Name: içinde Recombinase aracılı Kaset Borsası tarafından Rekombinant insan pluripotent kök hücreleri hızlı ve verimli Nesil AAVS1 Odağı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Öğrenin, insan pluripotent kök hücrelerinde AAVS1 lokusuna RMCE yöntemiyle hızlı ve verimli gen düzenleme yapmayı. Bu teknik 15 günde izojenik hücre hatları oluşturur ve kök hücre biyolojisi araştırmaları için güvenilir bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

L.O., IWT/OZM/090838, IACS BPAMER3/08/04 ve Aragon Hükümeti FMI048/08 tarafından finanse edildi; IWT bursu SB-121396 tarafından RB; MP, FWO 1288714N tarafından; ve R.S. Hollanda Diyabet Vakfı tarafından. N.H., J.V., K.C. ve Q.C. IWT bursları SB-121396, SB-101230, SB-91228 ve SB-093228 tarafından desteklendi. C.M.V.'ye finansman FWO G.0667.07, G.0975.11 ve KU Leuven'den (EIW-B4855-EF/05/11, ETH-C1900-PF, EME-C2161-GOA/11/012), IWT-HEPSTEM, BELSPO-IUAP-DEVREPAIR, FP7-HEMIBIO'dan (266777) sağlandı.

Transfeksiyon için FRT içeren hPSC Ana Hücre Hattının hazırlanması 1. <ol><li> Veya hESC veya besleyici içermeyen iPSC orta sırasıyla (Tablo 1) kullanılarak inaktive Fare Embriyonik Fibroblastlar (IMEF) kapalı standart prosedürler altında Kültür HESC / iPSC ana hücre hatları. Her deneysel koşul için 6-oyuklu bir plaka içerisinde hPSCs arasında (besleyiciler üzerine) 2 ya da 1 (besleyici içermeyen) kuyu hazırlayın. </li><li> kültürleri gözlemlemek ve hücreler 60 ulaştığınızda -% 70 confluency, plaka ilaca dirençli IMEF (iDR4). Kısaca, kat gerekli% 0.1 jelatin solüsyonu, 0.5 mL, 12 gözlü bir levhanın gözleri ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir. Plaka 125,000 oyuk başına iDR4s ve inkübe O / N IMEF ortamı (Tablo 1). </li></ol> Nucleofection tarafından 2. hPSC Transfeksiyon <ol><li> Ertesi gün, 37 ° C &#39;de 1 saat süre ile, 10 uM Rho-ilişkili protein kinaz (rock) inhibitörü (Y-27632) de dahil olmak üzere, taze ortam ile HESC / iPSC kültürler önceden inkübe edin. Next, oda sıcaklığına-sıcak öncesi buzdolabı HESC transfeksiyon çözüm almak. </li><li> Nucleofection durum başına nucleofection kaplama ortamı (Tablo 1) 1 ml hazırlayın. Oda sıcaklığı 1 mL PBS ile yıkayın, kuyular kapalı IMEF orta alın ve orta kaplama nucleofection 500 mcL ekleyin. Steril 1.5 ml tüpler diğer 500 uL aktarın ve kaplama kadar 37 ° C&#39;de saklayın. Not: 2 pFLPe vektörleri: 0, 2: 1 ve 0: Tipik RMCE deney üç farklı RMCE verici molekül oranına sahip koşulları içerir 1. </li><li> tek bir hücre süspansiyonu içine HESC / IPSC çıkarın. <ol><li> Medya çıkart RT 2 mL PBS ile yıkayın ve sırasıyla, besleyici ya da besleyici içermeyen hPSC kültürleri 1 ml tripsin% 0.05 veya Accutase ekleyin. 37 ° C de 5 (Accutase) dakika - 7 (tripsin) ya da 2 inkübe edin. Accutase tedavisi için - hücreleri gevşek, ama ekli kalmalıdır. </li><li> Dikkatle inkübatör gelen ve bir olmadan plakayı çıkarınHücreler ayırmak için llowing, aspirasyon ile ayrışma ajanı kaldırın. 1 ml hESC medya ekleyin ve hafifçe köpüklenme kaçınarak, plaka yüzeyinde medya temizlenerek gevşek hücreleri ayırmak. Hücreler tek bir hücre süspansiyonu olduğundan emin olun. </li><li> temiz ve steril bir 15 ya da 50 ml tüp içinde hücreler toplanır. HESC ortam 1 ml ile kuyu yıkayın aynı 15 veya 50 ml bir tüp içinde hücreleri toplamak. (Bir sonraki adımda sırasında) sayma hücre sayım cihazı kullanmak için bir 50 uL kısım alın. Koleksiyonun hacmini not edin ve toplam hücre sayısını hesaplamak. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de hücreleri aşağı doğru döndürün. </li></ol></li><li> 5 ml serolojik pipet ve yumuşak pipetleme ile PBS ile 10 6 hücre / ml ihtiva eden bir süspansiyona hücre pelletini. Köpürtmeyiniz. Temizlemek için deneysel koşul (yaklaşık 2 x 10 6 hücre), steril 15 ml tüpler başına 2 mL aktarın. </li><li> santrifüj birlikte, öncedenpFLPe plasmidleri 10 uL maksimum hacminde karışımları Donörün RMCE pare. <ol><li> Bir temiz, steril bir 1.5 ml&#39;lik tübe pFLPe (6.5 kb) 2.5 ug aktarın. PFLPe vektörüne RMCE donör vektörü 13 1 molekül oranı: 2 ekleyin. Örneğin, 12 Kb RMCE donör vektörünün yaklaşık olarak 10 ug. </li></ol></li><li> tüm adımlarda köpüren kaçınarak, nucleofection devam edin. NOT: Bazı hPSC transfeksiyon protokolleri adım 2.4 önce ek IMEF tükenmesi adımı uygulayın. Bununla birlikte, uygulamada, IMEF anlamlı transfeksiyon etkinliğini değiştirmeyen bir süspansiyon içinde küçük bir hücre fraksiyonu olan, ne de non-proliferatif beri bu kirletici rekombinant hücreler oluşturur. Buna ek olarak, bu canlılığı geliştirmek için transfeksiyon işlemi sırasında hızla devam etmek için önemlidir. Bu nedenlerden ötürü, IMEF tükenmesi uygulanmaz. <ol><li> kaplama ortamı ile iDR4 plaka ve 1.5 ml tüpler kaldırmainkübatör gelen. Bir seferde bir tüp, hücre pelet bozmadan özenle PBS kapalı pipetlemeyin. mümkün olduğu kadar çıkarın. hafifçe pipetleme transfeksiyon solüsyonu 100 uL pelletini. plazmid karışımları içeren 1.5 ml tüp hücre süspansiyonu aktarın ve hafifçe karıştırın. </li><li> kabarcıklar tanıtmak için dikkat, transfector küvetine hücre DNA karışımı aktarın. Program A13 (besleyiciler kültüre hücreleri) ya da F16 (besleyici içermeyen) Nucleofector cihazda küvet tanıtmak ve uygulamak. NOT: Diğer transfeksiyon yöntemleri veya Nucleofector cihazları bu programlar ya da transfeksiyon koşulları optimizasyonu gerekebilir. </li><li> nucleofection kiti mevcut harcanabilir aktarma pipet kullanarak, küvet geri almak ve kaplama orta 0.5 mL uygulayarak ve tüm hacim aspire içeriğini toplamak. ama nazikçe ve bir harekette, hızla bu adımı gerçekleştirin. </li><li> Plaka damla damla 12-wiDR4 ve orta kaplama 500 mcL içeren arşın plaka. Bir sonraki deneysel koşul için 2.6.4 - Tekrar 2.6.1 adımları. </li></ol></li><li> inkübatör bir raf üzerine kültür çanak yerleştirin ve eşit hücre süspansiyonu dağıtmak için yan yavaş yavaş ileri geri hareket ettirin ve yan. Bir sonraki medya değişikliği 24 saat önce hücreler 10 uM ROCK inhibitörü (Y-27632) varlığında kurtarmak için izin vermek için kuluçkaya yatmaktadır. </li></ol> 3. Pozitif ve Negatif Seçim Hücrelerinin Gören RMCE <ol><li> Günlük değiştirme kültür ortamı (/ oyuk 1 mL) ve 2-3 D transfeksiyondan 100 ng puromycin / ml seçimi ile başlar. NOT: pozitif ve negatif seçim Bileşenlerin optimum konsantrasyonu, her yeni oluşturulan hPSC ana hücre hattı için deneysel olarak tespit edilmelidir. Minimal görsel toksisite 7 sonra belirgin olduğu düşük doz (konsantrasyonunu belirlemek için ana hücre hattını kullanarak, bir kill eğrisi 13 gerçekleştirinSeçimin d ancak kültür büyümüş değildir), optimal doz (tüm hücreler seçimi 7 d sonra ölü en düşük konsantrasyon) ve yüksek doz (belirgin toksisite neden konsantrasyon, 2 sonra tüm hücreleri öldürme - 3 d) puromycin ve fialuridin (FIAU) hem de. <ol><li> HESC orta aspire. 1 mL PBS ile yıkayın. 100 ng / puromycin mL HESC orta ekleyin. </li></ol></li><li> ölümün ve büyüme dengeli böylece hücre büyümesi gözlemleyin. Adım 3.1.1 Aşağıdaki günlük puromycin ile ortamı değiştirmek. 250 ng / ml arasında en fazla 50 ng / mL - büyüme hücre ölümünü gelse olduğunda, 25 bloklarında puromisin konsantrasyonunu artırır. 7 gün - 5 için puromycin seçimini devam edin. </li><li> 3-4 d günü 6 post-transfeksiyon etrafında, puromisin seçimi başladıktan sonra, 0.5 uM FIAU ile seçim başlar. Günlük ortamı değiştirmek ve en fazla 7 gün boyunca sürekli FIAU korumak. </li></ol> RMCE Hatları 4. Genişleme ve Karakterizasyonu <ol&gt; <li> seçim işlemi tamamlandıktan sonra, D14 yaklaşık - 15, dirençli RMCE koloniler mevcut ve yeni RMCE hattı oluşturmaktadır. standart prosedürler (geçit 1, P1) Aşağıdaki 2: 1 oranında toplu olarak ayrıldı. </li><li> Plaka (orijinal ana hücre hattı normal kültür koşullarına bağlı olarak ya da besleyiciler kapalı), 12-çukurlu plaka 2 kuyu. daha fazla genişleme, depolama, ya da deneysel set-up (bu işlemlerin hiçbir ek açıklama bu protokol yapılır) ve karakterizasyon için diğeri için bir kuyu kullanın. </li><li> P1 hücreleri ayırmak için hazır olduğunda, 2.4&#39;te tarif edildiği gibi tek bir hücre süspansiyonu içine karakterizasyon için çok ayırmak ve 15 ml bir tüp içinde hücreleri toplamak. NOT: hPSC WT kullan hücreleri (genetik modifikasyon) ve karakterizasyonu için sırasıyla negatif ve pozitif kontroller, hem ana hücre çizgisi. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de aşağı doğru döndürün. 1 mL PBS içinde süspanse ve flow sitometri için ikiye bölünmüş örnekve DNA analizi 13. </li><li> Analizi 13 (300 uL) Flow sitometri: <ol><li> % 5 oranında bir nihai konsantrasyona kadar PBS içinde hücrelere fetal buzağı serumu ekleyin. Bir hücre süzgeç ile temiz bir FACS tüp hücreleri aktarın ve buz üzerinde saklayın. Not: Hücre canlılığı, bu şartlar altında, yüksek, yani canlı olmayan hücreler (örneğin, 7-AAD veya PI) bir floresan boya kullanmak mümkündür, ancak gerekli değildir. </li><li> Hücre analizörü bir akış sitometresinde analiz hemen geçin ve 20.000 kayıt - 30.000 olayları. Analiz için, WT negatif kontrol numunesi kullanılarak GFP veya TDT arka plan çiçeklenme üzerinde kapıları ayarlayın. </li></ol></li><li> DNA analizi 13 (700 uL): <ol><li> Temiz bir 1.5 ml tüp hücreleri aktarın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de Spin ve süpernatant aspire. Bir ticari kit kullanılarak, DNA ekstraksiyon geçin ve üreticinin talimatlarına uyun. enlem -20 ° C&#39;de kuru topak Mağazaer analizi. </li></ol></li><li> DNA konsantrasyonu ölçün. <ol><li> 25 dakika -. 15, 150 V 1x DNA jel leke ihtiva eden bir% 2 agaroz jeli üzerinde, Şekil 3&#39;te koşulları ve Tablo 2 13 çalıştırmak PCR örnekleri göre standart PCR reaksiyonları hazırlayın. Bir jel analizörü koşmak analiz edin. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 29 (8), 731-734 (2011).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeting+of+expressed+and+silent+genes+in+human+ESCs+and+iPSCs+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 27 (9), 851-857 (2009).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Baer, A., Bode, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coping+with+kinetic+and+thermodynamic+barriers%3A+RMCE%2C+an+efficient+strategy+for+the+targeted+integration+of+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Coping with kinetic and thermodynamic barriers: RMCE, an efficient strategy for the targeted integration of transgenes.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 12 (5), 473-480 (2001).</li>
<li>Sakurai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+integration+of+transgenes+into+a+defined+locus+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient integration of transgenes into a defined locus in human embryonic stem cells.</a> Nucleic Acids Res. 38 (7), e96(2010).</li>
<li>Irion, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+targeting+of+the+ROSA26+locus+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Identification and targeting of the ROSA26 locus in human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25 (12), 1477-1482 (2007).</li>
<li>Di Domenico, A. I., Christodoulou, I., Pells, S. C., McWhir, J., Thomson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+genetic+modification+of+the+hprt+locus+in+human+ESCs+combining+gene+targeting+and+recombinase-mediated+cassette+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Sequential genetic modification of the hprt locus in human ESCs combining gene targeting and recombinase-mediated cassette exchange.</a> Cloning Stem Cells. 10 (2), 217-230 (2008).</li>
<li>Lombardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+integration+and+tailoring+of+cassette+design+for+sustainable+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer.</a> Nat. Methods. 8 (10), 861-869 (2011).</li>
<li>Lombardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+editing+in+human+stem+cells+using+zinc+finger+nucleases+and+integrase-defective+lentiviral+vector+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery.</a> Nat. Biotechnol. 25 (11), 1298-1306 (2007).</li>
<li>Simth, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+%2C+Persistent+Transgene+Expression+in+Human+Embryonic+Stem+Cells+Is+Achieved+with+AAVS1-Targeted+Integration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Robust , Persistent Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cells Is Achieved with AAVS1-Targeted Integration.</a> Stem Cells. 26, 496-504 (2008).</li>
<li>DeKelver, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics%2C+proteomics%2C+and+regulatory+DNA+analysis+in+isogenic+settings+using+zinc+finger+nuclease-driven+transgenesis+into+a+safe+harbor+locus+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Functional genomics, proteomics, and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome.</a> Genome Res. 20 (8), 1133-1142 (2010).</li>
<li>Qian, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+system+for+regulating+gene+expression+in+human+pluripotent+stem+cells+and+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient system for regulating gene expression in human pluripotent stem cells and derivatives.</a> Stem Cells. 32 (5), 1230-1238 (2014).</li>
<li>Ordovás, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Recombinase-Mediated+Cassette+Exchange+in+hPSCs+to+Study+the+Hepatocyte+Lineage+Reveals+AAVS1+Locus-Mediated+Transgene+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient Recombinase-Mediated Cassette Exchange in hPSCs to Study the Hepatocyte Lineage Reveals AAVS1 Locus-Mediated Transgene Inhibition.</a> Stem Cell Reports. 5 (5), 918-931 (2015).</li>
<li>Du, Z. -W., Hu, B. -Y., Ayala, M., Sauer, B., Zhang, S. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+recombination-mediated+cassette+exchange+for+building+versatile+transgenic+human+Embryonic+Stem+Cells+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Cre recombination-mediated cassette exchange for building versatile transgenic human Embryonic Stem Cells lines.</a> Stem Cells. 27, 1032-1041 (2009).</li>
<li>Papapetrou, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+safe+harbors+permit+high+%CE%B2-globin+transgene+expression+in+thalassemia+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genomic safe harbors permit high β-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 29 (1), 73-78 (2011).</li>
<li>Ramachandra, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+recombinase-mediated+cassette+exchange+at+the+AAVS1+locus+in+human+embryonic+stem+cells+using+baculoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient recombinase-mediated cassette exchange at the AAVS1 locus in human embryonic stem cells using baculoviral vectors.</a> Nucleic Acids Res. 39 (16), e107(2011).</li>
<li>Takata, Y., Kondo, S., Goda, N., Kanegae, Y., Saito, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+efficiency+between+FLPe+and+Cre+for+recombinase-mediated+cassette+exchange+in+vitro+and+in+adenovirus+vector+production%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparison of efficiency between FLPe and Cre for recombinase-mediated cassette exchange in vitro and in adenovirus vector production.</a> Genes to Cells. 16 (7), 765-777 (2011).</li>
<li>Mizutani, T., Li, R., Haga, H., Kawabata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgene+integration+into+the+human+AAVS1+locus+enhances+myosin+II-dependent+contractile+force+by+reducing+expression+of+myosin+binding+subunit+85%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Transgene integration into the human AAVS1 locus enhances myosin II-dependent contractile force by reducing expression of myosin binding subunit 85.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 465 (2), 270-274 (2015).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Raitano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+progranulin+expression+rescues+cortical+neuron+generation+in+an+induced+pluripotent+stem+cell+model+of+frontotemporal+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Restoration of progranulin expression rescues cortical neuron generation in an induced pluripotent stem cell model of frontotemporal dementia.</a> Stem Cell Reports. 4 (1), 16-24 (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

güvenli liman loci Gen düzenleme yöntemleri hPSCs içinde transgenesis geliştirmek için çok önemli bir araçtır kalır. AAVS1 güvenli bir liman karakteri son zamanlarda bazı uygulamalarda 13,18 sorgulanmıştır rağmen, bu lokus şu anda en iyi insandan türetilmiş hücre soylarında, özelliği kalır. hPSCs kendi sınırlamaları Farkındalık güvenilir veri elde etmek için yardımcı olabilir. Bu nedenle, AAVS1 de gain- ve zarar-fonksiyon çalışmaları veya içinde ve kararlı bir genetik arka arasında bir izogenik bağlam gerektirir faktörlerin uyarılabilir / konstitütif ekspresyon için, örneğin, yararlı bir site olduğu tahmin edilmektedir. AAVS1 odağı ZFNs, Talen veya CRISPR / Cas9 1,2,19 kullanarak birçok grup tarafından hedef olmuştur. Bu nükleazlar önemli ölçüde belirli bir lokusunda homolog rekombinasyon etkinliğini artırmaktadır. Ancak süreç ekrana ve tam rastgele INTEG serbest doğru hedeflenen klonlar, karakterizerasyon ve pluripotensini korumak ve (optimize gen düzenleme araçlarını kullanarak) 3 ay (Şekil 3) kadar sürebilir bütünlüğünü genom. Son iki hedef dışı nükleaz aktivitesi ile üretilen mümkün mutasyonlar neden olabilir. Burada kullanılan RMCE sistemi, ancak, rekombinaz spesifik hedef diziler AAVS1 lokusuna önceden hazırlanmış bir kez, iki hafta içinde bu amaca ulaşmak için, hızlı, verimli ve zarif bir yöntem sunmaktadır. Pozitif / negatif seleksiyon ve uygun bir seçim programının kullanımı RMCE tarafından AAVS1 lokusunda gen düzenleme basitleştirilmesi katkıda bulunan ana faktörlerdir. Yeni transgenik hatların Genotipik karakterizasyonu anlamlı (hayır klonal tarama gerekli) azalır ve hedef dışı nükleaz aktivitesi ile ilişkili karakterizasyonu nedeniyle FRTS için FLPe özgüllüğüne vazgeçilebilir hale getirilir. karakterizasyonu da göstererek, rutin RMCE deneylerinde azaltılabilirTam kaseti değişimi ve rasgele entegrasyon eksikliği ile yeterli PCR (Şekil 2B) ile gösterilmiştir, çünkü ana hücre hattı (Şekil 2A) GFP ekspresyonu tamamen kaybedilmesi ve Southern blot 13. pozitif / negatif seleksiyon kullanımı da önceki raporlar ile temel fark oluşturmaktadır. Daha önce AAVS1 veya diğer lokusundakı ya hPSCs bölgesindeki RMCE açıklanan çeşitli gruplar, tek bir pozitif seçim adımı 7,14,16 kullanılabilir. koloni taraması eşit klonal düzeyde doğru entegrasyon ve rasgele entegrasyon yokluğunu göstermek amacıyla yapılmalıdır, çünkü bu, nükleazlara ile yapılan gen düzenleme üzerinde önemli bir teknik avantaj teşkil etmez. Birden HESC / iPSC satırlarında RMCE sisteminin kullanımı her bir bağımsız hattının AAVS1 lokusunda tarif FRT içeren kasetin preintegration gerektirir. Bununla birlikte, bir kez oluşturulanonun hız ve basitlik mümkün teknik olarak çok zaman alıcı olacaktır aksi takdirde yukarıda belirtilen uygulamalar için tanımlanan izogenik ayarlarında yarı yüksek verimlilik genetik ekranlar geliştirmek için yapar. Buna ek olarak, tüm RMCE vektörleri ZFNs ile lokusunu hedeflemek için kullanılabilir pZ AAVS1 gen hedefleme vektörü içinde inşa edilmiştir, ancak TALENS veya CRISPR / Cas9 da bildirilmiştir. RMCE Vector ikilik veya FRT olmayan hPSCs bir kararlı transgen için birden fazla satır üretmek için son derece yararlıdır. Örneğin, tek bir vuruş ideal sonuçları doğrulamak için birden çok hPSC hatları test edilmesi gerekir RMCE tarafından gerçekleştirilen belirli bir genetik ekran başarılı gösterdi. Birden RMCE-müsait ana hücre hatlarının yokluğunda, nükleazlar kullanılması isabet hedefleme doğrudan gen gerçekleştirilebilir. RMCE vektörleri ikili karakteri yarar Grubumuzun 20 tarafından kanıtlanmıştır. Bu çalışmada, gen rötuşu hastanın türevi içinde gerçekleştirilmiştirFrontotemporal Demans (FTD) PROGRANULIN (PGRN) ifade eksikliği yol açan bir mutasyon taşıyan iPSCs. PGRN seviyeleri restore eden bir kaset bölgesinin AAVS1 lokusunda ZFNs aracılı sokulması ile gen tamamlama, mutasyon varlığı ile ilişkili kortikogenezin kusurlu fenotipi giderilmiştir. Buna ek olarak, benzer bir dizisi, eksojen PGRN ifadesi için bir kontrol olarak kullanılmak üzere WT hESC RMCE göre oluşturuldu. Rekombinant kolonilerin yokluğunda, RMCE verici vektör transfeksiyon kontrol edilmesi. % 30 daha üstün transfeksiyon verimliliği yukarıda belirtilen sonuçlar. Alt transfeksiyon verimliliği rekombinasyon verimliliği azaltmaktadır. Son olarak, RMCE sistemi AAVS1 lokusunda elde edilmiş, fakat herhangi bir başka mahale uygulanabilir.

Hedeflenen genom rekombinasyon araştırma birçok alanda hızlı gelişmeler kolaylaştırmıştır. Farelerde, genom düzenleme ve kök hücre araştırmaları arasındaki sinerji gen fonksiyonu ve gen regülasyonu karmaşık mekanizması artan bir anlayış için izin verdi. Uzun yıllar insan embriyonik kök hücreleri ilk izolasyonu (hESC), ve indüklenen sonra insan yana, pluripotent kök hücreleri (hiPSCs), gen düzenleme teknik engel oluşturmuştur, ancak böyle bir ilerleme ve ayrıca insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) beklenen . Hedeflenen nükleazlar-Çinko Parmak Nükleazlar (ZFNs), Transkripsiyon aktivatör gibi efektör nükleazlar (TALEN), ya da kullanarak genom mühendisliği son gelişmeler kümelenmiş düzenli palindromik tekrarlar / CRISPR-ilişkili protein 9 (CRISPR / Cas9) bize bu üstesinden gelmek için izin kısa interspaced 3 - zorluklar, etkin sürecini rekombinasyon 1 hedeflenen yapmada. m spesifik lokusRosa26, Hprt1 veya COL1A1 gibi yan etkiler olmadan daha güvenilir ve her yerde transgen ekspresyonunu sağlar ouse genomu, genetik çalışmalar, performansında önemli bir araç haline gelmiştir. Güvenli liman lokusları izogenik bağlamlarda farelerin farklı çizgileri arasındaki karşılaştırılabilir analiz sağlar. Bu sokma mutajenez, doza bağlı etkileri veya alacalı transgen ekspresyonu gibi iyi bilinen sınırlamalar ile ilişkili standart rasgele entegrasyon yöntemleri kullanılarak elde edilemez. güvenli liman loci Gen düzenleme kolaylığı ve esneklik özellikle (sırasıyla, loxP veya FRT) hedef dizileri tanıyan ve aynı hedefler arasında etkili rekombinasyon katalize Cre veya Flippase (FLPe) gibi alana özgü hedefli rekombinaz kullanımı yoluyla artar. Bu özelliklerinden dolayı, önceden hazırlanmış güvenli liman loci içinde loxP veya FRT dizileri kullanılarak rekombinaz-aracılı gen düzenleme trans fare kullanılan yaygın bir araçtırdoğuşu. Kaset yerleştirilmesi veya özdeş hedef diziler arasındaki aracılı eksizyonunu ek olarak, uyumlu loxP ya FRT sitelerinin kullanılması yeniden bağlayıcının aracı olduğu kaseti değişimi (RMCE) 4 sağlar. İnsanda, güvenli liman loci yapılmıştır tanımlamaya çalışır. Fare orthologous HPRT, kayıp fonksiyon-Lesch-Nyhan Sendromu ve ROSA26 ile ilişkisi olmasına rağmen hPSCs hedef edilmiştir. HPRT hızla ROSA26 gibi, ESC transgen ifade susturmak ve rapor edilmiştir, transgen ekspresyonunu sürdürme yeteneği 7 - terminal açıdan farklılaşmış hücreleri, 5 araştırılmamıştır. CCR5 geninin homozigot boş mutasyon iyi insanlarda tolere gibi görünüyor, çünkü güvenli liman olarak değer. Değerlendirildi CCR5 hedeflenen ve EKH 8,9 dahil olmak üzere farklı insan hücre hatlarında, istikrarlı transgen ekspresyonunu sürdürmek bildirildi. Ancak,İkincisi, uzun vadeli kültür sırasında klonal düzeyde kanıtlanmış değildi ve her yerde transgen ifadesi üç germ farklılaşmış döl gösterdi değildi. AAVS1, Adeno ilişkili Virüs tip 2 (AAV) doğal entegrasyon sitesi, test edildi transgen nedeniyle rapor direnç yanı sıra hESC, içinde 10 susturulması. Daha sonra, birçok grup, in vitro ve in vivo 2,8,11,12, hem AAVS1 lokusunu kullanılan farklılaşmamış hPSCs sabit transgen ekspresyonunu, ve her üç germ farklılaşmış döl tarif. AAVS1 lokusu farklılaşmamış hESC ve hepatosit döl 13 in vitro değişken transgen inhibisyonunu uygulamak için bulunmuştur olarak son sonuçlar Bununla birlikte, bu bulgular nüans. rasgele entegrasyon yaklaşımları ve yöntemleri kullanarak ilave tarama çalışmaları Geno bulmak amaçlanmıştır tek kopya entegrasyon belirlemek içinhPSCs genişleme ve farklılaşma 14,15 sırasında transgen susturulması dayanıklı mikrofon entegrasyon siteleri. Genel olarak, şimdiye kadar, hiçbir genomik site tam hPSCs ve döl güvenli bir liman olarak onaylanmıştır; her yerde sabit bir transgen ekspresyonu, hPSCs değil, aynı zamanda in vitro ve in vivo olarak farklılaşmış progeny&#39;lerinde sadece uygun bir site tanımlanması, çözülmesi gerekmektedir. Tüm çalışılan loci arasında ve sınırlamalara rağmen, AAVS1 kalır en iyi karakterize ve kök hücre araştırmalarında en çok kullanılan. RMCE başarıyla FLPe Cre 17 daha etkilidir endikasyonlar olsa bile, çok Cre rekombinaz kullanılarak, bu lokuslarının 6,7,14,16 bazı hPSCs içinde gerçekleştirilmiştir. Bütün bu durumlarda, bir pozitif ilaç direnci kaseti, yeniden kolonilerin seçimi için kullanılmıştır. Başarılı olsa da, bu işlemler standart gen üzerinde bir teknik ilerlemeyi teşkil etmemektedirZFNs kullanarak düzenleme işlemleri, Talens veya CRISPR / Cas9, gibi tek bir antibiyotik seçimi prosedürü rasgele entegrasyonları ekarte ve doğru hedef klonları tanımlamak için koloni taraması gerektiriyor. Bu prosedürde, metotlar ile ± 15 gün içinde (önceden hazırlanmış kaset içinde) poliklonal transgenik hatların üretilmesine izin seçimleri, bir (gelen kaset içinde) pozitif kombinasyonunu ve negatif kullanılarak AAVS1 lokusunda hPSCs olarak RMCE gerçekleştirmek için tarif % 100 verim ve rasgele entegrasyon olaylarının ücretsiz. Bu nedenle, bu yöntem hPSCs şu anda açıklanan RMCE teknolojileri ötesinde ilerlemeyi temsil ediyor.

<table><tbody><tr><td>DR4 Fare Embriyonik Fibroblastları (MEF)</td><td>AMS bio</td><td>GSC-6204G</td><td>besleyicilerde hPSC kültürü</td></tr><tr><td>CF-1 MEF, mitomisin-C ile muamele edilmiş</td><td>AMS Bio</td><td>GSC-6001M</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax %0.1 Jelatin Çözeltisi</td><td>Millipore</td><td>ES-006-B</td><td>iMEF kaplama</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Gibco</td><td>31330-038</td><td></td></tr><tr><td>Nakavt Serum Replasmanı </td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8540</td><td>hESC ortamı</td></tr><tr><td>için L-Glutamin, 200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>iMEF ortamı</td></tr><tr><td>için 2-Merkaptoetanol, 50&nbsp; mM</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Çözelti İçinde İnsan temel FGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18C</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>VWR</td><td>688001-500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Yüksek Glikoz</td><td>Gibco</td><td>41965-039&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (%0.05), fenol kırmızısı</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>hPSC besleyicilerde kültür</td></tr><tr><td>Matrigel, hESC nitelikli</td><td>VWR</td><td>734-1440</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 komple orta kiti</td><td>Kök hücre teknolojileri</td><td>05850</td><td>Besleyicisiz kültür için</td></tr><tr><td>StemPro Accutase Hücre Ayrışma Reaktifi</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>Besleyici içermeyen kültür için</td></tr><tr><td>Çözelti içinde Y-27632</td><td>VWR</td><td>56726</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Kök Hücre Nükleofektör Kiti 2</td><td>Lonza</td><td>VVPH-5022</td><td></td></tr><tr><td>Puromycine Dihidroklorür</td><td>Gibco</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>FIAU (Fialuridin)</td><td>ABX</td><td>2910</td><td></td></tr><tr><td>Higromisin B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3274</td><td></td></tr><tr><td>pFLPe</td><td></td><td></td><td>: Puromisin RMCE donörlerini çıkarmak için pCAGGS-FLPe'den (MES4488, Açık Biyosistemler)</td></tr> modifiye edildi <tr><td></td><td>-</td><td></td> <td>pZ donöründen AAVS1 puromisin vektöründen (PZD0020-1KT, Sigma Aldrich) modifiye edildi 13< / sup</td></tr><tr><td>>5 mL Yuvarlak Tabanlı Polistiren Test Tüpü, Hücre Süzgeci</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Genomik DNA kiti</td><td>Invitrogen</td> <td>ile</td><td></td>K182001</tr><tr><td>GoTaq Flexi DNA Polimeraz</td><td>Promega</td><td>M8298</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Güvenli DNA Jel Leke</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Nükleofektör 2b Cihazı</td><td>Lonza (Amaxa)</td><td>AAB-1001</td><td></td></tr><tr><td>NükleoSayıcı NC-100</td><td>Kemometec</td><td>NC-100</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Kanto</td><td>BD Biyoloji Bilimleri</td><td>337175</td><td></td></tr><tr><td>NucleoCassette</td><td>Chemometec</td><td>941-0002</td><td></td></tr></tbody></table>

içinde recombinase aracılı kaset borsası tarafından rekombinant insan pluripotent kök hücreleri hızlı ve verimli nesil<em&gt; aavs1</em&gt; odağı

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Hatta CRISPR-Cas9, insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) genetik modifikasyon liderliğindeki gen hedefleme teknolojileri devrimi ile hala zaman alıcıdır. daha hızlı ve off-hedef etkilerine daha az eğilimli Cre veya FLPe gibi siteye özgü hedefli rekombinaz kullanmak yaklaşımlar, yarar olabilir güvenli liman loci entegre transgenlerin ile rekombinant çizgileri kullanıyoruz karşılaştırmalı çalışmalar. önemli ölçüde daha iyi performans gen çoğu yönden hedeflemeyen, her ne kadar bu tür yöntemler, tarif edilmiştir. Çinko-parmak nükleazlar kullanılması, daha önce heterotypic FRT dizileri ile çevrili kaset ifade eden bir GFP-Higromisin-tk içeren hPSCs arasında AAVS1 odağı bir ana hücre hattını oluşturdu. Burada, bu hattı kullanarak FLPe rekombinaz aracılı kaset değişimi (RMCE) gerçekleştirmek için prosedürler açıklanmaktadır. ana cell hattı yükselticisiz bir puromisin direnç içerir ve FLPe rekombinaz bir RMCE verici vektör ile transfekte edilir. hem (Puromycin) pozitif ve negatif (FIAU) seçim programının uygulama rastgele entegrasyonları olmadan RMCE seçimine yol açar. RMCE% 100 verimle 15 D olarak tam anlamıyla karakterize pluripotent poliklonal transjenik çizgiler oluşturur. Son zamanlarda AAVS1 mahalinin sınırlamaları açıklanan rağmen, sistemin kolaylığı, izogenik ayarları hPSC transgenesis önünü açıyor karşılaştırmalı çalışmalar için gerekli olduğunu ve aksi olur fonksiyon analizi kar / zararı yarı yüksek verimli genetik ekranlar sağlıyor çok zaman alıcı olabilir.

AAVS1-spesifik ZNFs kullanarak, heterotipik FRT hedef sekanslarını ihtiva eden tam olarak karakterize HESC / iPSC ana hücre çizgileri oluşturulur ve 13 tarif edilmiştir. FRT ihtiva eden ana hücre hatları ZFN tedaviden sonra pluripotensini ve genom bütünlüğünü muhafaza ve stabil bir şekilde in vitro ve in vivo olarak GFP ifade edilmiştir. RMCE FLPe rekombinazın ve RMCE donör vektörleri (Şekil 1A) ile ana hücre hatlarının kotransfeksiyonu ile gerçekleştirilir. RMCE vektörleri transgen sınırdaş AAVS1 ana hücre hattında olanlar aynı FRT dizilerini içeren Şekil 1B yapısal ifade TDT Pz kullanarak RMCE izler.:. F3-P CAGGS tdTPH-F transfeksiyon sonra hPSC eşit dağılmış hücreleri küçük gruplar oluştururlar iDR4 MEF tabakası ve transfekte hPSC hem GFP yanı sıra geçici TDT (Şekil 1B, D 2) ifade etmektedir. 3 - Hücreler 2 için geri bırakılırseçim başlamadan önce d post-transfeksiyon. Pozitif seçim ilk RMCE donör ekleme lehine amacıyla puromycin düşük doz kullanılarak başlatılır. İlk masif hücre ölümü rekombinasyon geçiren tek hücre yol açabilir, çünkü puromycin sürecini hayatta kalmak için onları yapamaz hale, başında hafifçe uygulanır. İlerleyen günlerde, puromisin konsantrasyonu nonrecombined hücreleri yavaş yavaş ölürken rekombinant hücreler küçük koloniler halinde büyümeye izin vermek için en uygun doz kademeli yukarı kaldırdı gerekmektedir. 3-4 d (D 6 post-transfeksiyon civarında) pozitif seçim başlattıktan sonra, negatif seçim FRT-aracılı rekombinasyon olayları için sadece seçmek için başlatılır. RMCE timidin kinaz (TK) intihar geni kaybı ve dolayısıyla Fialuridin (FIAU) duyarlılık neden olur. Bu noktada uygulanan negatif seçimi, burada 2 küçük kümeler - 4 GFP - / TdT + (RMCE) hücrelerdirBu gibi durumlarda, AAVS1 lokusunda TK gene etkilenmez, çünkü FIAU (Şekil 1B, D 6) için en uygun konsantrasyonları dayanabilecek, rasgele entegrasyon önler. Aynı anda oluşumu FRT aracılı daha sonra karakterizasyonu (Şekil 2B) sırasında rasgele entegrasyon olaylarının olmamasıyla gösterildiği gibi rastgele entegrasyon, son derece düşüktür. 10 post-transfeksiyon, bazı değil tamamen seçilen karma RMCE koloniler (Şekil 1B) bulunabilir - karışık RMCE GFP - daha homojen olurken D 9 ile böylece / TDT + koloniler, büyümeye devam ediyor. RMCE FLPe yokluğunda meydana gelmez ise, kullanılır: (2: 1) - GFP / TdT + RMCE koloniler RMCE verici ve FLPe hem de sadece mevcut olduğu zaman, (2: 0). Gün 13 kadar FIAU Tam seçimi - / TDT + KÜLTÜR - 15 sonrası transfeksiyon homojen bir GFP yol açare. RMCE 15 gün 13 12.8 ± 6.8 (n = 6) Puro R / FIAU R kolonilerinin ortalama verir. / TdT + fenotipi (Şekil 2A) - yeni oluşturulan RMCE hattı (a nonclonal bir hücre popülasyonu içinde bir araya Puro R / FIAU R RMCE koloni) karakterizasyonu Flow cytometry hücrelerin% 100 RMCE GFP mevcut olduğunu teyit etmektedir. Bir flüoresan raportör yapısal ifadesi olmadan RMCE donörler kullanıldığında, elde edilen Puro R / FIAU R RMCE hPSC hattı homojen GFP olduğu -. nonclonal RMCE hattının PCR tanımlaması tam kasetli değişimini (saptanabilir ana hücre hattının kasetinin izi) gösterir ve ikinci seçim programı RMCE verici ve her ikisi de FLPe salgılayan (rasgele entegrasyon içermeyen çizgileri oluşturduğu vektör) (Şekil 2B). Bu sonuçlar ayrıca s tarafından kanıtlanmışouthern benek ve ek olarak, RMCE hatları pluripotent 13 kalmasını göstermektedir. Bu artık gerekli rasgele entegrasyon genom değerlendirme veya rutin RMCE deneyler sırasında Pluripotency testi ya yürütmek için yapar. Özet olarak, bu protokolü kullanarak rasgele entegrasyon serbest AAVS1 lokusunda hPSC transgenik hücre soyları kolaylıkla% 100 verimle 15 D ve detaylı karakterizasyonu gerek kalmadan elde edilebilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54718/54718fig1.jpg" /> Şekil 1: RMCE şematik genel RMCE seçim programı (A) zaman çizelgesi.. Sol: ana hücre çizgisi (MCL), bir FRT-flanked kaseti GFP ve Higromisin-tk ifade (üçgenler) barındıran FLPe-ifade vektörü ile nucleofection (NF) tarafından transfekte edilir (2A kendini yararak peptidler ile bağlantılı) ve RMCE donör vektörü, wHIch yükselticisiz bir puromisin direnç geni ihtiva eder (raptetme alıcı - SA- Puro R) ve değişken bir deney kaseti (x). Sağ: Puromisinin (kırmızı üçgen) ve FIAU (mavi çizgi) ile seçim tamamlanmasından sonra elde edilen yeni RMCE hattı (RMCEL). (B) RMCE bir kurucu TdT eksprese eden verici ve donör DNA ve FLPe DNA&#39;nın farklı oranları kullanılarak (0: 1, 2: 1, 2: 0) fluoresan mikroskobu ile kontrol (GFP - yeşil floresan, TdT - kırmızı flüoresan), farklı olarak zaman noktalarında. D 2 ve 6: ölçekli çubukları 100 mikron temsil etmektedir. D 10: ölçekli çubukları 200 mikron temsil etmektedir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54718/54718fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54718/54718fig2.jpg" /> Şekil 2:. RMCE Lines Karakterizasyonu (A) Tayini RMCE byakım sitometri. GFP ve TdT sentezleme WT hattı, ana hücre soyu (MCL) gösterilmiştir ve yeni üretilen RMCE hattı D 15 sonrası nucleofection bir yapısal TdT-ekspresyon vektörü (CAGGS TdT) ile ya da GFP ile vericiler, bir GOOSECOID promotör ile tahrik edilir (GSCp GFP, kesin endoderm işaretleyici) veya bir AAT promotör (APOeAATp GFP, hepatosit işaretleyici). RMCE (B) Onay (5 &#39;/ 3&#39; JA RMCEL), ana hücre hattı (MCL) kaset (5 &#39;/ 3&#39; JA MCL), ve rasgele entegrasyon eksikliği olmaması (5 &#39;/ 3&#39; / FLPe RI ) PCR ile gösterilen primer çiftleri kullanılarak. Donör RMCE vektörü (+ RI), FLPe ifade vektörü ve hiçbir şablon kontrolü (NTC) kullanıldı - RMCE hatları (5 1) WT, MCL, DNA. Değiştirilmiş Şekil (Ordovas ve ark., 2015) 13. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54718/54718fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> = &quot;1&quot;&gt; sayfa içinde <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54718/54718fig3.jpg" /> . AAVS1 Left RMCE ile Hedefleme RMCE-uygun Usta Hücre Hattı ve Gene Karşılaştırılması Şekil 3. Nesil: Gen hedefleme ana hücre hattı üretimi için Şekil 1A açıklanan bir donör (kaset ile birlikte transfekte edilir değiştirilmemiş WT hücreleri kullanır MCL) ve özel optimize ZFNs. süreç tam karakterizasyon 3 aya kadar sürer tamamlayın. Sağ: RMCE FLPe vektörleri ile vericinin kotransfeksiyonu ile gerçekleştirilir, ve tam olarak karakterize hattı 15 D oluşturulur. AAVS1 Gen hedefleme verimliliği önceki çalışmalarda 1,2 kadardır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54718/54718fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> ays &quot;&gt; <tbody><tr><td> medya </td><td> Bileşenler </td><td> Nihai konsantrasyon </td></tr><tr><td rowspan="7"> hESC ortamı </td><td> DMEM-F12, HEPES </td><td> % 80 </td></tr><tr><td> Serum yerine ortamı </td><td> % 20 </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> 146 mg / ml </td></tr><tr><td> MEM Olmayan Esansiyel Amino Asitler Çözümü (100x) </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 2-merkaptoetanol </td><td> 0.1 mM </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> % 0.1 </td></tr><tr><td> İnsan bazik FGF </td><td> 4 ng / ml </td></tr><tr><td rowspan="6"> IMEF kültür ortamı </td><td> DMEM yüksek glikoz </td><td></td></tr><tr><td> Fetal bovin serumu (FBS) </td><td> % 15 </td></tr><tr><td> Penisilin-Streptomisin </td><td> % 0.1 </td></tr><tr><td> L-Glutamin, 200 mM </td><td> 4 mM </td></tr><tr><td> MEM esansiyel olmayan aminoAsitler Çözelti (100x) </td><td> 2 kere </td></tr><tr><td> 2-merkaptoetanol </td><td> 0.1 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> Aranın kaplanması </td><td> hESC ortamı </td><td> 100% </td></tr><tr><td> KAYA önleyicisi (Y-27632) </td><td> 10 uM </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Ortam terkip. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> tahlil </td><td colspan="2"> ileri </td><td colspan="2"> Ters </td><td> amplikon </td><td> PCR Döngüsü </td></tr><tr><td> 5&#39;JA MCL </td><td colspan="2"> CACTTTGAGCTCTACTGGCTTC </td><td colspan="2"> CGTTACTATGGGAACATACGTCA </td><td> 1.1 Kb </td><td> 95 ºC, 5 &#39;- [95 ºC, 30&#39; &#39;- 68 ° C (-0.5 ° C / çevrim), 1&#39; 30 &#39;&#39;] X15 - [95 ºC, 30 &#39;&#39; - 58 ° C, 30 &#39;&#39; - 72 ° C, 1 &#39;30&#39; &#39;] X25 - 72 ºC, 5&#39; </td></tr><tr><td> 3&#39;JA MCL </td><td colspan="2"> TAACTGAAACACGGAAGGAG </td><td colspan="2"> AAGGCAGCCTGGTAGACA </td><td> 1.4 Kb </td><td> 95 ºC, 5 &#39;- [95 ºC, 30&#39; &#39;- 68 ° C (-0.5 ° C / çevrim), 1&#39; 30 &#39;&#39;] X15 - [95 ºC, 30 &#39;&#39; - 58 ° C, 30 &#39;&#39; - 72 ° C, 1 &#39;30&#39; &#39;] X25 - 72 ºC, 5&#39; </td></tr><tr><td> 5&#39;JA RMCEL </td><td colspan="2"> CACTTTGAGCTCTACTGGCTTC </td><td colspan="2"> CATGTTAGAAGACTTCCTCTGC </td><td> 1.1 Kb </td><td> 95 ºC, 5 &#39;- [95 ºC, 30&#39; &#39;- 68 ° C (-0.5 ° C / çevrim), 1&#39; 30 &#39;&#39;] X15 - [95 ºC, 30 &#39;&#39; - 58 ° C, 30 &#39;&#39; -72 ºC, 1 &#39;30&#39; &#39;] X25 - 72 ºC, 5&#39; </td></tr><tr><td> 3&#39;JA RMCEL </td><td colspan="2"> TTCACTGCATTCTAGTTGTGG </td><td colspan="2"> AAGGCAGCCTGGTAGACA </td><td> 1.5 Kb </td><td> 95 ºC, 5 &#39;- [95 ºC, 30&#39; &#39;- 68 ° C (-0.5 ° C / çevrim), 1&#39; 30 &#39;&#39;] X15 - [95 ºC, 30 &#39;&#39; - 58 ° C, 30 &#39;&#39; - 72 ° C, 1 &#39;30&#39; &#39;] X25 - 72 ºC, 5&#39; </td></tr><tr><td> 5&#39;RI Donör </td><td colspan="2"> GTACTTTGGGGTTGTCCAG </td><td colspan="2"> TTGTAAAACGACGGCCAG </td><td> 0.5 Kb </td><td> 95 ºC, 5 &#39;- [95 ºC, 30&#39; &#39;- 60 ° C, 30&#39; &#39;- 72 ° C, 30&#39; &#39;] X25 - 72 ºC, 5&#39; </td></tr><tr><td> 3&#39;RI Donör </td><td colspan="2"> CCTGAGTTCTAACTTTGGCTC </td><td colspan="2"> ACACAGGAAACAGCTATGAC </td><td> 0.5 Kb </td><td&gt; 95 ºC, 5 &#39;- [95 ºC, 30&#39; &#39;- 60 ° C, 30&#39; &#39;- 72 ° C, 30&#39; &#39;] X25 - 72 ºC, 5&#39; </td></tr><tr><td> RI FLPe </td><td colspan="2"> CCTAGCTACTTTCATCAATTGTG </td><td colspan="2"> GTATGCTTCCTTCAGCACTAC </td><td> 0.65 Kb </td><td> 95 ºC, 5 &#39;- [95 ºC, 30&#39; &#39;- 60 ° C, 30&#39; &#39;- 72 ° C, 30&#39; &#39;] X25 - 72 ºC, 5&#39; </td></tr></tbody></table> PCR Genotiplendirme. Ordovas ve diğ., 2015 13&#39;ten Modifiye için kullanılan Tablo 2. Primer ayarlar.

Burada daha önce tarif edilen sistemler geliştirir insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) arasında AAVS1 lokusunda RMCE göre hızlı ve etkili bir gen düzenleme yöntemi sunulmaktadır. Bu tekniği kullanarak, izogenik hatları hızlı ve güvenilir hPSCs ile transgenesis aracılı araştırma kolaylaştıran, uygun karşılaştırmalı çalışmalar için oluşturulabilir.

içinde Recombinase aracılı Kaset Borsası tarafından Rekombinant insan pluripotent kök hücreleri hızlı ve verimli Nesil<em&gt; AAVS1</em&gt; Odağı

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is ...

Bu prosedürün genel amacı, flippaz kullanılarak Rekombinaz aracılı Kaset Değişimi yaklaşımı veya RMCE ile insan pluripotent kök hücrelerinin (veya insan PSC'lerinin) AAVS1 bölgesinde hızlı ve verimli hedefli genom düzenlemesi gerçekleştirmektir. RMCE, bir dizinin AAVS1 lokusuna hedefli yerleşimini iyileştirir; bu durum, bir molekülün fonksiyonunun aşırı ekspresyon veya nakavt yoluyla hızlıca test edilmesine olanak tanıdığı için kök hücre biyolojisi açısından büyük önem taşır. Bu tekniğin temel avantajı, rastgele entegrasyon olaylarından arındırılmış, halen pluripotent ve normal karyotipe sahip insan PSC hatlarının sadece 15 günde oluşturulabilmesidir.Bu yöntem, AAVS1 lokusunda transgenez için kullanışlı bir araç sağlar ancak diğer insan permisif lokuslarına da uygulanabilir. Başlamak için, insan PSC ana hücre hatlarını standart prosedürlere göre, inaktive edilmiş fare embriyonik fibroblastları (iMEF) üzerinde veya olmadan altı kuyucuklu plaklarda kültüre edin. Hücreler %60 ila %70 konfluense ulaştığında, öncelikle bir 12 kuyucuklu plağın gerekli kuyucuklarını kaplamak için %0,1'lik jelatin çözeltisi kullanarak ilaç dirençli iMEF'leri ekleyin ve plağı oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.Ardından, kuyuk başına 125,000 iDR4 ekleyin ve kültürleri iMEF medyumunda gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, insan PSC kültürlerini 10 micromolar ROCK İnhibitörü içeren taze medyum ile 37 degrees Celsius'de bir saat boyunca ön inkübasyona tabi tutun. Bu sırada, insan ESC transfeksiyon solüsyonunu ve hücre ayrıştırma ajanını oda sıcaklığına getirin.Her nukleofeksiyon koşulu için bir mililitre nukleofeksiyon ekim medyumu hazırlayın. Ardından, kuyucuklardaki iDR4 medyumunu uzaklaştırın, hücreleri yıkamak için bir mililitre oda sıcaklığında PBS kullanın ve nukleofeksiyon ekim medyumu ekleyin. Örnek başına 500 mikrolitre ekim medyumunu steril 1,5 mililitrelik tüplere aktarın ve ekim aşamasına kadar 37 °C'de saklayın.İnsan PSC'lerini tek hücre süspansiyonu şeklinde ayırmak için besiyerini uzaklaştırın, hücreleri yıkamak için oda sıcaklığında PBS kullanın ve feeder içeren veya feeder-free hPSC kültürlerine, sırasıyla bir mililitre %0,05 Trypsin veya Accutase ekleyin. Kültürleri 37 °C'de inkübe edin. Ardından, plakayı inkübatörden dikkatlice çıkarın ve hücrelerin ayrılmasına izin vermeden disosiasyon ajanını aspire edin ve 1 ml insan PSC besiyeri ekleyin.Plaka yüzeyindeki besiyerini, köpük oluşumunu önleyerek nazikçe yıkayarak gevşek hücreleri ayırın. Hücreleri temiz ve steril bir 15 veya 50 mililitre tüp içerisinde tek hücre süspansiyonu olarak toplayın. Ardından hücreleri yıkamak için 1 mililitre hESC besiyeri kullanın ve hücreleri aynı tüpte toplayın.Sayıyım için hücre süspansiyonundan 50 µL'lik bir alikot alın ve geri kalan hücreleri oda sıcaklığında 300 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süspansiyon santrifüj edilirken hücreleri bir hücre sayım cihazı ile sayın. Süpernatantı uzaklaştırın ve hücre konsantrasyonunu 10⁶ hücre/mL olacak şekilde oda sıcaklığındaki PBS ile nazikçe yeniden süspanse edin.Ardından, her deneysel koşul için iki mililitreyi temiz steril 15 mililitrelik tüplere aktarın ve santrifüj işlemini tekrarlayın. Numuneler döndürülürken, 2,5 mikrogram flippase plazmidi kullanarak üç temiz 1,5 mililitrelik tüpte 0:1, 2:1 ve 2:0 donör flippase moleküler oranlarında plazmid karışımları hazırlayın. Nukleofeksiyona geçmek için, iDR4 plakasını ve ekim besiyeri içeren 1,5 mililitrelik tüpü inkübatörden çıkarın.Çökeceği rahatsız etmeden, her seferinde bir tüpten PBS'yi dikkatlice pipetleyerek tamponun mümkün olduğunca fazlasını uzaklaştırın. Çökeceği nazikçe pipetleyerek yeniden süspansiyon haline getirmek için 100 µL transfeksiyon çözeltisi kullanın. Ardından, hücre süspansiyonunu plazmit karışımlarının bulunduğu 1,5 mL'lik tüpe aktarın ve nazikçe karıştırın.Hücre DNA karışımını, hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek transfeksiyon küvetine aktarın. Küveti nükleofektör cihaza yerleştirin ve feeder hücreler üzerinde kültüre edilen hücreler için A13 programını veya feeder-free transfeksiyon için F16 programını çalıştırın. Küveti çıkarın ve kit içindeki tek kullanımlık transfer pipetlerini kullanarak, küvete 0,5 milliliters plating medium'u nazikçe ancak hızlı ve tek bir hareketle ekleyin.Ardından, hacmi aynı yöntemle geri toplayın ve iDR4 ile ekim ortamı içeren 12 kuyucuklu plakaya damla damla ekleyin. Kültür kabını inkübatördeki bir rafa yerleştirin ve hücre süspansiyonunu eşit şekilde dağıtmak için yavaşça ileri geri ve yanlara doğru hareket ettirin. Besiyerini değiştirmeden önce kabı 24 saat boyunca inkübe edin.Transfeksiyondan iki ila üç gün sonra seçime başlayın. Besiyerini aspire edin, hücreleri yıkamak için 1 mililitre PBS kullanın, ardından 100 nanogram/mililitre puromisin içeren insan ESC besiyeri ekleyin. Hücre büyümesini gözlemleyin ve puromisin konsantrasyonunu maksimum 250 nanogram/mililitreye kadar uygun şekilde artırarak puromisin seçimini yedi gün boyunca sürdürün.Üç ila dört günlük puromisin seçiminden sonra, 0.5 micromolar fialüridin veya FIAU ile seçime başlayın. Besiyerini günlük olarak değiştirin ve FIAU uygulamasını yedi sürekli günden fazla sürdürmeyin. Seçim işlemi tamamlandıktan sonra, yaklaşık 14 ila 15. günlerde, dirençli RMCE kolonileri oluşacak ve bunlar yeni RMCE hattını oluşturacaktır.Hücreleri standart prosedürleri izleyerek 1:2 oranında ayırın. Anahtar 1'deki kuyucuklar ayırmaya hazır olduğunda, karakterizasyon için ayrılan kuyucuğu videonun önceki bölümlerinde açıklandığı gibi tek hücre süspansiyonuna dönüştürün ve hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe toplayın. Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 ×g hızında santrifüjleyin.Ardından, hücreleri yeniden süspand etmek için bir mililitre PBS kullanın ve örneği ikiye bölün. Bir filtreli hücre süzgeci kullanılarak akış sitometrisi için, diğeri ise metin protokolüne göre DNA analizi için ayrılır. Flippaz rekombinaz ve tdT RMCE donörü ile transfeksiyondan sonra, hPSC'ler iDR4 MEF tabakası üzerine eşit şekilde dağılmış küçük hücre grupları oluşturmuş ve konstitütif GFP ile transiyent tdT eksprese etmişlerdir.Puromisin kullanılarak yapılan pozitif seçilim RMCE donör insersiyonunu destekler, ardından FIAU kullanılarak yapılan negatif seçilim ise yalnızca TK içermeyen FRT aracılı rekombinasyon olaylarını seçer. Transfeksiyondan yaklaşık altı gün sonra, küçük RMCE GFP-negatif, tdT-pozitif hücre kümeleri tanımlanabilir. Burada gösterildiği üzere, GFP-negatif, tdT-pozitif RMCE kolonileri yalnızca hem RMCE donörü hem de flippaz kullanıldığında mevcutken, flippaz yokluğunda RMCE gerçekleşmez. Puromisin ve FIAU dirençli RMCE kolonileri olan yeni oluşturulan RMCE hatlarının, klonal olmayan bir hücre popülasyonunda birleştirilerek akış sitometrisi ile karakterize edilmesi, hücrelerin %100'ünün RMCE GFP-negatif, tdT-pozitif fenotipi temsil ettiğini doğrular.hPSC'lerde kaydedici aktivitesi olmayan RMCE donörleri kullanıldığında, hücrelerin %100'ü GFP-negatiftir. Burada gösterilen non-klonal RMCE hattının PCR karakterizasyonu, kaset değişiminin tam olarak gerçekleştiğini ve kullanılan seleksiyon programının hem RMCE donörü hem de flippaz eksprese eden vektör için rastgele entegrasyonsuz hatlar oluşturduğunu kanıtlamaktadır. Özetle, bu RMCE yöntemi, tanımlanmış bir lokus için hPSC'lerdeki gen düzenlemesini, hedeflenmiş nükleazlara kıyasla önemli ölçüde basitleştirmektedir.Bu teknik uzmanlaşıldığında 15 gün içinde tamamlanabilir. Bu nedenle RMCE, izojenik bir ortamda karşılaştırmalı çalışmalara olanak tanıyan oldukça hızlı bir gen düzenleme aracıdır. Bu prosedür uygulanırken, transfeksiyon verimliliğinin %30'tan yüksek olması ve uygun çekirdek stok seçim ajanının uygulanması önemlidir.Bu videoyu izledikten sonra, insan PSC'lerinin AAVS1 lokusunda RMCE işleminin nasıl gerçekleştirileceği ve rekombinant hattın nasıl karakterize edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

rapid-efficient-generation-recombinant-human-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Burada tek bir lentiviral yeniden programlanması vektörü kullanılarak periferal kan 3-4 ml insan iPSCs üretimi için basit ve etkili bir protokol göstermektedir. Hazır kan hücrelerinin yeniden programlanması daha geniş bir araştırma toplum için erişilebilir kılarak IPSC teknoloji kullanımı hızlandırmak için vaat ediyor.

STEMCCA lentiviral Vektör Kullanma Çevresel Blood İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre Üretimi

Burada, biz tutarlı sonuç ve geliştirilmiş verimlilik gösterir Sendai virüs ile transgen-özgür insan iPSCs içine insan somatik hücreleri yeniden programlamak için kurulan yöntem sunuyoruz.

Sendai-virüs ile İnsan Somatik Verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin

Burada bir episomuna göre yeniden programlama strateji ve histon deasetilaz inhibitörleri kullanılarak periferal kandan alınan insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi için bir protokol açıklar.

Epizomlar ve HDAC inhibitörleri kullanarak Blood Verimli iPS Hücre Üretimi

Gen hedefleme metodolojileri, nakavt, knock-in ve etiketli alellere sahip transgenik fareler oluşturmak için kullanılabilir.  Burada, E. coli'de, özel gen hedefleme vektörlerini hızlı bir şekilde oluşturmak için kullanılabilecek 'alt klonlama artı ekleme' olarak adlandırdığımız gelişmiş bir yeniden birleştirme yöntemini açıklıyoruz.

Alt klonlama Artı Ekleme (SPI) - Gen Hedefleme Vektörler Rapid İnşaat için Yeni Bir Yöntem Recombineering

Güvenli liman AAVS1 lokusunda TALEN aracılı gen düzenleme, insan iPSC'lerinde yüksek verimli transgen ilavesi sağlar. Bu protokol, raportör hatları oluşturmak için bir GFP geninin hedeflenen entegrasyonunu sağlamak için TALEN ve donör vektör iletimi için iPSC'lerin hazırlanması, iPSC'lerin transfekte edilmesi ve iPSC klonlarının seçilmesi ve izole edilmesi prosedürlerini açıklar.

Transfeksiyon, Seçim ve İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin Colony-toplama AAVS1 Safe Harbor içine GFP geninin ile TALEN-hedefli

Uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs), klinik uygulamalar ve temel araştırma için hastaya özgü dokuların bir kaynağı temsil eder. Burada, non-entegre epizomal plasmidleri kullanılarak viral içermeyen iPSCs içine donmuş buffy kat elde edilen insan periferal kan mononükleer hücreleri (PBMNCs) yeniden programlamak için detaylı bir protokol mevcut.

Bütünleşmeyen episomal plasmidler kullanılarak dondurulmuş Buffy tüylerdeki uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

İnsan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler) genom düzenlemesi hızlı ve verimli bir şekilde yapılabilir. Burada, EGFP'yi eksprese etmek ve antibiyotik direncini ortaya çıkarmak için AAVS1 güvenli liman lokusunun düzenlenmesiyle örneklendiği gibi, hPSC'leri genetik olarak tasarlamak için sağlam bir deneysel prosedür sunulmaktadır.

Genom düzenlenmiş İnsan Pluripotent Kök Hücre Hatları oluşturulması: İzolasyon hedefleyen Gönderen

Bu protokol, insan yetişkin periferik kan hücrelerinden entegrasyon gerektirmeyen iPSC'lerin verimli bir şekilde üretilmesi için ayrıntılı bir yöntemi açıklar. Yeniden programlama faktörlerini ifade etmek için dört oriP/EBNA bazlı epizomal vektörün kullanılmasıyla, KLF4, MYC, BCL-XL veya OCT4 ve SOX2, 1 mL periferik kandan binlerce iPSC kolonisi elde edilebilir.

Epizomal vektörlerin kullanılması insan periferik kan mononükleer hücrelerinden entegrasyon içermeyen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Proteinler genellikle farklı hücresel fonksiyonları sarf edebilirsiniz birden çok etki içerirler. Gen irtibat kutusu kapağı (KO) bu işlevsel çeşitliliği dikkate almaz. Burada, çeşitli işlevsel etki alanları veya bir proteinin varyantlarının moleküler diseksiyon sağlar KO embriyonik kök hücrelerin bir rekombinasyon aracılı kaset değişimi (RMCE) tabanlı bir yapı-işlev yaklaşım sunulmuştur.

Recombinase aracılı Kaset Değişimi Kullanarak Fare Embriyonik Kök Hücre yapı-fonksiyon Çalışmaları

Hematopoetik kök hücre biyolojisini ve hematolojik maligniteleri daha iyi incelemek için hematopoetik kök ve progenitör hücrelerdeki (HSPC'ler) somatik mutasyonları sadık bir şekilde modellemek için yeni stratejiler gereklidir. Burada, CRISPR / Cas9 kullanımını ve çift rAAV donör transdüksiyonunu birleştirerek HSPC'lerde heterozigot fonksiyon kazancı mutasyonlarını modellemek için bir protokol açıklanmaktadır.

İnsan Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerinde Onkojenik Heterozigot Fonksiyon Kazancı Mutasyonlarının Mühendisliği

Öğrenin, insan pluripotent kök hücrelerinde AAVS1 lokusuna RMCE yöntemiyle hızlı ve verimli gen düzenleme yapmayı. Bu teknik 15 günde izojenik hücre hatları oluşturur ve kök hücre biyolojisi araştırmaları için güvenilir bir araç sunar.

içinde Recombinase aracılı Kaset Borsası tarafından Rekombinant insan pluripotent kök hücreleri hızlı ve verimli Nesil AAVS1 Odağı (Video) | JoVE Journal

içinde Recombinase aracılı Kaset Borsası tarafından Rekombinant insan pluripotent kök hücreleri hızlı ve verimli Nesil

Daha fazla video keşfet