilir. Son deneyleri gerçekleştirmeden önce farklı dokular için uygun RNA numune yüklerini test etmek önemlidir.
Kurutma prosedürleri geleneksel olarak Dr. Southern ve farklı coğrafi yönlerden sonra adlandırıldığından, mevcut teknik için "kuzeydoğu" kurutma adını öneriyoruz.

Dinamik ve tersinir RNA modifikasyonlarının RNA homeostazında önemli rolleri vardır. Kırk yıl önce, N 6-metiladenozin (m6A) modifikasyonlarının ökaryotik transkriptomlarda bol miktarda bulunduğubulundu 1. Haberci RNA (mRNA), ribozomal RNA (rRNA), küçük nükleolar RNA, transfer RNA ve mikroRNA2'de çeşitli işlevlere sahiptirler. mRNA'nın m6A modifikasyonları, eklemelerini3, translasyon4, bozunma5 ve lokalizasyon2'yi etkiler. Ayrıca, ribozom biyogenezini ve mikroRNA fonksiyonunuetkilerler 6. RNA'nın m6A modifikasyonlarının evrimsel korunumu, tek hücreli bakterilerde çok hücreli insanlara7 not edilmiştir. M6A modifikasyonlarının rollerinin tanımlanması şu anda kapsamlı bir şekilde araştırılmaktadır. Çabaların transkripsiyon kontrolüne yeni bakış açıları sağlaması bekleniyor. Son çalışmalar, mRNA8'in diğer kimyasal modifikasyonlarının da RNA metabolizmasında kritik roller oynadığını ortaya koymaktadır. 
Sirkadiyen ritimler9, kök hücre pluripotensi10, trigliserid metabolizması4, fibroz11, obezite12 ve majör depresyon13, m6A modifikasyonlarının sonuçları kontrol ettiği bilinen süreçlere birkaç örnektir. Birçok sirkadiyen saat gen transkriptinde m6A bölgeleri14 bulunur. m6 A metilazveya demetilaz modülasyonu sirkadiyen dönem değişiklikleriniortaya çıkarır 15. Bir m6A transferaz olan Mettl3, kök hücre pluripotentliği için bir düzenleyicidir. Mettl3 eksikliği, implantasyon sonrası aşama10'da erken embriyonik ölümcüllüğe ve anormal soy astarına yol açar. Adipositlerde yağ kütlesi ve obezite ile ilişkili (FTO), bir m6A demetilaz eksikliği, Angptl44'ün transkripsiyon sonrası regülasyonu yoluyla yağ asidi mobilizasyonunu ve vücut ağırlığını etkiler. Bu çalışmalar, m6A'nın sadece mRNA işlemeyi kontrol etmekle kalmayıp, aynı zamanda embriyolojik gelişim ve pato-fizyolojide de kritik roller oynadığını ortaya koymaktadır. M6A modifikasyonlarının işlevi, gelecekteki terapötik düşünceler için çıkarımlar taşır.
RNA16-18'in m6A modifikasyonlarını ölçmek için çeşitli yöntemler mevcuttur. Geleneksel olarak, ince tabaka kromatografisi (TLC) ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC),m6A'nın çeşitli RNA'lardaki dağılımını incelemek için kullanılır19,20. Kütle spektrometresi, RNA'daki m6A modifikasyonlarının tespiti için hassas bir araçtır. Bununla birlikte, kütle spektrometresi21 ile analiz edilmeden önce RNA'nın RNaz tarafından kısa parçalara ayrılması gerekir. Metil-RNA immünopresipitasyon ve dizileme (m6A-Seq)22, parçalanmış RNA'ları m6A-spesifik antikorlarla immünopresipitite eder ve paralel RNA dizilemesi gerçekleştirir. Bu yöntem, transkriptom genişliğinde m6A manzaraları oluşturur. m6A bireysel nükleotid çözünürlüklü çapraz bağlama ve immünopresipitasyonun (miCLIP) yüksek çözünürlüklü haritalanması, tek nükleotid çözünürlüğünde m6A modifikasyonlarını daha da haritalandırır23. Her iki yöntem de, belirli genlerin bilgileriyle birlikte tüm transkriptom boyunca m6A modifikasyonunun ayrıntılarını sağlar. Bununla birlikte, deneyler birden fazla koşulun karşılaştırılmasını gerektiriyorsa, her iki yöntemde de nicelikler ve standardizasyon zordur. Ayrıca, m6A-Seq için RNA'nın parçalanması, orijinal RNA yapısını değiştirir ve bu da doğal m6A seviyelerini etkileyebilir. RNA'nın global m6A modifikasyonlarını ve farklı deneysel koşullar altında değişikliklerini tespit etmek için, modifiye edilmiş bir kuzey lekeleme protokolü kullanan bir yöntem rapor ediyoruz. Bu yöntem, jel elektroforezi18 kullanarak RNA'yı moleküler ağırlığa göre çözer. Bu prosedür, birden fazla koşul veya numune içeren deneyler için daha iyi standardizasyon ve nicelikler sağlar. Ayrıca, rRNA, mRNA veya mikroRNA olsun, farklı RNA'lar için spesifik m6 A modifikasyon bilgisi sağlar.

<table><tbody><tr><td>RNaseZap çözümü</td><td>Ambion</td><td>AM9782</td><td>Protokolü 1.1</td></tr><tr><td>TRI Reaktif çözeltisi</td><td>Ambion</td><td>AM9738</td><td>Protokolü 1.2.1.1</td></tr><tr><td>1-Bromo-3-kloropropan (BCP)</td> <td>Sigma</td><td>B9673</td><td>Protokolü 1.2.1.3</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>JTbaker</td><td>8006</td><td>Protokolü 1.2.1.3</td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td>Protokolü 1.2.1.3</td></tr><tr><td>GenElute mRNA Miniprep</td><td>Kiti Sigma</td><td>MRN70</td><td>Protokolü 1.2.2.1</td></tr><tr><td>Glikojen</td><td>Ambion</td><td>AM9510</td><td>Protokolü 1.2.2.2</td></tr><tr><td>Sodyum asetat</td><td>Fluka</td><td>71183</td><td>Protokolü 1.2.2.2</td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su</td><td>Ambion</td><td>AM9930</td><td>Protokolü 1.2.2.6</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td>Protokolü 2.1.1</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>JT Baker</td><td>A426</td><td>Protokolü 2.1.2</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td>Protokolü 2.1.3</td></tr><tr><td>%37 formaldehit Çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>Protokolü 2.1.3</td></tr><tr><td>EDTA, Disodyum Tuzu</td><td>JT Baker</td><td>8993</td><td>Protokolü 2.1.3 10x MOPS tampon</td></tr><tr><td>formamid</td><td>Sigma</td><td>F7503</td><td>Protokolü 2.2.1</td></tr><tr><td>RNA Milenyum İşaretleyici</td><td>Ambion</td><td>AM7150</td><td>Protokol 2.2.2</td></tr><tr><td>Etidyum Bromür</td><td>Amresco</td><td>X328</td><td>Protokol 2.2.5</td></tr><tr><td>Ficoll PM400</td><td>GE Sağlık</td><td>17-0300-10</td><td>Protokol 2.2.5 izleme boyası</td></tr><tr><td>Bromofenol mavisi</td><td>Sigma</td><td>114391</td><td>Protokol 2.2.5 izleme boyası</td></tr><tr><td>Ksilen Siyanol FF</td><td>Sigma</td><td>X4126</td><td>Protokolü 2.2.5 izleme boyası</td></tr><tr><td>Sodyum klorür dihidrat</td><td>JT Baker</td><td>3624</td><td>Protokolü 2.4.2 20x SSC tamponu</td></tr><tr><td>Trisodyum sitrat</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td>Protokolü 2.4.2 20x SSC tamponu</td></tr><tr><td>Hybond Kurutma Kağıdı</td><td>GE Sağlık RPN6101M</td><td></td><td>Protokolü 2.4.4</td></tr><tr><td>GE Hybond-N+ membranı</td><td>GE Sağlık RPN303B</td><td></td><td>Protokolü 2.4.6</td></tr><tr><td>Stratalinker UV Çapraz Bağlayıcı 2400</td><td>Stratagene</td><td>400075</td><td>Protokolü 3.1.2</td></tr><tr><td>Jel Yakalayıcı 1500</td><td>ANT</td><td>Teknolojisi Jel Yakalayıcı 1500</td><td>Protokolü 3.1.5</td></tr><tr><td>Anti-m6A (N6-metiladenozin)</td> <td>Sinaptik Sistemler</td><td>202003</td><td>Protokolü 3.2.3</td></tr><tr><td>Amersham ECL Anti-Tavşan IgG, HRP bağlantılı tüm Ab</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934</td><td>Protokolü 3.2.5</td></tr><tr><td>ChemiDoc MP Sistemi</td><td>BIO-RAD</td><td>1708280</td><td>Protokolü 3.2.8</td></tr></tbody></table>

rna ölçülmesi için bir yöntem<em&gt; k</em<sup&gt; 6</suphücre ve dokularda&gt; -methyladenosine değişiklikler

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

N 6-Metiladenozin (m6A) RNA modifikasyonları ökaryotlar arasında çeşitli ve her yerde bulunur. mRNA, rRNA, tRNA ve mikroRNA'da bulunurlar. Son çalışmalar, bu tersinir RNA modifikasyonlarının RNA ekleme, translasyon, bozunma ve lokalizasyonunu etkilediğini ortaya koymuştur. Sirkadiyen ritimler, kök hücre pluripotentliği, fibroz, trigliserit metabolizması ve obezite gibi çoklu fizyolojik süreçler de m6A modifikasyonları ile kontrol edilir. İmmünopresipitasyon / dizileme, kütle spektrometresi ve modifiye kuzey lekeleme, m6A modifikasyonlarını ölçmek için yaygın olarak kullanılan yöntemlerden bazılarıdır. Burada, m6A modifikasyonlarını ölçmek için bir kuzeydoğu lekeleme tekniği sunuyoruz. Mevcut protokol, RNA'nın iyi boyutta ayrılması, çeşitli deneysel tasarımlar için daha iyi konaklama ve standardizasyon ve çeşitli RNA kaynaklarında m6A modifikasyonlarının net bir şekilde tanımlanmasını sağlar. M6A modifikasyonlarının sirkadiyen ritimler ve obezite ile ilgili insan fizyolojisi üzerinde çok önemli bir etkiye sahip olduğu bilinmesine rağmen, diğer (pato)fizyolojik durumlardaki rolleri belirsizdir. Bu nedenle, m6A modifikasyonları üzerine yapılan araştırmalar, moleküler fizyolojiye temel bilgiler sağlamak için muazzam bir olasılığa sahiptir.

Normal ışık-karanlık sirkadiyen fazda 14 gün sonra, vahşi tip farelerde sürekli karanlıkta yerleştirildi. karaciğer RNA&#39;lar 4 saat aralıklarla numune ve modifiye Northern blot ile incelenmiştir. RRNA, mRNA ve küçük RNA&#39;ların metilasyonu açık (Şekil 2) tespit edilmiştir. Farklı sirkadiyen saatler arasında karşılaştırma (BT) doğru 18S rRNA standardı ile hesaplanabilir. RRNA, mRNA ve küçük RNA&#39;lar m 6 A düzeylerinin sağlam sirkadiyen salınım oldu. rRNA tarafından Sunulan girişimi önlemek için, poliadenile edilmiş RNA&#39;lar aşama 1.2.2 gibi saflaştırılabilir. Saflaştırmadan sonra, rRNA, büyük ölçüde diğer RNA&#39;lar (Şekil 3) daha iyi bir görünüm için izin ortadan kaldırılabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig1.jpg" /> <stron<html> g&gt; Şekil 1: leke aktarma ünitesi montajı. zara RNA kurutma için kılcal aktarım ünitesi gösterilmektedir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54672/54672fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig2.jpg" /> Şekil 2: C57BL / 6J fareler m 6 A düzeyleri günlük ritim. Bu rakam, m 6 vahşi tip farelerin karaciğer toplam RNA&#39;nın bir leke 4 saat aralıklarla normal ışık-karanlık fazın 14 gün sonra koyu, koyu fazının ilk gününde kurban gösterir. Miktar m 6 18S ve 28S rRNA arasındaki görüntü yoğunluk farkı kullanılarak yapıldı. M 6 A bolluk altındaki formaldehit jelden 18S rRNA bandına normalize edildi.et = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54672/54672fig3.jpg" /> Şekil 3: ya rRNA olmadan m 6 A lekeler. Örnek m toplam RNA ve vahşi tip fare karaciğerinde poliadenile RNA 6 bir blotlar gösterilmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54672/54672fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1 </td><td colspan="3"> 10x MOPS tampon (pH 7.0, ışıktan koruma) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> MOPS </td><td> 41.85 </td><td> g </td><td> 0.2 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Sodyum asetat </td><td> 4.1 </td><td> g </td><td>0.05 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> EDTA, disodyum tuzu </td><td> 3.7 </td><td> g </td><td> 0.01 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> DEPC su </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Genel Toplam </td><td> 1 </td><td> L </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> oda sıcaklığında karışmaya </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td colspan="3"> 20x SSC tamponu (pH 7.0) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Sodyum klorit </td><td> 175.3 </td><td> g </td><td> 3 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> trisodyum sitrat </td><td> 88.3 </td><td> g </td><td> 0.3 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> DEPC su </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Genel Toplam </td><td> 1 </td><td> L </td><td></td&gt; </tr><tr><td></td><td colspan="3"> Oda sıcaklığında karıştırdıktan sonra otoklav </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td colspan="3"> takip Boya </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 10x MOPS tamponu </td><td> 500 </td><td> ul </td><td> 1x </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Ficoll 400 </td><td> 0.75 </td><td> g </td><td> % 15 </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> mavi Bromophenol </td><td> 0.01 </td><td> g </td><td> % 0.2 </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Ksilen siyanol </td><td> 0.01 </td><td> g </td><td> % 0.2 </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> DEPC su </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Genel Toplam </td><td> 5 </td><td> mL </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> -20 ° C&#39;de de </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td colspan="3"> DEPC su </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 1&#39;den oranı sulandırmak: DEPC ve 1,000 GKD 2 O </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Gece boyunca oda sıcaklığında karıştırdıktan sonra otoklav </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="3"> Örnek tamponu (ışıktan korumak) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 10x MOPS tamponu </td><td> 200 </td><td> ul </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> % 37 formaldehid </td><td> 270 </td><td> ul </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> formamid </td><td> 660 </td><td> ul </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> -20 ° C&#39;de de </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody&gt; </table> Tablo 1: Tampon ve çözümleri.

RNA N 6 -methyladenosine (m 6 A) değişiklikleri ölçmek için bir değiştirilmiş Northern lekeleme yöntemi tarif edilmektedir. Geçerli yöntem çeşitli deneysel tasarımlar altında çeşitli RNA&#39;lar modifikasyonlar ve kontrolleri tespit edebilir.

RNA ölçülmesi için bir yöntem<em&gt; K</em<sup&gt; 6</supHücre ve dokularda&gt; -methyladenosine Değişiklikler

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Modifiye edilmiş northern blotting tekniğinin genel amacı, RNA'daki N6-metiladenosin (n6A) modifikasyonlarını ölçmek ve çeşitli RNA'lardaki modifikasyonları tespit etmektir. Bu yöntem, N6-metiladenosin modifikasyonları gibi RNA epigenetiğinin rolündeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, RNA'nın etkili bir şekilde ayrıştırılmasını, deneysel tasarımlar için daha iyi bir standardizasyonu ve RNA'lardaki n6A modifikasyonunun net bir şekilde belirlenmesini sağlamasıdır.Bu yöntem, RNA'daki n6A modifikasyonları hakkında bilgi sağlayabilir ve farklı saptama antikorları kullanılarak diğer RNA modifikasyonlarına da uygulanabilir. Deneye başlamak için, kağıt havluların üzerine ribonükleaz dekontaminasyon solüsyonu püskürtün ve pipetleri ile laboratuvar tezgah yüzeylerini silin. Kağıt havluları nükleaz içermeyen su ile ıslatın ve pipetleri ile laboratuvar tezgah yüzeylerini tekrar silin.Dört derece Celsius'te muhafaza edilen RNA izolasyon solüsyonunu temin edin ve solüsyondan 1 mL'yi yaklaşık 75 mg fare dokusuna ekleyin. Dokuyu homojenize etmek için bir üstten karıştırıcı kullanın. Ardından, her 1 mL örnek homojenatı için 100 µL 1-Bromo-3-kloropropan veya BCP ekleyin.Tüpleri 15 saniye boyunca kuvvetlice çalkalayın ve toplam RNA izolasyonuna geçin. Bir spektrofotometre kullanarak, 260 nanometre ve 280 nanometrelerdeki absorbansı kaydederek RNA konsantrasyonunu belirleyin. %0,8 agaroza jel elektroforezi gerçekleştirerek RNA örneğinin kalitesini kontrol edin.Tüm elektroforez ekipmanlarını dietilpirokarbonat veya DEPC'li su ile durulayın. Bir Erlenmeyer balonuna 2,5 gram agaroz ve ardından 215 mililitre DEPC'li su ekleyin ve karışımı bir mikrodalga fırında tamamen eritin. Çözelti eridikten sonra, 12,5 mililitre 10X MOPS tamponu ekleyin.Ardından erlene 22,5 mililitre %37'lik formaldehit ekleyin. Daha sonra solüsyonu 1,5 milimetre kalınlığında bir tarak bulunan elektroforez cihazına dökün. Temiz bir tarak kullanarak hava kabarcıklarını jelin kenarlarına itin.Jelin oda sıcaklığında katılaşmasını bekleyin. Ardından, jelin kuyucuklarını durulamak ve jeli ön çalıştırmaya tabi tutmak için önceden hazırlanmış 1X MOPS çalıştırma tamponu kullanın. RNA örneklerini jelin kuyucuklarına yükleyin ve ardından jeli çalıştırın.Ertesi gün, jeli UV ışığı altında inceleyin ve fotoğraflayın. Transferi hazırlamak için jeli kesin ve kullanılmayan kısmını çıkarın. 500 mililitre 10X salin sodyum sitrat veya SSC tamponu hazırlayın.Jeli iki kez 10X SSC tamponu ile yıkayın. Jeli örtecek büyüklükte bir adet filtre kağıdı tabakası kesin. Filtre kağıdından jelle aynı boyutta dört parça kesin.Ardından, pozitif yüklü naylon membrandan bir tabakayı jel ile aynı boyutta kesin. Doğru yönlendirmeyi sağlamak için jel ve membran üzerinde işaretleyici olarak bir çentik oluşturun. Membranı 2X SSC tamponunda bekletin.Transfer tepsisine 500 mililitre 10X SSC tamponu dökün. Büyük filtre kağıdı tabakasını cam plakanın üzerine yerleştirin ve filtre kağıdını transfer tamponu ile ıslatın. Ardından, oluşan hava kabarcıklarını bir pipet yardımıyla giderin.Önceden kesilmiş iki parça filtre kağıdını transfer tamponunda ıslatın ve filtre kağıdının merkezine yerleştirin. Varsa hava kabarcıklarını giderin. Daha sonra jeli üst yüzeyi aşağı gelecek şekilde filtre kağıdının üzerine yerleştirin ve jelin çentikleri ile membranın çentiklerini hizaladığınızdan emin olarak membranı jelin üzerine yerleştirin.Ardından, membran üzerine önceden kesilmiş iki parça filtre kağıdı yerleştirin. Katmanlar arasındaki hava kabarcıklarını giderin. Havluların yalnızca jel ve membrandan geçen tampon çözeltiyi emdiğinden emin olmak için jelin etrafını streç filmle sarın.Ardından, filtre kağıdın üzerine kağıt havlular yerleştirin. Havluların üzerine büyük boyutlu bir cam plaka ve yığının üzerine bir ağırlık koyun; RNA'nın jelden membrana gece boyunca aktarılmasını sağlayın. Aktarımın ardından, membranı 2X SSC tamponu içinde nemli tutun.İki adet filtre kağıdını 10X SSC tamponuna daldırın, ardından kağıtları UV crosslinker cihazına yerleştirin. RNA emen tarafın yukarıye baktığından emin olun ve ardından membranı filtre kağıdının üzerine yerleştirin. Otomatik crosslink modunu seçin ve ışınlamayı başlatmak için başlat düğmesine basın.RNA'nın jelden membrana transferini doğrulamak için membranı ve jeli bir UV jel görüntüleme sistemi ile inceleyin. Membranı, oda sıcaklığında bir saat boyunca TBST tamponu içerisindeki %5 yağsız süt ile bloke edin. Membranı, dört derece Celsius'ta gece boyunca m6A antikor çözeltisi ile inkübe edin.Ertesi gün, membranı TBST tamponu ile 15 dakika boyunca üç kez yıkayın. Ardından, membranı oda sıcaklığında bir saat boyunca HRP konjuge eşek anti-tavşan antikor çözeltisinde inkübe edin. Bir saatin ardından, membranı TBST tamponu ile 15 dakika boyunca üç kez yıkayın.Geliştirilmiş kemilüminesans substratını uygulayın. Kemilüminesansı dijital bir görüntüleyici ile yakalayın. Son olarak, m6A kantifikasyonuna geçin ve Image J kullanarak göreceli m6A kemilüminesans yoğunluğunu ölçün. Fare karaciğer RNA'ları dört saatlik aralıklarla örneklenmiş ve modifiye edilmiş northern blotting tekniği ile incelenmiştir.rRNA'ların, mRNA'ların ve küçük RNA'ların metilasyonu net bir şekilde tespit edildi. Yabanıl tip farelerin karaciğerlerinden elde edilen toplam RNA ve rRNA'sız RNA için temsilci m6A blotları gerçekleştirildi. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde yürütüldüğü takdirde dört günde tamamlanabilir.Geliştirildikten sonra bu teknik, RNA epigenetiği alanındaki araştırmacıların sirkadiyen ritim ve obezite ile ilgili insan fizyolojisi üzerindeki etkileri keşfetmelerinin önünü açmıştır.

a-method-for-measuring-rna-n6-methyladenosine-modifications-cells

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Burada, maya RNA-modifiye enzim, Mod5, biyokimyasal karakterizasyonu için bir iletişim kuralı tanımlamak ve nasıl diğer RNA enzimler için bu iletişim kuralı uygulanırsa tartışıyorlar.

TRNA-Isopentenyl transferaz aktivite tespit etmek için bir In Vitro tahlil

Burada RNA DNAzyme bağımlı dekolte için bir protokol salıyoruz. Bu, RNA 2'-O-metilasyonun hızlı ve yere bağlı analizini sağlar. Bu yaklaşım, snoRNA aktivitesinin ön veya önemli değerlendirilmesi için kullanılabilir.

RRNA 2'-O-Metilasyonun DNAzyme bağımlı analizi

Burada, sentetik veya in vitro transkripsiyonu RNA üzerinde metiltransferaz aktivitesinin doğrudan analizi için antikor içermeyen bir in vitro tahlil açıklanmıştır.

RNA metiltransferaz aktivite analizi için Antibody Içermeyen tahlil

Metillenmiş RNA immün önksepitasyon testi, metillenmiş RNA parçaları için zenginleştirmek için kullanılan antikor bazlı bir yöntemdir. Derin sıralama ile birleştiğinde, m5C modifikasyonlarını taşıyan transkriptlerin tanımlanmasına yol açar.

Arabidopsis'te m5C Modifikasyonu Çalışmak için Metillenmiş RNA İmmün Prempripitasyon Tahlil

Bitkilerde in vivo nükleozidler/nükleotidler nicelemesi için kesin ve tekrarlanabilir bir yöntem burada açıklanmıştır. Bu yöntem bir HPLC-MS/MS kullanmaktadır.

HPLC-MS/MS ile Nükleozid/Nükleotid İçerik Ölçümü için Bitki Numunesi Hazırlama

Viral enfeksiyonlarda RNA modifikasyonlarının rolü yeni yeni araştırılmaya başlanmıştır ve yeni viral konak etkileşim mekanizmalarını vurgulayabilir. Bu çalışmada, viral enfeksiyonlar bağlamında m6A ve m5C RNA modifikasyonlarını araştırmak için bir boru hattı sağlıyoruz.

Viral Enfeksiyon Üzerine m6A ve m5C Epitranscriptomes'i Keşfetmek: HIV ile Bir Örnek

Bu protokol, serbest ve proteine bağlı arginin ve metil-argininlerin 1H-NMR spektroskopisi ile hazırlanmasını ve kantitatif ölçümünü açıklamaktadır.

Arginin Metilomunun Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi ile Araştırılması

RNA'nın transkripsiyon sonrası modifikasyonları, son zamanlarda merkezi sinir sistemi plastisitesi ile bağlantılı olan az çalışılmış bir translasyon düzenleme katmanını temsil eder. Burada, tek nöronlarda çok sayıda RNA modifikasyonunun eşzamanlı karakterizasyonu için numune hazırlama ve sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometrisi yaklaşımı tanımlanmıştır.

Kütle Spektrometrisi Kullanarak Tek Nöronlardaki RNA Modifikasyonlarını Karakterize Etme

Protokol, mutasyonel profilleme deneyleri için RNA'nın dimetil sülfat ile modifiye edilmesi için talimat sağlar. İki alternatif kütüphane hazırlama yöntemi ile in vitro ve in vivo problama içerir.

RNA Yapısının Dimetil Sülfat Mutasyonel Profillemesi ile İn Vitro ve İn Hücre Dizilimi ile İncelenmesi

Burada, nokta blot kullanarak küresel m⁶A seviyelerini yarı nicel olarak değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz. Toplam RNA çıkarılır, denatüre edilir, naylon zar üzerinde lekelenir, anti-m⁶A antikoru ile incelenir ve kemilyümüsans ile görselleştirilir. Sinyal yoğunluğu, ImageJ gri tonlama analiziyle ölçülür, göreli metil bolluğunu yansıtır ve araştırma için tekrarlanabilir bir iş akışı sağlar.

Küresel N 6-metiladenosin RNA modifikasyon seviyelerini tespit etmek için nokta lekesi testi

Bu protokol, MeRIP-qPCR kullanılarak belirli RNA'nın m6Amodifikasyon seviyelerini değerlendirmek için ayrıntılı bir yaklaşım sunar.

Osteosarkom Hücrelerinde Spesifik RNA Modifikasyon Seviyeleriiçin MeRIP-qPCRTesti

Öğrenin, RNA epigenetiğinde N6-metiladenozin (m6A) modifikasyonlarını tespit etmek için modifiye northern blotting yöntemini. Bu teknik fare dokusundan RNA izolasyonu ve kemilüminesans ile çalışır.

RNA ölçülmesi için bir yöntem

Daha fazla video keşfet