Robot sıvı işleme derleme modüler DNA cihazların otomatik

Bu DNA montaj protokolünün genel amacı, DNA cihazlarının tekrarlanabilir, ölçeklenebilir, otomatikleştirilmiş yüksek verimli üretimini sağlamaktır. Bu çalışma, üst düzey DNA cihaz tasarımlarına dayalı olarak bir sıvı işleyici için pipetleme talimatları oluşturabilen sağlam ve kullanıcı dostu yazılım iş akışına olan ihtiyacı ele almaktadır. Bu tekniğin ana avantajı, otomatik reaksiyon hazırlamanın tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir olması ve manuel hazırlamaya kıyasla %4 kadar az uygulama süresi gerektirmesidir.

Bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir, çünkü otomasyon adımlarının öğrenilmesi zor olabilir ve deneysel ve hesaplama yöntemlerinin bir kombinasyonudur. Bu çalışma için senaryo oluşturmayı otomatikleştirebilecek bir yazılım aracı geliştirilmiştir. Herhangi bir web tarayıcısını kullanarak MoCloAssembly'ye gidin.

com ve kombinatoryal DNA cihaz tasarımına dahil edilecek tüm DNA parçaları için GenBank dosyalarını yükleyin. Tüm dosyalar yüklendikten sonra, istediğiniz DNA parçalarını seçin. Parça koleksiyonlarının yanı sıra tek tek parçalar da seçilebilir.

Parçaları boş tuval üzerine sürükleyin. DNA parçalarını, her parça için beş asal ve üç asal çıkıntı eşleşecek şekilde sıralayın. Parça türlerini, DNA parçalarının amaçlanan son sırasına yerleştirin.

Sayfanın sağ alt köşesindeki birleştir'e tıklayın. Yazılım aracının, BSA1 enzimi ile sindirildikten sonra her bir parçayı çevreleyen dört baz çifti çıkıntısına dayalı olarak yalnızca geçerli oluşturulabilir montajlar oluşturacağını unutmayın. Planlar sekmesine gidin ve araç tarafından oluşturulan dosyaları indirin.

Bu dosyalar, bilim adamlarının DNA örneklerini ve reaksiyonlar için gerekli reaktifleri hazırlamaları için insan tarafından okunabilir plaka haritalarını, sıvı işleyici için bir seçim listesini ve birleştirilecek tüm DNA cihazları için tam açıklamalı GenBank dosyalarını içerecektir. Modüler DNA düzeneğine başlamadan önce, metin protokolünde açıklandığı gibi plazmit DNA'yı hazırlayın. Bu prosedürün en kritik adımı, takım tarafından oluşturulan plaka haritalarını kullanarak kurulum plakasının ve reaktif plakasının doğru doldurulmasıdır.

Montaj aleti tarafından oluşturulan PDF dosyasının plaka haritasını takiben, her seyreltilmiş DNA parçasının belirtilen hacmini, tam etekli 96 oyuklu bir PCR plakası üzerindeki uygun kuyucuğa yerleştirin. Bu kurulum plakasını ihtiyaç duyulana kadar buz üzerinde tutun. Buz üzerinde, aşağıdaki bileşenlerle reaksiyon ana karışımını hazırlayın.

Her 20 mikrolitre reaksiyon için iki mikrolitre 0X T4 DNA ligaz tamponu, 0.5 mikrolitre T4 DNA ligaz ve bir mikrolitre BSA1 enzimi ekleyin. Oluşturulan PDF'deki reaktif plakası için plaka haritasını takip ederek, enzim ana karışımını yeni bir tam etekli 96 oyuklu PCR plakasının uygun kuyucuklarına dağıtın. Bu reaktif plakasını buz üzerinde veya 96 oyuklu soğuk bir blok üzerinde tutun.

Bu prosedüre başlamak için, kurulum plakasını ve reaktif plakasını sıvı işleyicinin güvertesine yerleştirin. Boş, tam etekli 96 oyuklu bir PCR plakası ekleyin. Boş plaka, reaksiyonların monte edildiği çıkış plakası olacaktır.

Sıvı işleyici kontrol yazılımını, hazırlanan her bir numunenin ve reaktif plakasının örneklerini oluşturarak, bunları tam olarak temiz deiyonize su etiketli bir rezervuar çukuru da dahil olmak üzere MoCloAssembly. com tarafından oluşturulan plaka haritalarında göründükleri gibi adlandırdığınızdan emin olarak hazırlayın. Kontrol yazılımındaki Worklist komutunu kullanarak, yazılım aracımız tarafından oluşturulan GWL dosyasını ve ardından ilk komutta yüklenen GWL dosyasını yürütecek başka bir Worklist komutunu yükleyin.

Denetleyici yazılımının Çalıştır komutunu kullanarak komut dosyasını yürütün. Robotik sıvı işleyici komut dosyasının yürütülmesini tamamladıktan sonra, sıvı işleyici güvertesinden tüm plakaları çıkarın. Kurulum plakasını alüminyum sızdırmazlık filmi ile kapatarak ve eksi 20 santigrat derecede saklayarak kalan DNA'yı saklayın.

Çıkış plakasını yapışkan film ile kapatın, bir termodöngüleyici veya ısı bloğuna yerleştirin ve aşağıdaki döngü parametreleriyle çalıştırın. İki saat boyunca 37 santigrat derece, beş dakika boyunca 50 santigrat derece, 10 dakika boyunca 80 santigrat derece ve dört santigrat derecede tutun. Steriliteyi korumak için, bu prosedür açık alevin yakınında yapılmalıdır.

Buz üzerinde ihtiyaç duyulan gerekli sayıda yetkin E.coli hücre alikotunu çözün. Hücreler çözülürken, uygun antibiyotik içeren LB agar plakalarını hazırlayın. IPTG ve X-GAL içeren bir ana karışım yapın.

Ana karışımdan 100 mikrolitre pipetleyin ve plakayı eşit şekilde kaplamak için cam boncuklar kullanın. Bakterileri kaplamadan önce plakaları en az 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Her reaksiyon için 10 mikrolitre yetkin hücreyi buz üzerinde yeni bir 96 oyuklu PCR plakasına ayırarak dönüşüm plakasını hazırlayın.

Çıkış plakasından her reaksiyondan bir ila üç mikrolitre dönüşüm plakasındaki karşılık gelen oyuğa ekleyin ve beş dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Dönüşüm plakasını yapışkan film ve ısı şoku ile 42 santigrat derecede 30 saniye boyunca bir termodöngüleyicide kapatın. Plakayı hemen iki dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.

Dönüşüm plakasının aynı kuyucuklarına 150 mikrolitre SOC ortamı ekleyin, yapışkan bir conta ile kapatın ve bir saat boyunca 900 RPM'de çalkalayarak 37 santigrat derecede inkübe edin. Bir saat sonra, dönüşüm plakasının her bir oyuğunun tam içeriğini daha önce hazırlanan LB agar plakaları üzerine plakalayın. Plakanın yüzeyini eşit şekilde kaplamak için cam boncuklar kullanın.

Plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Dönüşümü takip eden gün, kuyucuk başına 1,5 mililitre LB suyu içeren bir veya birkaç 96 oyuklu derin kuyu kültür bloğu hazırlayın. Steril bir kürdan kullanarak ve açık bir alevin yakınında çalışarak, dönüştürülmüş reaksiyonların her bir LB agar plakasından tek beyaz koloniler seçin ve derin kuyu kültür bloğunu aşılayın.

Kültür bloğunu gaz geçirgen bir conta ile kapatın ve gece boyunca 900 RPM'de çalkalayarak 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, ticari olarak temin edilebilen herhangi bir kiti kullanarak bakteri kültürlerinden plazma DNA'sını izole edin ve klonları doğrulamak için Sanger dizilimi için gönderin. Reaksiyon montaj süreleri her üç modalitede de karşılaştırıldı.

Manuel montaj iki saat 10 dakika sürdü ve bunların tamamı uygulamalı olarak yapıldı. Sıvı işleyicinin pipetleme komutlarını yerine getirmesi de benzer bir zaman aldı, ancak bu sürenin yalnızca beş dakikası uygulamalıydı. Akustik dağıtıcı, sıvı transferlerini gerçekleştirmek için önemli ölçüde daha az zaman aldı ve minimum uygulama süresiyle.

Bu grafik, her bir montaj yöntemi için reaksiyon başına maliyeti gösterir. Bu maliyet, kullanılan enzimlerin ve pipet uçlarının fiyatını içerir. 96 manuel ve sıvı taşıyıcı setinin %95'i için doğru diziler elde edildi.

Tam 96 düzeneğin sadece 12'si akustik dağıtıcı tarafından hazırlanan örneklerden dönüştürüldü ve %83'ü doğruydu. İki reaksiyon, muhtemelen çıkış plakasındaki DNA ve enzim ana karışım damlacıklarının yetersiz karıştırılması nedeniyle herhangi bir beyaz koloni veremedi. Beyaz kolonilerin toplam koloni sayısına oranıyla ölçülen klonlama reaksiyonu verimliliklerinin karşılaştırılması, elle monte edilmiş ve sıvı işleyici ile monte edilmiş reaksiyonlar için karşılaştırılabilir yüzdeler gösterir.

Araştırmacılar, aracımızı kullanarak kombinatoryal DNA kütüphaneleri oluşturmak için sıvı işleme robotlarından yararlanabilirler. Bu yöntem tekrarlanabilir, ölçeklenebilirdir, değerli araştırmacılara zaman kazandırır ve insanların tekrarlayan karmaşık pipetleme görevlerini yerine getirmesinden kaynaklanan pipetleme hataları olasılığını azaltır. Bu videoyu izledikten sonra, çevrimiçi aracımızı kullanarak modüler klonlama reaksiyonları için kombinatoryal montajları nasıl oluşturacağınızı ve oluşturulan iki pipetleme komut dosyasını bir sıvı işleme robotunda nasıl çalıştıracağınızı öğrenmiş olmalısınız.

Gelecekteki sentetik biyoloji laboratuvarlarında sadece bir adım olarak sıvı işleme robotları ile otomatik DNA montajını öngörüyoruz. Tasarım karmaşıklığı arttıkça, bunun gibi yaklaşımların giderek daha yaygın hale gelmesini bekliyoruz ve bu süreçteki bu ilk adımı temsil etmekten heyecan duyuyoruz.