Denatüre edici olmayan poliakrilamid jel elektroforez kullanılarak insan mxa Çok alt birim protein kompleksleri karakterizasyonu

Bu deneyin genel amacı, denatüre edici olmayan sodyum dodekilsülfat-poliakrilamid jel elektroforezi kullanarak hücre lizatlarındaki homooligomerik protein komplekslerindeki alt birim sayısını belirlemektir. Bu yöntem, temel hücresel süreçlerde yer alan proteinlerin oligomerik durumu gibi hücre biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, homooligomerik protein komplekslerinin saflaştırılmasını veya özel, pahalı ekipmanları gerektirmemesidir.

Bu nedenle, çoğu laboratuvarda uygulanabilir. Bu deney iki tip hücre kullanmaktadır: endojen Myxovirus direnç A proteinini (MxA) eksprese eden A549 hücreleri ve MxA'yı aşırı eksprese eden viroseller.

A549 hücrelerini ve virohücreleri, kuyucuk başına iki mililitre büyüme ortamı olacak şekilde altı kuyucuklu kaplara ekin. Hücreleri bir hücre kültürü inkübatöründe gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, hücreleri hasat edin.

Her kuyucuğu bir mililitre PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında yaklaşık beş dakika boyunca 0,5 mililitre %0,25 Trypsin-EDTA çözeltisi ekleyerek hücreleri koparın. Hücreler kapla olan bağlantısını keser kesmez 0,5 mililitre büyüme ortamı ekleyin ve pipetleme yaparak dikkatlice karıştırın. Her kuyucuktaki hücreleri iki mililitrelik bir tüpe aktarın ve masaüstü santrifüj kullanarak çöktürün.

Hücre peletini bozmadan, pipetleme yoluyla süpernatanı dikkatlice uzaklaştırın. Bir mililitre buz gibi soğuk PBS ekleyerek ve hücre süspansiyonunu dikkatlice aşağı yukarı pipetleyerek hücreleri yıkayın. Hücreleri masaüstü bir santrifüjde pelet haline getirin.

Hücre peletini yerinden oynatmadan, süpernatantı pipetleme yoluyla dikkatlice uzaklaştırın. 200 microliters buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin, hücreleri aşağı yukarı pipetleyerek yeniden süspande edin ve ardından buz üzerine yerleştirin. Lizis tamponundaki iodoacetamide ışığa duyarlı olduğu için tüpleri alüminyum folyo ile kaplayarak lizatı hemen ışıktan koruyun.

30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. İyodoasetamid kullanımı kritiktir çünkü iyodoasetamid, bir tioeter bağı oluşturarak serbest sisteinlerin tiyol grubunu geri dönüşümsüz olarak korur ve yapay protein agregasyonunu önler. Ardından, önceden soğutulmuş bir masaüstü santrifüj ile santrifüj ederek hücre kalıntılarını uzaklaştırın.

Santrifüj işlemi sırasında, 10,000 moleküler ağırlık kesme sınırına sahip diyaliz kolonlarını hazırlayın. Diyaliz kolonlarını bir yüzücü şamandıraya takın ve kolonların dengelenmesi için önceden soğutulmuş diyaliz tamponu ile doldurulmuş bir behere yerleştirin. Membrana dokunmayın.

Bir beher içine manyetik karıştırıcı yerleştirin ve beheri soğuk odaya aktarın. Nazik karıştırmayı sağlamak için manyetik karıştırıcıyı kullanarak, 4 °C'de 20 dakika boyunca dengeleyin. 20 dakika sonra, kolonları diyaliz tamponundan ve yüzücü şamandıradan çıkarın.

Berraklaştırılmış lizatları, membrana değdirmeden pipetleyerek hazırlanmış diyaliz kolonlarına aktarın. Kolonları bir yüzücü şamandıraya sabitleyin. Kolonları diyaliz tamponuyla dolu beherin içine geri yerleştirin ve ardından beheri soğuk odaya taşıyın.

Denatüre olmayan poliakrilamid jel elektroforezini etkileyebilecek küçük metabolitleri ve tuzları uzaklaştırmak için, bir manyetik karıştırıcıyla dikkatlice karıştırarak lizatı dört santigrat derecede en az dört saat boyunca diyalize edin. Diyaliz tamamlandığında, diyalize edilmiş her örneği 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Çökelmeleri, masaüstü bir santrifüjle santrifüj ederek uzaklaştırın.

Oligomerik protein komplekslerinin ayrışmasını önlemek için elektroforez, lizatların diyalizi tamamlandıktan hemen sonra gerçekleştirilmelidir. İç ve dış jel haznesini önceden soğutulmuş çalışma tamponu ile doldurun. Denatüre etmeyen poliakrilamid jeli, önceden soğutulmuş çalışma tamponu ile jel başına 25 miliamperde, dört santigrat derecede 15 dakika boyunca ön çalışmaya tabi tutun.

Hazırlanan lizattan 15 µL'yi, 5 µL 4X örnek tamponu ile karıştırın. Seçilen bir natif protein standardını ve 15 µL örneği jele yükleyin. Jeli 4 °C'de, 25 mA'de dört saat boyunca çalıştırın.

Denatüre edilmemiş poliakrilamid jel elektroforezi tamamlandığında, jeli sökün ve dikkatlice SDS tamponuna aktarın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin. Her jel için iki sünger, dört selüloz filtre kâğıdı tabakası ve bir blotlama membranı hazırlayıp bunları blotlama tamponunda bekletin.

Sandviç düzeneği aşağıdan yukarıya doğru şu şekilde oluşturun. Bir sünger, iki selüloz filtre kağıdı tabakası, bir blotting membranı, jel, iki selüloz filtre kağıdı tabakası ve bir sünger. Membranın artı kutba, jelin ise eksi kutba baktığından emin olarak sandviç düzeneği blotting tankına yerleştirin.

Blotting tankını önceden soğutulmuş blotting tamponu ile doldurun. En iyi protein transfer sonuçları için, blotting işlemini dört derece santigrat sıcaklıkta, gece boyunca 90 miliamperde gerçekleştirin. Ertesi gün, sandviç yapısını sökün.

Protein standardını görselleştirmek için membranı oda sıcaklığında beş dakika boyunca Ponceau S çözeltisi içinde inkübe edin. Membranı deiyonize suya yerleştirip yıkayarak boyasını giderin. Membranı bir tepsiye aktardıktan sonra, protein standardının bantlarını bir kalem kullanarak işaretleyin.

Membranı, oda sıcaklığında en az bir saat veya dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca bloklama tamponu ile bloke edin. Ardından, metin protokolünde açıklandığı üzere, MxA'ya karşı yöneltilmiş tavşan poliklonal bir antikor kullanılarak immün boyama ile ilgilenilen proteinler görselleştirilir. Endojen MxA eksik olan viroseller, rekombinant vahşi tip MxA ile monomerik ve dimerik MxA varyantları ile transfekte edilmiştir.

Rekombinant MxA varyantlarının beklenen moleküler ağırlıklarda göç etmesi, oligomerik durumlarını doğrulamıştır. Ektopik olarak eksprese edilen vahşi tip MxA, tetramer olarak göç etmiştir. Bu rekombinant proteinler daha sonra, interferon-alfa ile stimüle edilmiş A549 hücrelerinden türetilen endojen insan MxA proteininin oligomerik durumunu değerlendirmek için kullanılmıştır.

Sonuçlar, interferon-alfa ile stimüle edilmiş A549 hücrelerinin lizatlarındaki MxA boyutunun bir tetramere karşılık geldiğini ortaya koymuştur. Bu teknik bir kez kavrandıktan sonra, doğru şekilde uygulandığı takdirde bir buçuk günde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, protein etkileşimlerini bozabileceği veya protein agregasyonlarına neden olabileceği için tüm süreç boyunca örneklerin dondurulup çözülmemesi gerektiğini unutmamak önemlidir.

Ayrıca, iodoacetamide gibi ışığa duyarlı reaktiflerle çalışırken, lizis aşamasında örneklerin ışıktan korunması önemlidir. Non-denatüre SDS-PAGE'i takiben, enzimatik aktivite ve potansiyel hetero-oligomerik komplekslerin karakterizasyonu gibi ek soruları yanıtlamak için protein jel ekstraksiyonu, enzimatik aktivite AsiS veya ikinci boyut PAGE gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların kültür hücrelerindeki oligomerik protein komplekslerinin kompozisyonunu keşfetmelerinin önünü açmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, non-denatüre PAGE analizinde oligomerik proteinleri incelemek için hücre kültürlerinden hücre lizatlarının nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. İyodoasetamid ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve eldiven kullanımı ile göz koruması gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.