içinde Recombinase aracılı Kaset Borsası tarafından Rekombinant insan pluripotent kök hücreleri hızlı ve verimli Nesil AAVS1 Odağı

Bu prosedürün genel amacı, bir flippase, Rekombinaz aracılı Kaset Değişimi yaklaşımı veya RMCE kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinin veya insan PSC'lerinin AAVS1'inde hızlı ve verimli hedeflenmiş genom düzenlemesi gerçekleştirmektir. RMCE, bir molekülün işlevinin aşırı ekspresyon veya knockdown yoluyla hızlı bir şekilde test edilmesine izin verdiği için kök hücre biyolojisi için büyük önem taşıyan AAVS1 lokusuna bir dizinin hedef yerleştirilmesini iyileştirir. Bu tekniğin temel avantajı, insan PSC hatlarının rastgele entegrasyon olaylarından arınmış, hala pluripotent olması ve normal karyotiplerin sadece 15 gün içinde oluşturulabilmesidir.

Bu yöntem, AAVS1 lokusunda transgenez için yararlı bir araç sağlar, ancak diğer insan izin veren lokuslarına da uygulanabilir. Başlamak için, altı kuyucuklu plakada inaktive edilmiş fare embriyonik fybroblastları veya iMEF'leri açık veya kapalı standart prosedürler altında kültür insan PSC ana hücre hatları. Hücreler %60 ila %70'e ulaştığında, ilaca dirençli iMEF'ler, önce 12 oyuklu bir plakanın gerekli kuyucuklarını kaplamak için% 0.1 jelatin çözeltisi kullanarak ve plakayı oda sıcaklığında beş dakika inkübe ederek.

Daha sonra, oyuk başına 125.000 iDR4 plakalayın ve kültürleri gece boyunca iMEF ortamı ile inkübe edin. Ertesi gün, insan PSC kültürlerini bir saat boyunca 37 santigrat derecede 10 mikromolar ROCK İnhibitörü içeren taze ortamla ön inkübe edin. Bu arada, insan ESC transfeksiyon çözeltisini ve hücre ayrışma ajanını oda sıcaklığına getirin.

Nükleofeksiyon koşulu başına bir mililitre nükleofeksiyon kaplama ortamı hazırlayın. Ardından, iDR4 ortamını kuyulardan çıkarın, hücreleri yıkamak için bir mililitre oda sıcaklığında PBS kullanın ve nükleofeksiyon kaplama ortamı ekleyin. Kaplama ortamı numunesi başına 500 mikrolitreyi steril 1,5 mililitrelik tüplere aktarın ve kaplamaya kadar 37 santigrat derecede saklayın.

İnsan PSC'lerini tek bir hücre süspansiyonunda ayırmak için, ortamı çıkarın, hücreleri yıkamak için oda sıcaklığında PBS'yi kullanın ve besleyici veya besleyici içermeyen hPSC kültürlerine sırasıyla bir mililitre% 0.05 Tripsin veya Accutase ekleyin. Kültürleri 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, plakayı inkübatörden dikkatlice çıkarın ve hücrelerin ayrılmasına izin vermeden, ayrışma ajanını aspire edin ve 1 mililitre insan PSC ortamı ekleyin.

Köpük oluşumunu önlerken ortamı plaka yüzeyinde nazikçe yıkayarak gevşek hücreleri ayırın. Hücreleri temiz ve steril 15 veya 50 mililitrelik bir tüpte tek bir hücre süspansiyonunda toplayın. Daha sonra hücreleri yıkamak ve aynı tüpte toplamak için 1 mililitre hESC ortamı kullanın.

Sayım için 50 mikrolitrelik bir hücre süspansiyonu alın ve kalan hücreleri oda sıcaklığında 300 kez g'de beş dakika santrifüjleyin. Süspansiyon santrifüjleme işlemine tabi tutulurken hücreleri bir hücre sayma cihazı ile sayın. Süpernatanı çıkarın ve hücre rengini mililitre başına 10 ila altıncı hücreye nazikçe yeniden süspanse etmek için oda sıcaklığında PBS'yi kullanın.

Daha sonra steril 15 mililitrelik tüpleri temizlemek için deney koşulu başına iki mililitre aktarın ve santrifüjlemeyi tekrarlayın. Numuneler dönerken, 2.5 mikrogram flippas plazmidi kullanarak 0:1, 2:1 ve 2:0 donör flippas moleküler oranlarına sahip üç temiz 1.5 mililitrelik tüpte plazmit karışımları hazırlayın. Nükleofeksiyona devam etmek için, iDR4 plakasını ve kaplama ortamı olan 1.5 mililitrelik tüpü inkübatörden çıkarın.

Her seferinde bir tüp, peleti bozmadan, PBS'yi dikkatlice pipetleyin ve tamponun mümkün olduğunca fazlasını çıkarın. Hafifçe pipetleyerek peleti yeniden süspanse etmek için 100 mikrolitre transfeksiyon solüsyonu kullanın. Daha sonra, hücre süspansiyonunu plazmit karışımlarını içeren 1.5 mililitrelik tüpe aktarın ve yavaşça karıştırın.

Hücre DNA karışımını, kabarcıkların girmemesine dikkat ederek tranfector küvetine aktarın. Küveti nükleofektör cihazına yerleştirin ve besleyicilerde kültürlenen hücreler için A13 programını veya besleyicisiz transfeksiyon için F16 programını çalıştırın. Küveti çıkarın ve küvete nazikçe, ancak hızlı ve tek hareketle 0,5 mililitre kaplama ortamı eklemek için kitteki tek kullanımlık transfer pipetlerini kullanın.

Ardından, hacmi aynı şekilde geri kazanın ve iDR4 ve kaplama ortamını içeren 12 oyuklu plakada damla damla plakaya koyun. Kültür kabını inkübatördeki bir rafa yerleştirin ve hücre süspansiyonunu eşit şekilde dağıtmak için yavaşça ileri geri ve yan yana hareket ettirin. Ortamı değiştirmeden önce yemeği 24 saat inkübe edin.

Transfeksiyondan iki ila üç gün sonra seçime başlayın. Ortamı aspire edin, hücreleri yıkamak için 1 mililitre PBS kullanın, ardından mililitre puromisin başına 100 nanogram ile insan ESC ortamı ekleyin. Hücre büyümesini gözlemleyin ve puromisin konsantrasyonunu buna göre mililitre başına maksimum 250 nanograma kadar artırın ve puromisin seçimine yedi gün boyunca devam edin.

Puomisin seçiminden üç ila dört gün sonra, 0.5 mikromolar fialuridin veya FIAU ile seçime başlayın. Ortamı günlük olarak değiştirin ve FIAU'yu sürekli yedi günden fazla tutmayın. Seçimin tamamlanmasından sonra, yaklaşık 14 ila 15. günlerde, dirençli RMCE kolonileri mevcut olacak ve yeni RMCE hattını oluşturacaktır.

Standart prosedürleri izleyerek hücreleri 1:2 oranında bölün. Anahtar 1'deki kuyucuklar bölünmeye hazır olduğunda, karakterizasyon için kuyuyu videoda daha önce açıklandığı gibi tek bir hücre süspansiyonuna ayırın ve hücreleri 15 mililitrelik bir tüpte toplayın. Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 kez g döndürün.

Ardından, hücreleri yeniden süspanse etmek ve numuneyi ikiye bölmek için bir mililitre PBS kullanın. Biri akış sitometrisi yapmak için bir hücre süzgeci kullanılarak filtrelenir ve diğeri metin protokolüne göre DNA analizi için kullanılır. Flippas rekombinaz ve tdT RMCE donörü ile transfeksiyonu takiben, hPSC'ler iDR4 MEF tabakası üzerinde eşit olarak dağılmış küçük hücre grupları oluşturdu ve yapısal GFP ve geçici tdT'yi eksprese etti.

Puromisin kullanılarak yapılan pozitif seçim, RMCE donör yerleştirmesini destekler, ardından FIAU kullanılarak negatif seçim, TK içermeyen yalnızca FRT aracılı rekombinasyon olayları için seçer. Transfeksiyondan yaklaşık altıncı günde, RMCE GFP-negatif, tdT-pozitif hücrelerin küçük kümeleri tanımlanabilir. Burada gösterildiği gibi, GFP-negatif, tdT-pozitif RMCE kolonileri sadece hem RMCE donörü hem de flippas kullanıldığında bulunurken, flippas yokluğunda RMCE oluşmaz. Klonal olmayan bir hücre popülasyonunda birleştirilen puromisin ve FIAU'ya dirençli RMCE kolonileri olan yeni oluşturulan RMCE hatlarının akış sitometrisi karakterizasyonu, hücrelerin %100'ünün RMCE GFP negatif, tdT pozitif fenotipini temsil ettiğini doğrular.

hPSC'de kaydedici aktivitesi olmayan RMCE donörleri kullanıldığında, hücrelerin %100'ü GFP negatiftir. Burada klonal olmayan RMCE hattının gösterilen PCR karakterizasyonu, tam kaset değişimini ve kullanılan seçim programının hem RMCE donörü hem de flippas eksprese eden vektör olmak üzere rastgele entegrasyon içermeyen hatlar oluşturduğunu gösterir. Özetle, bu RMCE yöntemi, hedeflenen nükleazlara kıyasla tanımlanmış bir lokus için hPSC'lerde gen düzenlemeyi önemli ölçüde basitleştirir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik 15 gün içinde tamamlanabilir. Bu nedenle RMCE, izojenik bir ortamda karşılaştırmalı çalışmalara izin verecek çok hızlı bir gen düzenleme aracıdır. Bu prosedürü kullanırken, %30'dan daha yüksek transfeksiyon verimliliğine sahip olmak ve uygun çekirdek depolama seçim ajanını önceden oluşturmak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, insan PSC'lerinin AAVS1 lokusunda RMCE'nin nasıl gerçekleştirileceği ve rekombinat hattının nasıl karakterize edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.