B Grubu bir murin modelinde Streptococcus Vajinal Kolonizasyon

Bu hayvan modelinin genel amacı, murin vajinal yolunun B grubu Streptokok veya GBS kolonizasyonunu oluşturmaktır. Bu yöntem, B grubu Streptokok kolonizasyonu hakkında, kolonizasyon için önemli olan bakteriyel faktörlerin neler olduğu ve konak yanıtlarının vajinal kalıcılığı nasıl etkilediği gibi temel soruları anlamamıza yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, aşılamanın tipik olarak anestezi, immünosupresanlar veya koyulaştırıcı ajanlar kullanılmadan yüzde 90'dan fazla kolonizasyonla sonuçlanmasıdır.

Fare başına 0.5 miligram beta-Estradiolü, tüm topaklar çıkarılana ve beta-Estradiol ince bir toz olarak görünene kadar 15 mililitrelik konik bir tüpte girdaplayarak başlayın. Daha sonra, şırınga filtresi fare başına 100 mikrolitre susam yağı, 0.45 mikronluk bir süzgeçten tüpe ve tüpü tekrar girdaplayın. Hormon yağ boyunca homojen bir süspansiyon olarak dağıtıldığında, reaktifi yeni, 10 mililitrelik bir şırıngaya çekin ve 18 gauge, bir inçlik bir iğne takın.

Süspansiyonun 100 mikrolitresini fare başına bir, bir mililitre tüberkülin şırıngasına alın ve her bir tüberkülin şırıngasını steril, 26 gauge, yarım inçlik bir iğne ile donatın. Daha sonra, her bir hayvanın periton boşluğunun sol veya sağ alt çeyreğine 100 mikrolitre beta-Estradiol verin. Enjeksiyonla aynı gün, 37 santigrat derecede Todd Hewitt et suyunda veya THB'de GBS suşunun beş mililitre, gece boyunca sıvı bir kültürünü büyütün.

Ertesi sabah, bakteriler orta log fazına ulaşana kadar, 37 santigrat derecede iki ila üç saatlik bir inkübasyon için GBS'yi taze THB'de bir ila 10 hacimde alt kültürleyin. Daha sonra, alt kültürü steril, 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve bakteri hücrelerini santrifüjleyin. Peleti 200 mikrolitre steril PBS'de tekrar süspanse edin.

Ardından, yeni, beş mililitrelik bir kültür tüpünde 0.4'lük bir OD600'e ulaşmak için süspansiyonun toplam hacmini 10 fare başına bir mililitre PBS'ye getirin. Kültürü 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve bakterileri yeniden peletleyin. Ardından, PBS'deki hücreleri orijinal hacmin onda biri oranında yeniden askıya alın.

İnokulumun tam CFU'sunu belirlemek için THB agar üzerine seri seyreltme ve kaplama için 50 mikrolitre bakteri ayırın. Daha sonra, 200 mikrolitrelik jel yüklemeli bir pipet ucuna 10 mikrolitre GBS çekin ve gevşek cildi ilk hayvanın boynunun tırnağında, başparmak ve işaret parmağı arasında manuel olarak sabitleyin, ardından kuyruğu hareketsiz hale getirin. Pipet ucunu vajinal lümene 5 ila 10 milimetre yerleştirin ve aşının tüm hacmini dağıtın.

Ardından, ön pençeleri sert bir yüzeyde yürürken, hayvanın arka ucunu yükseltmek için tırnağı hemen serbest bırakın ve kuyruğu kaldırın. Bir dakika sonra, vajinal açıklığı herhangi bir aşı geri akışı açısından görsel olarak inceleyin. Swablamadan hemen önce, pamuğu PBS'de önceden ıslatın ve farelerden birini az önce gösterildiği gibi kısıtlayın.

Swabı vajinal lümene 10 milimetre yerleştirin ve vajinal duvara hafif bir baskı uygularken saat yönünde dört kez ve saat yönünün tersine dört kez hafifçe döndürün. Swabı 100 mikrolitre PBS içeren 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve bakterileri pamuk liflerinden serbest bırakmak için tüpü ve swabı yaklaşık 15 saniye boyunca vorteksleyin. Daha sonra, her bir numuneyi PBS'de seri olarak seyreltin ve 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübasyon için üreticinin talimatlarına göre hazırlanan diferansiyel orta agar plakası üzerinde bir ila 10 ila 10.000 seyreltme arasında 20 mikrolitre plakalayın.

GBS kolonileri parlak pembe veya leylak rengi olarak görünecektir. Vajinal lavajı toplamak için, vajinal lümene 20 mikrolitre PBS dağıtmak için 200 mikrolitrelik jel yüklemeli bir pipet ucu kullanın. Tüm hacmi lümen içinde dört kez yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin.

Ardından, aynı ucu kullanarak tüm hacmi geri çekin. Aşağı akış lavaj sıvısı analizi için, lavajı 0,7 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne dağıtın. Doku diseksiyonu homojenizasyonu için, ötenazi yapılmış bir hayvanın ventral karnına yüzde 70 etanol püskürtün ve abdominopelvik boşluğu açmak için steril makas kullanın.

Üreme sistemi açığa çıkacak şekilde bağırsakları yerinden çıkarın. Ardından, rahim gövdesi ile yumurtalıklar arasında orta uzunlukta her iki rahim boynuzunu kesin. Makas ve forseps kullanarak, viseral yağı, zarları ve idrar kesesini üreme sisteminden ayırın ve dokuları kaudal olarak hareket ettirin.

Ardından, üreme sistemini vücuttan ayırmak için vajinayı vulvaya mümkün olduğunca yakın bir şekilde enine kesin. Dokunulmuş üreme sistemini steril bir Petri kabına aktarın ve uterusu serviksten tek bir enine kesikle ayırmak için yeni bir tıraş bıçağı kullanın. Rahim ağzını vajinadan başka bir enine kesi ile ayırın.

Daha sonra, dokuların her birini 500 mikrolitre PBS ve homojenleştirici boncuklar içeren bireysel, önceden tartılmış, iki mililitrelik tüplere aktarmak için steril forseps kullanın. Doku ağırlıklarını belirlemek için her 2 mililitrelik tüpü tartın. Ardından, vidalı kapaklı tüpleri sıkıca kapatın ve dokuları bir dakika boyunca maksimum hızda bir doku homojenizatöründe homojenize edin.

Bakteri yükünü ölçmek için, 37 santigrat derecede 24 saatlik bir inkübasyon için 25 mikrolitre doku homojenatını ve plakayı bir ila 10 ila 10.000 dilüsyon diferansiyel ortam agar plakaları üzerinde seri olarak seyreltin. Sitokin miktar tayini için numuneleri saklamak için homojenatları eksi 20 santigrat derecede dondurun. Bu görüntülerde, ıslak montajlı vajinal lavaj sıvısı ile belirlenen fare kızgınlık döngüsünün dört aşaması gösterilmektedir.

Proöstrus aşamasında aşılanan fareler, özellikle aşılama sırasında diestrus içinde olanlar olmak üzere, diğer tüm östrus aşamalarından daha uzun süre GBS ile kolonize edildi. Sürekli kızgınlık, aşılamadan iki hafta sonra gözlenen yüzde 90'lık bir kolonizasyon ile CD-1 farelerinde GBS A909 kalıcılığını destekler. Aşılamadan önce bir doz beta-Estradiol ile yapılan tipik bir deneyde, farelerin sadece yüzde 40 ila 50'si aşılamadan bir hafta sonra kolonize edildi ve kolonizasyon yüzdesini taklit eden geri kazanılmış bir ortalama GBS ile kolonize edildi.

Sürekli kızgınlığın sürdürülmesinin CD-1 farelerinin çoğunda GBS vajinal kalıcılığını desteklediğini göstermek. GBS A909, soylu CD-1 farelerinde ve akraba içi FVB farelerinde vajinal sistemde yaklaşık bir hafta boyunca devam eder. Oysa kendi içinde yetiştirilmiş BALB / c ve C57BL / 6 farelerinin çoğunluğu bir hafta içinde bir ay veya daha uzun süre kolonize olur.

Aşılanmış hayvanlarda GFP pozitif GBS'nin görselleştirilmesi, murin vajinal epiteline yapışmış ve diğer doğal vajinal floraya yakın GBS'nin varlığını gösterir. Tüm farelerin kolonize olmasını sağlamak için aşılama sırasında geri akışı önlemek önemlidir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik hayvan sayısına bağlı olarak bir ila iki saat içinde tamamlanabilir.

Bu model, konakçı/patojen etkileşimleri alanındaki araştırmacıların, B grubu streptokok gibi bakterilerin dişi üreme sistemini kolonize etme yeteneğini keşfetmelerine olanak tanır. Bu prosedür, terapötik müdahaleler hakkında ek soruları yanıtlamak için yeni bileşikleri veya probiyotik tedavileri test etmek için kullanılabilir.