Algılama Trypanosoma brucei Varyant Yüzey Glikoprotein Değiştirme

Bu yöntemin genel amacı, belirli bir varyant yüzey glikoproteinini veya VSG'yi eksprese eden tripanozomları popülasyonun geri kalanından izole etmek ve başlangıçtaki baskın VSG'den diğer herhangi bir VSG'ye geçen parazitleri tanımlamaktır. Bu yöntem, bir parazit popülasyonunda VSG geçişini etkileyen faktörler veya olaylar nelerdir gibi tripanozom biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, daha önce yayınlanmış yöntemlerden daha hızlı olması ve anahtarsız hücrelere geçişin kolay bir şekilde ölçülmesine izin vermesidir.

Laboratuvar antijenik varyasyon üzerinde çalışmaya başladığında, ilk sorun nadir anahtarlayıcıların nasıl tespit edileceğiydi. Bu tür bir problem aslında birkaç yıl önce immünolojide, belirli bir özellik için negatif olan hücreleri zenginleştirmek için manyetik olarak aktive edilmiş hücre sıralamasının kullanılmasıyla çözülmüştü. Seçilmeme sürecini antijenik varyasyona taşımak gerçekten umut verici bir fikir gibi görünüyordu.

Başlamak için, Lister 427 suşu kan dolaşımı tripanozomları mililitre başına 0.5 ila 100.000 yoğunluğa kadar büyütülmelidir. Altı hücreli numuneyi 50 kez 10 kez 15 mililitrelik bir tüpe indirin ve ardından santrifüjleyin. Daha sonra pozitif ve negatif antikor kontrolleri olarak kullanılmak üzere altı hücreye ve kültüre bir kez 10 tasarruf edin.

Tüpte yaklaşık 750 mikrolitre bırakarak süpernatantın çoğunu pipetleyin. Hücreleri 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Son olarak, hücreleri dört santigrat derecede 2800 kez g'de dört dakika santrifüjleyin.

Ve sonra tüm süpernatanı pipetleyin. Hücreleri 150 mikrolitre kültür ortamında, ayrıca uygun seyreltmede birincil anti varyant yüzey glikoprotein antikoru veya anti VSG'de yeniden süspanse edin. Ardından, hücreleri 10 dakika boyunca dört santigrat derecede girdaplayın.

800 ila 1000 mikrolitre soğuk kültür ortamı ile yıkayın. Hücreleri dört santigrat derecede 5200 kez g'de dört dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire ettikten sonra, hücreleri bir mililitre kültür ortamı ile yıkayın ve tekrar santrifüjleyin.

Süpernatanı çıkarın ve peleti 100 mikrolitre kültür ortamında yeniden süspanse edin. Primer antikor için uygun tipte 110 mikrolitre manyetik ile aktive edilmiş hücre sıralama mikroboncukları ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın ve ardından girdap yapın.

Hücreler girdap oluştururken, manyetik olarak aktive edilen bir ayırma sütunu oluşturun. Hazırlama ortamını toplamak için altına 15 mililitrelik bir tüp yerleştirin. Sütunu astarlamak için iki mililitre kültür ortamı ekleyin.

Daha sonra, numuneyi girdaptan çıkarın ve 800 ila 1000 mikrolitre soğuk kültür ortamı ekleyin. Numuneyi santrifüjleyin ve ardından bağlanmamış antikoru çıkarmak için süpernatanı çıkarın. Peletlenmiş hücreleri bir mililitre kültür ortamı ile yıkayın ve tekrar santrifüjleyin.

Bu sefer süpernatanı aspire edin, ancak tüpte 100 mikrolitre bırakın. Pelet tamamen yeniden askıya alınana kadar santrifüj tüpünü kuvvetlice hafifçe vurun. Bir mililitre kültür ortamı ekleyin ve hücreleri tamamen yeniden süspanse etmek için yukarı ve aşağı pipetleyin.

Hazırlama ortamını toplamak için kullanılan 15 milimetrelik konik boruyu çıkarın ve anahtarlanmış parazitleri içeren akışı toplamak için yeni bir 15 mililitrelik konik ile değiştirin. Hücre süspansiyonunu astarlanmış sütuna uygulayın. Akışı, aşağıda 15 mililitrelik bir tüpte toplayın, bu da bir mililitre orta artı tripanozom için tipik olarak altı ila yedi dakika sürer.

Daha sonra, sütunu bir mililitre kültür ortamı ile iki kez yıkayın ve akışı aynı tüpte toplayın. Toplamda kabaca üç mililitre olması gereken akışı iki adet 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne bölün. Ardından tüpleri buzun üzerine yerleştirin.

Kolona üç mililitre kültür ortamı ekleyin ve kolonu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne daldırın. Bu, başlangıç baskın VSG'yi ifade eden hücreleri elde edecektir. Bu ayrıştırılmış malzemeden 300 mikrolitre çıkarın ve buz üzerinde tutun, geri kalanı atılabilir.

Pozitif bir kontrol oluşturmak için, hücrelerin başlangıç kültüründen yaklaşık 100.000 hücre alın ve bunları 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin. Negatif bir kontrol oluşturmak için bunu yineleyin. Akış numunelerini ve pozitif kontrol numunesini santrifüjleyin.

Ve sonra süpernatanı çıkarın ve atın. Pozitif kontrol hücrelerini, uygun seyreltmede birincil florofor işaretli anti VSG antikoru ile 100 Mikrolitre kültür ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, uygun seyreltmede birincil florofor etiketli anti VSG antikoru ile 100 mikrolitre kültür ortamında bir akış peletini yeniden süspanse edin.

Daha sonra peleti ikinci akış borusunda yeniden süspanse etmek için süspansiyonu kullanın, bu da bir havuz borusu ile sonuçlanır. Yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Hücreleri vorteksleyin ve ardından 800 ila 1000 mikrolitre soğuk kültür ortamı ekleyin.

Numuneleri dört santigrat derecede 5200 kez g'de dört dakika santrifüjleyin ve ardından herhangi bir bağlanmamış antikoru çıkarmak için süpernatanı atın. Hücreleri bir mililitre kültür ortamı ile yıkayın, ardından hücreleri santrifüjleyin. Pozitif ve negatif kontroller ve daha önce buz üzerinde depolanan ayrıştırılmış hücreler.

Süpernatanı atın. Bundan sonra, numunelere 148,5 mikrolitre kültür ortamı ekleyin. Daha sonra, 25 mikrolitre mutlak sayma boncuğu ve ardından 1,5 mikrolitre Propidium İyodür boyama çözeltisi ekleyin.

Pozitif ve negatif kontrol peletlerini 175 mikrolitre kültür ortamı ile yeniden süspanse edin. Numuneler artık akış sitometresinde çalıştırılabilir. Bu akış sitometrisi grafikleri, indüklenmemiş hücrelere karşı çift sarmallı bir DNA kırılması oluşturmak için indüklenen tripanozom popülasyonlarından hücre ayrılmasının sonuçlarını gösterir.

Soldaki paneller, numuneye eklenen canlı ve ölü hücrelerin ve boncukların aydınlatılmasını sağlayan ileri ve yan saçılmayı gösterir. Daha sonra bunları saçılma özelliklerine göre belirleyen kapılar oluşturulabilir. Sağ taraftaki paneller, yalnızca sol taraftaki panellerde oluşturulan saçılma kapılarına dayalı olarak canlı olarak sınıflandırılabilecek hücreleri gösterir.

Bu durumda baskın başlangıç VSG'si VSG ikiydi. Propidium İyodür için pozitif lekelenen hücreler ölü hücrelerdir. Ve bunlar arsanın Q birinci ve Q iki bölgelerinde görülmektedir.

Baskın VSG için pozitif, PI için negatif boyanan hücreler Q üç bölgesine girer ve kirleticidir. Son olarak, Q dörtteki hücreler, değiştirici olarak kabul edilen baskın VSG için negatif olarak boyanan canlı hücrelerdir. Bu grafik, indüklenmiş kırılmalar olmadan ve olmadan tripanozom popülasyonlarının hesaplanan gözlemlenen anahtarlama frekanslarını göstermektedir.

Stokastik anahtarlama seviyesi in vitro olarak oldukça düşüktür. Bir kırılmayı indüklerken, önemli ölçüde daha fazla hücre ile sonuçlanır ve baskın olmayan VSG'ye geçer. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik yaklaşık üç saat içinde gerçekleştirilebilir.

Bu prosedürü denerken, numuneleri baştan sona soğuk tutmak ve özellikle kolon üzerinde izolasyondan önce peletleri yeterince yeniden süspanse etmek önemlidir. Bu prosedürü takiben, RNA dizilimi gibi diğer yöntemler, bir anahtar popülasyonunda hangi VSG'lerin ifade edildiği gibi ek soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu yöntem tipik olarak VSG anahtarlamasını ölçmek için kullanılır, ayrıca ilgilenilen herhangi bir yüzey proteinini ifade eden parazitlerin izolasyonu ve miktarının belirlenmesi için de kullanılabilir.