İrritabl Bağırsak Sendromu içinde miRNA'lar Sirkülasyon tedirginlikler bir Çoklanmış Yüksek verim Gen İfadesi Platformu Kullanma Algılanan
30 Kasım 2016
Amplifikasyona ihtiyaç duymadan biyolojik substratlardaki molekülleri barkodlayarak ve sayarak gen ekspresyonunu ölçen çoğullanmış yüksek verimli bir gen ekspresyon platformunun kullanımını açıklıyoruz. Platformu, irritabl bağırsak sendromu olan ve olmayan kişilerde tam kandaki mikroRNA (miRNA) ekspresyonunu ölçmek için kullandık.
Bu multipleks nükleik asit miktar tayin protokolünün genel amacı, tam kandaki mikroRNA ekspresyonunu dijital olarak ölçmektir. Bu yöntem, sindirim bozukluklarının incelenmesinde temel soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir. MikroRNA'lar gibi düzensiz moleküler mekanizmaların ve biyobelirteç imzalarının tanımlanmasına yardımcı olur.
Bu tekniğin ana avantajı, mikroRNA nicelemesinin amplifikasyona dayanmamasıdır. Bu teknoloji, moleküler hedefleri dijital olarak sayar ve büyük ölçüde otomatiktir. Toplam RNA'yı saflaştırmak için, önceden toplanmış ve dondurulmuş tam kan örneklerini iki saat boyunca çözdürün ve inkübe edin.
Tüpleri oda sıcaklığında on dakika boyunca 5.000 kez g sıcaklıkta santrifüjlemek için sallanan bir kova rotoru kullanın. Ardından, peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek bir atık tüpüne dikkatlice dökerek veya pipetleyerek süpernatantları çıkarın. Pelete dört mililitre RNaz içermeyen su ekleyin.
Kapağı güvenli bir şekilde değiştirin ve pelet gözle görülür şekilde çözülene kadar girdaplayın. Ardından, tüpü tekrar santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Ardından, peletlere 350 mikrolitre BM1 tamponu ekleyin ve pelet gözle görülür şekilde çözülene kadar girdap yapın.
Ardından, otomatik toplam RNA ekstraksiyonu için numuneyi iki mililitrelik bir işleme tüpüne aktarın. Ticari olarak temin edilebilen bir RNA ekstraksiyon kiti kullanarak, RNA saflaştırma kitinde sağlanan önceden yüklenmiş pipet uçlarını, santrifüj tüplerini, tamponları ve reaktifleri robotik RNA ekstraksiyon sistemine yükleyerek, tam kan örneğinden mikroRNA da dahil olmak üzere hücre içi RNA'nın otomatik saflaştırılmasını gerçekleştirin. Protokol seçim menüsünden Blood miRNA PartA protokolünü seçin ve çalıştırmayı başlatın.
RNA ekstraksiyonunu tamamlayın ve numuneleri metin protokolüne göre saklayın. 12 RNA örneğini mikrolitre başına 33 nanograma normalleştirmek için önce RNaz içermeyen su kullanarak mikroRNA örneklerini hazırlayın. Nükleaz içermeyen su ile, tahlil kitinde sağlanan mikroRNA kontrollerinin 500'de 1'i oranında seyreltilmesini hazırlayın ve buz üzerinde tutun.
Ardından, 13 mikrolitre tavlama tamponu, 26 mikrolitre mikro R-tag reaktifi ve 6,5 mikrolitre mikroRNA kontrolünü birleştirerek tavlama ana karışımını hazırlayın. 12 adet 0.2 mililitre şerit tüpünün her birine 3.5 mikrolitre tavlama ana karışımı ekleyin ve ardından 3 mikrolitre RNA örneği ekleyin. Karıştırmak için tüpleri hafifçe vurun, tezgah üstü mini mikrosantrifüj ile 2000 kez g'de döndürün ve aşağıdaki programı kullanarak tüpleri bir termodöngüleyicide çalıştırın.
Ardından, üç mikrolitre ligasyon tamponu ve 19.5 mikrolitre PEG'i birleştirerek bir ligasyon ana karışımı hazırlayın. Ardından, reaksiyonların her birine 2,5 mikrolitre ligasyon ana karışımı ekleyin. Tüpleri karıştırdıktan ve döndürdükten sonra, beş dakika boyunca 48 santigrat derecede termo döngüleyiciye geri koyun.
Daha sonra, hala termosikler bloğundayken her numuneye doğrudan bir mikrolitre ligaz ekleyin ve aşağıdaki programı kullanarak tüpleri inkübe edin. Tüpleri yavaşça karıştırın ve döndürün ve her numuneye bir mikrolitre ligasyon temizleme enzimi ekleyin. Ardından, tüpleri burada gösterildiği gibi termosiklerde inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, karıştırmadan ve döndürmeden önce numunelere 40 mikrolitre RNaz içermeyen su ekleyin. MikroRNA hibridizasyonunu gerçekleştirmek için, raportörü çözün ve buz üzerinde sağlanan prob setlerini yakalayın ve döndürün. Reporter Code Set 2'ye 130 mikrolitre hibridizasyon tamponu ekleyin ve hibridizasyon ana karışımını oluşturmak için karıştırın.
12 yeni 0,2 mililitrelik şerit tüpüne, 20 mikrolitre hibridizasyon ana karışımı ekleyin. 85 santigrat derecede yeni hazırlanan mikroRNA örneklerini beş dakika boyunca denatüre edin ve buz üzerinde soğutun. Ardından, hibridizasyon ana karışımını içeren şerit tüplerinin her birine 5 mikrolitre mikroRNA örneği ekleyin.
Termocycler'ı, 30 mikrolitre hacim hesaplanan sıcaklıkta 65 santigrat dereceye ve ısıtmalı kapağı, çalışmanın sonunda 4 santigrat dereceye kadar düşmemesi için Forever time ayarında programlayın. Her tüpe 5 mikrolitre yakalama probu seti ekleyin ve karıştırın. Ardından, onları döndürdükten sonra, tüpleri hemen 65 santigrat derecede termo döngüleyiciye yerleştirin.
Numuneleri en az 12 saat ve en fazla 30 saat inkübe edin. Önce kartuşu ve plakaları oda sıcaklığına ısıtarak hazırlık istasyonunu kurun. Ardından plakaları aşağı doğru döndürün.
Hazırlık istasyonunu yüklemek için istasyon kapısını açın ve reaktif plakalarını, kartuşu, pipet uçlarını, hazırlanan numuneleri 0,2 mililitrelik şerit tüplere ve iki adet boş 0,2 mililitrelik 12 tüplü şerit tüplerini robottaki uygun yerlere yükleyin. Şerit tüp kapaklarını ve reaktif plakası kapağını çıkarın. Ardından, hazırlık istasyonu kapısını kapatın ve kontrol panelinden uygun tahlili çalıştırın.
Hareketsizleştirilmiş ve yönlendirilmiş üçlü komplekslerin barkodlarını görselleştirmek ve saymak için, kartuşu hazırlık istasyonundan çıkarın, kapatmak için verilen kapağı kullanın ve mevcut herhangi bir yuvaya dijital analizöre yerleştirin. Bir kartuş tanımlama dosyası veya CDF oluşturmak için dokunmatik ekranı kullanın. CDF'deki her örneğe uygun raporlayıcı kitaplık dosyasının atandığından emin olun.
Tarama tamamlandıktan sonra, verileri işlemeden ve analiz etmeden önce, ilgili kalite kontrol ve analiz protokolüne göre veri dosyalarını bir USB sürücü kullanarak veya e-posta yoluyla dijital analizörden indirin. Gen ekspresyon platformu tahlil sistemi, yüksek düzeyde otomatikleştirilmiş doğası sayesinde teknik gürültüyü azaltır ve kullandığı benzersiz kimya, yüksek hassasiyetli gen ekspresyon verileri üretir. Burada gösterilen teknik kopyalar, hem endojen hem de viral mikroRNA ekspresyon miktar tayininde mümkün olan yüksek tekrarlanabilirliği göstermektedir.
Bu yöntem kullanılarak, sağlıklı çalışma katılımcıları tarafından tanımlandığı gibi, beklenen ifadeden sapma gösteren viral kodlu ve endojen insan mikroRNA'ları, IBS'de ilgi çekici hedefler olarak tanımlanabilir. Yöntemin hassasiyeti ve hassasiyeti, düşük ifadeli hedefler arasındaki bozulmaların tespit edilmesini sağlar ve ince bozulmalar da güvenilir bir şekilde gözlemlenebilir. Bu rakamlar, sağlıklı kontrollere kıyasla IBS ve IBS alt tiplerinde dolaşımdaki mikroRNA'lardaki bazı bozulmaları göstermektedir.
IBS katılımcılarında diferansiyel olarak yükseltilmiş en önemli iki mikroRNA burada sunulmaktadır. Bu keman grafiğindeki eğriler, miR-150 için sayımların sıklığını gösterir. Dikey çubuklar birinci ve üçüncü çeyrekleri temsil eder ve kırmızı kare medyan sayıyı gösterir.
Bu prosedürü takiben, daha büyük kohortlarda biyobelirteç imzalarını doğrulamak ve temel RNA ve protein ilişkilerini keşfetmek için aynı teknolojiye dayalı daha hedefli özel tahliller gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, biyomedikal araştırma alanındaki araştırmacıların hızlıca, hassasiyet ve doğrulukla hastalık için tanısal biyobelirteç panelleri geliştirmelerinin yolunu açtı.
Genel Bakış
Bu makale, tam kan örneklerinde mikroRNA ekspresyonunu kantitize etmek için tasarlanmış bir multiplex yüksek verimli gen ekspresyon platformu sunmaktadır. Yöntem, amplifikasyon gerektirmeden doğru ölçüm sağlar ve bu da onu irritabl bağırsak sendromu gibi durumları incelemek için uygun kılar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Gen ekspresyon analizi
- MikroRNA kantitasyonu
- Sindirim bozuklukları araştırması
Arka Plan
- MikroRNA'lar gen düzenlemesinde önemli bir rol oynar.
- Bunların ekspresyonunu anlamak, çeşitli hastalıklara ilişkin içgörüler sağlayabilir.
- Mevcut yöntemler genellikle amplifikasyona dayanır, bu da değişkenliği artırabilir.
- Bu çalışma, bu sınırlamaların yeni bir yaklaşımla aşılması amacını taşır.
Çalışmanın Amacı
- Kanda mikroRNA'nın dijital kantitasyonu için bir yöntem geliştirmek.
- Irritabl bağırsak sendromunda dysregüle moleküler mekanizmaları belirlemek.
- Sindirim bozuklukları için biyobelirteç imzaları oluşturmak.
Kullanılan Yöntemler
- Tam kan örneklerinden otomatik RNA ekstraksiyonu.
- Spesifik reaktifler kullanarak mikroRNA örneklerinin hazırlanması.
- MikroRNA tespiti için hibridizasyon ve ligasyon süreçleri.
- Spesiyalize bir platform kullanarak gen ekspresyon verilerinin dijital analizi.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, mikroRNA seviyelerini kantitize etmede yüksek hassasiyet göstermiştir.
- Teknik tekrarlar, sonuçların tekrarlanabilirliğini göstermiştir.
- Sağlıklı ekspresyon profillerinden sapma gösteren mikroRNA'lar belirlenmiştir.
- Düşük ekspresyonlu hedeflerdeki ince değişiklikler güvenilir bir şekilde tespit edilmiştir.
Sonuçlar
- Multiplex platform, kanda mikroRNA'yı incelemek için güçlü bir araç sağlar.
- Sindirim bozukluklarının moleküler temelini anlamaya yardımcı olabilir.
- Bu yaklaşım, irritabl bağırsak sendromu için yeni biyobelirteçlerin keşfine yol açabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This multiplexed high-throughput gene expression platform enables robust, amplification-free quantification of circulating miRNAs, supporting biomarker discovery in digestive disorders such as irritable bowel syndrome. By providing high sensitivity and reproducibility in detecting low-expression miRNA perturbations, the method enhances target validation confidence and reduces mechanistic ambiguity in early discovery. Its automated workflow and digital counting approach improve assay standardization and scalability for cross-functional R&D teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying dysregulated circulating miRNAs as potential biomarkers in IBS.
- Operational Value: Supports biological de-risking through precise, amplification-free quantification that minimizes technical variability.
- Predictive Value: Facilitates detection of subtle miRNA perturbations, improving confidence in target relevance and portfolio triage decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates highly reproducible, quantitative miRNA expression data suitable for assay standardization and biomarker panel development.
- Operational Value: Reduces investigator effects via largely automated sample preparation and robotic processing, enhancing throughput and consistency.
- Scalability: Permits multiplexed analysis of up to 800 transcripts per reaction, enabling efficient screening of miRNA signatures across cohorts.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports validation of circulating miRNA biomarkers discovered in human samples for further preclinical investigation.
- Mechanistic De-risking: Allows correlation of miRNA expression changes with disease subtypes, aiding in pathophysiological understanding.
- Predictive Confidence: Enables reliable detection of low-abundance miRNAs, improving biomarker sensitivity and reducing false-negative risk in translational studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis-driven biomarker screening to assay validation, supporting progression from early discovery to lead identification in digestive disorder research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing by quantifying miRNA expression changes in whole blood, clarifying dysregulated molecular pathways in IBS.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs with high linearity and sensitivity, supporting reliable compound or biomarker evaluation.
- Analytics: Provides digital barcode counts and normalized expression data that facilitate statistical comparison across conditions and cohorts.
- Translational Research: Connects circulating miRNA findings to disease relevance, supporting biomarker continuity into preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, automated platform for miRNA profiling applicable across multiple therapeutic areas beyond gastrointestinal disorders.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing technical noise and enabling detection of low-expression miRNA changes.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through automation, minimizing batch effects and user variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust biomarker data, reducing late-stage failure risk due to poorly validated targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of miRNA biomarkers based on reproducible, quantifiable expression changes in clinically relevant samples.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid handling, automated liquid handling systems, and digital image analysis for accurate miRNA quantification.
- Dependent on access to robotic prep stations, digital analyzers, and proprietary fluorescent probe sets with color-coded barcodes.
- Necessitates cross-team standardization of sample collection, RNA normalization, and hybridization protocols to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the assay to different biofluids or tissue types beyond whole blood.
- Limited by the need for specialized reagents and equipment, which may constrain adoption in low-resource settings despite high reproducibility.
