İrritabl Bağırsak Sendromu içinde miRNA'lar Sirkülasyon tedirginlikler bir Çoklanmış Yüksek verim Gen İfadesi Platformu Kullanma Algılanan

Bu multipleks nükleik asit kantifikasyon protokolünün genel amacı, tam kanda mikroRNA ekspresyonunu dijital olarak kantifiye etmektir. Bu yöntem, sindirim sistemi bozukluklarının incelenmesindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. mikroRNA'lar gibi disregüle olan moleküler mekanizmaların ve biyobelirteç imzalarının tanımlanmasına katkı sağlar.

Bu tekniğin temel avantajı, mikroRNA miktar tayininin amplifikasyona dayanmamasıdır. Bu teknoloji, moleküler hedefleri dijital olarak sayar ve büyük ölçüde otomatize edilmiştir. Toplam RNA'yı saflaştırmak için, önceden toplanmış ve dondurulmuş tam kan örneklerini çözdürün ve iki saat boyunca inkübe edin.

Tüpleri, salıncaklı kova rotoru kullanarak oda sıcaklığında on dakika boyunca 5,000 ×g'de santrifüjleyin. Ardından, peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatantları dikkatlice dökerek veya pipetle bir atık tüpüne aktarın. Pelete dört mililitre RNaz içermeyen su ekleyin.

Kapağı sıkıca kapatın ve pelet görünür şekilde çözünene kadar vorteksleyin. Ardından, tüpü tekrar santrifüjleyin ve süpernatanı uzaklaştırın. Sonrasında, pelete 350 µL BM1 tamponu ekleyin ve pelet görünür şekilde çözünene kadar vorteksleyin.

Ardından, örneği otomatik total RNA ekstraksiyonu için iki mililitrelik bir işlem tüpüne aktarın. Ticari olarak mevcut bir RNA ekstraksiyon kiti kullanarak, RNA saflaştırma kitinde sağlanan önceden doldurulmuş pipet uçlarını, santrifüj tüplerini, tamponları ve reaktifleri robotik RNA ekstraksiyon sistemine yükleyerek, tam kan örneğindeki mikroRNA da dahil olmak üzere hücre içi RNA'nın otomatik saflaştırmasını gerçekleştirin. Protokol seçim menüsünden Blood miRNA PartA protokolünü seçin ve çalışmayı başlatın.

RNA ekstraksiyonunu tamamlayın ve örnekleri metin protokolüne uygun olarak saklayın. Öncelikle, 12 RNA örneğini mikrolitre başına 33 nanograma normalize etmek için RNase-free su kullanarak mikroRNA örneklerini hazırlayın. Assay kitinde sağlanan mikroRNA kontrollerinin nükleaz içermeyen su ile 1/500'luk dilüsyonunu hazırlayın ve buz üzerinde tutun.

Ardından, 13 µL tavlama tamponu, 26 µL micro R-tag reaktifi ve 6.5 µL microRNA kontrollerini birleştirerek tavlama ana karışımını hazırlayın. 12 adet 0.2 mL strip tüpün her birine 3.5 µL tavlama ana karışımı ekleyin ve ardından 3 µL RNA örneği ekleyin. Karıştırmak için tüpleri hafifçe sallayın, masaüstü mini mikrocentrifüj ile 2000 ×g hızında çöktürün ve tüpleri aşağıdaki programı kullanarak bir termosiklet cihazında çalıştırın.

Ardından, 3 µL ligasyon tamponu ve 19,5 µL PEG'i birleştirerek bir ligasyon master miksi hazırlayın. Daha sonra, her bir reaksiyona 2,5 µL ligasyon master miksi ekleyin. Tüpleri karıştırıp santrifüjle çöktürdükten sonra, tüpleri beş dakika boyunca 48 °C'ye ayarlanmış termosikletöre geri yerleştirin.

Ardından, tüpler henüz termosaykler bloğundayken her bir örneğe doğrudan bir mikrolitre ligaz ekleyin ve tüpleri aşağıdaki programı kullanarak inkübe edin. Tüpleri hafifçe karıştırıp santrifüjle dibe çöktürün ve her örneğe bir mikrolitre ligasyon temizleme enzimi ekleyin. Daha sonra, tüpleri burada gösterildiği gibi termosayklerde inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, numuneleri karıştırıp santrifüjlemeden önce her birine 40 µL RNaz içermeyen su ekleyin. MikroRNA hibridizasyonunu gerçekleştirmek için, buz üzerinde sağlanan raporlayıcı ve yakalama prob setlerini çözdürün ve santrifüjleyin. Raporlayıcı Kod Seti 2'ye 130 µL hibridizasyon tamponu ekleyin ve hibridizasyon ana karışımını oluşturmak için karıştırın.

12 adet yeni 0,2 mililitrelik şerit tüpe, 20 µL hibridizasyon ana karışımı ekleyin. Yeni hazırlanan microRNA örneklerini 85 °C'de beş dakika boyunca denatüre edin ve buz üzerinde soğutun. Ardından, hibridizasyon ana karışımı içeren her bir şerit tüpe 5 µL microRNA örneği ekleyin.

Termosiklet cihazını 30 µL hacme göre hesaplanmış 65 °C sıcaklığa ve ısıtmalı kapağı, çalışma sonunda 4 °C'ye düşmemesi için "Forever" zaman ayarına programlayın. Her tüpe 5 µL yakalama prob seti ekleyin ve karıştırın. Ardından, tüpleri santrifüjle çöktürdükten sonra hemen 65 °C'deki termosiklete yerleştirin.

Numuneleri en az 12 saat, en fazla 30 saat inkübe edin. Öncelikle kartuşu ve plakaları oda sıcaklığına getirerek hazırlık istasyonunu kurun. Ardından plakaları santrifüjleyin.

Hazırlık istasyonunu yüklemek için istasyon kapağını açın ve reaktif plakalarını, kartuşu, pipet uçlarını, 0,2 mililitrelik şerit tüplerde hazırlanan numuneleri ve iki adet boş 0,2 mililitrelik 12'li şerit tüpü robotun uygun konumlarına yerleştirin. Şerit tüp kapaklarını ve reaktif plakası kapağını çıkarın. Ardından hazırlık istasyonu kapağını kapatın ve kontrol panelinden uygun analizi çalıştırın.

İmmobilize edilmiş ve yönlendirilmiş üçlü komplekslerin barkodlarını görselleştirmek ve saymak için kartuşu hazırlama istasyonundan çıkarın, kapatmak için verilen kapağı kullanın ve mevcut herhangi bir yuvaya dijital analizöre yerleştirin. Bir kartuş tanım dosyası (CDF) oluşturmak için dokunmatik ekranı kullanın. CDF içindeki her bir örneğe uygun raporlayıcı kütüphane dosyasının atandığından emin olun.

Tarama işlemi tamamlandığında, verileri ilgili QC ve analiz protokolüne göre işleme ve analiz etmeden önce, bir USB sürücü kullanarak veya e-posta yoluyla dijital analizörden indirin. Gen ekspresyon platformu analiz sistemi, yüksek düzeyde otomatik yapısı sayesinde teknik gürültüyü azaltır ve kullandığı benzersiz kimya yüksek hassasiyetli gen ekspresyon verileri üretir. Burada gösterilen teknik tekrarlar, hem endojen hem de viral mikroRNA ekspresyon kantifikasyonunda mümkün olan yüksek tekrarlanabilirliği kanıtlamaktadır.

Bu yöntem kullanılarak, sağlıklı çalışma katılımcıları tarafından tanımlanan beklenen ekspresyondan sapma gösteren viral kodlu ve endojen insan mikroRNA'ları, IBS'de ilgi çekici hedefler olarak tanımlanabilir. Yöntemin hassasiyeti ve duyarlılığı, düşük ekspresiyonlu hedefler arasındaki perturbasyonların tespit edilmesine olanak tanır ve hafif perturbasyonlar da güvenilir bir şekilde gözlemlenebilir. Bu şekiller, sağlıklı kontrollerle karşılaştırıldığında IBS ve IBS alt tiplerindeki dolaşımdaki mikroRNA'larda meydana gelen bazı perturbasyonları göstermektedir.

IBS katılımcılarında farklı şekilde yükselmiş olan en önemli iki mikroRNA burada sunulmuştur. Bu keman grafiğindeki eğriler, miR-150 için sayım sıklığını göstermektedir. Dikey çubuklar birinci ve üçüncü çeyrekliklerini, kırmızı kare ise medyan sayımı temsil etmektedir.

Bu prosedürün ardından, biyobelirteç imzalarını daha büyük kohortlarda doğrulamak ve temel RNA ile protein ilişkilerini araştırmak amacıyla, aynı teknolojiye dayalı daha hedefli özel analizler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, biyomedikal araştırma alanındaki araştırmacıların hastalıklar için tanısal biyobelirteç panellerini hızlı, hassas ve doğru bir şekilde geliştirmelerinin önünü açmıştır.