Aracı Olarak Etilen serbest Bileşik, 2-chloroethylphosphonic acid, kullanan Bakterilerin Etilen Yanıtı Eğitim için

Bu prosedürün genel amacı, bakterilerin etilene verdiği yanıtın incelenmesi için basit ve güvenli bir yöntem sunmaktır. Bu yöntem, etilenin bitkilerde bakteriyel yapışma ve kolonizasyondaki rolü gibi bitki-mikrop etkileşimlerine dair temel soruları yanıtlayacaktır. Bu tekniğin temel avantajı, herhangi bir özel ekipman gerektirmemesi ve laboratuvarda gaz halindeki etilenle çalışmaktan çok daha güvenli olmasıdır.

Bu yöntem, bakteriyel selüloz üretiminin etilenden nasıl etkilendiğine dair bilgi sağlayabilmesinin yanı sıra, etilen aracılı süreçlerin bitki kolonizasyonuna nasıl dahil olduğunu in vitro olarak incelemek amacıyla bitki ilişkili diğer mikroorganizmalar için de uygulanabilir. Hazırlık aşamasında, Arabidopsis fideleri için 100 mililitre büyüme ortamı ve CEPA ayrışması için 100 mililitre bakteriyel büyüme ortamı hazırlayın. Arabidopsis ortamı oda sıcaklığına geldiğinde, 40 mililitreyi steril bir flaska ayırın ve bu alikotu 40 µL 10 mM ACC ile destekleyin.

Şimdi, plaka kadranlarına beş mililitre besiyeri ekleyin ve agarın katılaşmasını bekleyin. Tüm plakaların karşıt kadranlarında bakteri büyüme besiyeri ve arabidopsis besiyeri bulunur. Üç farklı besiyeri konfigürasyonu kullanın.

CEPA işlemi protokolün ilerleyen aşamalarında gerçekleştirilecektir. Her plaka konfigürasyonunu üç tekerrürlü olarak hazırlayın. Agar soğuduktan sonra, arabidopsis ortamının her kadranına yaklaşık 50 tohumu eşit şekilde dağıtın.

Ardından, plakları dört derece santigrat sıcaklıkta, karanlıkta üç ila dört gün boyunca inkübe edin. Daha sonra, tohumları inkübe ettikten sonra iki saat boyunca floresan ışığa maruz bırakın. Ardından, bir plak konfigürasyonunun bakteriyel agarı üzerine 10 µL 500 mM CEPA stok çözeltisi yayın.

Agar içerisindeki nihai CEPA konsantrasyonu 1 mM olacaktır. Şimdi, tüm plakaları laboratuvar filmi ile kapatın ve folyoya sarın. Ardından, plakaları agar tarafı aşağı gelecek şekilde 23 °C sıcaklıkta karanlık bir ortama yerleştirin ve tohumların çimlenmesi için üç gün boyunca inkübe edin.

Tohumlar çimlendikten sonra, her bir işleme karşılık gelen fideleri çıkarmak için alevle sterilize edilmiş pensler kullanın. Toplamda işlem başına 180 adet olacak şekilde, her kuadrandan 30 fide seçin. Fideleri, ölçekleme için yanına bir cetvel koyarak siyah bir arka plan önünde, bir diseksiyon mikroskobu altında veya yüksek çözünürlüklü bir dijital kamera ile görüntüleyin.

Ardından, hipokotil uzunluklarını ImageJ yazılımını kullanarak ölçün. "Straight" aracını kullanarak 10 milimetreyi ölçün ve ölçeği ayarlamak için "Analyze" sekmesi altındaki "Set Scale" seçeneğini belirleyin. Daha sonra, her bir hipokotili ölçmek için "Straight Line" aracı altındaki "Segmented" aracını kullanın ve uzunlukları hesaplamak için M tuşuna basın.

Pelikül analizi, bakteriyel selüloz üretimi için standart bir analiz aracıdır. pH ve morfolojik analizler ilgili protokolde detaylandırılmıştır. Hazırlık aşamasında, hücreleri başlangıç kültürlerinden üç tekrarlı olarak toplayın ve hücreleri bir Petroff-Hauser Sayım Odası kullanarak nicelleştirin.

Ardından, farklı CEPA konsantrasyonlarına sahip dört adet ortam ana karışımı hazırlayın. Her bir ana karışım için, 60 mililitre pH 7 SH ortamı alikote edin ve sıfır, 0,1, 0,1 veya 1,0 milimolar nihai CEPA konsantrasyonları elde etmek için sıfır, beş, 50 veya 500 milimolar CEPA stok çözeltisinden 120 mikrolitre ekleyin. Bu ortamları flaskları çalkalayarak karıştırın.

Her bir triplikat için bir set besiyeri gereklidir ve steril kontrol olarak görev yapması için dördüncü bir set gereklidir. Bu nedenle, hazırlanan her 60 milliliter besiyerini dört adet 14 milliliter alikota bölün. Ardından, mililitre başına 100,000 hücre nihai konsantrasyonunda ilgili başlangıç kültürleri ile inoküle etmeden önce 14 milliliter alikotları ön soğutma işlemine tabi tutun.

Selüloz üretimini önlemek için inoküle edilen tüm tüpleri buz üzerinde tutun. Kalan 14 mikrolitrelik alikotları steril kontrol kuyucukları için kullanın. Şimdi, her 14 mikrolitrelik ana karışımdan, analiz edilen başlangıç kültürü başına toplam dört yüklü plaka olacak şekilde, steril bir 24 kuyucuklu plakanın altı kuyucuğuna ikişer mikrolitrelik alikotlar yükleyin.

Plakaları parafin film ile dikkatlice mühürleyin ve 30 °C'de yedi gün boyunca statik olarak inkübe edin. İnkübasyon sırasında, ortamın asitliğini periyodik olarak ölçmek için paralel olarak 25 mL'lik bir sıvı kültürü inkübe edin. Asitlik pH 5'in altına düşerse, organizmanın büyümesi CEPA'nın etilene dönüşümünü engelleyecektir ve bu durum söz konusu analizle uyumsuzdur.

Bir hafta sonra, pelikül ıslak ağırlığını, kalınlığını, kuru ağırlığını ve kristalliğini hasat edin ve ölçün. Plakadan pelikül toplamak için, karşı kenarı yükseltmek amacıyla pelikülün bir tarafına bastırın ve pensle alın. Tutuşu korurken, fazla medyumu temizlemek için pelikülleri üç saniye boyunca temiz bir kağıt havlu üzerine yerleştirin.

Ardından, her bir pelikliği tartın ve bunu ıslak ağırlık olarak kaydedin. Daha sonra, peliklikleri bir cetara hizalayın ve yüksek çözünürlüklü bir dijital kamera kullanarak yan taraftan fotoğraflarını çekin. Pelikliklerin kalınlıklarını belirlemek için bu fotoğrafları analiz edin.

Ardından, pelikülleri tek tek altı kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına aktarın. Hücreleri parçalamak için 80 °C'de 20 dakika boyunca 12 mL 0,1 normal sodyum hidroksit ile muamele edin. Daha sonra sodyum hidroksiti uzaklaştırın ve işlem görmüş pelikülleri, altı kuyucuklu bir plakada 24 saat boyunca ajitasyonla 12 mL ultra saf su ile iyice yıkayarak nötralize edin.

Bu inkübasyon sırasında suyu her altı saatte bir değiştirin. İnkübasyon sona erdiğinde, peliküller beyaz renkte olmalıdır. Ardından, kuru ağırlık ölçümüne hazırlamak için pelikülleri silikon matlara yerleştirin ve 50 °C'de 48 saat boyunca kurutun.

Peliküllerin kristalliği, Fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopisi kullanılarak analiz edilebilir. Karanlıkta büyütülen arabidopsis thaliana fideleri; ACC varlığında ve SH ortamında CEPA bozunması yoluyla üretilen etilen varlığında, kısa ve kalın hipokotil ile belirgin bir apikal kanca ile karakterize edilen üçlü yanıt fenotipini sergilemiş, ancak işlem görmemiş koşullar altında bu durumu sergilememiştir. Açıkça görülmektedir ki, işlem görmüş tohumların hipokotil uzunluğu, işlem görmemiş kontrollere göre anlamlı derecede daha kısadır.

Böylece, SH ortamındaki CEPA'dan fizyolojik olarak ilgili bir konsantrasyonda etilen salınımı gerçekleşmiştir. CEPA kaynaklı etilenin tüm konsantrasyonları pelikül yaş ağırlığını önemli ölçüde azaltmış ancak pelikül kalınlığını etkilememiş; CEPA kaynaklı etilenin tüm konsantrasyonları ise pelikül kuru ağırlığını önemli ölçüde artırmıştır. Ayrıca, CEPA kaynaklı etilenin tüm konsantrasyonları pelikül hidratasyonunu azaltmıştır.

Bu prosedürü uygularken, CEPA'nın etilene yıkımının engellenmemesi için pH değerinin beşin altına düşmediğinden emin olmak amacıyla büyüme ortamının pH'ını ölçmek önemlidir. Toz halindeki CEPA'nın mukoza zarları için son derece tehlikeli olduğunu unutmayın. Bu protokol uygulanırken her zaman gerekli önlemler alınmalıdır.

Bu teknik, bitki-bakteri etkileşimleriyle ilgilenen araştırmacıların, etilen aracılı yanıtları in vitro ortamda güvenle incelemelerine olanak sağlayacaktır. Bu, bitki sinyallerinin bakteriyel kolonizasyon ve adezyonu nasıl yönettiğine ışık tutmaya yardımcı olacaktır. Mevcut durumda, bu alan yeterince çalışılmamıştır.