Name: Algılama Trypanosoma brucei Varyant Yüzey Glikoprotein Değiştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Keşfedin, manyetik hücre ayırma ile Trypanosoma brucei'de VSG değiştirme varyantlarını izole etme ve nadir switcher'ları tespit etme yöntemini. Bu teknik, antijenik varyasyon çalışmalarını hızlandırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz tripanozom biyoloji genel tavsiye için George Haçı kabul etmek istiyorum. Bu çalışma aynı zamanda DS, MRM bir NSF Yüksek Lisans Araştırma Bursu (DGE-1.325.261) ve FNP bir NIH / NIAID (hibe # AI085973) Bir Bill ve Melinda Gates Vakfı GCE hibe ile desteklenmiştir. Biz-SCEI geni ve tanıma bölgesi içeren gerginlik kullanımı için Galadriel Hovel-Miner teşekkür ederim.

NOT: süreci boyunca, o buz üzerinde hücreleri tutmak için gereklidir. Soğuk ortam ayrıca boyunca kullanılmalıdır. 1. Numune Hasat <ol><li> 1.000.000 / ml - 0.5 bir yoğunluğa Lister 427 suşu kan dolaşımı tripanozomlann büyütün. Bu parazit az sayıda kültürleri başlamak en iyisidir. 1.500 x g&#39;de 10 dakika boyunca 50 x 10 6 hücre / örnek aşağı doğru döndürün. Daha sonra pozitif ve negatif antikor denetimlerini kullanın için kültüründe 1 x 10 6 hücre bırakın emin olun. NOT: Bu protokol ayrıca, hayvan kanı (detaylar için tartışmaya bakınız) izole tripanozomlann kullanılabilir. </li><li> Pipet veya yüzer maddenin en dökün (yaklaşık 750 ul bırakın). 1.5 ml mikrosantrifüj tüp hücreleri aktarın. </li><li> bir mikrosantrifüj içinde 5,200 x g&#39;de, 4 dakika boyunca 4 ° C &#39;de hücreler Spin ve supernatant çıkarın. </li></ol> 2. Manyetik Etiketleme <ol><li> Tekrar süspansiyon hücreleri 150 ul kültür ortamında (HMI-9 wiUygun seyreltme örneğin inci serumu) + primer anti-VSG antikoru. Not: Anti-VSG antikoru evde yapılan ve 1:50 seyreltmede kullanılmıştır. Bir florofor ile işaretlenmiş bir birincil anti-VSG antikor kullanılması önemlidir. </li><li> 10 dakika boyunca 4 ° C &#39;de soğuk bir odada 8 - hız 6 bir girdap adaptör 60 kullanılarak vorteks hücreleri. 1.000 ul soğuk HMI-9 serum ile - 800 ile yıkayın. </li><li> 5,200 x g&#39;de, 4 dakika boyunca 4 ° C &#39;de spin ve süpernatant aspire. serum ile 1 ml HMI-9 ile yıkayın ve yukarıdaki gibi döndürün. süpernatant aspire. serumu HMI-9, 100 ul içinde süspanse pelet. </li><li> (MSC) mikroboncuklar ayırma Manyetik aktive hücre 110 ul ekle. birincil anti-VSG antikor uygun olarak, anti-fare anti-tavşan veya anti-biyotin boncuk kullanın. İyice karıştırın. 10 dakika boyunca 4 ° C &#39;de soğuk bir odada Vorteks hücreleri. </li><li> Hücreler vorteks olsa da, bir ayırma mıknatıs üzerinde bir manyetik aktive ayırma kolonu / örnek oluşturdu. Bir yeniden var emin olunsütununda ceptacle (biz bir 15 ml santrifüj tüpü kullanın) flow-through toplamak için. Soğuk bir odada aparatı ayarlayın. </li><li> Başbakan sütuna serum ile HMI-9 2 ml ekleyin. akış her bir örnek toplamak için sütunu altında bir 15 ml santrifüj tüp yeri emişli sonra. </li><li> Adım 2.4 10 dakika inkübasyondan sonra, 800-1000 civarında ul soğuk HMI-9 serumu ile ekleyin. 5,200 x g&#39;de, 4 dakika boyunca 4 ° C &#39;de dönel çıkartıldı ve süpernatan bağlanmamış antikorların çıkarılması için. Serum ve tekrar süpernatant 100 ul bırakarak ile HMI-9 1 ml yıkayın. </li><li> şiddetle ve görsel santrifüj tüpü Flick pelet tamamen yeniden süspanse olduğundan emin olmak için tüp inceleyin. Hücreler de yeniden süspanse emin olmak için yukarı ve aşağı serum ve pipet ile HMI-9 1 ml ekleyin. </li></ol> 3. Manyetik Ayırma <ol><li> Yukarıda açıklandığı gibi sütunlar hazırlanmış olduğundan emin olun. sütun hücreler uygulanır. Hücreler baskın olmayan VS ifade ile flow-through toplayınsütun üzerinden akmaya 7 dakika - G. 1 orta ml + tripanozomlar genellikle 6 alır. </li><li> Yıkama 1 ml HMI-9 serum ile 2x ve adım 3.1 olarak akış yoluyla aynı tüp içinde toplamak. </li><li> Bölme akış (3 mi), iki 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine. Not: Bu, daha sonra bir araya getirilebilir ya da yarı vb RNA izole etmek için de kullanılabilir </li><li> mıknatıstan sütun çıkarın. sütununa serum ile HMI-9 3 ml ilave edilir ve başlangıç ​​baskın VSG ifade eden hücreleri elde etmek için bir 15 ml santrifüj tüpüne sütun dalma. daha sonra analiz için akıtılan malzemenin 300 ul çıkarın. buz üzerinde bu hücreleri tutun. </li><li> pozitif ve bir negatif kontrol olarak kullanılmak üzere, 37 ° C &#39;de büyümekte, kontrol hücrelerinin başlangıç ​​kültüründen yaklaşık 1.000.000 hücre sunar 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine bunları pipet (bu sıklıkla geçiş beklenmemektedir). Not: pozitif kontrol hücreleri adım 4.1 fluoroforla işaretlenmiş antikor ile boyanmış olacaktır. Negatif kontrol hücreleri remaProtokolün geri kalanı boyunca lekesiz olarak. </li><li> Sıkma akış örnekler ve 5,200 x g&#39;de, 4 dakika boyunca 4 ° C &#39;de pozitif antikor kontrol örneği ve supernatant çıkarın. Not: elüt hücrelerinin diğer 300 ul alikosu, anti-VSG boyama için pozitif kontrol olarak kullanılabilir. </li></ol> 4. Boyama Bulaşanlar ve switcherlar Belirlemek İçin <ol><li> Süspanse akış örnekler ve 100 ul HMI-9, uygun seyreltide Serum primer, fluoroforla işaretlenmiş anti-VSG antikoru ile pozitif kontrol hücreleri. Not: etiketli anti-VSG antikoru evde yapılan ve 1 seyreltme ile kullanılır: 1000. fluoroforla işaretlenmiş anti-VSG step.There adım 3.5 aşağıdaki iki mikrosantrifüj tüpleri içinde akış numune 3 mi olmalıdır MACS ayırma etiketlenmemiş antikor olarak aynı kaynaktan olabilir. </li><li> yeniden sus ise iki mikrosantrifüj tüpler pelet birleştirmek, akım sitometri-through akımı ile tüm analiz etmek100 ul HMI-9 serum + anti-VSG antikoru ile örnekleri bekleyen. İyice karıştırın. </li><li> 10 dakika boyunca 4 ° C &#39;de soğuk bir odada Vorteks hücreleri. 1.000 ul soğuk HMI-9 serum ile - 800 ekleyin. 4 dakika boyunca 4 ° C&#39;de santrifüj örnekleri süpernatan 5,200 xg&#39;de ve çıkarma bağlanmamış antikorların çıkarılması için. </li><li> serumu HMI-9 için 1 ml hücre yıkayın. 4 dakika boyunca 4 ° C&#39;de santrifüj örnekleri süpernatan 5,200 xg&#39;de çıkarın. Bu son dönüş sırasında, adım 3.4 ve negatif kontrol örneğinden yıkandı-örnekleri aşağı doğru döndürün. </li><li> 148.5 ul HMI-9 serumu, 25 ul mutlak sayım boncuk ve 1.5 ul Propidium iyodür solüsyonu (175 ul toplam) boyama: Tüm akış ve elüt örnekleri yeniden süspanse edin. 175 ul pozitif ve negatif antikor kontrol örnekleri tekrar süspansiyon HMI-9 serumu ile. Mutlak sayım boncuk / kullanılan özel lot için 25 ul sayısını kaydetmek için emin olun. </li><li> bir akış sitometresinde aracılığıyla tüm örnekleri çalıştırmak ve veri toplamak. PI olarak leke ölü hücreler <sup&gt; +. Kirletici maddeler PI olarak leke - VSG +. VSG - - Seçiciler PI olarak leke 8. </li><li> veri flow sitometri kullanılarak anahtarlama frekansları hesaplayın. NOT: anahtarlama frekansları nasıl hesaplanacağı ile ilgili talimatlar için, ek dosyasına başvurun <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54715/Flow_Cytometry_Calculations.docx" target="_blank">Sitometrisi Calculations.docx</a> ve Tablo 1&#39;de. </li></ol>

<ol><li>Horn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+variation+in+African+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Antigenic variation in African trypanosomes.</a> Molecular & Biochemical Parasitology. 195 (2), 123-129 (2014).</li>
<li>Lamont, G. S., Tucker, R. S., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+antigen+switching+rates+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Analysis of antigen switching rates in Trypanosoma brucei.</a> Parasitology. 92 (Pt 2), 355-367 (1986).</li>
<li>Rudenko, G., McCulloch, R., Dirks-Mulder, A., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+exchange+can+be+an+important+mechanism+of+variant+surface+glycoprotein+gene+switching+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Telomere exchange can be an important mechanism of variant surface glycoprotein gene switching in Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 80 (1), 65-75 (1996).</li>
<li>Turner, C. M., Barry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+of+antigenic+variation+in+Trypanosoma+brucei+rhodesiense+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">High frequency of antigenic variation in Trypanosoma brucei rhodesiense infections.</a> Parasitology. 99 (Pt 1), 67-75 (1989).</li>
<li>Miller, E. N., Turner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+antigenic+types+appearing+in+first+relapse+populations+of+clones+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Analysis of antigenic types appearing in first relapse populations of clones of Trypanosoma brucei.</a> Parasitology. 82 (1), 63-80 (1981).</li>
<li>Horn, D., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Trypanosoma+brucei+vsg+expression+site+switching+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Trypanosoma brucei vsg expression site switching in vitro.</a> Mol Biochem Parasitol. 84 (2), 189-201 (1997).</li>
<li>Figueiredo, L. M., Janzen, C. J., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+histone+methyltransferase+modulates+antigenic+variation+in+African+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A histone methyltransferase modulates antigenic variation in African trypanosomes.</a> PLoS Biol. 6 (7), e161(2008).</li>
<li>Boothroyd, C. E., Dreesen, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast-endonuclease-generated+DNA+break+induces+antigenic+switching+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A yeast-endonuclease-generated DNA break induces antigenic switching in Trypanosoma brucei.</a> Nature. 459 (7244), 278-281 (2009).</li>
<li>Engstler, M., Pfohl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+Flow-Mediated+Protein+Sorting+on+the+Cell+Surface+of+Trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic Flow-Mediated Protein Sorting on the Cell Surface of Trypanosomes.</a> Cell. 131 (3), 505-515 (2007).</li>
<li>Mugnier, M. R., Cross, G. A. M., Papavasiliou, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+dynamics+of+antigenic+variation+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The in vivo dynamics of antigenic variation in Trypanosoma brucei.</a> Science. 347 (6229), 1470-1473 (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Deneysel tekniği ile ilgili olarak, protokolün en önemli bileşeni soğuk tüm örnekleri tutuyor. Tripanozomlarına çok hızlı yüzeyleri 9 bağlanan antikor içselleştirmeye ancak bu işlem motilite bağlıdır ve hücreler, 4 ° C &#39;de tutulur sürece tahlil etkilemez. Tüm numuneler daima buz üzerinde tutulmalıdır ve pipet 25 ° C laboratuar ortamında maruz kalma en aza indirmek için hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Soğuk HMI-9 serum ile deneyin başlangıcında mevcut olmalıdır ve boyunca buz üzerinde tutulmalıdır. sütun ü...

Protozoon parazit, Trypanosoma brucei, Sahra-altı Afrika boyunca (Trypanosoma brucei brucei aracılığıyla) ve hayvanlar (Trypanosoma brucei gambience ve Trypanosoma brucei rhodesiense aracılığıyla) insanları etkileyen bir hastalık etkenidir. Bu çeçe sineği vektörünün tükürük yoluyla memeli konakçıda iletilir. İnsan ve Hayvan Afrika tripanosomyası Hem endemik bölgelerde ciddi bir ekonomik yük getiren ve birkaç ilaç mevcuttur ya da iki hastalığın tedavisi için geliştirilmektedir. Bağışıklık kaçırma mekanizmalarının anlaşılması trypanosomiasis için ilaçların geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir. Parazit kapsayan yoğun Variant Yüzey Glikoprotein (VSG) kat antijenik varyasyon birincil aracı biri olan T. brucei, memeli antikor tepkisini kaçınır. ~ 15 Expres VSG geninin yaklaşık olarak 2.000 varyantları tripanosom genomuna vardır, ama sadece bir birinden belirli bir zamanda transkripsiyonusion siteleri. Ifade VSG &#39;geçiş&#39; aktif ifadesi sitesine bir VSG genini kopyalayarak, veya (1 gözden) daha önce sessiz ifade sitenin transkripsiyonel aktivasyonu yoluyla gerçekleşebilir. Çok iş T. anlamak antijenik varyasyon ayrılmış olmasına rağmen brucei, anahtarlama frekansı etkileyen faktörler hala tam olarak anlaşılamamıştır. Günümüze kadar yapılan çalışmalar anahtarlama in vitro davranışsal oluşurken, anahtarlama frekansları yaklaşık 10 6 hücre 2 içinde 1 mertebesinde, çok düşük olduğu gerçeği ile engellenmiştir. Bu anahtarlama ilk etapta tespit etmek zor olduğundan, belirli bir faktör artar veya anahtarlama frekansını azaltır olmadığını ölçmek zor hale getirir. 2009 öncesinde, belirli bir nüfusta anahtarlayıcıları izole etmek için yöntemler uzun ve emek yoğun. Bunlar arasında baskın VSG karşı aşılanmış farelerde ile tripanozomlarına pasaj ve daha sonra hücreler toplandıBir gün sonra 3 veya immünofloresan 4,5 ile hücrelerin yüzlerce sayma. Ilaç direnci anahtarlayıcıları 6 izole etmek için başka bir strateji seçimi dayanmaktadır. In vitro olarak yetiştirilen Afrika tripanozomlar tipik bir büyük varyant ve alternatif varyantları ifade switcherlar çok daha küçük bir nüfusa ifade büyük bir nüfus oluşuyor, çünkü biz baskın, başlangıç VSG olarak bu yazıda boyunca büyük varyantı bakın. Bunu yaparken, biz hiçbir şekilde bu önemli varyant popülasyonda diğer varyantları daha fazla uygunluk olduğunu ima etmek istiyoruz. 4 saat - Burada güvenilir 3 belirli bir nüfusta bir dominant olmayan VSG ifade tripanozomlann sayısını ölçebilen bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, bir belirli bir genetik manipülasyon ya da ilaç tedavisi popülasyonda açık hücrelerin sayısını artırır olmadığını belirlemek istediğinde için özellikle yararlıdır. Bunun yerine do ifade hücrelerinin nüfusu riddingminant ilaç ile VSG başlayan ya da immünolojik vasıtasıyla, bu hücreler önce, bir manyetik sütun üzerinde izole hâkim VSG karşı antikora bağlanmış manyetik boncuk ile kaplanması ve ortadan kaldırılmıştır. anahtarlamalı nüfus daha sonra akış yoluyla toplanan ve kirletici tanımlamak için bir fluorofor etiketli anti-VSG antikoru ile tekrar lekeli. Niceleme hücrelere tanelerin oranı belirlenir ve nüfus 7 anahtarlama sayısını ölçmek için kullanılabilir, böylece her bir örnek için, mutlak sayaç boncuk belirli sayıda ekleyerek elde edilir.

<table><tbody><tr><td>etiketsiz anti-VSG antikoru</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>VSG antikoru evde yapılır</td></tr><tr><td>florofor etiketli anti-VSG antikoru</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>VSG antikoru evde yapılır</td></tr><tr><td>HMI-9 ortamı</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>HMI-9 evde yapılır</td></tr><tr><td>Propidium İyodür</td><td>BD Pharmingen</td><td>556463</td><td></td></tr><tr><td>CountBright mutlak sayma boncukları</td><td>Thermofisher Bilimsel</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>LD sütunları</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>MACS mıknatıs</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MACS manyetik ayırıcı</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>vorteks adaptörü-60</td><td>ThermoFisher bilimsel</td><td>AM10014</td><td></td></tr><tr><td>akış sitometresi</td><td>Coulter</td><td>yok</td><td></td></tr><tr><td>akış sitometresi analiz yazılımı</td><td>FloJo</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

algılama<em&gt; trypanosoma brucei</emmanyetik aktif hücre sorting ve akış sitometrisi ile&gt; varyant yüzey glikoprotein değiştirme

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, hem İnsan hem de Hayvan Afrika Trypanosomimiasis'e (sırasıyla uyku hastalığı ve nagana olarak bilinir) neden olan bir protozoan parazit bir çeçe vektörü ile bir memeli konakçı arasında döngüler. Yüzeyini kaplayan yoğun, varyant yüzey glikoproteinini (VSG) periyodik olarak değiştirerek memeli konakçı bağışıklık sisteminden kaçar. Trypanosoma brucei'de antijenik varyasyonun saptanması hem zahmetli hem de emek yoğun olabilir. Burada, belirli bir popülasyonda yeni bir VSG'yi ifade etmek için 'değişen' parazitlerin sayısını ölçmek için bir yöntem sunuyoruz. Parazitler önce başlangıç VSG'sine karşı bir antikor ile boyanır ve daha sonra manyetik bir boncuk üzerine bağlı ikincil bir antikor ile boyanır. Başlangıç VSG'sini ifade eden parazitler daha sonra parazitleri bir mıknatısa bağlı bir sütun üzerinden geçirerek popülasyonun geri kalanından ayrılır. Baskın, başlangıç VSG'sini ifade eden parazitler kolon üzerinde tutulurken, akış, yeni bir VSG'yi ifade eden parazitlerin yanı sıra başlangıç VSG'sini ifade eden bazı kirleticileri içerir. Bu akış popülasyonu, kirleticileri etiketlemek için başlangıç VSG'sine karşı floresan olarak etiketlenmiş bir antikor ve ölü hücreleri etiketleyen propidyum iyodür (PI) ile tekrar boyanır. Akış sitometrisi ile görülebilen bilinen sayıda mutlak sayma boncuğu, akış popülasyonuna eklenir. Boncukların toplanan hücre sayısına oranı daha sonra tüm numunedeki hücre sayısını tahmin etmek için kullanılabilir. Akış sitometrisi, başlangıç, baskın VSG için pozitif lekelenmeyen PI negatif hücrelerin sayısını sayarak anahtarlayıcıların popülasyonunu ölçmek için kullanılır. Popülasyondaki anahtarlayıcıların oranı daha sonra akış sitometrisi verileri kullanılarak hesaplanabilir.

Burada anlatılan yöntemi nüfusu 8 switcherlar sayısını artırdı VSG ifade site içinde bu çift iplikli tatili göstermek için kullanılmıştır. Burada, aynı ifade yerinde bir çift iplikli bir mola oluşturmak için uyarılan olan tripanozomlann bir nüfusa temsilcisi sonuçlarını gösterir. Biz bir çift iplikli bir mola oluşturmak için uyarılan edilmemiş olması olanlara bu tripanozomlann karşılaştırın. 1 akış-geçen manyetik aktive hücre sıralama kolondan toplanan un-uyar...

İn vitro olarak yetiştirilen Afrika tripanozomları, düşük bir oranda antijenik varyasyona uğrar, öyle ki popülasyonlar, baskın bir varyant yüzey glikoprotein (VSG) tipini ifade eden parazitlerden ve küçük bir "anahtarlamalı" varyant popülasyonundan oluşur. Bu protokol, bu popülasyonları tespit etmek ve ölçmek için hızlı bir yöntemi tanımlar.

Algılama<em&gt; Trypanosoma brucei</emManyetik Aktif Hücre Sorting ve Akış Sitometrisi ile&gt; Varyant Yüzey Glikoprotein Değiştirme

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Bu yöntemin genel amacı, belirli bir varyant yüzey glikoproteinini (VSG) eksprese eden tripsonomları popülasyonun geri kalanından izole etmek ve başlangıçtaki baskın VSG'den herhangi bir başka VSG'ye geçmiş parazitleri tanımlamaktır. Bu yöntem, bir parazit popülasyonunda VSG değişimini etkileyen faktörlerin veya olayların neler olduğu gibi tripsonom biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, daha önce yayınlanmış yöntemlerden daha hızlı olması ve değişim gösteren hücrelerin değişim göstermeyenlere oranının kolayca miktarlandırılmasına olanak tanımasıdır.Laboratuvar antijenik varyasyon üzerine çalışmaya başladığında, karşılaşılan ilk sorun nadir değişim gösteren hücrelerin nasıl tespit edileceğiydi. Bu tür bir problem, aslında yıllar önce immünolojide, belirli bir özellik açısından negatif olan hücreleri zenginleştirmek için manyetik aktivasyonlu hücre ayıklama yöntemi kullanılarak çözülmüştü. Seçim yapmama sürecini antijenik varyasyona uyarlamak, gerçekten gelecek vaat eden bir fikir gibi görünüyordu.Başlangıçta, Lister 427 suşu kan dolaşımı trypanosomları mililitre başına 0,5 ile 100.000 yoğunluğa ulaşana kadar büyütülmelidir. 50 × 10⁶ hücrelik bir örneği 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve ardından santrifüjleyin. Pozitif ve negatif antikor kontrolleri olarak daha sonra kullanılmak üzere 1 × 10⁶ hücre ve kültür saklayın.Tüpte yaklaşık 750 microliters kalacak şekilde süpernatantın çoğunu pipetle alın. Hücreleri 1.5 milliliters santrifüj tüpüne aktarın. Son olarak, hücreleri dört derece Celsius'ta, dört dakika boyunca 2800 times g hızında santrifüjleyin.Ardından tüm süpernatantı pipetle çekerek uzaklaştırın. Hücreleri, uygun dilüsyondaki primer anti varyant yüzey glikoprotein antikoru veya anti VSG eklenmiş 150 µL kültür ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücreleri 4 °C'de 10 dakika boyunca vorteksleyin.800 ila 1000 µL soğuk kültür ortamı ile yıkayın. Hücreleri 4 °C'de, 5200 ×g hızında dört dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı aspire ettikten sonra, hücreleri 1 mL kültür ortamı ile yıkayın ve tekrar santrifüjleyin.Süpernatantı uzaklaştırın ve pellet'i 100 µL kültür ortamında yeniden süspande edin. Birincil antikor için uygun tipteki 110 µL manyetik aktive hücre ayıklama mikroboncuklarını ekleyin. Pipetleme yaparak iyice karıştırın ve ardından vorteksleyin.Hücreler vorteksle karıştırılırken, manyetik aktivasyonlu bir ayırma kolonu hazırlayın. Hazırlama ortamını toplamak için kolonun altına 15 mililitrelik bir tüp yerleştirin. Kolonu hazırlamak için iki mililitre kültür ortamı ekleyin.Ardından, örneği vorteksten çıkarın ve 800 ila 1000 µL soğuk kültür ortamı ekleyin. Bağlanmamış antikorları uzaklaştırmak için örneği santrifüjleyin ve ardından süpernatantı alın. Çökeltilen hücreleri 1 mL kültür ortamı ile yıkayın ve tekrar santrifüjleyin.Bu kez süpernatantı aspire edin ancak tüpte 100 µL bırakın. Pelet tamamen resüspan olana kadar santrifüj tüpünü kuvvetlice sallayın. Bir mililitre kültür ortamı ekleyin ve hücreleri tamamen resüspande etmek için pipetle yukarı aşağı karıştırın.Hazırlama ortamını toplamak için kullanılan 15 milimetrelik konik tüpü çıkarın ve yerini, yer değiştirmiş parazitleri içeren akış sıvısını toplamak için yeni bir 15 mililitrelik konik tüp ile değiştirin. Hücre süspansiyonunu hazırlanmış kolona uygulayın. Akış sıvısını alttaki 15 mililitrelik bir tüpte toplayın; bu işlem bir mililitre ortam artı tripanozomlar için tipik olarak altı ila yedi dakika sürer.Ardından, kolonu bir mililitre kültür ortamı ile iki kez yıkayın ve geçiş sıvısını aynı tüpte toplayın. Toplamda yaklaşık üç mililitre olması gereken geçiş sıvısını iki adet 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne paylaştırın. Sonra tüpleri buza yerleştirin.Kolona üç mililitre kültür ortamı ekleyin ve kolonu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Bu işlemle başlangıçtaki dominant VSG'yi eksprese eden hücreler elde edilecektir. Elüye edilen bu materyalin 300 mikrolitresini alıp buz üzerinde saklayın, geri kalanı atılabilir.Pozitif kontrol oluşturmak için, başlangıç hücre kültüründen yaklaşık 100.000 hücre alıp bunları 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin. Negatif kontrol oluşturmak için bu işlemi tekrarlayın. Akış-geçiş (flow-through) örneklerini ve pozitif kontrol örneğini santrifüjleyin.Ardından süpernatantı uzaklaştırın ve atın. Pozitif kontrol hücrelerini, uygun dilüsyondaki primer florokrom işaretli anti VSG antikoru içeren 100 µL kültür ortamında yeniden süspande edin. Daha sonra, bir akış pelletini uygun dilüsyondaki primer florokrom işaretli anti VSG antikoru içeren 100 µL kültür ortamında yeniden süspande edin.Ardından, peleti ikinci akış tüpünde yeniden süspanse etmek için süspansiyonu kullanın; böylece tek bir havuz tüpü elde edilmiş olur. Pipetle aşağı yukarı çekerek iyice karıştırın. Hücreleri vorteksleyin ve ardından 800 ila 1000 µL soğuk kültür ortamı ekleyin.Bağlanmamış antikorları uzaklaştırmak için örnekleri 4 °C'de, 5200 ×g'de dört dakika boyunca santrifüj edin ve ardından süpernatanı atın. Hücreleri 1 mL kültür ortamı ile yıkayın, ardından hücreleri santrifüj edin. Pozitif ve negatif kontroller ile daha önce buz üzerinde saklanan elüye edilmiş hücreleri kullanın.Süpernatantı atın. Ardından, örneklere 148.5 µL kültür medyumu ekleyin. Sonrasında, 25 µL mutlak sayım boncuğu ve ardından 1.5 µL Propidium Iodide boyama çözeltisi ekleyin.Pozitif ve negatif kontrol peletlerini 175 µL kültür ortamı ile yeniden süspanse edin. Örnekler artık akış sitometresinde analiz edilebilir. Bu akış sitometrisi grafikleri, çift zincirli DNA kırılması oluşturması için indüklenmiş trypanosom popülasyonlarından ayrıştırılan hücrelerin, indüklenmemiş hücrelerle karşılaştırmalı sonuçlarını göstermektedir.Sol paneller, numuneye eklenen canlı ve ölü hücreler ile boncukların ayırt edilmesini sağlayan ileriye doğru saçılım (forward scatter) ile yan saçılımı (side scatter) göstermektedir. Daha sonra, bu unsurları saçılım özelliklerine göre belirleyen kapılar (gates) oluşturulabilir. Sağ paneller, yalnızca sol panellerde oluşturulan saçılım kapılarına göre canlı olarak sınıflandırılabilen hücreleri göstermektedir.Bu vakadaki baskın başlangıç VSG, VSG ikisiydi. Propidium Iodide ile pozitif boyanan hücreler ölü hücrelerdir. Bunlar, grafiğin Q bir ve Q iki bölgelerinde görülmektedir.Dominant VSG için pozitif ve PI için negatif boyanan hücreler Q üç bölgesine düşer ve kontaminanlardır. Son olarak, Q dört bölgesindeki hücreler, dominant VSG için negatif boyanan canlı hücrelerdir ve bunlar değiştiriciler (switchers) olarak kabul edilir. Bu grafik, indüklenmiş kırılmalar olan ve olmayan trypanosome popülasyonlarının hesaplanmış gözlenen değişim frekanslarını göstermektedir.In vitro ortamda stokastik geçiş düzeyi oldukça düşüktür. Bir kırılma indüklemek, baskın olmayan VSG'ye geçiş yapan hücre sayısında önemli bir artış sağlar. Bu teknik uzmanlaşıldığında, yaklaşık üç saat içinde gerçekleştirilebilir.bu prosedür uygulanırken, örneklerin işlem boyunca soğuk tutulması ve özellikle kolonda izolasyon öncesinde peletlerin yeterince resüspande edilmesi önemlidir. Bu prosedürün ardından, bir değişim popülasyonunda hangi VSG'lerin eksprese edildiği gibi ek soruları yanıtlamak için RNA dizileme gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Bu yöntem tipik olarak VSG değişimini ölçmek için kullanılsa da, ilgi duyulan herhangi bir yüzey proteinini eksprese eden parazitlerin izolasyonu ve nicelendirilmesi için de kullanılabilir.

detection-trypanosoma-brucei-variant-surface-glycoprotein-switching

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Manyetik modülasyon biyoalgı sistemi hızla DNA molekülleri ve proteinler gibi biyolojik testleri, hassas ve kolayca tespit etmek için kullanılmaktadır.

Biyolojik Tahliller Manyetik Modülasyon Biyoalgılayıcı Sistemi kullanarak hızlı Homojen Algılama

Beyin kan damarlarının gelen yapışık inflamatuar lökositlerin izolasyonu için bir...

Den Beyin sekestre Lökositler İzolasyonu ve Analizi<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-enfekte Fare

kırmızı kan hücrelerinin içinde sıtma paraziti girdiği, ve çoğaltır. Merozoit işgali ve parazitemya doğru değerlendirme sıtma enfeksiyonu seyrini değerlendirmede nedenle çok önemlidir. Burada sıtma bir fare modelinde bu parametrelerin ölçülmesi için tabanlı protokol sitometri akışı tarif eder.

Akış Cytometry tarafından Kemirgen Plasmodium parazitemi Vivo Değerlendirilmesi ve Merozoit Invasion

Bu el yazması, geç evre enfeksiyonun izlenmesini sağlamak için Afrika tripanozomlarının biyolüminesan bir suşunun kullanımını açıklar ve in vivo canlı görüntülemenin merkezi sinir sistemi içindeki enfeksiyonları gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için nasıl kullanılabileceğini gösterir.

Biyoparlaklık Görüntüleme Afrika Trypanosomiasis Geç Evre Enfeksiyon Algılama için

Bir proteine bir etiket eklemek, onun işlevi hakkında fikir edinmenin güçlü bir yoludur. Burada, yüzlerce Trypanosoma brucei proteinini paralel olarak endojen olarak etiketlemek için bir protokol açıklıyoruz, böylece genom ölçeği etiketlemesi elde edilebilir.

Yüksek verimli Gen Etiketleme içinde<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Virüsler veya hücre dışı veziküller, yüzey antijenlerini tanıyan antikorlara bağlı 15 nm manyetik nanopartiküller ile immüno-yakalandı. Yakalanan virionlar veya veziküller, diğer yüzey antijenlerine karşı floresan antikorlarla etiketlendi. Elde edilen kompleksler yüksek manyetik alanda ayrıldı ve floresan üzerinde tetiklenen geleneksel akış sitometreleri ile analiz edildi.

Virionlar antijenik Spectra ve ekstrasellüler veziküllerin Analiz Virometry Akış

Bu yöntem kan trypanosome ayrılma memeli kan hücreleri daha az negatif olmak onların yüzey şarj bağlı olarak değişir. Enfekte kan yerleştirilir ve bir anyon değiştirici sütun tedavi. Bu yöntem, en uygun teşhis için Afrika tripanozomiyasına, immünolojik, biyolojik, biyokimyasal, ilaç ve moleküler biyoloji İncelemeler için saflaştırılmış parazitler sağlar.

Afrika, anyon-değiştiriciler (Diethylaminoethyl-selüloz sütunlar) tarafından kandan da dahil olmak üzere hücre dışı Tripanozomlar arıtma

İnce Iğne aspirasyonu bir tekniktir, bu sayede hücreler ince bir iğne kullanarak bir lezyonun veya organdan elde edilir. Aspirated malzeme bulaşmış, lekelenmiş ve tanı için bir mikroskop altında incelenmiştir veya moleküler biyoloji, sitometri veya in vitro analiz için kullanılır. Ucuz, basit, hızlı ve minimal travma neden olur.

Ince Iğne aspirasyonu ile Ekstrasovasküler Trypanosoma parazitlerin tespiti

Bu protokolün genel amacı, plasmodium falciparum enfeksiyonuna doğal olarak maruz kalan bireylerin sera veya plazmasında bulunan antikorların kapasitesinin nasıl ölçüleceklerine, parazit enfekte eritrositlerin (IEs) fagositozunu opsonize etmek ve indüklemek tir.

Akış SitometriSi-Bazlı Bir Test ile Plasmodium falciparum Parazitlerine Doğal Olarak Edinilmiş Fagositoz-Indükleyen Antikorların Ölçülmesi

Dünya çapında tıbbi kan parazitleri, düşük kodlu bir yapay zeka platformunda basit adımlar kullanılarak otomatik olarak tarandı. Kan filmlerinin prospektif tanısı, hibrit bir derin öğrenme modelinde bir nesne algılama ve sınıflandırma yöntemi kullanılarak geliştirilmiştir. Aktif izleme ve iyi eğitilmiş modellerin işbirliği, tripanozom iletiminin sıcak noktalarının belirlenmesine yardımcı olur.

Hibrit bir derin öğrenme modeli kullanarak tripanozom parazitlerinin üstün otomatik tanımlanması

PH'ın, Afrika tripanozomlarının kan dolaşımı formunun glikozomlarındaki çevresel ipuçlarına nasıl tepki verdiğini incelemek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yaklaşım, pH dinamiklerini ölçmek için akış sitometrisi ile birlikte pH'a duyarlı kalıtsal bir protein sensörünü hem zaman seyri tahlili olarak hem de yüksek verimli bir ekran formatında içerir.

Canlı Trypanosoma brucei'de Dinamik Glikozomal pH Değişikliklerinin Ölçülmesi

Keşfedin, manyetik hücre ayırma ile Trypanosoma brucei'de VSG değiştirme varyantlarını izole etme ve nadir switcher'ları tespit etme yöntemini. Bu teknik, antijenik varyasyon çalışmalarını hızlandırır.

Algılama

Daha fazla video keşfet