Stresli bitkilerden izole edilen kloroplastlarda içine Protein İthalat analizi

Bu metodolojinin genel amacı, stresin etkilerine özel olarak odaklanarak, çekirdek kodlu proteinlerin kloroplastlara aktarılmasını incelemektir. Bu yöntem, kloroplast proteini ithalatının nasıl düzenlendiği gibi kloroplast alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin özel bir avantajı, stresin kloroplast proteini ithalatı üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesine izin vermesidir.

Bu yöntem, model bitki Arabidopsis thaliana ile kullanılmak üzere geliştirilmiş olsa da, mahsul bitkileri gibi diğer sistemlerle kullanım için değiştirilebilir ve uyarlanabilir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir doktora sonrası araştırmacı olan Qihua Ling olacak. Başlamak için, önce Arabidopsis bitkilerini ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi büyütün.

Daha sonra bitkiler sekiz günlük olduğunda, bir stres tedavisi yapın. Bitkileri agar plakasından elle nazikçe kazıyın ve stres etkeni içeren sterilize edilmiş bir sıvı MS ortamı şişesine yerleştirin. Deneyin niteliğine bağlı olarak, kontrol olarak stres etkeni olmadan benzer bir şişeye ek bitkilerin yerleştirilmesi de gerekli olabilir.

Şişelerin ağzını sterilize edilmiş folyo ile kapatın ve bitkilerin hafifçe çalkalayarak bir orbital çalkalayıcı üzerinde iki gün daha büyümesine izin verin. Önce 13 mililitre Percoll, 13 mililitre iki x kloroplast izolasyon tamponu ve beş miligram glutatyonu 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde karıştırarak sürekli bir yoğunluk gradyanı hazırlayın. Sonra karışımı santrifüjleyin.

Santrifüjlemeden sonra, gradyanı bozmamak için tüpü dikkatli bir şekilde tutun ve daha sonra kullanmak üzere buz üzerinde tutun. Daha sonra, koşul başına 100 mililitre kloroplast izolasyon tamponunu bir litrelik bir behere aktarın. Fideleri bir elek içine çevirerek sıvı ortamdan çıkarın.

Daha sonra bunları kloroplast izolasyon tamponu içeren behere aktarın. Kalıntı ortamı çıkarmak için dokuyu tamponla durulayın ve ardından tamponu 100 mililitre taze izolasyon tamponu ile değiştirin. İlk homojenizasyon turu için, bitki dokusunu elinizle 50 mililitrelik bir behere aktarın ve önceki tamponun parmaklarınızdan akmasına izin verin.

Daha sonra doku homojenizatörünün probunu dokuya yerleştirin ve her biri bir ila iki saniyelik iki darbeyle homojenize edin. Homojenatı iki kat filtrasyon bezinden 250 mililitrelik bir santrifüj tüpüne süzün. Bezi hafifçe sıkarak bitirin.

Süzüntüyü saklayın ve bitki dokusunu 50 mililitrelik behere geri aktarın. Daha sonra 50 mililitrelik kabın içine ikinci bir 20 mililitre kloroplast izolasyon tamponu yerleştirin ve ilk homojenizasyon turunda kullanılmayan kalan dokuları ekleyin. Homojenizasyon ve filtrasyon adımlarını dört kez daha tekrarlayın.

Havuzlanmış homojenatı dört santigrat derecede beş dakika boyunca 1.000 kez g'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden hemen sonra süpernatanı dökün ve peleti rahatsız etmemeye dikkat edin. Tüpü buzun üzerine yerleştirin ve tüpü hafifçe çalkalayarak peleti kalan süpernatan içinde yeniden süspanse edin.

Ardından, homojenatı alıcı tüpün duvarı aracılığıyla önceden hazırlanmış sürekli yoğunluk gradyanının üstüne nazikçe aktarmak için bir Pasteur pipeti kullanın. Daha sonra numuneyi ve gradyanı, fren kapalıyken dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 7.800 kez g'de sallanan bir kova rotorunda santrifüjleyin. Bitirdiğinizde, gradyanda görülebilen iki yeşil bandı gözlemleyin.

Kırık kloroplast içeren üst bandı atın ve sağlam kloroplast içeren alt bandı 50 mililitrelik yeni bir santrifüj tüpüne aktarmak için bir Pasteur pipeti kullanın. Daha sonra, tüpe 25 mililitre HMS tamponu ekleyin ve Percoll'u kloroplastlardan yıkamak için tüpü iki kez ters çevirin. Ardından tüpü sallanan kova rotoruna geri yerleştirin ve kloroplastları yeniden sürün.

Süpernatanı dökün ve tüpü buz üzerinde hafifçe çalkalayarak peleti artık tamponda yeniden süspanse edin. Gerekirse 100 ila 300 mikrolitre daha HMS tamponu ekleyin, ancak numuneyi çok fazla seyreltmemeye çalışın. Yeniden askıya alınan kloroplastları buz üzerinde saklayın.

1,5 mililitrelik bir tüpte 495 mikrolitre HMS tamponuna izole edilmiş kloroplastlardan beş mikrolitre ekleyerek başlayın. Çözeltiyi nazikçe karıştırmak için tüpü ters çevirin. Daha sonra bir hemasitometrenin sayma odasının üzerine bir kapak camı yerleştirin.

Seyreltilmiş kloroplast süspansiyonunun 40 ila 60 mikrolitresini kapak camı ile sayma haznesi arasındaki boşluğa yavaşça pipetleyin. Bir faz kontrast mikroskobu kullanarak, kloroplastları 20x objektifle görüntüleyin. Sağlam kloroplastlar yuvarlak ve parlak görünür ve bir ışık halesi ile çevrilidir.

Ardından, 10 büyük karedeki kloroplast sayısına 10x hedefini kullanın. Büyük kare başına düşen kloroplast sayısı ortalama 10 ile 30 arasında olmalıdır. Çok az veya çok fazla kloroplast varsa, seyreltme faktörünü ayarlayın ve işlemi tekrarlayın.

Uygun aralığa girdikten sonra, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi mililitre başına kloroplast sayısını hesaplayın. Üç zaman noktasına sahip bir zaman rotası çalıştırmak için, her biri 130 mikrolitrelik bir içe aktarma durdurma tamponu içeren üç tüp hazırlayın ve bunları buz üzerinde bırakın. İki mililitrelik bir tüpte, reaksiyon tamponu ve radyo işaretli öncü proteini içeren ithalat reaksiyonunu hazırlayın.

Test edilecek her koşul için bir reaksiyon olması gerektiğini unutmayın. Zaman noktası başına yaklaşık 10 milyon kloroplast kullanın. Reaksiyon tüpünü 25 santigrat derecede sınırlı miktarda ışık altında bir su banyosunda inkübe edin.

Kloroplastları yeniden süspanse etmek için ara sıra tüpleri hafifçe vurun. Doğrusal ithalat aralığı içinde gerekli zaman noktalarında reaksiyondan 130 mililitre alikot ile bir zaman seyri yürütmek. Çekildikten hemen sonra, her 130 mikrolitrelik alikotu, tüpe hafifçe vurarak karıştırılmış bir buz gibi soğuk ithalat durdurma tamponu tüpüne aktarın ve zaman seyri tamamlanana kadar tüpleri buzun üzerine yerleştirin.

Son numune çıkarıldıktan sonra, tüm numuneleri bir Mikrofüjde 12.000 kez g'de 30 saniye boyunca santrifüjleyin. Ardından, süpernatanları atın ve peletleri 15 mikrolitre iki x protein yükleme tamponunda yeniden süspanse edin. Daha sonra örnekleri girdaplama ile karıştırın.

Son olarak, standart SDS-PAGE ve otoradyografi, florografi veya fosforgörüntüleme kullanarak tüm numuneleri ve bir öncü giriş kontrolünü analiz edin. PsaD, 23 kilodalton'un daha büyük bir öncüsü olarak sentezlenen fotosistem I'in 18 kilodaltonluk bir bileşenidir. Olgun 18 kilodalton formuna işleme, kloroplastlara ithalatın gerçekleştiğini gösterir.

Burada incelenen Arabidopsis'in sp1 mutantı, kloroplast proteini ithalat mekanizmasının önemli bir düzenleyicisi olan sp1 proteininde bir kusur taşır. Stres koşulları altında, sp1 mutant kloroplastlara PsaD proteini ithalat miktarı, vahşi tipe göre artar, ancak normal stresli olmayan koşullar altında değildir. PsaD'nin olgun protein formu, her iki bitki genotipinden kloroplastlarla zamana bağlı bir şekilde biriktirilirken, sp1 mutant kloroplastlar için ithalat oranı, vahşi tip kloroplastlara göre önemli ölçüde daha yüksekti.

Bu sonuçlar, stres koşulları altında kloroplast proteini ithalatını düzenlemede sp1 proteini için önemli bir rol olduğunu göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, kloroplast izolasyonundan içe aktarma testinin tamamlanmasına kadar olan bu yöntem, uygun şekilde gerçekleştirilirse beş ila altı saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, kloroplastların maksimum aktiviteyi korumasını sağlamak için tüm kloroplast izolasyon adımlarını dört santigrat derecede gerçekleştirmeyi unutmamak önemlidir.

Birkaç on yıl önce ilk geliştirilmesinden sonra, in vitro kloroplast protein ithalat testi, bu alandaki araştırmacıların kloroplast proteini ithalat mekanizmasının birçok farklı yönünü keşfetmelerinin yolunu açtı. Burada sunulan arıtma, stres koşullarının protein ithalatı üzerindeki etkilerinin araştırılmasını sağlar. Radyoaktif maddelerle çalışmanın özel dikkat gerektirdiğini unutmayın.

Bu işlem yapılırken eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük gibi önlemler her zaman alınmalıdır.