Name: Stresli bitkilerden izole edilen kloroplastlarda içine Protein İthalat analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Öğrenin, stresli bitkilerden izole edilen kloroplastlara protein ithalatını nasıl analiz edeceğinizi. Arabidopsis thaliana kullanarak kloroplast biyolojisi ve stres yanıtlarını araştırmak için bu hızlı yöntemi keşfedin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi PJ bir hibe ile desteklenmiştir (BBSRC; ref hibe BB / K018442 / 1.).

1. Arabidopsis Bitkilerin Büyüme ve Stres Tedavisi <ol><li> 1 L iyondan arındırılmış su kadar MS temel tuz karışımı içinde 4.3 g, 10 g sakroz, 0.5 g 2- (N-morfolino) etan sülfonik asit (MES) eklenerek Murashige ve Skoog (MS) ortamı 1 L hazırlanmakta ve ayarlamak potasyum hidroksit ile pH&#39;ı 5.7&#39;ye (KOH). 120 ° C de 20 dakika süreyle phytoagar ve otoklav 6 g ekleyin. <ol><li> katılaşma önce, (- plaka başına 25 ml MS ortamı 20 ile çapı 9 cm, yükseklik 1.5 cm) yuvarlak Petri kapları içine orta dökün. Plakalar kapakları kapatmadan önce bir laminer akış kaputu 1 ~ için h kurumaya bırakın. </li></ol></li><li> % 70 1 ml% 0.02 (h / h) Triton X-100 ihtiva eden ve sürekli, 5-10 dakika boyunca çalkalama (h / h) etanol ilave yüzey sterilizasyonu için 1.5 ml bir test tüpüne, Arabidopsis thaliana tohumları yerleştirin. 150 fidan - Her genotip / durum için, 10 Petri plakaları her taşıyan ~ 100 hazırlar. </li><li> Tohumlar yerleşmek kadar yaklaşık 10 saniye bekleyinDaha sonra tüpün alt ve pipetleme süpernatant atın. % 100 etanol 1 mL ekleyin ve 10 dakika için daha tüp çalkalayın. </li><li> tohumlar sterilize ederken laminer akış kaputu hazırlayın. , Örnek başına filtre kağıdı tek parça almak ekim kolaylaştırmak için ikiye katlayın ve kaputu% 100 etanol içinde ıslatın. tamamen kurur kadar bekleyin. daha hızlı bir şekilde,% 70 etanol daha buharlaştıkça yani% 100 etanol kullanılır edin. </li><li> İnce ucundan 1 ml pipet kesim ~ 5 mm kullanarak pipetleme filtre kağıdı üzerine tohum aktarın. 15 dk - onları yaklaşık 10 almalı, hangi kurumaya bırakın. </li><li> Her MS ortamı Petri plaka üzerine eşit 150 sterilize tohumları ve cerrahi bant ile her plaka mühür - ~ 100 Sow. </li><li> teşvik ve çimlenmesini senkronize 4 d - ters 2 4 ° C&#39;de plakaları saklayın. Eski tohumlar 4 ° C&#39;de (bir hafta kadar) daha uzun kalmak gerekebilir. </li><li> bir bitki doku kültürü odasına plakaları aktarın ve baş yukarı bırakın.Uzun gün döngüsü altında 8 gün boyunca bitkiler büyümek (16 saat 100 ľmol · m - 2 · s - 1 ışık, 8 saat karanlık) 20 ° C&#39;de. </li><li> Bitkiler akış kaputu, 8 d eski stres tedavisi için, hafifçe stres içeren sıvı MS ortamında bir sterilize balona, etanol sterilize eldiven giyen elle onları kazıma, agar ortamı aktarabilirsiniz (örneğin 200 mM mannit). agar ortamı üzerinde taşıyan kaçının. steril folyo ile şişe ağzı kapatılır ve bitkiler hafifçe çalkalanarak (-100 rpm) ile orbital bir karıştırıcı üzerinde ek 2 gün boyunca adım 1.8 ile aynı koşullar altında büyümeye olanak sağlar. </li></ol> 2. in vitro transkripsiyon ile öncü proteinin yapma / yaptı Not: Bu protokol, şablon / preprotein olarak D öncüsü (pPsaD) kompleksi Arabidopsis fotosistem kullanımını varsaymaktadır, ancak yöntem diğerleri ile uyumludur. <ol&gt; <li> PBluescript II SK vektör (veya akış yukarı T7 promoteri ile benzer başka vektör) 13 çoklu klonlama bölgesinin (MCS) içerisine pPsaD kodlama dizisi (CDS) klonlama. DNA izolasyon kiti kullanılarak plazmid (pBSK-pPsaD) saflaştınlır ve DNA dizilimi yolu ile sekansının doğrulanması. NOT: Tüm bu adımlar, standart moleküler klonlama teknikleri kullanır. </li><li> 260 nm&#39;de absorbans ölçümü için ayarlanmış bir spektrofotometre kullanılarak pBSK-pPsaD plazmit DNA konsantrasyonunun belirlenmesi. 10 ng / ml bir son konsantrasyona kadar plazmid seyreltilir. </li><li> şablon olarak seyreltildi plasmidi kullanılarak (35 çevrim için) 20 uL PCR çalışması. 2 ul 10 x polimeraz tamponu, 2 uL 2mM dNTP, 1 uL 5 mM M13 ileri primeri (5&#39;-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3 &#39;), 1 uL 5 mM M13 ters primeri (5: aşağıdaki reaksiyon hazırlanması &#39;-CAG GAA ACA-3 ACC GCT ATG&#39;), 1 uL pBSK-pPsaD plazmid, 1 U Taq polimeraz ve damıtılmış su ile seyreltilir kadar toplam reaksiyon hacmi oluşturmak için20 uL. aşağıdaki gibi standart bir PCR programı kullanarak: 95 ° C, 5 dak; [95 ° C, 30 saniye 35 döngü; 56 ° C, 30 saniye; 72 ° C, 30 saniye); ve 72 ° C, 5 dakika. </li><li> TAE tamponu (Tris-HCI, pH 7.6, 20 mM asetik asit, 1 mM EDTA) içinde agaroz jeli cDNA doğru amplifikasyon kontrol ve ilgili ölçmek için (ağ / hac),% 1 üzerinde PCR ürünün 5 uL başlat standartlara bant göreli konsantrasyonunu onaylayın. diğer uygulamalar için -20 ° C &#39;de, ürünün geri kalan saklayın. </li><li> Aşağıdaki gibi PCR DNA ile uyumlu olan bir tavşan retikülosit lizat göre hücresiz transkripsiyon / translasyon sistemi kullanılarak 50 ml&#39;lik bir reaksiyon hazırlanması: 40 uL retikülosit lizatı transkripsiyon / translasyon sistemi, 2.5 uL radyo işaretli [35S] metionin, 11 uCi / ml (spesifik aktivite:&gt; 1000 Ci / mmol), 2.5 uL steril damıtılmış su ve 5 uL pPsaD PCR ürünü (100-800 ng). Dikkat: eldiven, laboratuvar giysi ve emniyet glas Wearses radyoaktif madde taşırken. Monitör ve çalışma yüzeyi ve araçlarını temizlemek. onaylı bir atık konteynerine tüm radyoaktif atık bertaraf edin. </li><li> 30 ° C su banyosu içinde 90 dakika boyunca reaksiyon inkübe edin. Buz üzerinde numunesinin ederek reaksiyonu durdurun. </li><li> otoradyografi, florografi ya da fosfor görüntüleme ardından standart sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) üzerine doğrulaması için bir test örneği olarak reaksiyon (aynı hacmi de aşama 5.7 için bir giriş kontrol olarak hizmet görebilir) 1 uL çıkarın. İyi bir sonuç pPsaD (~ 23 kD) molekül ağırlığına karşılık gelen bir tat ve güçlü bant gözlem ile gösterilir. diğer uygulamalar için, -80 ° C&#39;de reaksiyon kalan saklayın. </li></ol> 3. Kloroplast İzolasyon <ol><li> Aşağıdaki stok çözümler hazırlayın: <ol><li> 0.6 M sorbitol, 10 mM magnezyum klorür: Kloroplast izolasyon tamponunda (CIB, 2x) hazırlanması(MgCI2), 10 mM etilen glikol tetraasetik asit (EGTA), 10 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 20 mM sodyum bikarbonat (NaHCO3), 40 mM 4- (2-hidroksietil) piperazin-1-etansülfonik asit (HEPES) ; KOH ile pH 8.0 olacak şekilde ayarlanır. 2x CIB 2 L hazırlayın alikotları yapmak ve uzun süreli depolama için -20 ° C&#39;de muhafaza edin, ya da kısa süreli depolama için 4 ° C&#39;de. damıtılmış su ile 1;: 1x CIB ettirmek için, 2x CIB 1 seyreltin Bu kloroplast yalıtım deney gününde taze olarak hazırlanabilir. </li><li> HEPES-MgSO 4 sorbit tamponu (HMS, 1 x) hazırlanması: 50 mM HEPES, 3 mM magnezyum sülfat (MgSO ^ 4), 0.3 M sorbitol; Sodyum hidroksit (NaOH) ile pH 8.0 olacak şekilde ayarlanır. , 400 mL kadar tamponu hazırlayın alikotları yapmak ve uzun süreli depolama için -20 ° C&#39;de muhafaza edin, ya da kısa süreli depolama için 4 ° C&#39;de. </li></ol></li><li> soğuk oda veya buz üzerinde aşağıdaki prosedürleri yürütün. st önce çözümler, gereç, ekipman ve rotor tüm ön soğutmaArting. </li><li> 13 mL Percoll, 13 mL 2x CIB tamponu ve 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü içinde 5 mg glutatyon karıştırılması ve 4 ° C&#39;de 30 dakika (fren kapalı) için 43,000 x g&#39;de karışım santrifüj ile sürekli bir yoğunluk gradyanı hazırlayın. Santrifüj işleminden sonra, degrade rahatsız etmemek ve daha sonra kullanmak üzere buz üzerinde tutmak için dikkatle tüp kolu. </li><li> 1 L&#39;lik bir behere genotip / durum başına 1 x CIB 100 mL aktarın. <ol><li> bir elek içine devrilme sıvı ortamdan fidan kaldırmak ve başka CIB içeren beher içine aktarabilirsiniz; Daha sonra, taze CIB 100 mL ile değiştirmeden önce herhangi bir kalıntı sıvı ortam kaldırmak için CIB ile doku durulayın. </li></ol></li><li> homojenizasyon için, 50 ml beher düzenlenen taze CIB 20 mL kullanarak yuvarlak homojenizasyon beş ardışık tur, her numune başına 100 mL 1x CIB toplam kullanın. <ol><li> homojenizasyon ilk turu için, izin elle 50 ml beher içine bitki doku transferiBir önceki tutma tampon parmaklarının arasından boşaltmak için. ilk turda dokusunun en kullanmaya çalışın, ama tamponu ile batırılır emin olun; Bu mümkün değilse, ikinci turda kalan kullanılmamış dokuyu tanıtmak. </li></ol></li><li> doku içine doku homojenleştirici duyargasını ve 1 iki darbeleri ile homojenize - 2 sn her. yumuşak bir sıkarak 250 mL&#39;lik santrifüj tüpü içine filtre bezi iki katmanı boyunca Homojenat filtre. süzüntü saklayın ve 50 ml beher geri doku aktarın. </li><li> homojenizasyon ilk turunda kullanılmayan kalan doku ekleyerek, 50 ml beher içine ikinci bir 20 mL CIB kısım yerleştirin ve homojenizasyon ve filtrasyon adımları tekrarlayın. Bu nedenle, tekrar CIB 100 ml (yani, 5 20 mL alikotları), ve elde edilen süzüntüler bir araya kullanıldıktan tüm kadar 3.5 ve 3.6 adımları tekrarlayın. </li><li> Santrifüj 4 ° C&#39;de 5 dakika (fren) için 1000 x g&#39;de toplanmış Homojenat ve kapalı dökünsüpernatant hemen pelet rahatsız etmemek için özen, santrifüj tamamlanmasını takiben. yavaşça buz tüpü çalkalayarak tüp içinde kalan kalıntı süpernatant pelletini. pipetle veya vorteks kuvvetlice tekrar süspansiyon yok. </li><li> Yavaşça alıcı borunun çeperi yoluyla uygulamak için bir Pasteur pipeti kullanılarak, önceden hazırlanmış sürekli yoğunluk gradyanı üst kısmına Homojenat aktarın. degrade rahatsız etmemek. 4 ° C&#39;de 10 dakika (fren kapalı) için 7800 x g&#39;de bir sallanan kepçeli rotor santrifüjleyin. Alt bant sağlam kloroplast içerir ve üst bant kırık kloroplast içerir: İki yeşil bantlar santrifüj sonra degrade görülebilir: NOT. </li><li> pipetleme En bant atın, sonra gradyanı başına 8 mL&#39;lik bir hacmi koruyarak, yeni bir 50 mL santrifüj tüpüne Pasteur pipeti ile alt bant aktarın. </li><li> t ~ 1x HMS 25 ml tüp içine tampon ekleyin ve iki kez tüp terso kloroplastlar gelen Percoll yıkayın. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca (fren) için 1000 x g&#39;de sallanan kovalı rotor ve santrifüj içinde tekrar tüp yerleştirin. </li><li> Süpernatantı dökün ve dikkatlice yavaşça buz tüpü çalkalayarak tüp içinde kalan artık HMS kloroplast pelletini. (Pelet boyutu ve Bölüm 4&#39;te sayma dayanarak) gerekirse HMS 300 uL, ama çok fazla örneği sulandırmak için değil deneyin - ek bir 100 ekleyin. <ol><li> buz üzerinde kloroplast tutun. kloroplastlar, aşağı uygulamalar için kullanılır önce her zaman onları tekrar süspansiyon tüp sallayın. Her zaman kloroplast aktarmak için (büyütülmüş gözenek) ile bir kesim pipet kullanın. </li></ol></li></ol> Kloroplast Verim ve Bozulmamışlık 4. Analizi <ol><li> 1.5 ml tüp içinde 495 uL 1x HMS tamponuna izole kloroplastların 5 mcL ekleyin ve sonra 1 elde etmek için tersini tüp hafifçe karıştırın: 100 seyreltme. </li><li> Plahaemositometre sayma odasının üstüne bir kapak camı ce. Yavaşça pipet ~ 40 - kapak cam ve sayım odasına arasındaki boşluğa seyreltilmiş kloroplast süspansiyonu 60 ul. 10X veya 20X amacı ile bir faz-kontrast mikroskop kullanarak, bozulmamış kloroplastlar yuvarlak ve parlak görünmesini ve ışık halesi ile çevrilidir. NOT: Mikroskop altında, 25 büyük meydanlar, sayma odasının merkezinde her biri 16 küçük kareler ile 1 mm 2 sayma alanı yoktur. </li><li> 10 büyük kareler kloroplastlar sayısını. çok az veya çok fazla kloroplast varsa, buna göre seyreltme faktörü (yukarıdaki adım 4.1) ayarlayabilir ve prosedürü tekrarlayın 10 ila 30 büyük kare başına kloroplastların sayısı ortalama gerekir. </li><li> aşağıdaki gibi mL (konsantrasyon) başına kloroplastların sayısını hesaplayın: n (Adım 4.3 hesaplanan büyük kare başına kloroplastların ortalama sayısı), büyük kareler 25 (toplam sayısını ×) 100 (seyreltme faktörü) x 25 kareler üzerinde hacmi 0.1 mm3 olduğu), 1 mL başına veri ifade 10 4 (ölçekleme faktörü ×. </li><li> Adım 3.12 &#39;de elde edilen kloroplast süspansiyon hacimce konsantrasyonu çarpılarak kloroplast gerçek verimini hesaplayın. Normal olarak, birden fazla 50 x 10 6 kloroplast elde edilebilir. </li></ol> 5. Kloroplast Protein İthalat <ol><li> Aşağıdaki stok çözümler hazırlayın: <ol><li> 10x HMS tamponu hazırlayın: 500 mM HEPES, 30 mM MgSO 4 ve 3.0 M sorbitol; NaOH ile pH&#39;ı 8.0&#39;a ayarlayın. uzun süreli depolama için -20 ° C&#39;da, bu tampon, kısım ve mağaza 50 mL hazırlanması ve kısa süreli depolama boyunca 4 ° C &#39;de. </li><li> 1x HMS tampon içinde çözünmüş 50 mM EDTA: İthalat durdurma tamponu hazırlayın. -20 ° C&#39;de bu tampon, kısım ve mağaza 50 mL hazırlayın. </li><li> (60 w mM Tris-HCl, pH 6.8,% 10 (h / h) gliserol,% 2: 2x protein yükleme tamponu hazırlayın/ H) SDS,% 0.005 (ağ / hac) bromofenol mavisi. 4 ° C&#39;de 50 mL, ve mağaza sağlayın. Kullanımdan hemen önce, tampon 900 uL 1 M, 1,4-ditiyotreitol (DTT), 100 uL ilave edin. </li></ol></li><li> 3 zaman noktaları ile bir zaman ders çalıştırmak 3 tüpleri ithal durdurma tamponu 130 mcL kısım içeren her hazırlamak ve buz üzerinde bunları bırakın. (Genotip / durum başına) 2 ml tüp içinde 450 uL ithalat reaksiyonu hazırlayın. kullanımdan hemen önce tüm malzemeyi çözülme. <ol><li> Bir içe reaksiyonu için tipik bir uL hacim içinde 10 x 10 6 kloroplast kullanımı; Örneğin kloroplast konsantrasyonu 2.5 x 10 8 ug / ml 40 uL kloroplast süspansiyonu kullanmak faydalı olacaktır. Üç zaman noktaları 3 × A uL gerekir (yani, bizim örneğimizde 120 uL). </li><li> Aşağıdaki sırayla, buz üzerinde reaksiyonlar bileşenleri karıştırmak: damıtılmış su (toplam hacim 600 uL yapmak için), B uL 10x HMS tamponu (B = [600-3 x A] / 10, yani, 48 bizim örneğimizde), 12 uL1 M glukonik asit (potasyum tuzu), 6 uL 1 M NaHCO 3, 6 uL% 20 BSA, 30 uL 100 mM adenozin 5&#39;-trifosfat, magnezyum tuzu (MgATP), 24 uL 250 mM metionin (a / h) (radyoaktif olmayan ) ve 30 uL protein öncüsünün. Hemen ithalat reaksiyonu başlamadan önce, 3 × kloroplast bir uL ekleyin ve tüp hafifçe dokunarak karıştırın. </li></ol></li><li> 2 · s - 1 - ışık 100 umol · m altında bir su banyosu içinde 25 ° C &#39;de, reaksiyon tüpü inkübe edin. Bazen kloroplast tekrar süspansiyon tüpler hafifçe vurun. </li><li> Zamana karşı yapmak için, pPsaD için ~ 12 dakika (4, 8 ve 12 dakikalık zaman noktalarında uygun kadar olan içe doğrusal aralığı içinde gerekli zaman noktalarında reaksiyonundan 130 uL&#39;lik geri bu durumda). Lineer aralığı süresi farklı proteinler 14 değişebilir. Nedenle, t optimize etmek için daha önce her bir de ön test etmek için önerilmektedirO zaman puan. </li><li> Hemen geri çekilmesi üzerine, buz gibi soğuk ithal durdurma tamponu bir tüp her 130 uL kısım aktarmak tüp hafifçe dokunarak karıştırın ve zaman ders tamamlanana kadar buz üzerinde tüm tüpleri korumak. </li><li> Santrifüj bir mikrofüj içinde 12,000 x g &#39;de 30 saat boyunca tüm örnekler, pipetleme süpernatantlar atmak ve pelet tekrar vorteks yoluyla 15 ul 2x protein yükleme tamponu. </li><li> Tüm örnekler artı standart SDS-PAGE ve otoradyografi, florografi ya da fosfor görüntüleme 15 ile pPsaD giriş kontrolü (adım 2.7, her ithalat reaksiyonuna ilave miktarın% 10&#39;u kadar pPsaD eşdeğer içeren) analiz. Sonuçları ölçmek ve analiz etmek için görüntü analiz yazılımı kullanın. içe verimliliği bir gösterge sağlamak için, farklı genotipler ithal protein miktarı / koşullar Her bir olgun bant ile bağlantılı radyoaktivite ölçümü ile değerlendirilebilir. </li></ol>

<ol><li>Jarvis, P., Lòpez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14 (12), 787-802 (2013).</li>
<li>Saibo, N. J., Lourenco, T., Oliveira, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+and+regulation+of+photosynthetic+and+related+metabolism+under+environmental+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Bot%22%5BJournal%5D)">Transcription factors and regulation of photosynthetic and related metabolism under environmental stresses.</a> Ann. Bot. 103 (4), 609-623 (2009).</li>
<li>Ling, Q., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chloroplast+protein+import+by+the+ubiquitin+E3+ligase+SP1+is+important+for+stress+tolerance+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of chloroplast protein import by the ubiquitin E3 ligase SP1 is important for stress tolerance in plants.</a> Curr Biol. 25 (19), 2527-2534 (2015).</li>
<li>Chua, N. H., Schmidt, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+synthesis%2C+transport%2C+and+assembly+of+ribulose+1%2C5-bisphosphate+carboxylase+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">In vitro synthesis, transport, and assembly of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase subunits.</a> Basic Life Sci. 11, 325-347 (1978).</li>
<li>Highfield, P. E., Ellis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+transport+of+the+small+subunit+of+chloroplast+ribulose+bisphosphate+carboxylase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synthesis and transport of the small subunit of chloroplast ribulose bisphosphate carboxylase.</a> Nature. 271, 420-424 (1978).</li>
<li>Aronsson, H., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+isolating+import-competent+Arabidopsis+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">A simple method for isolating import-competent Arabidopsis chloroplasts.</a> FEBS Lett. 529 (2-3), 215-220 (2002).</li>
<li>Froehlich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+Arabidopsis+envelope+protein+localization+and+topology+using+thermolysin+and+trypsin+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying Arabidopsis envelope protein localization and topology using thermolysin and trypsin proteases.</a> Methods Mol Biol. 774, 351-367 (2011).</li>
<li>Flores-Pérez, Ú, Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+suborganellar+fractionation+of+Arabidopsis+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and suborganellar fractionation of Arabidopsis chloroplasts.</a> Methods Mol. Biol. 1511, 45-60 (2017).</li>
<li>Kubis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+ppi1+mutant+is+specifically+defective+in+the+expression+chloroplast+import%2C+and+accumulation+of+photosynthetic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis ppi1 mutant is specifically defective in the expression chloroplast import, and accumulation of photosynthetic proteins.</a> Plant Cell. 15 (8), 1859-1871 (2003).</li>
<li>Kubis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+specialization+amongst+the+Arabidopsis+Toc159+family+of+chloroplast+protein+import+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional specialization amongst the Arabidopsis Toc159 family of chloroplast protein import receptors.</a> Plant Cell. 16 (8), 2059-2077 (2003).</li>
<li>Aronsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+binding+and+dimerization+at+the+chloroplast+pre-protein+import+receptor%2C+atToc33%2C+are+not+essential+in+vivo+but+do+increase+import+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Nucleotide binding and dimerization at the chloroplast pre-protein import receptor, atToc33, are not essential in vivo but do increase import efficiency.</a> Plant J. 63 (2), 297-311 (2010).</li>
<li>Huang, W., Ling, Q., Bédard, J., Lilley, K., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analyses+of+the+roles+of+essential+Omp85-related+proteins+in+the+chloroplast+outer+envelope+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">In vivo analyses of the roles of essential Omp85-related proteins in the chloroplast outer envelope membrane.</a> Plant Physiol. 157 (1), 147-159 (2011).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual.+Second+edn%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second edn</a>. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
<li>Aronsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monogalactosyldiacylglycerol+deficiency+in+Arabidopsis+thaliana+affects+pigment+composition+in+the+prolamellar+body+and+impairs+thylakoid+membrane+energization+and+photoprotection+in+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Monogalactosyldiacylglycerol deficiency in Arabidopsis thaliana affects pigment composition in the prolamellar body and impairs thylakoid membrane energization and photoprotection in leaves.</a> Plant Physiol. 148, 580-592 (2008).</li>
<li>Aronsson, H., Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+Arabidopsis+chloroplasts+and+their+use+for+in+vitro+protein+import+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of Arabidopsis chloroplasts and their use for in vitro protein import assays.</a> Methods Mol. Biol. 774, 281-305 (2011).</li>
<li>Haldrup, A., Lunde, C., Scheller, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+thaliana+plants+lacking+the+PSI-D+subunit+of+photosystem+I+suffer+severe+photoinhibition%2C+have+unstable+photosystem+I+complexes%2C+and+altered+redox+homeostasis+in+the+chloroplast+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis thaliana plants lacking the PSI-D subunit of photosystem I suffer severe photoinhibition, have unstable photosystem I complexes, and altered redox homeostasis in the chloroplast stroma.</a> J. Biol. Chem. 278 (35), 33276-33283 (2003).</li>
<li>Kubis, S. E., Lilley, K. S., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+preparation+of+chloroplasts+from+Arabidopsis+thaliana+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and preparation of chloroplasts from Arabidopsis thaliana plants.</a> Methods Mol. Biol. 425, 171-186 (2008).</li>
<li>Chen, X., Smith, M. D., Fitzpatrick, L., Schnell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+the+role+of+atTic20+in+protein+import+into+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of the role of atTic20 in protein import into chloroplasts.</a> Plant Cell. 14, 641-654 (2002).</li>
<li>Miras, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-canonical+transit+peptide+for+import+into+the+chloroplast%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Non-canonical transit peptide for import into the chloroplast.</a> J. Biol. Chem. 277 (49), 47770-47778 (2002).</li>
<li>Nada, A., Soll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inner+envelope+protein+32+is+imported+into+chloroplasts+by+a+novel+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Inner envelope protein 32 is imported into chloroplasts by a novel pathway.</a> J. Cell Sci. 117 (17), 3975-3982 (2004).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Biz son zamanlarda kloroplast protein ithalat aktif kloroplast fonksiyonu ve bitki yaşam 3 için kritik stres, ile kontrol edilebilir olduğunu gösterdi. Bu çalışmada, bu tür düzenlemeyi izlemek için, biz stres koşulları altında yetiştirilen bitkilerin ithalat kapasitesinin değerlendirilmesini sağlamak için bizim kloroplast izolasyon ve in vitro ithalat tahlil prosedürleri güncellenmiştir. Sonuçlar kloroplast protein ithalat düzenlenmesinde SP1 için önemli bir rol gösterdi. Geleneksel in vitro ithalat deneyleri standart MS ağar ortamı 6,17,18 yetiştirilen bitkiler kullanın. Burada anlatılan sp1 mutant durumunda, bu tür geleneksel tahliller WT 3 protein ithalat göreli herhangi bir farklılık ortaya koymamıştır. Protein ithalat burada tarif edilen yöntemler (Şekil 1) kullanarak stres koşulları altında değerlendirilir Ancak, protein ithalat düzenlenmesinde SP1 rolü açıkça ortaya çıkar. o m ikenay doğrudan (yöntemler sırasıyla, sıvı kültüründe ve agar ortamı üzerinde yetiştirilen bitkiler istihdam gibi) geleneksel deneylerde elde edilenlerle stres koşulları testte ithalat verileri karşılaştırmak mümkün olmayabilir, stres ve non-stres koşulları arasındaki karşılaştırmalar yapılabilir şartıyla vardır bitkilerin hepsi ya da stres olmadan aynı sıvı kültür ortamında yetiştirilir. Agar ortamı üzerinde stres tedavisi ile karşılaştırıldığında, sıvı kültür içinde in vitro içe deneyleri için gereken bitkilerin çok sayıda tedavisi için daha uygundur. Ayrıca, kısa süreli stres tedaviler için özellikle önemlidir, tüm bitkiler için bir stres, düzgün uygulamayı kolaylaştırır. Burada sunulan yöntem manitol tedavisi ile osmotik stres çalışma uygulanmış, ama kolayca, diğer streslere geniş bir şekilde adapte edilebilir; örnek, kısa vadeli tuz stresi ve oksidatif stres, hangi karşılık gelen stres olabilir b içine benzer sıvı MS ortamı aracılığıyla başvurdu. gerilmelerin diğer türleri için, stres derecesi ilk optimize edilmiş öneririz; aşırı ağır tedaviler izole organellerin verim ve / veya ithal yeterlilik üzerinde olumsuz etkileri olabilir. aşağıda ayrıntılı olarak bir, özel dikkat protokol kapsamında birçok önemli adım vardır. üreticiye bağlı olarak - (ağırlık / hacim,% 0.9 0.6) MS ortamı için en uygun agar konsantrasyonu değişebilir. Bu nedenle, deneysel deneyler başlamadan önce konsantrasyonda agar optimize etmek önerilir. orta o hasat adım (adım 1.9) de dokuya yapışır ve böylece yumuşak olmamalı, ne o kadar zor bitkinin kök gelişimini önlediğini olmalıdır. sukroz konsantrasyonu da kullanılan bitkilere göre ayarlanabilir. (W / v) sakaroz bitkilerin daha iyi büyümesi yardımcı olabilir% 3 - özellikle de hasta mutantları ile çalışırken, MS ortamı 2 ile takviye edilmiştir. ne zaman uygulamastres tedavileri yalan, sıvı ortamda (örneğin,&gt; 14 gün eski) çok eski bitkilerin aktarmak iyi değildir. eski tesislerin daha gelişmiş kök daha kolay bir transfere sırasında zarar olmasıdır. buğday tohumu dayananlar ve tavşan retikülosit dayananlar: kopya / çeviri sistemine ilişkin olarak, 2 büyük sistemler bulunmaktadır. Bu kitler, örneğin linearize plazmid, unlinearized plazmidler, ya da PCR ürünleri gibi farklı şablonlar kullanabilir. kitleri, aynı zamanda, T3, T7 ve SP6 başlatıcısına özgüdür. Burada tavsiye kiti PCR ürünlerinin ve T7 promotörü ile birlikte kullanılmak üzere uygun olduğunu not edin. Ancak, bilinmeyen nedenlerle, bu sistem ile yapılan bazı radyoaktif işaretli preproteins ithalat deneyinde verimli işe yaramayabilir; Bu tür durumlarda, bir bir buğday tohumu özü sistemi veya plazmid şablonları içindir bir retikülosit lizat sistemi deneyebilirsiniz. Bir de transkripsiyon / çeviri yeniden sonucunu artırabilirÜreticinin el kitabında göre reaksiyon koşulları değiştirerek eylem. Bu sabah erken kloroplast izolasyon başlamak önemlidir (ya da erken büyüme odasında ışık döngüsü içinde) bozulmamış organellerin izolasyonu engelleyebilir nedeniyle fotosentez kloroplastların içinde nişasta birikimini önlemek amacıyla. kloroplast izolasyon prosedürü gereksiz gecikme olmadan hızlı bir şekilde yapılmalıdır ve izole kloroplastların her zaman soğuk tutulmalıdır. Bu yavaş yavaş iyi değil onların canlılığını kaybeder kloroplast izole gözlem karşı azaltmaktır. Yeni çözülmüş CIB veya HMS tampon kullanıyorsanız, homojen bir çözelti elde etmek Kullanmadan önce iyice tampon karıştırmak için emin olun. bitki malzemesinin homojenizasyonu için en uygun koşullar ampirik olarak kurulmuştur ve farklı doku homojenizer kullanıldığında değişebilir. Farklı bitki genotipleri simila içeriyorsar klorofil düzeyleri, klorofil miktar ithalat deneyleri yapmadan önce örnekleri normalleştirmek için alternatif bir yol olarak kullanılabilir. Klorofil% 80 izole edilmiş kloroplastlara bir numunenin ekstre aşağıdaki spektrofotometrik tespit edilebilir (h / h) sulu bir aseton 19,20. Bitkilerin ithalat oranları (örneğin, klorotik fenotipleri ile mutantlar) karşılaştırılmalıdır farklı klorofil içeriğini gösteren Ancak, ithalat tahlillerinde kloroplast örnekleri normalleştirmek sayma kloroplast numarasını kullanabilirsiniz. İyice adımda 3.11 kloroplast tekrar süspansiyon özellikle önemlidir. Yetersiz tabanda ithalat reaksiyonlarında doğru yükleme engel olacak böylece zor numaralar doğru saymaya yapacak kloroplastların, agrega terk edip olabilir. Şiddetli toplama mikroskop altında görüldüğü takdirde Aggregat kadar buz üzerinde kloroplast örnek sallayarak devam (örneğin, 10 kloroplast birlikte katıldı&gt; ile agrega)es kaldırılır. Tampon daha küçük bir hacimde kloroplast tekrar süspansiyon daha kolaydır. Protein ithalat reaksiyonları (Bölüm 5) nedeniyle radyoaktif doğanın uygun önlemler ile yapılmalıdır farkında olmak önemlidir. Gerekli önlemler şunlardır: izleme ve çalışma yüzeyi ve ekipman dekontaminasyon ve onaylı bir atık konteynerine tüm radyoaktif atıkların bertaraf, tek kullanımlık eldiven, laboratuvar giyim ve koruyucu gözlük takan. Ayrıca doğru ozmotik basınç ithalat reaksiyonları esnasında kloroplast sa¤laml korumak için kritik öneme sahiptir akılda tutmak ve bu esas HMS tampon tarafından yapılmaktadır. 10x HMS yapışkan olduğu için, ilk önce oda sıcaklığına kadar ısıtılmalıdır ve daha sonra iyice karıştırıldı ve doğru hacim ölçümü sağlamak için bir kesim pipet kullanılarak uygulanmalıdır. içe reaksiyonunda soğuk metionin olmayan chloropl halinde serbest radyo-etiketli metionin dahil edilmesini önlemek için ilave edilirinkübasyon aşaması esnasında organel çeviri yoluyla ast proteinler, BSA proteazlar için bir alt-tabaka olarak işlev görerek, proteolizi en aza için kullanılır ise.

Kloroplastlar bitkilerin yeşil dokularda mevcut oldukça bol organelleri. Onlar fotosentez kritik rol, şeker karbondioksit dönüştürmek ve böylece yeryüzünde 1 neredeyse tüm yaşamı desteklemek için ışık enerjisini kullanan bir işlem için iyi bilinmektedir. Buna ek olarak, kloroplast (ve plastidler adlandırılan ilgili organellerin geniş ailesi) amino asitler, lipidler, pigmentlerin sentezi ve bu ağırlık ve patojen zorlaması gibi çevresel sinyalin duyulması da dahil olmak üzere, bitkilerde bir çok önemli rol oynar. Fotosentez, belirli koşullar altında yararlı role sahip olduğu, yan ürünleri gibi reaktif oksijen türleri (ROS) oluşturur, ancak, eğer zarar ya da ölümcül etkilere neden olabilir fazlasıyla üretilmiştir. ROS aşırı özellikle olumsuz çevre koşulları tarafından teşvik edilir ve böylece kloroplastlar yakından tuzluluk ve ozmotik stresler 2 olarak abiyotik streslere, verilen yanıtların bağlantılıdır. Chloroplasts karmaşık bir yapıya sahiptir. Her bir kloroplast dış ve iç membranlar oluşur kaplama olarak adlandırılan bir çift membran dış katman ile çevrilidir. Dahili olarak, fotosentezin ışık reaksiyonları gerçekleşecek thylakoid, adında başka bir zar sistemi vardır. iki membran sistemleri arasında sulu bir bölme arama C tespit katılır stroma vardır. Bir kloroplast 3.000 ~ farklı proteinleri içerebilir, ve bu proteinlerin büyük çoğunluğu ön-madde biçiminde sitozol sentezlenir ve zarf membran 1 adanmış proteini translocons ile organel içe gerekir. İlginçtir, son çalışma kloroplast proteini ithalatı aktif düzenlenir belirtti ve bu yüzden kloroplast proteom üzerinde kontrol önemli bir seviyede uygulamak mümkün. Örneğin, protein ithalat inci bolluğu doğrudan yönetmelikle abiyotik strese yanıt verebilir 2015 yılında rapor edilmiştirubikuitin-proteazom sistemi 3 ile kloroplastlar (TOK) Dış zarfın zarında e translokon. Saflaştırılmış kloroplast kullanılması ve in vitro sentezlenen ön-madde proteinlerinin protein içe vitro 4,5 içinde yeniden edilebilir. Böylece, in vitro yöntemler, protein ithalat makine varsayılan bileşenlerinin analizi için ve protein ithalat ve düzenleme altında yatan mekanizmaları keşfetmek için kritik bir yaklaşım olmuştur farklı mutant bitki 6, ithalat oranlarını değerlendirmek için de kullanılabilir. Ayrıca, kloroplast kloroplast proteinlerinin 7,8 alt organel lokalizasyon, topoloji ve çalışmalarını kolaylaştırabilir in vitro ithalat aşağıdaki ileri fraksiyon ya da proteaz sindirim, ile işlenebilir. biz açıklayacağız olarak stres protein ithalat düzenlenmesini incelemek için, bizim rutin kloroplast izolasyon yöntemi değiştirdinizİşte. Önemli olarak, kloroplast 8 gün boyunca ortam agar standart Murashige ve Skoog (MS) büyütülmüş ve daha sonra, nispeten kısa, kontrollü baskı tedavisi sağlayan, stres ile takviye Sıvı MS ortamı içine transfer edilmiş bitkilerden izole edildi. Stres ile tedavi edilen bitkilerden izole kloroplast verimi ve yetkinlik İn-vitro protein içe tahlilinde 3 alt uyumludur. Kloroplast yalıtım protokole ek olarak, sağlam olduğu kanıtlanmıştır ve yaygın olarak 3,9-12 kullanılan in vitro protein alma için, rutin bir yöntem sunuyoruz.

<table><tbody><tr><td>Murashige ve Skoog bazal tuzu&nbsp;</td><td>Melford</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>phytoagar</td><td>Melford</td><td>P1003</td><td></td></tr><tr><td>2- (N-morfolino) etan sülfonik asit (MES)</td> <td>Melford</td><td>B2002</td><td></td></tr><tr><td>triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BPE151-500</td><td></td></tr><tr><td>cerrahi bant (örn., Mikro gözenek, 3M)</td> <td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>filtre kağıdı</td><td>Fisher</td><td>FB59023</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Fisher</td><td>10607095</td><td></td></tr><tr><td>Etilen Glikol Tetraasetik Asit (EGTA)</td> <td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td> <td>Fisher</td><td>D / 0700/53</td><td></td></tr><tr><td>4- (2-hidroksietil) piperazin-1-etansülfonik asit (HEPES)</td> <td>Melford</td><td>B2001</td><td></td></tr><tr><td>filtrasyon bezi (Miracloth)</td> <td>Calbiochem</td><td>475855</td><td></td></tr><tr><td>50 mL santrifüj tüpü</td><td>Fisher</td><td>CFT-595-040M</td><td></td></tr><tr><td>250 mL santrifüj şişesi</td><td>Fisher</td><td>CFT-891-V</td><td></td></tr><tr><td>Polytron (örn., Kinematica PT10-35)</td><td>Fisher</td><td>11010070</td><td></td></tr><tr><td>Polytron probu (örn., Kinematica PTA20S)</td><td>Fisher</td><td>11030083</td><td></td></tr><tr><td>santrifüj (örneğin , Beckman Coulter Avanti JXN-26, 50 ve 250 mL tüpler için)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B34182</td><td></td></tr><tr><td>250&nbsp için sabit açılı rotor; mL şişeler (örneğin , JLA-16.250)</td><td>Beckman Coulter</td><td>363930</td><td></td></tr><tr><td>50&nbsp için sabit açılı rotor; mL tüpler (örn., JA-25.50)</td><td>Beckman Coulter</td><td></td>, 50 mL tüpler için sallanan kova rotoru 363058 <td></td></tr><tr><td>(örn., JS-13.1)</td><td>Beckman Coulter</td><td>346963</td><td></td></tr><tr><td>radyo işaretli [35S] metiyonin</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG072002MC</td><td></td></tr><tr><td>tavşan retikülosit lizat tabanlı hücresiz çeviri sistemi (TNT T7 PCR DNA için hızlı kit)</td><td>Promega</td><td>L5540</td><td></td></tr><tr><td>faz kontrast mikroskobu (ör. , Nikon Eclipse 80i)</td><td>Nikon</td><td>kullanılamıyor</td><td></td></tr><tr><td>hemositometre (Geliştirilmiş Neubauer BS748 bölmesi)</td><td>Hawksley Technology</td><td>AC1000</td><td>0,1 mm derinlik, 1/400 mm2</td></tr><tr><td>cover camlar</td><td>VWR</td><td>16004-094</td><td>22 mm & kez; 22 mm, kalınlık 0,13-0,17 mm</td></tr><tr><td>1,5 mL mikrofüj tüpleri</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>2 mL mikrofüj tüpleri</td><td>Starlab</td><td>S1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>mikrofüj (örn., Eppendorf 5415D)</td><td>Eppendorf</td><td>kullanılamıyor</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 spektrofotometre veya benzeri</td><td>Thermo Fisher</td><td>SPR-700-310L</td><td></td></tr><tr><td>glukonik asit (potasyum tuzu)</td><td>Fisher</td><td>22932-2500</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA)</td> <td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>metiyonin</td><td>Sigma</td><td>M6039</td><td></td></tr><tr><td>bromofenol mavisi</td><td>Fisher</td><td>B / P620 / 44</td><td></td></tr><tr><td>gliserol</td><td>Fisher</td><td>G / 0650/17</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher</td><td>S / 5200/53</td><td></td></tr><tr><td>Tris Baz & nbsp;</td><td>Melford</td><td>B2005</td><td></td></tr><tr><td>ditiotreitol (DTT)</td><td>Melford</td><td>MB1015</td><td></td></tr><tr><td>görüntü analiz yazılımı (e., Aida Image Analyzer)</td><td>Raytest</td><td>kullanılamıyor</td><td></td></tr></tbody></table>

stresli bitkilerden izole edilen kloroplastlarda içine protein İthalat analizi

Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants

Kloroplastlar fotosentez ama birçok diğer metabolik ve sinyal fonksiyonları sadece içeren bitkilerin pek çok yaşamsal roller ile organelleri. Ayrıca, kloroplast gibi tuzluluk ve ozmotik stresler gibi çeşitli abiyotik streslere, bitki yanıtları için kritik öneme sahiptir. Bir kloroplast kendi genomu tarafından kodlanan, bazıları ~ 3.000 farklı protein kadar ihtiva edebilir. Ancak, kloroplast proteinlerinin çoğunluğu çekirdeğine kodlanmış ve sitozolde sentezlenen ve bu proteinler kloroplast zarf membranların de translocons aracılığıyla kloroplast alınmak üzere ihtiyacı vardır. Son çalışmalar, kloroplast proteini içe aktif stres ile kontrol edilebilir olduğunu göstermiştir. biyokimyasal stres koşulları altında, protein ithalat gibi düzenlenmesini araştırmak, biz kolayca herhangi bir laboratuvarda elde edilebilir hızlı ve basit bir işlem olarak burada açıklanan yöntemi geliştirdi. Bu yöntemde, bitkiler normal conditio altında yetiştirilirDaha sonra ns ve sıvı kültüründe stres koşullarına maruz. Bitki materyali toplanır ve kloroplastlar sonra homojenizasyon tarafından serbest bırakılır. Ham homojenat sağlam kloroplast izolasyonunu sağlayan, yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile ayrılır. Kloroplast verim sayımı ile değerlendirilir ve kloroplast intakt bir mikroskop altında kontrol edilir. Protein ithalat tahlilleri için, saflaştırılmış kloroplastlar in vitro çevrilmiş haberci proteinleri 35 S radyoetiketlenmiş ile inkübe edilir ve zaman ders deneyler stres koşullarında genotipleri arasındaki ithalat oranları karşılaştırmalar sağlamak için yapılmaktadır. Biz düzenleyici mutant gelen kloroplastlar içine protein ithalat oranı özellikle ozmotik stres koşulları altında değişmiş olduğunu gösteriyor bu yöntem kullanılarak üretilen verileri sunmak.

3 zaman noktaları ile bir örnek kloroplast proteini içe Deney, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. PSAD ~ 23 kD 16 bir ön-madde biçiminde olan, bir stroma maruz fotosistem bir ~ 18 kD bileşenidir. Bunu sabit olarak WT göre SP1 mutant, yükselir çünkü pSAD mutant 3 ithalat etkinliğindeki bir değişikliğe işaret, gerilimli şartlar altında, burada in vitro protein içe deneyi için seçildi. SP1 proteini 3 - sp1 mutant kloroplast protein ithalat makine önemli bir regülatör bir kusur taşır. Normal koşullar altında yetiştirilen bitkilerden izole kloroplastların için sp1 ve WT arasındaki pSAD ithalat belirgin bir fark yoktu (veriler gösterilmemiştir) 3. Ancak, burada açıklanan yöntemler kullanılarak ozmotik izole kloroplastların içine pSAD ithalat değerlendirmek içinstresli bitkiler, açık bir fark tespit edildi. Biz de genotipleri ile zamana bağlı bir şekilde olgun protein formunda birikimi gözlenen iken, ithalat oranı önceki sonuçlarla 3 ile uyumludur sp1 kloroplastlarda (Şekil 1), için daha WT kloroplastlar için anlamlı olarak daha düşüktü ve ortaya stres koşulları altında pSAD kloroplast ithalatını düzenleyen SP1 proteinin önemli bir rol. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54717/54717fig1.jpg" /> Şekil 1. Protein İthalat Testi stres koşullarında yetiştirilen Kloroplastlar 10 günlük bir WT (Col-0) izole edilmiştir. Osmotik Stres Koşullarında Yetiştirilen bitkilerden izole edilen kloroplastlarda ve sp1 mutant Arabidopsis bitkileri kullanarak Yürütülen (200 mM mannitol) 2 gün boyunca. (A) Protein ithalat kullanılarak gerçekleştirilmiştir [35 S] -methionine etiketli pPsaD ve SDS-PAGE ve fosfor görüntüleme ile analizden önce 4, 8 ve 12 dakika devam etmesine izin verilir. Buna paralel olarak, in vitro olarak aşağıdakileri içeren pPsaD% 10 giriş kontrolü, çevrilen protein (IVT) analiz edilmiştir. muhtemelen kesilmiş veya proteolizlenen çeviri ürünlere karşılık iki bant vardır aralarında iken kendi yoğunluk zamanla (*) sırasında değişmedi çünkü (ön) ve olgun haberci (mat) pPsaD formları, belirtilmiştir. Stres koşulları altında yetiştirilen WT ve sp1 bitkilerden kloroplastların içine ithalat fiyatlarını karşılaştırın (B), A ithal olgun proteine karşılık gelen her bir bandın şiddeti ölçüldü. Tüm veriler 12 dakika sonra WT bitkilerden kloroplastlarda ithal protein miktarı yüzde olarak ifade edilir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54717/54717fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Burada stres altında izole kloroplastların içine protein ithalat incelemek için yeni bir yöntem tarif. yöntemi hızlı ve basittir ve kloroplast protein alma için farklı stres koşullarında sonuçlarını ve ilgili düzenleyici mekanizmaları incelemek için uygulanabilir.

Stresli bitkilerden izole edilen kloroplastlarda içine Protein İthalat analizi

Chloroplasts are organelles with many vital roles in plants, which include not only photosynthesis but numerous other metabolic and signaling functions. ...

Bu metodolojinin genel amacı, özellikle stres etkilerine odaklanarak çekirdek kodlu proteinlerin kloroplastlara aktarımını incelemektir. Bu yöntem, kloroplast protein aktarımının nasıl düzenlendiği gibi kloroplast alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin özel bir avantajı, stresin kloroplast protein aktarımı üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesine olanak tanımasıdır.Bu yöntem model bitki Arabidopsis thaliana ile kullanım için geliştirilmiş olsa da, tarım bitkileri gibi diğer sistemlere uyarlanabilir ve modifiye edilebilir. Prosedürü laboratuvarımdan doktora sonrası araştırmacı Qihua Ling uygulamalı olarak gösterecektir. Başlamak için öncelikle, beraberindeki metin protokolünde açıklandığı şekilde Arabidopsis bitkilerini yetiştirin.Ardından, bitkiler sekiz günlük olduğunda stres uygulaması gerçekleştirin. Bitkileri agar plakadan elinizle nazikçe sıyırın ve stres faktörünü içeren sıvı MS besiyerinin bulunduğu steril bir erlene yerleştirin. Deneyin doğasına bağlı olarak, kontrol grubu olarak stres faktörü içermeyen benzer bir erlene ek bitkiler yerleştirmek de gerekli olabilir.Erlenlerin ağzını steril folyo ile kapatın ve bitkilerin nazikçe sallanan bir orbital çalkalayıcıda iki gün daha büyümesine izin verin. Bir 50 mL santrifüj tüpünde 13 mL Percoll, 13 mL iki katı kloroplast izolasyon tamponu ve beş mg glutatyonu karıştırarak sürekli bir yoğunluk gradyanı hazırlayın. Ardından karışımı santrifüjleyin.Santrifüj işleminden sonra, gradyanın bozulmasını önlemek için tüpü dikkatlice taşıyın ve daha sonra kullanmak üzere buz üzerinde tutun. Ardından, her koşul için 100 mililitre kloroplast izolasyon tamponunu bir litrelik bir behere aktarın. Fideleri, bir eleğe boşaltarak sıvı ortamdan çıkarın.Ardından bunları kloroplast izolasyon tamponu içeren behere aktarın. Kalan tüm ortamı temizlemek için dokuyu tamponla durulayın ve ardından tamponu 100 mililitre taze izolasyon tamponu ile değiştirin. İlk homojenizasyon aşaması için, önceki tamponun parmaklarınız arasından süzülmesine izin vererek bitki dokusunu elle 50 mililitrelik bir behere aktarın.Ardından, doku homogenizatörünün probunu dokuya yerleştirin ve her biri bir ila iki saniye süren iki darbe ile homogenize edin. Homojenatı, iki kat filtrasyon kumaşı üzerinden 250 mililitrelik bir santrifüj tüpüne süzün. İşlemi, kumaşı nazikçe sıkarak tamamlayın.Süzüntüyü saklayın ve bitki dokusunu tekrar 50 mililitrelik behere aktarın. Ardından, 50 mililitrelik behere ikinci bir 20 mililitre kloroplast izolasyon tamponu ekleyin ve ilk homojenizasyon aşamasında kullanılmamış olan geri kalan tüm dokuyu ekleyin. Homojenizasyon ve filtrasyon adımlarını dört kez daha tekrarlayın.Havuzlanmış homogenatı, 4 °C'de 5 dakika boyunca 1, 000 ×g'de santrifüjleyin. Santrifüj işleminin hemen ardından, pellet'i rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatantı dökün. Tüpü buza yerleştirin ve tüpü nazikçe çalkalayarak pellet'i kalan süpernatant içinde yeniden süspanse edin.Ardından, bir Pasteur pipeti kullanarak homojenatı, alıcı tüpün kenarından önceden hazırlanmış sürekli yoğunluk gradyanının üst kısmına nazikçe aktarın. Daha sonra örneği ve gradyanı, salıncak kovalı bir rotorda, fren kapalı konumdayken, 4 °C'de 10 dakika boyunca 7.800 ×g hızında santrifüjleyin. İşlem tamamlandığında, gradyan içinde görülebilen iki yeşil bandı gözlemleyin.Kırılmış kloroplastları içeren üst bandı atın ve sağlam kloroplastları içeren alt bandı yeni bir 50 milliliter santrifüj tüpüne aktarmak için bir Pasteur pipeti kullanın. Ardından, tüpe 25 milliliter HMS tamponu ekleyin ve kloroplastlardaki Percoll'ü yıkamak için tüpü iki kez ters çevirin. Daha sonra tüpü tekrar salıncak kovalı rotora yerleştirin ve kloroplastları yeniden çöktürün.Süpernatantı dökün ve tüpü buz üzerinde nazikçe çalkalayarak peleti kalan tampon içinde yeniden süspanse edin. Gerekiyorsa 100 ila 300 microliter ek HMS tamponu ekleyin, ancak örneği çok fazla seyreltmamaya çalışın. Yeniden süspanse edilen kloroplastları buz üzerinde saklayın.İzole edilmiş kloroplastların beş µL'sini, 1,5 mL'lik bir tüp içindeki 495 µL HMS tamponuna ekleyerek başlayın. Çözeltiyi nazikçe karıştırmak için tüpü ters çevirin. Ardından, bir hemositometrenin sayım odasının üzerine bir lamel yerleştirin.Seyreltilmiş kloroplast süspansiyonundan 40 ila 60 µL'yi, lamla sayım odası arasındaki boşluğa yavaşça pipetleyin. Faz kontrast mikroskobu kullanarak, 20x objektif ile kloroplastların görüntüsünü alın. Bozulmamış kloroplastlar yuvarlak ve parlak görünür ve çevreleri bir ışık halesi ile çevrilidir.Ardından, 10 büyük karedeki kloroplast sayısını belirlemek için 10x objektifini kullanın. Büyük kare başına düşen kloroplast sayısının ortalaması 10 ile 30 arasında olmalıdır. Çok az veya çok fazla kloroplast mevcutsa, dilüsyon faktörünü ayarlayın ve prosedürü tekrarlayın.Uygun aralığa ulaşıldığında, beraberindeki metin protokolünde açıklandığı şekilde mililitre başına kloroplast sayısını hesaplayın. Üç zaman noktasıyla bir zaman serisi yürütmek için, her biri 130 µL import durdurma tamponu alikotu içeren üç tüp hazırlayın ve bunları buz üzerinde bekletin. İki mililitrelik bir tüpte, reaksiyon tamponu ve radyoaktif olarak işaretlenmiş öncül proteini içeren import reaksiyonunu hazırlayın.Test edilecek her bir koşul için bir reaksiyon olması gerektiğine dikkat edin. Zaman noktası başına yaklaşık 10 milyon kloroplast kullanın. Reaksiyon tüpünü, sınırlı miktarda ışık altında, 25 °C'deki bir su banyosunda inkübe edin.Kloroplastları yeniden süspande etmek için tüpleri ara ara hafifçe sallayın. Bir zaman serisi yürütmek için, importun doğrusal aralığı içindeki gerekli zaman noktalarında reaksiyondan 130 mikrolitrelik alikotlar alın. Çekim işleminin hemen ardından, her bir 130 µL alikotu buz soğukluğundaki import durdurma tamponu içeren bir tüpe aktarın, tüpe hafifçe vurarak karıştırın ve zaman serisi tamamlanana kadar tüpleri buz üzerinde bekletin.Son örnek çıkarıldıktan sonra, tüm örnekleri bir Microfuge içerisinde 12, 000 times g hızda 30 saniye boyunca santrifüjleyin. Ardından, süpernatantları atın ve peletleri 15 µL iki x protein yükleme tamponu içinde yeniden süspanse edin. Son olarak, örnekleri vorteksleyerek karıştırın.Son olarak, tüm örnekleri ve bir öncül giriş kontrolünü standart SDS-PAGE ve autoradiography, fluorography veya phosphorimaging kullanarak analiz edin. PsaD, 23 kilodaltonluk daha büyük bir öncül olarak sentezlenen, fotosistem I'in 18 kilodaltonluk bir bileşenidir. Olgun 18 kilodaltonluk forma dönüştürülme işlemi, kloroplastlara girişin gerçekleştiğini gösterir.Burada incelenen Arabidopsis sp1 mutantı, kloroplast protein aktarım mekanizmasının önemli bir düzenleyicisi olan sp1 proteininde bir kusur taşımaktadır. Stres koşulları altında, sp1 mutant kloroplastlarına PsaD proteini aktarım miktarı yabani tipe kıyasla artarken, normal stres dışı koşullarda bu durum görülmez. PsaD'nin olgun protein formu her iki bitki genotipinden gelen kloroplastlarda zamana bağlı olarak birikmiş olsa da, aktarım hızı sp1 mutant kloroplastları için yabani tip kloroplastlarından önemli ölçüde daha yüksekti.Bu sonuçlar, stres koşulları altında kloroplast protein ithalatının düzenlenmesinde sp1 proteininin önemli bir rolü olduğunu göstermektedir. Kloroplast izolasyonundan ithalat analizinin tamamlanmasına kadar olan bu yöntem, doğru şekilde uygulandığında, uzmanlaşıldıktan sonra beş ila altı saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, kloroplastların maksimum aktivitesini korumasını sağlamak için tüm kloroplast izolasyon adımlarının 4 °C'de gerçekleştirildiğini hatırlamak önemlidir.Birkaç on yıl önceki ilk geliştirilmesinden sonra, in vitro kloroplast protein import analizi, bu alandaki araştırmacıların kloroplast protein import mekanizmasının birçok farklı yönünü keşfetmelerinin yolunu açmıştır. Burada sunulan geliştirme, stres koşullarının protein importu üzerindeki etkilerinin incelenmesine olanak tanır. Radyoaktif materyallerle çalışmanın özel dikkat gerektirdiğini unutmayın.Bu prosedür gerçekleştirilirken eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük kullanımı gibi önlemler her zaman alınmalıdır.

analysis-protein-import-into-chloroplasts-isolated-from-stressed

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Tarif edilen karşılaştırmalı nicel proteomik yaklaşım, farklı koşullar altında multiprotein komplekslerinin bileşimi içine bir bakış açısı elde etmeyi amaçlamaktadır ve genetik olarak farklı suşların karşılaştırılması ile gösterilmiştir. Kantitatif analiz için bir sükroz yoğunluk gradyanı farklı fraksiyonların eşit hacimleri kütle spektrometresi ile analiz edilir ve karıştırılır.

Multiprotein kompleksleri Karşılaştırmalı Analizi için Yeni Bir Yaklaşım dayanarak<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolik Etiketleme ve Kantitatif Kütle Spektrometre

In vivo protein komplekslerinin oluşumu bimoleküler floresan tamamlanmasıyla görselleştirilebilir. Etkileşim ortakları floresan etiketler tamamlayıcı bölümlerine bağlı ve geçici olarak tütün yaprakları olarak ifade edilen iki protein arasında yakın üzerine yeniden flüoresan sinyal elde edilir.

Tütün protoplastlarında ve Yapraklar Bimoleküler Floresan tamamlama tarafından Visualized protein-protein etkileşimleri

Biz burada fizyolojik aktif thylakoids yüksek verimli izolasyon için protokoller ve protein taşıma deneyleri kloroplast ikiz arginin translocation (cpTat), salgı (cpSec1) ve sinyal tanıma parçacık (cpSRP) yolu için mevcut.

Yalıtım fizyolojik aktif Thylakoids ve onların kullanımı enerji bağımlı Protein taşıma deneyleri

Burada PEG aracılı dönüşüm yöntemi kullanarak önceki proteinler ifade için bir protokol açıklayın. Kolay ifade ilgi protein ve protein yerelleştirme ve çeşitli deneysel koşullar için alma işlemini verimli soruşturma yöntemdir içinde vivo.

Önceki kullanarak kloroplast eğitim Protein içe aktarma işlemi

Burada protein alma kompleksleri (TOC-TIC kompleksi) dokunun etiketini kullanarak kloroplast arıtma için kanıtlanmış ve test iletişim kuralı mevcut. Tek benzeşimi yalıtım Protokolü potansiyel olarak herhangi bir protein için uygulanabilir ve kütle spektrometresi ile yeni etkileşim ortaklar tanımlamak için kullanılan.

Kloroplast Translocon Protein kompleksleri dokunun etiketini kullanarak benzeşme arıtma

Burada, Arabidopsis yaprakları ve onların üç ana alt bölmeler (zarf, stroma ve thylakoids) sağlam kloroplast arındırmak için bir yöntem tarif fark centrifugations, sürekli Percoll degradeler, bir arada kullanarak ve iş öğelerinin sürekli olmayan sükroz degradeler. Subplastidial ve immunoblotting ve proteomik proteinlerin hücre altı yerelleştirme için önemli bir yöntemdir.

Kloroplast alt bölmeler Arabidopsis üzerinden hazırlanması Protein yerelleştirme Immunoblotting veya proteomik analizi için

Burada sunulan protokol, ribozomlarla ilişkili mRNA'lar olan translatom'u, sakaroz yoğunluk gradyan santrifüjlemesi yoluyla Arabidopsis'ten polisomal olmayan ve polisomal RNA'lara izole etmek için polisomal profillemeyi içerir. Bu yöntem, ısı stresli Arabidopsis'in çeviri verimliliğini göstermektedir.

Isı Stresi Altında Polizom Profilleri Kullanılarak Translasyon Verimliliği Testi

Coomassie Brillant Blue (CBB) poliakrilamid jeller G-250 ile protein boyanması için kısa bir protokol CBB ile klasik boyama işlemleri gibi organik çözücüler veya asetik asit kullanmadan açıklanmıştır.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

İlişikteki video GELFREE 8100 Fraksiyonu Sistemi kullanımı, kompleks protein örneklerinin moleküler ağırlık bazında bölümleri açıklar ve sıvı faz fraksiyonları kurtarır. Video teknoloji, nasıl kullanılır, inşaat işleri ve fraksiyone sığır karaciğer Homojenat poliakrilamid jel elektroforezi analizleri ile ortaya çıkan veri sağlar.

Sıvı Faz Kurtarma Moleküler Ağırlık Tabanlı Fraksiyonu GELFREE 8100 Fraksiyonu Sisteminin Kullanılması

Yeşil floresan proteini füzyon göre, Escherichia coli içinde rekombinant zar proteinlerinin ifadesi için tarama için bir aerodinamik bir yaklaşım sunulmuştur.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

Öğrenin, stresli bitkilerden izole edilen kloroplastlara protein ithalatını nasıl analiz edeceğinizi. Arabidopsis thaliana kullanarak kloroplast biyolojisi ve stres yanıtlarını araştırmak için bu hızlı yöntemi keşfedin.

Stresli bitkilerden izole edilen kloroplastlarda içine Protein İthalat analizi

Daha fazla video keşfet