Name: Denatüre edici olmayan poliakrilamid jel elektroforez kullanılarak insan mxa Çok alt birim protein kompleksleri karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Öğrenin, denatüre edici olmayan poliakrilamid jel elektroforezi kullanarak insan MxA proteininin oligomerik durumunu hücre lizatlarından hızlıca değerlendirin. Bu yöntem, protein komplekslerinin saflaştırılmasına gerek kalmadan çalışır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı'ndan (Grant nr. 31003A_143834) JP'ye verilen bir hibe ile finanse edilmiştir.

NOT: Bu protokol daha önce yayınlanmış denatüre PAGE protokolü 12 dayanır. Bu çalışmada, bir MxA proteininin oligomerik durumu endojen mxa ifade mxa aşırı ifade Vero hücreleri ya da IFN-α-uyarılmış A549 hücreleri kullanılarak tayin edilmiştir. Aşağıda açıklanan protokol mxa ek olarak herhangi bir protein oligomerik durumunu analiz etmek için kullanılabilir. Ancak, daha fazla optimizasyon gerekli olabilir. Denatüre edici olmayan PAGE için hücre lizatının hazırlanması 1. Not: her iki Vero ve A549 hücrelerinde insan MxA proteininin oligomerik durumunu analiz etmek için, 1.0 x 10 6 hücre hasat edilmiştir. hücre tipi veya analiz etmek için protein bolluğu ile ilgili olarak, hücre sayısı ayarlanmalıdır. En kısa ışığa duyarlı iyodoasetamid eklendiğinde, ışığa maruz kalmaktan lizis tamponu korumak için de önemlidir. <ol><li> Kuyu başına Tohum 0,3 x 10 6 A549 veya Vero hücrelerinde6 iyi yemekleri. Oyuk başına 2 ml büyüme ortamı içinde hücre tutulur (bakınız Tablo 1). Bir hücre kültür inkübatörü içinde bir gece boyunca inkübe hücreleri (37 ° C,% 5 CO2). </li><li> fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), 1 ml ile yıkanır hücreleri hasat ve 0.5 ml 0.25% tripsin etilendiamintetraasetik asit (EDTA), oda sıcaklığında yaklaşık olarak 5 dakika boyunca 1 x çözeltisi ilave edilerek çıkarın. </li><li> En kısa sürede hücreler çanak ayırmak gibi 0.5 ml besi ekleyin ve dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. </li><li> iyi bir 2 ml tüp içine her hücreleri aktarın ve bir masa üstü santrifüj (5000 xg, 4 ° C, 5 dk) kullanarak onları pelet. </li><li> Dikkatle hücre pelletini bozmadan pipetleme süpernatant kaldırmak. </li><li> dikkatle yukarı ve aşağı hücre süspansiyonu pipetle 1 ml buz gibi soğuk PBS ile hücreleri yıkayın. </li><li> bir masa üstü santrifüjde Pelet hücreleri (5,000 xg, 4 ° C, 5 dakika). </li><li> Dikkatle wi pipetleme süpernatant kaldırmakHücre topaklarını ayırma thout. </li><li> Yukarı ve aşağı pipetleme ve buz koymak tarafından 200 ul buz gibi soğuk lizis tamponu (bakınız Tablo 1) yeniden süspanse hücreleri. </li><li> Hemen sonra, teneke folyo kullanarak ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edilir tüpler kaplayarak ışıktan lizat korur. Not: serbest tiol gruplarının korunması geri çevrilemez olduğu, buz üzerinde 30 dakika süre ile inkübe edildikten sonra, artık ışığa maruz kalmaktan lizat korumak için esastır. </li><li> önceden soğutulmuş bir masa üstü santrifüj (13,000 x g, 4 ° C, 20 dakika) içinde santrifüjleme ile hücre debrisini uzaklaştırmak. </li><li> Santrifüj aşaması esnasında, 20 dakika boyunca 4 ° C &#39;de soğuk bir odada, diyaliz tampon maddesi (Tablo 1) diyaliz sütun dengelenmesi. 10.000 kesilmiş bir moleküler ağırlığa sahip bir sütun kullanarak. <ol><li> Bir şamandıra şamandıra sütunlar takın ve diyaliz tamponu ile dolu bir beher içine koydu. hafif karıştırma sağlamak için, bir manyetik karıştırıcı kullanın. membran dokunmayın. NOT: Dialyssütun satın alınabilir veya Fiala ve çalışma arkadaşları 19 tarafından tarif edilen protokole göre 1.5 ml tüpler hazırlanabilir edilir. </li></ol></li><li> diyaliz tamponu ve şamandıra şamandıra sütunları çıkarın. membran dokunmadan pipetleme hazırlanmış diyaliz sütuna temizlenir lizatları aktarın. Bir şamandıra şamandıra sütunlar takın ve diyaliz tamponu ile dolu beher içine geri koyun. </li><li> Dikkatli bir şekilde manyetik bir karıştırıcı kullanılarak karıştırılarak, 4 ° C&#39;de en az 4 saat (ya da tercihen bir gece) buz soğukluğunda diyaliz tampon (Tablo 1) ihtiva eden bir beher içinde lizat dialyze. 200 ul lizat için en az 100 mi diyaliz tampon kullanın. </li><li> 1.5 ml tüp içine diyaliz örnek aktarın. bir masa üstü santrifüj (13,000 x g, 4 ° C, 20 dakika) içinde santrifüjleme ile çökeltileri uzaklaştırmak. kompleksler hemen diyalizden sonra protokolü (bölüm 2) ile devam oligomerik protein ayrışmasını önlemek için. donma yokHazırlanan lizatları. </li></ol> 2. Elektroforez Not: bazı değişiklikler 22 daha önce anlatıldığı gibi Elektroforez uygulandı. Aşağıda tarif edilen protokol, ön döküm gradyan jelleri (% 4-15 gradyan) kullanılmıştır. Seçenek olarak ise, jeller laboratuarda hazırlanabilir. SDS oligomerik protein kompleksleri ayrışmasını önlemek için gibi herhangi bir denatüre etme maddesini dahil etmek çok önemlidir. elektroforez Zaman insan MxA proteinin farklı oligomerik devletler için optimize edilmiştir. Bununla birlikte, bu oligomerik kompleksinin büyüklüğü gibi karmaşık analiz elde edilebilir gerekiyordu ayırma aralığına bağlı olarak, diğer proteinler için değişebilir. Bu nedenle, elektroforez optimal zaman deneysel olarak tespit edilmelidir. oligomerlerin optimal çözünürlük analiz edilmesi için akım 25 mA geçmemelidir. <ol><li> Jel odasında sigara denatüre SAYFA jel birleştirin. t doldurunÖnceden soğutulmuş çalışan tamponu (Tablo 1) de, iç ve dış oda. </li><li> 4 ° C&#39;de soğuk bir odada 15 dakika boyunca jel başına 25 mA önceden soğutulmuş çalışan tampon maddesi ile jel ön çalıştırın. </li><li> 4x numune tamponu, 5 ul (Tablo 1), yukarıda hazırlanan lizatlar 15 ul karıştırın. örnek kaynatmayın. </li><li> 15 örnek ul ve jel üzerinde seçim doğal protein standardı yükleyin. 4 ° C&#39;de soğuk bir odada 4 saat 25 mA&#39;da jel üzerinde çalıştırıldı. Not: yarı-nicel analiz için, bir protein miktar protokol (örneğin, bir Bradford protein tahlili 23) şerit başına toplam protein eşit miktarlarda yükleme sağlamak için gerçekleştirilebilir. </li></ol> 3. Western Blot NOT: Aşağıda açıklanan ıslak western blot sistemi protokolüdür. Herhangi bir kurutma membran kullanılabilir. tampon ile kurutma bölgesi dengeleme önce% 100 metanol poliviniliden florür (PVDF) zarlara etkinleştirmefer. Yarı-kuru western blot alternatif olarak kullanılabilir, ancak büyük oligomerik kompleksleri için optimize edilmiş olması gerekir. <ol><li> Jel sökün ve dikkatlice SDS tamponu (Tablo 1) içine aktarın. </li><li> hafifçe çalkalanarak oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 2 süngerler, 4 selüloz filtre kağıdı çarşaf ve jel başına bir kurutma membran hazırlayın. Tampon (Tablo 1) blotting onları ıslatın. </li><li> 1 sünger, 2 selüloz filtre kağıdı levhalar, membran, jel, 2 selüloz filtre kağıdı yaprak, 1 sünger: (aşağıdan yukarıya) aşağıdaki gibi sandviç birleştirin. </li><li> lekeleme tankına sandviç koyun. Jel eksi kutup yüzleri ise membran artı kutbu karşı karşıya olduğundan emin olun. </li><li> Önceden soğutulmuş lekeleme tampon ile blot doldurun. </li><li> en iyi protein aktarımı sonucu, 4 ° C&#39;de bir gece boyunca 90 mA&#39;da kurutun. </li><li> sandviç sökün ve Ponç membran inkübe edilerek protein standardı görselleştirmekOda sıcaklığında 5 dakika boyunca eau çözüm. </li><li> açıkça protein standardı bantları görünceye kadar dikkatli deiyonize su ile Ponceau S yıkayarak membranın destain. </li><li> Bir kalem kullanarak protein standardı bantları işaretleyin. NOT: Artık Ponceau S immün engelleyebilir. Bunu önlemek için, membran deiyonize su ile 1 dakika ve daha sonra yıkama için 0.1 M NaOH içinde inkübe edilerek, daha boyası olabilir. </li><li> Blokaj tamponu ile membran bloke oda sıcaklığında en az 1 saat veya gece boyunca 4 ° C (Tablo 1 e bakınız). </li><li> Analiz edilecek proteine ​​karşı yöneltilmiş antikorlar kullanılarak imüno-boyama ile ilgili proteini (ler) görselleştirme. Not: tampon (Tablo 1) bloke 1000: insan MxA proteininin insan MX1 özgü tavşan poliklonal antikoru kullanılarak görselleştirilmiştir 1 seyreltilmiştir. antikor çözeltisi 4 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edildi. Seçenek olarak ise, monoklonal birnti-MxA antikoru (klon 143) 24 (veriler gösterilmemiştir) kullanılabilir. </li></ol>

<ol><li>Baisamy, L., Jurisch, N., Diviani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leucine+zipper-mediated+homo-oligomerization+regulates+the+Rho-GEF+activity+of+AKAP-Lbc%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Leucine zipper-mediated homo-oligomerization regulates the Rho-GEF activity of AKAP-Lbc.</a> J Biol Chem. 280, 15405-15412 (2005).</li>
<li>Chen, C. P., Posy, S., Ben-Shaul, A., Shapiro, L., Honig, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+cell-cell+adhesion+by+classical+cadherins%3A+Critical+role+for+low-affinity+dimerization+through+beta-strand+swapping%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Specificity of cell-cell adhesion by classical cadherins: Critical role for low-affinity dimerization through beta-strand swapping.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8531-8536 (2005).</li>
<li>Jackson-Fisher, A. J., Chitikila, C., Mitra, M., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+TBP+dimerization+in+preventing+unregulated+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A role for TBP dimerization in preventing unregulated gene expression.</a> Mol Cell. 3, 717-727 (1999).</li>
<li>Torshin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+oligomerization+as+intermediate+level+of+signal+transduction%3A+analysis+of+protein-protein+contacts+and+active+sites+in+several+glycolytic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Activating oligomerization as intermediate level of signal transduction: analysis of protein-protein contacts and active sites in several glycolytic enzymes.</a> Front Biosci. 4, 557-570 (1999).</li>
<li>Goodsell, D. S., Olson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+symmetry+and+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Structural symmetry and protein function.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 29, 105-153 (2000).</li>
<li>Flydal, M. I., Martinez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenylalanine+hydroxylase%3A+function%2C+structure%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Phenylalanine hydroxylase: function, structure, and regulation.</a> IUBMB Life. 65, 341-349 (2013).</li>
<li>Haller, O., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+MxA+protein%3A+an+interferon-induced+dynamin-like+GTPase+with+broad+antiviral+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Human MxA protein: an interferon-induced dynamin-like GTPase with broad antiviral activity.</a> J Interferon Cytokine Res. 31, 79-87 (2011).</li>
<li>Haller, O., Staeheli, P., Schwemmle, M., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mx+GTPases%3A+dynamin-like+antiviral+machines+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mx GTPases: dynamin-like antiviral machines of innate immunity.</a> Trends Microbiol. 23, 154-163 (2015).</li>
<li>Di Paolo, C., Hefti, H. P., Meli, M., Landis, H., Pavlovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecular+backfolding+of+the+carboxyl-terminal+end+of+MxA+protein+is+a+prerequisite+for+its+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Intramolecular backfolding of the carboxyl-terminal end of MxA protein is a prerequisite for its oligomerization.</a> J Biol Chem. 274, 32071-32078 (1999).</li>
<li>Janzen, C., Kochs, G., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monomeric+GTPase-negative+MxA+mutant+with+antiviral+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A monomeric GTPase-negative MxA mutant with antiviral activity.</a> J Virol. 74, 8202-8206 (2000).</li>
<li>Gao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+myxovirus+resistance+protein+a+reveals+intra-+and+intermolecular+domain+interactions+required+for+the+antiviral+function%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Structure of myxovirus resistance protein a reveals intra- and intermolecular domain interactions required for the antiviral function.</a> Immunity. 35, 514-525 (2011).</li>
<li>Nigg, P. E., Pavlovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+and+GTP-binding+Requirements+of+MxA+for+Viral+Target+Recognition+and+Antiviral+Activity+against+Influenza+A+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligomerization and GTP-binding Requirements of MxA for Viral Target Recognition and Antiviral Activity against Influenza A Virus.</a> J Biol Chem. 290, 29893-29906 (2015).</li>
<li>Gao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+oligomerization+in+the+stalk+region+of+dynamin-like+MxA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis of oligomerization in the stalk region of dynamin-like MxA.</a> Nature. 465, 502-506 (2010).</li>
<li>Ghosh, I., Hamilton, A. D., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiparallel+leucine+zipper-directed+protein+reassembly%3A+Application+to+the+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Antiparallel leucine zipper-directed protein reassembly: Application to the green fluorescent protein.</a> J Am Chem Soc. 122, 5658-5659 (2000).</li>
<li>Patching, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+plasmon+resonance+spectroscopy+for+characterisation+of+membrane+protein-ligand+interactions+and+its+potential+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Surface plasmon resonance spectroscopy for characterisation of membrane protein-ligand interactions and its potential for drug discovery.</a> Biochim Biophys Acta. 1838, 43-55 (2014).</li>
<li>Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein-protein+interactions+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy.</a> Methods. 24, 289-296 (2001).</li>
<li>Wyatt, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Scattering+and+the+Absolute+Characterization+of+Macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Light-Scattering and the Absolute Characterization of Macromolecules.</a> Analytica Chimica Acta. 272 (93), 1-40 (1993).</li>
<li>Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation+for+the+study+of+protein+association+and+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly.</a> Curr Opin Chem Biol. 10, 430-436 (2006).</li>
<li>Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28BN-PAGE%29+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Zou, H., Li, Y., Liu, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+APAF-1.cytochrome+c+multimeric+complex+is+a+functional+apoptosome+that+activates+procaspase-9%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9.</a> J Biol Chem. 274, 11549-11556 (1999).</li>
<li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217, 220-230 (1994).</li>
<li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondenaturing+polyacrylamide+gel+electrophoresis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis of proteins.</a> Methods Mol Biol. 32, 17-22 (1994).</li>
<li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Quantitation of protein.</a> Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).</li>
<li>Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-induced+antiviral+protein+MxA+interacts+with+the+cellular+RNA+helicases+UAP56+and+URH49%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interferon-induced antiviral protein MxA interacts with the cellular RNA helicases UAP56 and URH49.</a> J Biol Chem. 286, 34743-34751 (2011).</li>
<li>Stertz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-induced%2C+antiviral+human+MxA+protein+localizes+to+a+distinct+subcompartment+of+the+smooth+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Interferon-induced, antiviral human MxA protein localizes to a distinct subcompartment of the smooth endoplasmic reticulum.</a> J Interferon Cytokine Res. 26, 650-660 (2006).</li>
<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta. 1666, 105-117 (2004).</li>
<li>Kochs, G., Haener, M., Aebi, U., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+human+MxA+GTPase+into+highly+ordered+dynamin-like+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of human MxA GTPase into highly ordered dynamin-like oligomers.</a> J Biol Chem. 277, 14172-14176 (2002).</li>
<li>Kochs, G., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP-bound+human+MxA+protein+interacts+with+the+nucleocapsids+of+Thogoto+virus+%28Orthomyxoviridae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae).</a> J Biol Chem. 274, 4370-4376 (1999).</li>
<li>Reichelt, M., Stertz, S., Krijnse-Locker, J., Haller, O., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missorting+of+LaCrosse+virus+nucleocapsid+protein+by+the+interferon-induced+MxA+GTPase+involves+smooth+ER+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Missorting of LaCrosse virus nucleocapsid protein by the interferon-induced MxA GTPase involves smooth ER membranes.</a> Traffic. 5, 772-784 (2004).</li>
<li>Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+RNA+helicase+UAP56+is+required+for+prevention+of+double-stranded+RNA+formation+during+influenza+A+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The cellular RNA helicase UAP56 is required for prevention of double-stranded RNA formation during influenza A virus infection.</a> J Virol. 85, 8646-8655 (2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada Western blot analizi ile, ardından denatüre PAGE ile memeli hücrelerinde ifade edilen proteinlerin oligomerik durum hızla belirlenmesini sağlayan basit bir yöntem tarif eder. Bu yaklaşımın en önemli avantajı, belirli bir proteinin oligomerik durumu önceden protein saflaştırma olmadan bütün hücre lizatları belirlenebilir olmasıdır. Bu oligomerize veya yardımcı faktörler ile birlikte kendi işlevini yerine proteinler için önemli olabilir. Buna ek olarak, proteinler, yerli durumunda hala ve daha da jelden ekstre için...

Bir proteinin kuaterner yapı, birçok hücresel süreçlerde önemli bir rol oynar. Sinyal yolları, gen ifadesi ve enzim devreye alma / devreden tüm protein kompleksleri 1-4 doğru montaj güveniyor. Ayrıca, homo veya hetero-oligomerizasyonu olarak da bilinen bu proses geri dönüşü olmayan kovalent ya da geri dönüşümlü, elektrostatik ve hidrofobik protein-protein etkileşimleri kaynaklanmaktadır. Oligomerizasyon genom boyutunu artırmadan farklı hücresel süreçleri çeşitlendirmektedir, ancak proteinler denatürasyon ve yıkımı 5 karşı daha dirençli kararlı kompleksler inşa etmek için de bir strateji sağlar sadece. oligomerizasyonu bozukluklar protein fonksiyonu üzerinde bir etkisi vardır ve hastalığın gelişmesine yol açar. Örneğin, enzim, fenilalanin hidroksilaz tetrameric kompleks oluşturur. Protein kompleksi içindeki bazı mutasyonlar tetramer oluşumu zayıflatmak ve hastalık fenilketonüri 6 yol açabilir. 7 indüklenen bir interferon (IFN) &#39;dir. Bu Dynamin-gibi büyük GTPases üst ailesine ait olan ve in vitro 8 büyük oligomerik yapıları oluşturma kapasitesine sahiptir. Oligomerizasyonu, hızlı bozulmaya 9,10 arasında mxa korumak için önerilmiştir. Birçok araştırma grubu tarafından yoğun çabalarına rağmen, eylem moleküler mekanizması büyük ölçüde belirsiz kalır ve antiviral işlevi için mxa oligomerizasyon devletin rolü tartışma 9,11,12 altındadır. Bu bağlamda, Gao ve ark MxA büyük halka benzeri oligomerik yapılarının 11 şeklinde viral Nükleoproteinlerin ile etkileşerek antiviral aktivite sergiler bir model önerdi. Ancak, son zamanlarda biz MxA dimerleri antivirütik aktivite sergilerler ve grip A virüsü 12 nükleoprotein ile etkileşim olduğu gösterilmiştir. Bmxa kristal yapısına ased Gao ve çalışma arkadaşları, in vitro olarak oligomerizasyonu ve antiviral fonksiyonu 11,13 için kritik olan arayüz bölgelerde çeşitli amino asit kalıntıları tespit edilmiştir. Bu nedenle, anti-viral aktivite sergiler mxa oligomerik çizen aydınlatmak üzere, hızla endojen MxA IFNa uyarıldıktan sonra ifade hem de insan hücrelerinde ifade edilen bir MxA arayüz mutantlarının oligmeric durumunu belirlemek için basit bir protokol için çalışmıştır. Gibi yaygın bölünmüş Yeşil Floresan Protein olarak proteinler arasındaki etkileşimi araştırmak için kullanılan birçok teknik olmasına rağmen (split-GFP) tamamlama deneyi 14, yüzey plazmon rezonans 15 ve Förster rezonans enerji transferi (FRET) 16, onlar vermeyin bir oligomerik bir protein kompleksinin tam stokiyometri bilgiler. bu özel yanının araştırılması için teknikler gibiçok açılı bir ışık saçılım (MALS) 17 ve analitik ultrasantrifügasyon 18 çok kullanışlıdır. Genellikle, bu yöntemler kullanılarak analiz proteinler saflaştırılmış proteinlerdir. Oligomerleştirme işlemleriyle, diğer hücresel faktörlere bağlı olabilir. Bu faktörler bilinmiyorsa, analiz çok daha zordur. Ayrıca, bazı proteinler E. ifade etmek zordur E. coli ve saflaştırılması için. Bu nedenle, bu yöntemler hücresel ortamda protein oligomerizasyon analiz için en uygun seçenek değildir. Buna ek olarak, bu teknikler hazır olmayan pahalı aletleri gerektirir. Denatüre edici olmayan poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE), boyut dışlama kromatografisi ya da geleneksel sodyum dodesil sülfat (SDS) sayfalık, ardından kimyasal çapraz bağlama hücre lizatları 2,19,20 gelen oligomerlerin oluşma özellikleri için yararlı araçlardır. Bu yöntemler özel ekipman gerektirmez ve kolayca pe olabilirStandart bir laboratuarda rformed. Başlangıçta değişmez spesifik olmayan birleşimine ve mxa çökelmesine yol çeşitli kimyasal çapraz bağlama protokolleri değerlendirildi. Bu nedenle, önümüzdeki olmayan denatüre SAYFA protokolleri test etti. olmayan denatüre SAYFA SDS kullanımını hariç olarak, proteinlerin göç kendi ana şarj bağlıdır. Mavi yerel PAGE SDS benzer bir negatif yük, proteinleri yüklemek için Coomassie parlak mavisi G250 kullanır, ancak protein 21 denatüre etmez. Ne yazık ki, yüksek tuzlar ve genellikle lizis tampon içerdiği iki değerlikli katyonlar (örneğin, Mg + 2) varlığında, parlak mavi çökeltileri coomassie. kullanılan tamponlar bağlı olarak, oligomerik protein kompleksi üzerinde bir etkiye sahip olabilir adımların daha fazla optimizasyon yapmadan numuneyi analiz etmek zor olabilir. Burada oligomerizasyonuna belirlemek için, daha önce yayınlanan bir yöntem 22 dayalı basit bir protokol mevcutdenatüre PAGE kullanılarak hücre lizatları elde edilen insan MxA proteini.

<table><tbody><tr><td>Slide-A-Lyzer MINI Diyaliz Üniteleri, 10K MWCO, 0.5 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69570</td><td>Diyaliz tamponunda ön denge (Gliserol çıkarılması istenirse) Fiala ve ark. 2011</td></tr><tr><td>4&ndash; % 15 Mini-PROTEAN TGX Prekast Protein Jelleri, 10 kuyulu,</td> <td>Bio-Rad</td><td>456-1083</td><td>Tampon sistemini ayarlamak için çalışma tamponunda önceden çalıştırma</td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, EDTA içermeyen</td><td>Roche&nbsp;</td><td>11836170001</td><td>50 ml PBS başına 1 tablet</td></tr><tr><td>, pH 7.4&nbsp; 500 ml Gibco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7170<</td><td>güçlü>TOKSİ</güçlü> eldiven giyin ve gözleri koruyun</td></tr><tr><td>NativeMark Lekesiz Protein Standardı&nbsp; 50 &mikro; l</td><td>Invitrogen</td><td>P / N 57030</td><td>yük 5 ve mikro; l/kuyu</td></tr><tr><td>A549 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL185</td><td>Büyüme ortamında büyür (bkz. <güçlü>Tablo 1</güçlü>)</td></tr> <tr><td>Vero hücreleri</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL81</td><td>Büyüme ortamında büyür (bkz. <güçlü>Tablo 1</güçlü>)</td></tr> <tr><td>anti-Mx1 antikoru</td><td>Novus Biologicals</td><td>H00004599_D01P</td><td>1: 1.000 seyreltmede kullanın</td></tr><tr><td>ECL Anti-tavşan IgG, Yaban turpu Peroksidaz bağlantılı tüm antikor ( eşek)</td><td>GE-Healthcare</td><td>NA934V</td><td>1:10.000 seyreltmede</td></tr><tr><td>%0,5 Tripsin-EDTA (1x)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Yaşam Teknolojileri</td><td>Thermo Fisher</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>İyodoasetamid&nbsp; &nbsp; 5 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6125</td><td>stok&nbsp; 100 mM</td></tr><tr><td>Bromphenolblue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Piruvat yaşam teknolojileri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Kalem&nbsp; Strep 100 x&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 100ml ve nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; yaşam teknolojileri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140 - 130</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 100x Et Suyu, 100 ml&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; yaşam teknolojileri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>350500-038</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu, Diyalizli, ABD Menşeili 500 ml Gibco Lot:42G9552K</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Selüloz filtre kağıdı</td><td>Bio-Rad</td><td>1703965</td><td></td></tr><tr><td>PVDF lekeleme ve membran</td><td>GE-Healthcare</td><td>10600022</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hidroksimetil)aminometan</td><td>Biosolve</td><td>0020092391BS</td><td></td></tr><tr><td>sodyum florür (NaF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-7920</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492015</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, EDTA içermeyen</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>11836170001</tr><tr><td>Tween 20</td><td>Calbiochem</td><td>6555204</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS %10 çözelti</td><td>Amresco</td><td>N907</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Biosolve</td><td>0007132391BS</td><td></td></tr><tr><td>sodyum ortovanadat (Na3VO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-Gliserofosfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Süt tozu</td><td>Migros/İsviçre</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Millipore</td><td>1.06009</td><td></td></tr><tr><td>sodyum klorit (NaCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>magnezyum klorür (MgCl2)</td><td>Amresco</td><td>288</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat (SDS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>sodyum hidroksit (NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-8045</td><td></td></tr></tbody></table>

denatüre edici olmayan poliakrilamid jel elektroforez kullanılarak insan mxa Çok alt birim protein kompleksleri karakterizasyonu

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

Oligomerik komplekslerin oluşumu, birçok proteinin uygun yapısı ve işlevi için çok önemli bir ön koşuldur. İnterferon ile indüklenen antiviral efektör protein MxA, birçok virüse karşı geniş bir antiviral aktivite gösterir. MxA, dinamin benzeri bir GTPazdır ve daha yüksek dereceli oligomerik yapılar oluşturma kapasitesine sahiptir. Bununla birlikte, MxA'nın antiviral aktivitesi için oligomerizasyonunun gerekli olup olmadığı bir tartışma konusudur. Burada, Western blot analizi ile kombinasyon halinde denatüre olmayan poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile insan hücre hatlarının sitoplazmik fraksiyonunda endojen veya ektopik olarak eksprese edilen MxA'nın oligomerik durumunu değerlendirmek için basit bir protokol açıklıyoruz. Protokolün kritik bir adımı, özellikle MxA gibi hücresel zarlarla ilişkili proteinlerin, enzimatik aktivitesine müdahale etmeden toplanmasını ve/veya çökelmesini önlemek için deterjan seçimidir. Protokolün bir diğer önemli yönü, proteinin yapay etkileşimlerini önlemek için sistein kalıntılarının serbest tiyol gruplarının iyodoasetamid tarafından geri dönüşümsüz olarak korunmasıdır. Bu protokol, MxA'nın oligomerik durumunun basit bir değerlendirmesi için uygundur ve ayrıca MxA arayüz mutantlarının antiviral aktivitesinin ilgili oligomerik durumları ile doğrudan bir korelasyonuna izin verir.

Denatüre PAGE kullanılarak, insan vahşi tip bir MxA, dimerik arayüz mutantlan MxA (R640A) ve MxA (L617D) yanı sıra hücre lizatları 12 monomerik arayüz mutant MxA (M527D) oligomerik durumunu analiz edilmiştir. Hücreler,% 1 oktilfenoksipolietoksietanoldür (NP-40) ve iyodoasetamid, protein çözünürlüğünü ve serbest tiol gruplarının korunmasını sağlamak için ihtiva eden bir tampon maddesi içinde lize edilmiştir (bakınız Şekil 1). Daha önce tarif edildiği gibi, bir tuzu ve küçük metabolitler diyali...

Bu makale, insan hücrelerinin lizatlarından elde edilen dinnamin benzeri GTPase MxA proteininin oligomerik durumunu, denatüre olmayan PAGE ile western blot analizinin bir kombinasyonunu kullanarak değerlendirmek için basit ve hızlı bir protokolü açıklamaktadır.

Denatüre edici olmayan poliakrilamid jel elektroforez kullanılarak insan mxa Çok alt birim protein kompleksleri karakterizasyonu

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

Bu deneyin genel amacı, denatüre edici olmayan sodyum dodekilsülfat-poliakrilamid jel elektroforezi kullanarak hücre lizatlarındaki homooligomerik protein komplekslerindeki alt birim sayısını belirlemektir. Bu yöntem, temel hücresel süreçlerde yer alan proteinlerin oligomerik durumu gibi hücre biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, homooligomerik protein komplekslerinin saflaştırılmasını veya özel, pahalı ekipmanları gerektirmemesidir.Bu nedenle, çoğu laboratuvarda uygulanabilir. Bu deney iki tip hücre kullanmaktadır: endojen Myxovirus direnç A proteinini (MxA) eksprese eden A549 hücreleri ve MxA'yı aşırı eksprese eden viroseller.A549 hücrelerini ve virohücreleri, kuyucuk başına iki mililitre büyüme ortamı olacak şekilde altı kuyucuklu kaplara ekin. Hücreleri bir hücre kültürü inkübatöründe gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, hücreleri hasat edin.Her kuyucuğu bir mililitre PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında yaklaşık beş dakika boyunca 0,5 mililitre %0,25 Trypsin-EDTA çözeltisi ekleyerek hücreleri koparın. Hücreler kapla olan bağlantısını keser kesmez 0,5 mililitre büyüme ortamı ekleyin ve pipetleme yaparak dikkatlice karıştırın. Her kuyucuktaki hücreleri iki mililitrelik bir tüpe aktarın ve masaüstü santrifüj kullanarak çöktürün.Hücre peletini bozmadan, pipetleme yoluyla süpernatanı dikkatlice uzaklaştırın. Bir mililitre buz gibi soğuk PBS ekleyerek ve hücre süspansiyonunu dikkatlice aşağı yukarı pipetleyerek hücreleri yıkayın. Hücreleri masaüstü bir santrifüjde pelet haline getirin.Hücre peletini yerinden oynatmadan, süpernatantı pipetleme yoluyla dikkatlice uzaklaştırın. 200 microliters buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin, hücreleri aşağı yukarı pipetleyerek yeniden süspande edin ve ardından buz üzerine yerleştirin. Lizis tamponundaki iodoacetamide ışığa duyarlı olduğu için tüpleri alüminyum folyo ile kaplayarak lizatı hemen ışıktan koruyun.30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. İyodoasetamid kullanımı kritiktir çünkü iyodoasetamid, bir tioeter bağı oluşturarak serbest sisteinlerin tiyol grubunu geri dönüşümsüz olarak korur ve yapay protein agregasyonunu önler. Ardından, önceden soğutulmuş bir masaüstü santrifüj ile santrifüj ederek hücre kalıntılarını uzaklaştırın.Santrifüj işlemi sırasında, 10,000 moleküler ağırlık kesme sınırına sahip diyaliz kolonlarını hazırlayın. Diyaliz kolonlarını bir yüzücü şamandıraya takın ve kolonların dengelenmesi için önceden soğutulmuş diyaliz tamponu ile doldurulmuş bir behere yerleştirin. Membrana dokunmayın.Bir beher içine manyetik karıştırıcı yerleştirin ve beheri soğuk odaya aktarın. Nazik karıştırmayı sağlamak için manyetik karıştırıcıyı kullanarak, 4 °C'de 20 dakika boyunca dengeleyin. 20 dakika sonra, kolonları diyaliz tamponundan ve yüzücü şamandıradan çıkarın.Berraklaştırılmış lizatları, membrana değdirmeden pipetleyerek hazırlanmış diyaliz kolonlarına aktarın. Kolonları bir yüzücü şamandıraya sabitleyin. Kolonları diyaliz tamponuyla dolu beherin içine geri yerleştirin ve ardından beheri soğuk odaya taşıyın.Denatüre olmayan poliakrilamid jel elektroforezini etkileyebilecek küçük metabolitleri ve tuzları uzaklaştırmak için, bir manyetik karıştırıcıyla dikkatlice karıştırarak lizatı dört santigrat derecede en az dört saat boyunca diyalize edin. Diyaliz tamamlandığında, diyalize edilmiş her örneği 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Çökelmeleri, masaüstü bir santrifüjle santrifüj ederek uzaklaştırın.Oligomerik protein komplekslerinin ayrışmasını önlemek için elektroforez, lizatların diyalizi tamamlandıktan hemen sonra gerçekleştirilmelidir. İç ve dış jel haznesini önceden soğutulmuş çalışma tamponu ile doldurun. Denatüre etmeyen poliakrilamid jeli, önceden soğutulmuş çalışma tamponu ile jel başına 25 miliamperde, dört santigrat derecede 15 dakika boyunca ön çalışmaya tabi tutun.Hazırlanan lizattan 15 µL'yi, 5 µL 4X örnek tamponu ile karıştırın. Seçilen bir natif protein standardını ve 15 µL örneği jele yükleyin. Jeli 4 °C'de, 25 mA'de dört saat boyunca çalıştırın.Denatüre edilmemiş poliakrilamid jel elektroforezi tamamlandığında, jeli sökün ve dikkatlice SDS tamponuna aktarın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin. Her jel için iki sünger, dört selüloz filtre kâğıdı tabakası ve bir blotlama membranı hazırlayıp bunları blotlama tamponunda bekletin.Sandviç düzeneği aşağıdan yukarıya doğru şu şekilde oluşturun. Bir sünger, iki selüloz filtre kağıdı tabakası, bir blotting membranı, jel, iki selüloz filtre kağıdı tabakası ve bir sünger. Membranın artı kutba, jelin ise eksi kutba baktığından emin olarak sandviç düzeneği blotting tankına yerleştirin.Blotting tankını önceden soğutulmuş blotting tamponu ile doldurun. En iyi protein transfer sonuçları için, blotting işlemini dört derece santigrat sıcaklıkta, gece boyunca 90 miliamperde gerçekleştirin. Ertesi gün, sandviç yapısını sökün.Protein standardını görselleştirmek için membranı oda sıcaklığında beş dakika boyunca Ponceau S çözeltisi içinde inkübe edin. Membranı deiyonize suya yerleştirip yıkayarak boyasını giderin. Membranı bir tepsiye aktardıktan sonra, protein standardının bantlarını bir kalem kullanarak işaretleyin.Membranı, oda sıcaklığında en az bir saat veya dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca bloklama tamponu ile bloke edin. Ardından, metin protokolünde açıklandığı üzere, MxA'ya karşı yöneltilmiş tavşan poliklonal bir antikor kullanılarak immün boyama ile ilgilenilen proteinler görselleştirilir. Endojen MxA eksik olan viroseller, rekombinant vahşi tip MxA ile monomerik ve dimerik MxA varyantları ile transfekte edilmiştir.Rekombinant MxA varyantlarının beklenen moleküler ağırlıklarda göç etmesi, oligomerik durumlarını doğrulamıştır. Ektopik olarak eksprese edilen vahşi tip MxA, tetramer olarak göç etmiştir. Bu rekombinant proteinler daha sonra, interferon-alfa ile stimüle edilmiş A549 hücrelerinden türetilen endojen insan MxA proteininin oligomerik durumunu değerlendirmek için kullanılmıştır.Sonuçlar, interferon-alfa ile stimüle edilmiş A549 hücrelerinin lizatlarındaki MxA boyutunun bir tetramere karşılık geldiğini ortaya koymuştur. Bu teknik bir kez kavrandıktan sonra, doğru şekilde uygulandığı takdirde bir buçuk günde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, protein etkileşimlerini bozabileceği veya protein agregasyonlarına neden olabileceği için tüm süreç boyunca örneklerin dondurulup çözülmemesi gerektiğini unutmamak önemlidir.Ayrıca, iodoacetamide gibi ışığa duyarlı reaktiflerle çalışırken, lizis aşamasında örneklerin ışıktan korunması önemlidir. Non-denatüre SDS-PAGE'i takiben, enzimatik aktivite ve potansiyel hetero-oligomerik komplekslerin karakterizasyonu gibi ek soruları yanıtlamak için protein jel ekstraksiyonu, enzimatik aktivite AsiS veya ikinci boyut PAGE gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların kültür hücrelerindeki oligomerik protein komplekslerinin kompozisyonunu keşfetmelerinin önünü açmıştır.Bu videoyu izledikten sonra, non-denatüre PAGE analizinde oligomerik proteinleri incelemek için hücre kültürlerinden hücre lizatlarının nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. İyodoasetamid ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve eldiven kullanımı ile göz koruması gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

characterization-multi-subunit-protein-complexes-human-mxa-using-non

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu video, mavi yerli poliakrilamid jel elektroforezi (BN-PAGE) multiprotein kompleksler (MPCs) karakterizasyonu açıklar. Birinci boyut, diyaliz hücresel lizatları bireysel MPCs tanımlamak için BN-PAGE ile ayrılır. Ikinci bir boyut SDS-PAGE, faiz MPCs daha immün bileşenleri analiz alt gruba ayrılır.

Hücresel lizatları Multiprotein Kompleksleri Analizi Mavi Native Poliakrilamid Jel Elektroforez (BN-PAGE)

Bu video, proteinler için denatüre edici bir poliakrilamid bazlı ayırma tekniğini göstermektedir. Bu teknik, proteinlerin moleküler ağırlıklarına göre ön tanımlanmasına yardımcı olur.

Protein Analizi için Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi: Moleküler Ağırlığa Göre Proteinleri Ayırmak ve Görselleştirmek İçin Bir Teknik

Bu videoda, doğal protein komplekslerini doku homojenatlarından ayırmak için multimerik PAGE açıklanmaktadır. Teknik, mavi yerel PAGE ve SDS-PAGE tekniklerinin bir karışımıdır. Ayrılan kompleksler, hücre işleyişindeki rolleri için karakterize edilebilir ve incelenebilir.

Doğal protein komplekslerini ayırmak için Multimer-PAGE: bozulmamış multimerik proteinleri doku lizatından ayırmak için Blue Native-PAGE ve SDS-PAGE'den oluşan hibrit bir ayırma tekniği

Bu videoda, insan fonksiyonel olmayan hipofiz adenomunun (NFPA) tümör dokularından elde edilen karmaşık bir protein karışımından tek tek proteinleri ayıran iki boyutlu bir jel elektroforezi yöntemi gösteriyoruz. Proteinler, birinci boyutta elektrik yüklerine göre ayrılır ve ikinci boyutta moleküler ağırlıklara göre daha da ayrılır.

İki Boyutlu Poliakrilamid Jel Elektroforezi: Yük ve Moleküler Ağırlığa Dayalı Kompleks Protein Karışımındaki Proteinlerin Analizi İçin Bir Ayırma Tekniği

Müsinler, boyutları 0.2 ila 200 megadalton (MDa) arasında değişen yüksek moleküler ağırlıklı glikokonjugatlardır. Boyutlarının bir sonucu olarak, müsinler geleneksel poliakrilamid jellere nüfuz etmez ve ayrılma için daha büyük gözenekler gerektirir. Bağıl miktar tayinini değerlendirmek ve polimer montajını incelemek için müsin agaroz jel elektroforezi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Musin Agaroz jel elektroforezi: Yüksek molekül ağırlıklı glikoproteinler için Western Blot

Hücre içi depolardanCa2+ salınımına aracılık eden homo-tetramerik bir iyon kanalı olan ryanodin reseptörünün oligomerizasyonu, iskelet ve kalp kası kasılması için kritik öneme sahiptir. Burada, proteinlerin kendi kendine birleşmesini tespit etmek ve homo-oligomer stokiyometrisini belirlemek için tamamlayıcı in vivo ve in vitro yöntemler sunuyoruz.

Genetik ve biyokimyasal Yaklaşımlar<em&gt; İn Vivo</em&gt; ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Protein oligomerization Değerlendirilmesi: Riyanodin Reseptör Vaka Çalışması

stabilize edici ve yeni bir iki boyutlu poliakrilamit jel elektroforez bağlanmış bir amin-reaktif protein çapraz bağlayıcı kullanılarak modifiye edilmemiş doku lizattan doğal protein kompleksleri ayırmak için bir yöntem olup (PAGE) sistemi sunulmuştur.

Multimer-PAGE: Biyolojik örnekler olarak yakalamak için bir yöntem ve özümleme protein kompleksleri

Burada bir etiket bilgilerini kantitatif kütle spektrometresi kullanılarak protein korelasyon profil ardından afinite protein komplekslerinin saflaştırılması ve mavi doğal PAGE ile onların ayrılması için protokoller, mevcut. Bu yöntem, farklı protein kompleksleri halinde interactomes çözmek için yararlıdır.

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Bu protokol, fonksiyonel mitokondriyal elektron transport zincir komplekslerinin (Cx) IV ve bunların süper komplekslerinin yerli elektroforezi kullanarak, bunların montajı ve yapısı hakkında bilgi vermek üzere ayrılmasını açıklamaktadır. Nativ jel immünoblotlama, in-jel deneylerine tabi tutulabilir ve bireysel kompleksleri daha da karakterize etmek için elektroliz ile saflaştırılabilir.

Mitokondriyal Elektron Nakil Zincirinin Süper Komplekslerinin Yerli Elektroforez, In-Jel Testleri ve Elektroelüsyon ile İncelenmesi

Bir iletişim kuralı bitki aydınlatma için thylakoid protein kompleksi organizasyon ve mavi yerel polyacrylamide ile kompozisyon jel elektroforez (BN-sayfa) ve 2D-SDS-sayfa açıklanmıştır. Protokol Arabidopsis thalianaiçin optimize edilmiş ama küçük değişiklikler ile diğer bitki türleri için kullanılabilir.

Thylakoid membran Protein kompleksleri tarafından mavi yerli jel elektroforez Analizi

Bu protokol, proteinleri ve kompleksleri çözelti mutlak karakterize etmek için çok açılı ışık saçılma (SEC-,) ile boyut dışlama Kromatografi kombinasyonu açıklar. SEC-, saf proteinler, yerli oligomerler, heterokompleksleri ve glikoproteinler gibi değiştirilmiş proteinlerin molekül ağırlığını ve boyutunu belirler.

Boyutlar-dışlama kromatografi ile çok açılı ışık saçılmasına bağlı proteinlerin karakterizasyonu (SEC-,)

Öğrenin, denatüre edici olmayan poliakrilamid jel elektroforezi kullanarak insan MxA proteininin oligomerik durumunu hücre lizatlarından hızlıca değerlendirin. Bu yöntem, protein komplekslerinin saflaştırılmasına gerek kalmadan çalışır.

Denatüre edici olmayan poliakrilamid jel elektroforez kullanılarak insan mxa Çok alt birim protein kompleksleri karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal

Denatüre edici olmayan poliakrilamid jel elektroforez kullanılarak insan mxa Çok alt birim protein kompleksleri karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet