Denatüre edici olmayan poliakrilamid jel elektroforez kullanılarak insan mxa Çok alt birim protein kompleksleri karakterizasyonu

Bu deneyin genel amacı, denatüre olmayan sodyum dodekosülfat-poliakrilamid jel elektroforezi kullanarak hücre lizatlarındaki homooligomerik protein komplekslerindeki alt birimlerin sayısını belirlemektir. Bu yöntem, temel hücresel süreçlerde yer alan proteinlerin oligomerik durumu gibi hücre biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, homooligomerik protein komplekslerinin saflaştırılmasını veya özel, pahalı ekipmanı gerektirmemesidir.

Bu nedenle, çoğu laboratuvarda gerçekleştirilebilir. Bu deneyde iki tür hücre kullanılmaktadır. Endojen Miksovirüs direnci A proteini veya MxA'yı eksprese eden A549 hücreleri; ve MxA'yı aşırı eksprese eden viroseller.

A549 hücrelerini ve virohücreleri, kuyu başına iki mililitre büyüme ortamı olan altı kuyulu tabağa tohumlayın. Hücreleri gece boyunca bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. Ertesi gün hücreleri hasat edin.

Her kuyuyu bir mililitre PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında yaklaşık beş dakika boyunca 0.5 mililitre% 0.25 Tripsin-EDTA çözeltisi ekleyerek hücreleri birleştirin. Hücreler tabaktan ayrılır ayrılmaz, 0,5 mililitre büyüme ortamı ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek dikkatlice karıştırın. Her bir oyuğun hücrelerini iki mililitrelik bir tüpe aktarın ve bir masa üstü santrifüj kullanarak pelet haline getirin.

Hücre peletini bozmadan pipetleme yoluyla süpernatanı dikkatlice çıkarın. Bir mililitre buz gibi soğuk PBS ekleyerek ve hücre süspansiyonunu dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri yıkayın. Hücreleri bir masa üstü santrifüjde peletleyin.

Hücre peletini ayırmadan pipetleme yoluyla süpernatanı dikkatlice çıkarın. 200 mikrolitre buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin, hücreleri yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin ve ardından buzun üzerine yerleştirin. Tüpleri folyo ile kaplayarak lizatı hemen ışıktan koruyun, çünkü lizis tamponundaki iyodoasetamid ışığa duyarlıdır.

30 dakika buz üzerinde kuluçkaya yatırın. İyodoasetamid kullanımı çok önemlidir, çünkü iyodoasetamid bir tiyoeter bağı oluşturarak serbest sisteinlerin tiyol grubunu geri dönüşümsüz olarak korur ve yapay protein agregasyonunu önler. Ardından, önceden soğutulmuş bir masa üstü santrifüjde santrifüjleme yoluyla hücre kalıntılarını çıkarın.

Santrifüjleme sırasında, moleküler ağırlığı 10.000 olan diyaliz kolonları hazırlayın. Diyaliz kolonlarını bir şamandıra şamandırasına takın ve kolonları dengelemek için önceden soğutulmuş diyaliz tamponu ile doldurulmuş bir behere yerleştirin. Membrana dokunmayın.

Bir behere manyetik bir karıştırıcı yerleştirin ve kabı soğuk odaya aktarın. Hafifçe karıştırmayı sağlamak için manyetik karıştırıcıyı kullanarak, dört santigrat derecede 20 dakika dengeleyin. 20 dakika sonra, kolonları diyaliz tamponundan ve şamandıra şamandırasından çıkarın.

Temizlenen lizatları membrana temas etmeden pipetleme yaparak hazırlanan diyaliz kolonlarına aktarın. Sütunları bir şamandıra şamandırasına takın. Bunları diyaliz tamponu ile doldurulmuş behere geri koyun ve ardından beheri soğuk odaya aktarın.

Lizatı dört santigrat derecede en az dört saat diyalize ederken, denatüre olmayan poliakrilamid jel elektroforezi ile etkileşime girebilecek küçük metabolitleri ve tuzları uzaklaştırmak için manyetik bir karıştırıcı ile dikkatlice karıştırın. Diyaliz tamamlandığında, diyalize alınan her numuneyi 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Çökeltileri bir masa üstü santrifüjde santrifüjleyerek çıkarın.

Oligomerik protein komplekslerinin ayrışmasını önlemek için lizatların diyalizinden hemen sonra elektroforez yapılmalıdır. İç ve dış jel haznesini önceden soğutulmuş çalışma tamponu ile doldurun. Denatüre olmayan poliakrilamid jeli, jel başına 25 miliamperde önceden soğutulmuş çalışma tamponu ile dört santigrat derecede 15 dakika önceden çalıştırın.

Hazırlanan lizatın 15 mikrolitresini beş mikrolitre 4X numune tamponu ile karıştırın. Jel üzerine tercih edilen doğal bir protein standardı ve 15 mikrolitre numune yükleyin. Jeli dört santigrat derecede dört saat boyunca 25 miliamperde çalıştırın.

Denatüre olmayan poliakrilamid jel elektroforezi tamamlandığında, jeli sökün ve dikkatlice SDS tamponuna aktarın. Hafifçe çalkalayarak oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Jel başına iki sünger, dört selüloz filtre kağıdı tabakası ve bir lekeleme zarı hazırlayın ve bunları kurutma tamponuna batırın.

Sandviçi aşağıdan yukarıya doğru aşağıdaki gibi monte edin. Bir sünger, iki selüloz filtre kağıdı tabakası, bir lekeleme zarı, jel, iki selüloz filtre kağıdı tabakası ve bir sünger. Sandviçi kurutma tankına koyun, zarın artı kutbuna, jelin ise eksi kutba baktığından emin olun.

Kurutma tankını önceden soğutulmuş kurutma tamponu ile doldurun. En iyi protein transfer sonuçları için, gece boyunca dört santigrat derecede 90 miliamperde kurulayın. Ertesi gün sandviçi sökün.

Protein standardını görselleştirmek için zarı Ponceau S solüsyonunda oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Deiyonize suya koyarak ve yıkayarak zarı lekeleyin. Membranı bir tepsiye aktardıktan sonra, protein standardının bantlarını bir kalem kullanarak işaretleyin.

Membranı oda sıcaklığında en az bir saat veya gece boyunca dört santigrat derecede bloke edici tampon ile bloke edin. Daha sonra, ilgilenilen proteinler, metin protokolünde tarif edildiği gibi MxA'ya karşı yönlendirilmiş bir tavşan poliklonal antikoru kullanılarak immün boyama ile görselleştirilir. Endojen MxA'dan yoksun olan virohücreler, rekombinant vahşi tip MxA ve monomerik ve dimerik MxA varyansı ile transfekte edildi.

Rekombinant MxA varyansının beklenen moleküler ağırlıklarında göçü, oligomerik durumlarını doğruladı. Ektopik olarak ifade edilen vahşi tip MxA, bir tetramer olarak göç etti. Bu rekombinant proteinler daha sonra interferon-alfa ile uyarılmış A549 hücrelerinden türetilen endojen insan MxA proteininin oligomerik durumunu değerlendirmek için kullanıldı.

Sonuç, interferon-alfa ile uyarılmış A549 hücrelerinin lizatlarındaki MxA boyutunun bir tetramere karşılık geldiğini ortaya koydu. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa bir buçuk gün içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, tüm prosedür boyunca numuneleri dondurmamayı ve çözmemeyi unutmamak önemlidir, çünkü bu, protein etkileşimlerini yok edebilir veya protein agregasyonlarına neden olabilir.

Ek olarak, iyodoasetamid gibi ışığa duyarlı reaktiflerle çalışırken, lizis adımı sırasında numuneleri ışıktan korumak önemlidir. Denatüre edici olmayan SDS-PAGE'yi takiben, enzimatik aktivite ve potansiyel hetero-oligomerik komplekslerin karakterizasyonu gibi ek soruları yanıtlamak için protein jel ekstraksiyonu ve enzimatik aktivite AsiS veya ikinci bir boyut PAGE gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların kültürlenmiş hücrelerdeki oligomerik protein komplekslerinin bileşimini keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, denatüre olmayan PAGE analizinde oligomerik proteinleri incelemek için hücre kültürlerinden hücre lizatlarının nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız. İyodoasetamid ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve eldiven giymek ve göz koruması gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.