İnsan Primer Hücre Kültürleri içinde Sirkadyen Saat Gen İfade ve Hormon salgısını Paralel Ölçümü
11 Kasım 2016
Burada, paralel sirkadiyen biyolüminesansı ve insan adacık hücrelerinin ve birincil miyotüplerin salgı aktivitesini izlemek için ayarları açıklıyoruz. Bunun için, bir lusiferaz çekirdek saat raportörünün lentiviral gen iletimini, ardından in vitro senkronizasyonu ve sürekli hücre perifüzyonu ile çıkış ortamının toplanmasını kullandık.
Bu prosedürün genel amacı, sirkadiyen biyolüminesansın paralel değerlendirilmesi ve en vitro kültürlenen ve senkronize edilen insan primer endokrin hücrelerinin salgı aktivitesidir. Bu yöntem, hücre salgısının zamansal modelini ve hücre otonom sirkadiyen saatleri tarafından nasıl düzenlenebileceğini araştırmaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, sirkadiyen lusiferinleri raportör aktivite olarak izlememize ve aynı anda salgılanan hormonların ve miyokinlerin seviyelerini ölçmek için dışarı akış ortamını toplamamıza izin vermesidir. Sirkadiyen biyolüminesans raportörlerini lentiviral transdüksiyon yoluyla birincil hücrelere sokmak için, önce insan miyoblastlarını içeren 3,5 cm'lik petri kaplarını %30 ila %50 birleşimde bir laminer akış kabinine aktarın. İnsan miyoblast ortamını 2 mL büyüme ortamı ile değiştirin. Daha sonra, üçe eşit bir enfeksiyon çokluğu elde etmek için lentivirüs çözeltisini tabağa pipetleyerek birincil hücre kültürünü dönüştürün. Hücreleri gece boyunca bir doku kültürü inkübatöründe inkübe edin. Ertesi gün ortamı değiştirin. En vitro senkronizasyonu elde etmek için, daha önce transfekte edilmiş primer hücreleri içeren 3,5 cm petri kabı başına 2 mL ortama 10 mikromolar adenilil siklaz aktivatörü ekleyin. Hücreleri 37 ° C'de 60 dakika inkübe edin
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, insan adacık hücreleri ve primer miyotüplerin salgılayıcı aktivitesi ile birlikte sirkadiyen biyolüminesansı izleme yöntemlerini açıklamaktadır. Yaklaşım, bir lusiferaz çekirdek saat raporerinin lentiviral gen transferini ve ardından in vitro senkronizasyon ile besiyeri toplama için sürekli hücre perifüzyonunu içermektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Kronobiyoloji
Arka Plan
- Sirkadiyen ritimler, hücresel fonksiyonlarda kritik bir rol oynar.
- Biyolüminesans izlemi, hücresel aktivite hakkında bilgiler sağlayabilir.
- İnsan adacık hücreleri, insülin sekresyonu için hayati öneme sahiptir.
- Primer miyotüpler, kas fizyolojisinin incelenmesi için önemlidir.
Çalışmanın Amacı
- Sirkadiyen ritimler ile salgılayıcı aktivite arasındaki ilişkiyi araştırmak.
- Hücresel fonksiyonların gerçek zamanlı izlenmesi için bir yöntem geliştirmek.
- İnsan hücrelerindeki metabolik süreçlere dair anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Lusiferaz reporter ekspresyonu için lentiviral gen aktarımı.
- Hücre kültürlerinin in vitro senkronizasyonu.
- Besiyeri toplama için sürekli perifüzyon.
- Sirkadiyen ritimleri değerlendirmek için biyolüminesans ölçümü.
Temel Sonuçlar
- İnsan adacık hücrelerinde sirkadiyen biyolüminesansın başarılı bir şekilde izlenmesi.
- Primer miyotüplerin salgılayıcı aktivitesinin gösterilmesi.
- Hücresel ritimleri incelemek için güvenilir bir yöntem oluşturulması.
- Sirkadiyen biyoloji ile hücresel fonksiyon arasındaki etkileşime dair öngörüler sağlanması.
Sonuçlar
- Çalışma, hücresel aktiviteleri gerçek zamanlı olarak izlemek için yeni bir yaklaşım sunmaktadır.
- Bulgular, sirkadiyen etkilerin metabolizma üzerindeki etkilerinin anlaşılmasına katkıda bulunmaktadır.
- Diyabet araştırmaları ve kas fizyolojisinde potansiyel uygulama alanları mevcuttur.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
İnsan primer hücre kültürlerinde sirkadiyen saat geni ekspresyonu ve hormon sekresyonunun paralel ölçümü, insan endokrin ve kas sistemlerindeki zamansal düzenlemenin doğrudan sorgulanmasına olanak tanır. Bu yaklaşım, moleküler sirkadiyen osilatörleri fonksiyonel sekresyon çıktılarıyla ilişkilendirerek hedef doğrulamasındaki öngörüsel güveni artırır. Bu ölçümlerin keşif aşamasında entegre edilmesi, portföy genelindeki metabolik ve kronobiyoloji programlarının risk ayarlı ilerlemesini destekler.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Birincil insan hücrelerinde saat geni aktivitesini hormon ve miyokin salınımıyla ilişkilendirerek mekanistik risk azaltmaya olanak tanır.
- Çekirdek saat genlerini bozarak ve aşağı akıştaki sekresyon etkilerini nicelleştirerek fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Metabolik ve endokrin hedefler için yolak seçiminde öngörüsel güveni kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Sağlam bir analiz geliştirme süreci için valide edilmiş, senkronize primer hücre sistemleri oluşturur.
- Hem gen ekspresyonunun hem de sekresyon aktivitesinin kantitatif, zaman çözünürlüklü çıktılarını sağlar.
- Bileşiklerin veya genetik pertürbasyonların sirkadiyen düzenlemeli çıktılar üzerindeki etkilerinin tekrarlanabilir şekilde değerlendirilmesine olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Primer adacık ve kas hücreleri kullanarak in vitro bulguları hastalıkla ilişkili insan fizyolojisiyle uyumlu hale getirir.
- Moleküler saat bozulmasını fonksiyonel sekresyon fenotiplerine bağlayarak translasyonel biyobelirteç keşfini destekler.
- Metabolik ve kronobiyoloji araştırmalarında, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar süreklilik sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, insan primer hücrelerinde sirkadiyen regülasyonun hipotez testlerini mümkün kılarak erken keşif ile preklinik araştırmalar arasında köprü kurmakta, hem hedef doğrulamayı hem de translasyonel sürekliliği desteklemektedir.
- Keşif Biyolojisi: Sirkadyen gen fonksiyonunun ve bunun salgı yolları üzerindeki etkisinin doğrudan test edilmesine olanak tanır.
- Tarama: Bileşik değerlendirmesi için kantitatif çıktılara sahip, senkronize ve analiz hazır primer hücre modelleri sağlar.
- Analitik: Koşullar arasında güçlü istatistiksel karşılaştırmalar için zaman çözünürlüklü biyolüminesans ve salgı verileri oluşturur.
- Translasyonel Araştırma: Moleküler saat pertürbasyonunu, insan hücrelerindeki hastalıkla ilgili salgı fenotipleriyle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çeşitli primer hücre tipleri ve hedeflerde sirkadyen düzenlemenin değerlendirilmesi için yeniden kullanılabilir bir platform sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hedef doğrulamada öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Primer insan hücrelerinde uzun vadeli, paralel ölçüm iş akışlarını standartlaştırır.
- Stratejik Değer: Hastalıkla ilgili sistemlerde moleküler ve fonksiyonel çıktıları ilişkilendirerek devam/durdur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Metabolik ve kronobiyoloji programlarının riskle uyumlu önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Lentiviral transdüksiyon, primer hücre kültürü ve biyolüminesans ölçümü konularında uzmanlık gerektirir.
- Senkronize perifüzyon sistemlerine ve hassas hormon/miyokin analizlerine erişim gereklidir.
- Tekrar üretilebilir zaman serisi veri toplama işlemi için ekipler arası standardizasyon gereklidir.
- Farklı primer hücre tipleri veya salgılama uç noktaları için adaptasyon gerekebilir.
- Her uygulama için uzun süreli kültür ve raporlayıcı stabilitesi doğrulanmalıdır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:05
Title
0:52
Continuos Long-term Circadian Bioluminescence Recording, Performed in Parallel with the Assessment of Hormone Secretion in Living Human Primary Cells
2:24
Parallel Assessment of Circadian Bioluminescence Recording and Hormone Secretion Profiles in Synchronized Human Secretory Primary Cells
4:37
Results: Evaluation of the Clock Regulation of Basal IL-6 Secretion by Human Myotubes
5:33
Conclusion
